Summary
提出了一种方便、快速、经济的方法，测量固体肿瘤细胞系中侧群细胞的比例。
Abstract
癌症干细胞（CSC）是肿瘤生长、转移和复发的重要原因。CSC的分离和鉴定对肿瘤研究具有重要意义。目前，几种技术用于从肿瘤组织和肿瘤细胞系中识别和净化CSC。侧群 （SP） 细胞的分离和分析是两种常用的方法。这些方法依赖于 CSC 快速排出荧光染料（如 Hoechst 33342）的能力。染料的流出与 ATP 绑定盒式 （ABC） 运输机相关联，可由 ABC 运输器抑制剂抑制。介绍了用Hchst 33342染色培养肿瘤细胞的方法，并通过流动细胞测量分析其SP细胞的比例。此检测方便、快速且经济高效。此测定中生成的数据有助于更好地了解基因或其他细胞外和细胞内信号对肿瘤细胞干细胞特性的影响。
Introduction
癌症干细胞（CSC）是具有自我更新能力和多分化潜力的细胞子集，在肿瘤生长、转移和复发1、2中起着至关重要的作用。目前，CSC已确定存在于各种恶性肿瘤中，包括肺癌、脑癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和肝癌3、4、5、6、7、8、9。这些肿瘤中CSC的鉴定主要基于表面标记蛋白的存在，如CD44、CD24、CD133和Sca-19、10的高和/或低表达，但迄今尚未报告能够区分CSC与非CSC的独特标记。目前，用于识别和净化肿瘤组织或肿瘤细胞系中的 CSC 的几种技术。这些技术是根据 CSC 的特定属性设计的。其中，侧群（SP）细胞的测定和排序是两种常用的方法。
SP细胞最初是由古德尔等人11日发现的，当时它们特征是小鼠骨髓细胞中的造血干细胞。当小鼠骨髓细胞被贴上荧光染料Hhchst 33342的标签时，一小群Hchst 33342模糊染色细胞出现在流动细胞测定测量的二维点图中。Hoechst 33342 是一种 DNA 结合染料，至少有两种绑定模式，导致不同的光谱特征。同时以两个波长查看荧光发射时，可以显示多个种群12。在他们的测定中，Hoechst 33342 在 350 nm 时兴奋不已，荧光是使用 450/20 nm 带通 （BP） 滤光片和 675 nm 边缘滤光长通 （EFLP）11来测量的。与整个骨髓细胞群相比，这组细胞富含称为SP细胞11的造血干细胞。SP细胞能够快速驱逐霍赫斯特33342。这种染料的流向与ATP绑定盒式磁带（ABC）运输机13有关，可以抑制一些代理，如富米特雷莫金C14，维拉帕米尔和雷塞平15，16。之后，在各种组织、器官、肿瘤组织和肿瘤细胞系17、18、19中检测出不同比例的SP细胞。这些SP细胞具有干细胞的许多特征17，19。
本手稿描述了霍奇斯特33342对培养肿瘤细胞的标记和染色，以及通过流动细胞学对SP细胞的分析。此外，还显示了使用此方法优化的 Hoechst 33342 浓度和特定肿瘤细胞系的适当阻滞剂选择。最后，证明了干细胞促进或抑制信号对肿瘤细胞SP比例的影响。实验实例表明，对SP的分析可用于探索各种信号的影响，如基因表达、小抑制剂、活化剂、细胞因子和化疗因子，对肿瘤茎的作用。与其他分离和纯化 CSC 的方法（如 CD44+/CD24） 种群排序、醛脱氢酶 （ALDH） 分析和肿瘤球体形成检测）相比，该方法更容易操作，且具有成本效益。
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Protocol
1. 细胞准备
- 细胞消化和中和
- 种子肿瘤细胞（如MDA-MB-231细胞）在6井板，并在37°C孵化器中培养他们提供5%的二氧化碳。
- 当细胞密度达到90%左右时，收获细胞。彻底吸气培养介质，用3mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗细胞2倍。
注意：为了检查信号通路抑制剂（例如FRA1抑制剂）或活化剂（例如STAT3活化剂）对肿瘤细胞干细胞特性的影响，肿瘤细胞在6个井板中播种，并在收获前用抑制剂或活化剂预处理一段时间。 - 在 6 口井板的每口井中加入 500μL 的 0.25% trypsin-EDTA，将板放在 37 °C 的孵化器中 1~3 分钟（分钟），然后轻轻敲击板以分离细胞。
注意：由于细胞生存能力的变化，长时间的消化会影响SP配置文件。 - 在 6 口井板的每口井中加入 3 毫升 PBS，补充 2% 胎儿牛血清 （FBS），以终止消化，并轻轻地将细胞上下吹风 3-5 倍，以分散细胞团。
- 将 0.5 mL 的细胞悬浮添加到新 6 井板的一口井中，并在显微镜下检查。如果观察到细胞团，通过 70 μM 细胞过滤器通过细胞悬浮。
注：这是一个可选的步骤。 - 将细胞转移到 15 mL 离心管。离心机在200 x g 下5分钟到颗粒细胞。去除超自然，并重新发送他们在3毫升的PBS补充2%FBS。将细胞上下吹3-5倍，进行彻底混合。
- 细胞计数
- 将 50 μL 的细胞悬架添加到 1.5 mL 微中微富格管中，并与 50 μL 试锅蓝色溶液混合。使用标准方法（如血细胞计）计算活细胞数量的混合物的 Pipette 10 μL。
- 稀释PBS中的细胞，辅以2%FBS，最终浓度为1×106 细胞/毫升。将 1 mL 的细胞悬架添加到 5 mL 聚苯乙烯圆形底部试管中，并准备两个样品管。
2. 细胞染色与霍赫斯特 33342
- 将霍奇斯特 33342 添加到一个管中，以达到适当的最终浓度。
注：例如，霍奇斯特33342的适当浓度为MDA-MB-231细胞的3微克/mL。 - 将阻滞剂（如富米特雷莫金 C、维拉帕米尔或雷塞平）添加到另一管中，以适当的最终浓度，在 37 °C 下孵育管 30 分钟，然后添加与步骤 2.1 中描述的相同的霍赫斯特 33342 浓度。
注：对于MDA-MB-231细胞，适当的阻滞剂是雷瑟平（40μM）。Reserpine 用作阻塞控制，以验证封闭 SP 区域中缺少单元格。 - 准备几个含有细胞的管子，并将 Hoechst 33342 添加到不同的浓度梯度中。流细胞测定后，根据SP的轮廓和比例选择适当的浓度。
注：这是用于定义霍奇斯特 33342 适当浓度的可选步骤。 - 准备几个包含细胞的管子，将阻滞剂添加到不同的浓度梯度中，在 37 °C 下孵育管 30 分钟，然后将 Hoechst 33342 添加到适当的浓度中。流细胞测量检测后，根据封闭SP区域中细胞的缺失选择适当的浓度。
注意：这是用于定义拦截器适当浓度的可选步骤。 - 将管子放在 37 °C 的孵化器中，孵育 60 分钟，每 10 分钟摇动一次管子。
注意：彻底摇动管子对染色很重要，因为它确保细胞和染料之间的完全接触，从而获得更好的染色效果。 - 孵化后，将细胞在200 x g、4°C下蒸发5分钟，并仔细吸气超自然，因为细胞形成非常松散和不稳定的颗粒。
- 在 1 mL 的冰冷 PBS 中重新补充每个管子的细胞，并辅以 2% FBS 和移液器，使细胞上下 3-5 倍完全混合。在每根管子的悬架中加入1微升1毫克/mL硫化物（PI），以识别死细胞。
注意：此步骤中的所有程序应在 4 °C 下执行，以抑制来自肿瘤细胞的 Hoechst 33342 的排泄。应保护管子免受直接暴露在光线下。
3. 流量细胞学分析
注：本节中描述了使用流量细胞仪软件的说明（见材料表），补充数字 1–10。
- 在流测速仪软件中，单击 FOLDER 按钮。单击 实验 按钮，然后单 击"新实验 "（补充图 1A，B）。
- 单击"确定"按钮。"Experiment_001"将出现在文件夹下（补充图2A，B）下。
- 单击Experiment_001按钮将文件夹名称更改为特定名称（例如，"20191118-SP"）。单击"输入"。新名称（"20191118-SP"）将出现在FOLDER下（补充图 3A，B）下。
- 单击 "新标本 "按钮，将标本添加到新的实验文件夹（"20191118-SP"）。单击 新管 按钮，在标本中添加一个管子。单击 箭头 按钮（补充图 4A-C）。
- 单击 参数 按钮并设置流环仪的参数（补充图 5）。
- 使用 610 nm 滴镜短通 （DMSP） 来分离发射波长。使用 450/20 nm BP 过滤器收集蓝色荧光和 675 nm EFLP 来收集红色荧光。
注：霍赫斯特33342是兴奋的紫外线激光在355纳米和PI是兴奋的488纳米。
- 使用 610 nm 滴镜短通 （DMSP） 来分离发射波长。使用 450/20 nm BP 过滤器收集蓝色荧光和 675 nm EFLP 来收集红色荧光。
- 在流动细胞仪上运行细胞样本。
注：SP细胞可以通过荧光激活细胞分拣（FACS）在无菌条件下进行排序。应收集总共100，000至500，000个细胞进行后续实验。- 在流动细胞仪上沾染了霍赫斯特 33342 的运行单元。
- 将含有带有霍奇斯特33342的细胞的管子放在细胞计上。
- 单击点图按钮以显示点图，然后单击X 轴并将其设置为"FSC-A"：单击Y 轴并将其设置为"PI-A"。显示前散射脉冲区域（FSC-A，X轴设置为线性模式）与 PI 荧光（Y 轴设置为对数刻度）的点图。调整电压，以显示右侧的活细胞和左上角带有 PI 的非活细胞。然后，通过单击多边形门按钮来关闭 P1 子集（也称为 FSC-A、PI-A 子集（补充图 6A，B），建立一个多边形门，以排除死细胞和细胞碎片（图1A）。
- 单击点图按钮以显示点图，单击X 轴并将其设置为"FSC-A"：单击Y轴并将其设置为"FSC-W"。显示 FSC-A （X 轴） 与前散射脉冲宽度 （FSC-W， Y 轴） 的点图。右键单击点图，单击显示"显示人口"按钮下的P1按钮。单击矩形门按钮创建一个矩形门以门 P2 子集（也称为 FSC-A、FSC-W 子集）。这将排除体积大的细胞（补充图 7A-C和图 1A）。
- 单击点图按钮以显示点图，单击X 轴并将其设置为"SSC-A"：单击Y轴并将其设置为"SSC-W"。显示侧散射脉冲区域（SSC-A、X轴）与侧散射脉冲宽度（SSC-W、Y轴）的点图。右键单击点图，然后单击"显示人口"按钮下的P2按钮。然后单击矩形门按钮创建一个矩形门，以门进入 P3 子集（也称为 SSC-A、SSC-W 子集）。这将获得具有均匀粒度的细胞群（补充图8A-C和图1A）。
- 单击点图按钮显示点图，单击X 轴并将其设置为"霍赫斯特红 A"：单击Y 轴并将其设置为"霍克斯蓝 A"。显示霍奇斯特红 A （X 轴） 与霍奇斯特蓝 A （Y 轴） 的点图。右键单击点图，单击显示"显示人口"按钮下的P3按钮。单击多边形门按钮创建一个多边形门，以门进入 P4 子集（也称为霍赫斯特红 A，霍奇斯特蓝 A 子集）。右键单击点图，单击显示人口层次结构按钮以显示人口层次结构。
注：点图将显示三个不同的人口：1） 靠近图形中心的 G0-G1 相数：2） 右上角附近的 S-G2/M 相位人口;3） SP.然后，SP 被封为进一步分析的大门（补充图 9A-D 和 图 1A）。如果霍奇斯特红 A 与霍奇斯特蓝 A 的点图图没有显示类似于 图 1A中的 SP 配置文件，则应调整电压，直到看到类似的轮廓。同时，相应地调整上述所有门。 - 在确定 SP 单元的门区域后，单击"获取数据"，从每个样本中收集 20，000 至 100，000 个事件，以分析 SP 单元的百分比（补充图 10）。
- 运行在流动细胞仪上用阻滞剂处理的霍赫斯特 33342 染色细胞。
- 将装有阻滞剂的管子放在细胞计上，并使用相同的电压和门运行单元，以进一步检查电压和门是否选择得当。
注：与仅限 Hoechst 33342 染色相比，只有很小一部分细胞（如果有的话）应出现在 SP 的门控区域（图 1B）。 - 从每个样本中收集 20，000–100，000 个事件，以分析 SP 细胞的百分比。
- 将装有阻滞剂的管子放在细胞计上，并使用相同的电压和门运行单元，以进一步检查电压和门是否选择得当。
- 在流动细胞仪上沾染了霍赫斯特 33342 的运行单元。
4. 数据分析
注：本节中描述了使用流细胞分析软件的说明（见 材料表）， 补充数字 11-16。
- 将fcs格式的文件复制到计算机上，打开流细胞分析软件，并将一个样本文件拖动到软件（补充图11A，B）。
- 门细胞并获取 SP 单元的百分比。
- 双击此示例文件，单击X 轴并将其设置为"FSC-A"：单击Y 轴并将其设置为"PI-A"。然后，创建一个多边形门，然后单击OK按钮以获取 FSC-A、PI-A 子集（补充图 12A-E）。
- 双击FSC-A、PI-A 子集文件，单击X 轴并将其设置为"FSC-A"：单击Y轴并将其设置为"FSC-W"。然后，创建一个矩形门，然后单击OK按钮以获取 FSC-A、FSC-W 子集（补充图 13A-E）。
- 双击FSC-A、FSC-W 子集文件，单击X 轴并将其设置为"SSC-A"：单击Y轴并将其设置为"SSC-W"。然后，创建一个矩形门，然后单击OK按钮以获取 SSC-A、SSC-W 子集（补充图 14A-E）。
- 双击 SSC-A、SSC-W 子集文件，单击 X 轴 并将其设置为"霍赫斯特红 A"：单击 Y 轴 并将其设置为"霍克斯蓝 A"。然后，创建一个多边形门，然后单击 OK 按钮以获取霍赫斯特红 A、霍奇斯特蓝 A 子集（补充图 15A-E）。
- 通过单击"打开布局编辑器"按钮打开布局编辑器。将SSC-A、SSC-W 子集文件拖至布局编辑器，然后单击"点击"以保存布局窗口以保存布局窗口以保存图像结果（补充图 16A-C）。
- 关闭软件时，保存工作空间以保留门控信息。
- 使用统计分析软件进行 t 测试分析，以比较两组之间的差异。P < 0.05 值被定义为统计学上显著值。
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Representative Results
根据这种方法进行了四次实验性SP分析。在第一个，我们检测到SP细胞在MDA-MB-231中的比例，这是人类乳腺癌细胞系的三重阴性，在正常条件下。在细胞计数后，Hoechst 33342 被添加到一个包含 1 x 106细胞的管中，最终浓度为 3 μg/mL。Reserpine 和 Hoechst 33342 分别添加到另一根管中，最终浓度分别为 40μM 和 3μg/mL。PI 被添加到两个管中。FSC-A（X轴）与PI-A（Y轴）的点图显示了三个种群：1） 代表死细胞的PI阳性细胞群：2） 细胞碎片：和3）主要人群是PI阴性细胞，这些细胞经过进一步分析（图1A，B）。使用从 FSC-A （X 轴） 与 FSC-W （Y 轴） 的点图中封闭的单细胞群，以及 SSC-A （X 轴） 与 SSC-W （Y 轴） 的点图图用于分析 SP 单元的比例（图 1A，B）。SP细胞从霍奇斯特红-A（X轴）与霍奇斯特蓝A（Y轴）的点图中封闭，它们在MDA-MB-231细胞中的百分比约为0.9%（图1A）。然而，雷瑟平大大降低了SP细胞的比例（图1B），支持SP的门绘是正确的。
第二个实验是确定Hchst 33342在MDA-MB-435细胞中的适宜染色浓度。在细胞计数后，Hoechst 33342 被添加到 1 x 106 个细胞中，这些细胞被悬浮在 1 mL 的 PBS 中，并辅以 2% FBS，以不同的浓度梯度（包括 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 和 4μg/mL）。如 图2A所示，当Hchst 33342的浓度过低（即0.5，1，1.5微克/mL）时，很难区分SP细胞和其他细胞群，因为很多细胞处于模糊的染色状态。当Hochst 33342的浓度过高（即2.5，3，3.5，4微克/mL）时，SP细胞的比例下降，直到它消失。因此，2μg/mL 霍奇斯特 33342 是 MDA-MB-435 细胞 SP 分析的最佳浓度。此外，为了确定该细胞系的适当阻滞剂，Hoechst 33342 和阻滞剂（维拉帕米尔或雷塞平）被添加到 1 x 106 个细胞中，这些细胞被悬挂在 1 mL 的 PBS 中，并辅以 2% FBS，最终浓度分别为 2μg/mL 和 40 μM。如 图2B所示，大约0.4%的细胞在维拉帕米尔治疗后排出染料。然而，经过雷塞平治疗后，该比率下降到约0.1%（图2C）。从这个实验中，Reserpine被认为是这个细胞系更合适的阻滞剂。
在第三个例子中，A549细胞（人类肺腺癌细胞）与STAT3活化剂-科利文林20（100 nM）预处理48小时（h）。STAT3信号通路对促进肿瘤细胞21的干细胞特征具有重要意义。如 图3所示，在结肠素刺激下，SP细胞的比例增加。
在最后一个例子中，T47D细胞（人类乳腺癌细胞）以0.1μM FRA1抑制剂-SKLB816（也称为13an）预处理，为48小时22。FRA1是上皮-心肌过渡（EMT）的看门人，参与肿瘤茎的调节23。如 图4所示，SP细胞的比例由于FRA1抑制剂的治疗而下降。
图1：SP分析中MDA-MB-231细胞的加丁策略。（A） MDA-MB-231细胞的加丁策略，其中染色了霍奇斯特33342（3微克/mL）和碘化物（PI，1μg/mL）。（B） MDA-MB-231细胞的加丁策略，用雷瑟平（40μM）治疗，并沾染了霍奇斯特33342（3μg/mL）和PI（1μg/mL）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：优化Hchst 33342浓度和MDA-MB-435细胞中的阻滞剂选择。（A） MDA-MB-435细胞的SP分析结果，这些细胞在不同浓度梯度（0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4μg/mL）和PI（1μg/mL）中沾染了Hoechst 33342（霍斯特）。（B） MDA-MB-435细胞的SP分析结果，用维拉帕米尔（40微米）治疗，并沾染了霍奇斯特33342（2微克/mL）和PI（1微克/mL）。（C） MDA-MB-435细胞的SP分析结果，用雷瑟平（40μM）处理，并沾染了霍奇斯特33342（2μg/mL）和PI（1μg/mL）。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：A549细胞中的STAT3活化器提高了SP细胞的比例。（A） 使用STAT3活化剂-科利文（100 nM）或其车辆控制（Ctrl）-H2O预处理48小时的A549细胞的SP分析结果。使用与雷塞平（45μM）治疗的A549细胞作为阻塞控制。A549 细胞沾染了霍奇斯特 33342 （7μg/mL） 和 PI （1μg/mL）。（B） 用科利弗林（100 nM）治疗的A549细胞SP细胞比例及其车辆控制的统计结果。数据以均值 （SEM） 的平均 + 标准误差表示， 每个组的 n = 3 。"*"表示 P < 0.05。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：SP细胞的比例在T47D细胞中被FRA1抑制。（A） 使用SKLB816 （0.1μM） 或其车辆控制 （Ctrl） - DMSO 预处理 48 小时的 T47D 细胞的 SP 分析结果。使用与雷塞平（40μM）治疗的T47D细胞作为阻塞控制。T47D 细胞沾染了霍奇斯特 33342 （8μg/mL） 和 PI （1μg/mL）。（B） 用SKLB816 （0.1μM） 处理的 T47D 细胞中 SP 细胞比例及其车辆控制的统计结果。数据以平均值+SEM表示，每组为n=3。"*"表示 P < 0.05。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充图1：流量细胞仪软件步骤编号3.1的说明。 （A） 单击 "文件夹" 按钮。（B） 单击 实验 按钮，然后单击 "新实验 "按钮。 请单击此处下载此图。
补充图2：流量细胞仪软件步骤编号3.2的说明。 （A） 单击 "确定 "按钮。（B） Experiment_001 出现在 文件夹下。 请单击此处下载此图。
补充图 3： 流量细胞仪软件步骤数 3.3 的说明。 （A） 单击 Experiment_001 按钮，将Experiment_001的名称更改为特定名称（例如"20191118-SP"）。（B） 单击 "输入" 按钮。 请单击此处下载此图。
补充图4：流量细胞仪软件步骤编号3.4的说明。 （A） 单击 "新标本 "按钮。（B） 单击 新管 按钮。（C） 单击 箭头 按钮。 请单击此处下载此图。
补充图 5：流量细胞仪软件步骤编号 3.5 的说明。 （A） 单击 参数 按钮以设置参数。 请单击此处下载此图。
补充图6：流量测速仪软件步骤编号3.6.1.2的说明。 （A） 单击 点图 按钮以显示点图，单击 X 轴 并将其设置为"FSC-A"：单击 Y 轴 并将其设置为 "PI-A"。（B） 单击 多边形门 按钮，创建一个多边形门，以门进入 P1 子集（也称为 FSC-A，PI-A 子集）。 请单击此处下载此图。
补充图 7： 流量细胞仪软件步骤编号 3.6.1.3 的说明。（A） 单击点绘图按钮以显示点图，单击X 轴并将其设置为"FSC-A"：单击Y轴并将其设置为"FSC-W"。（B） 右键单击点图，然后单击"显示人口"按钮下的P1按钮。（C） 单击矩形门按钮，创建一个矩形门，以门进入 P2 子集（也称为 FSC-A、FSC-W 子集）。请单击此处下载此图。
补充图 8：流量细胞仪软件步骤编号 3.6.1.4 的说明。（A） 单击点图按钮以显示点图，单击X 轴并将其设置为"SSC-A"：单击Y轴并将其设置为"SSC-W"。（B） 右键单击点图，然后单击显示"显示"下方形"按钮下方形门按钮，创建一个矩形门以门进入 P3 子集（也称为 SSC-A、SSC-W 子集）。请单击此处下载此图。
补充图9：流量细胞仪软件步骤编号3.6.1.5的说明。（A） 单击点图按钮以显示点图，单击X 轴并将其设置为"霍赫斯特红 A"：单击Y 轴并将其设置为"霍克斯蓝 A"。（B） 右键单击点图，然后单击显示"显示人口"按钮下的P3按钮。（C） 单击多边形门按钮，创建一个多边形门，以门进入 P4 子集（也称为霍奇斯特红 A，霍奇斯特蓝 A 子集）。（D） 右键单击点图，然后单击显示人口层次结构按钮以显示人口层次结构。请单击此处下载此图。
补充图10：流量测速仪软件步骤编号3.6.1.6的说明。 （A） 单击 获取数据 按钮，然后从每个样本中收集 20，000-100，000 个事件。 请单击此处下载此图。
补充图11：流细胞分析软件步骤编号4.1的说明。 （A） 打开流细胞分析软件，将一个样本文件拖入软件中。（B） 样本文件是导入的。 请单击此处下载此图。
补充图12：流细胞分析软件步骤编号4.2.1的说明。 （A） 双击此 示例文件。 （B） 单击 X 轴 并将其设置为"FSC-A"：单击 Y 轴 并将其设置为"PI-A"。（C） 单击 "创建多边形门 "按钮以创建多边形门。（D） 单击 "确定 "按钮以获取 FSC-A、PI-A 子集。（E） 获得 FSC-A、PI-A 子集。 请单击此处下载此图。
补充图13：流细胞分析软件步骤编号4.2.2的说明。 （A） 双击 FSC-A、PI-A 子集文件。 （B） 单击 X 轴 并将其设置为"FSC-A"：单击 Y轴 并将其设置为"FSC-W"。（C） 单击 创建矩形门 按钮以创建矩形门。 （D） 单击 "确定 "按钮以获取 FSC-A、FSC-W 子集。 （E） 获得 FSC-A、FSC-W 子集。 请单击此处下载此图。
补充图14：流细胞分析软件步骤编号4.2.3的说明。 （A） 双击 FSC-A、FSC-W 子集文件。 （B） 单击 X 轴 并将其设置为"SSC-A"：单击 Y轴 并将其设置为"SSC-W"。（C） 单击 "创建矩形门 "按钮以创建矩形门。（D） 单击 "确定 "按钮以获取 SSC-A、SSC-W 子集。（E） 获得 SSC-A、SSC-W 子集。 请单击此处下载此图。
补充图15：流细胞分析软件步骤编号4.2.4的说明。 （A） 双击 SSC-A、SSC-W 子集文件。 （B） 单击 X 轴 并将其设置为"霍赫斯特红 A"：单击 Y 轴 并将其设置为"霍克斯蓝 A"。（C） 单击 "创建多边形门 "按钮以创建多边形门。（D） 单击 "确定 "按钮以获取霍赫斯特红A、霍奇斯特蓝A子集。（E） 获得霍赫斯特红-A、霍赫斯特蓝-A子集。 请单击此处下载此图。
补充图16：流细胞分析软件步骤编号4.2.5的说明。 （A） 单击 "打开布局编辑器" 按钮以打开布局编辑器。（B） 将 SSC-A、SSC-W 子集示例文件 拖至 布局编辑器。（C） 单 击"点击"以保存布局窗口以存档 按钮以保存图像结果。 请单击此处下载此图。
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Discussion
对于 SP 分析，需要牢记几个要点。首先是为每个细胞系选择适当的阻滞剂，如维拉帕米尔或雷塞平，因为 SP 细胞的"门"位置根据添加阻止器后大量 SP 细胞消失的位置确定。对于MDA-MB-231细胞系，雷瑟平工作得很好。然而，对于其他细胞系，不同的阻滞剂可能效果更好。
第二个是霍赫斯特33342的浓度。有代表性的数据显示，随着霍赫斯特33342的染色浓度降低，SP细胞的百分比增加。这种现象可以用染料吸收动力学24来解释。染料浓度的变化影响细胞中Hhoechst 33342的富集。因此，霍赫斯特33342染色浓度与SP检测结果密切相关。此外，霍赫斯特33342的吸收和驱逐因细胞类型而异。因此，在SP分析之前，需要针对不同的细胞系探索霍赫斯特33342的适当浓度。
第三个是流环仪的变异（CV）系数良好，这对SP分析25也至关重要。紫外线激光功率是更好的CV12的重要标准。此协议使用商业流量细胞仪（参见 材料表）执行 SP 检测。在这个cuvette流细胞仪器中，我们使用功率为15mW的紫外线激光器来获得最好的简历。一般来说，相对较高的紫外线激光功率提供最佳的简历。例如，50-100mW 在空中飞行仪器12上提供最佳的霍赫斯特信号。有些激光提供更低的紫外线功率，可以减少简历。在这些情况下，良好的激光对齐至关重要。
最后一个是实验中其他因素的影响。细胞状态、温度、染色时间、流动细胞测量操作等因素也可能影响SP检测的比例和质量。例如，细胞悬架准备过程中细胞生存能力的变化将影响SP细胞的比例。因此，在进行SP分析之前，需要探索最佳的实验条件。考虑到上述因素，不同实验室测得的同一细胞系的SP比可能不同。例如，据报道，MDA-MB-231细胞和A549细胞的比例分别为~0.1%-4.8%26、27、28、29和~0.8%-18%，分别为30、31、32、33、34。
研究人员可以针对不同的应用修改此检测，例如研究其他肿瘤细胞系或原发性患者衍生肿瘤细胞。如果协议对正在测试的细胞效果不好，研究人员可以使用MDA-MB-231细胞作为阳性控制，并按照给定规格对细胞进行污渍。由于该协议对霍奇斯特33342的浓度、染色温度和时间等非常敏感，研究人员应仔细检查所有这些情况。SP在许多类型的人类肿瘤细胞系中所占百分比相对较低（+0%-37%）19、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36。如果观察到 SP 的过高或低百分比，则可能是由于使用霍赫斯特 33342 或阻滞剂的浓度不当。如果问题似乎与流量细胞仪有关，则应获得技术支持。
虽然使用 SP 分析和分离 CSC 是高效的，但仍有一定的局限性。首先是它对染色条件的高灵敏度12。许多因素，如Huchst 33342的浓度，细胞状态，温度，染色时间，流细胞测量的操作，以及阻滞剂的选择，可以影响SP分析的质量。第二个是霍赫斯特33342的细胞毒性作用。Hoechst 33342是一种DNA结合染料，但当细胞达到高浓度时对细胞有毒，从而减少细胞活性37。
总之，SP分析是近年来识别和净化肿瘤细胞系中CSC的最常用方法之一。虽然该方法存在一定的局限性，但在缺乏特定的CSC表面标记的情况下，它仍然是一种方便、快速、经济高效地充实CS的方法。该方法有利于研究CSC的生物功能，并有助于特定表面标记物的识别。此外，通过检测各种信号对肿瘤细胞SP比的影响，可以为这些信号通路对CSC特征的调节作用提供线索，促进新机制的发现，最终指导肿瘤的靶向治疗。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本工作由中国自然科学基金委员会81572599、81773124、81972787资助：天津市自然科学基金（中国） 19JCYBJC27300：天津市人民医院 - 南开大学合作研究资助2016rmnk005;中央大学基础研究基金、南开大学63191153。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5 mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
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