Summary
고형 종양 세포주에서 측면 집단 세포의 비율을 측정하는 편리하고 빠르며 비용 효율적인 방법이 제시된다.
Abstract
암 줄기 세포 (CSC)는 종양 성장, 전이 및 재발의 중요한 원인입니다. CSC의 격리 및 식별은 종양 연구에 큰 의미가 있습니다. 현재, 몇몇 기술은 종양 조직 및 종양 세포주에서 CSC의 식별 그리고 정화를 위해 이용됩니다. 측면 집단(SP) 세포의 분리 및 분석은 일반적으로 사용되는 두 가지 방법이다. 이 방법은 HCs가 Hoechst 33342와 같은 형광 염료를 빠르게 추방하는 능력에 의존합니다. 염료의 efflux는 ATP 결합 카세트 (ABC) 수송기와 연관되고 ABC 수송 억제제에 의해 억제 될 수있다. Hoechst 33342를 사용하여 배양된 종양 세포를 염색하고 혈류 세포에 의한 SP 세포의 비율을 분석하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 분석은 편리하고 빠르며 비용 효율적입니다. 이 분석에서 생성된 데이터는 종양 세포의 줄기 특성에 대한 유전자 또는 기타 세포 외 및 세포 내 신호의 효과에 대한 더 나은 이해에 기여할 수 있습니다.
Introduction
암 줄기세포(CSC)는 자가 재생 능력과 여러 분화 잠재력을 가진 세포의 하위 집합으로 종양 성장, 전이 및 재발1,2에서중요한 역할을 한다. 현재 CSC는 폐, 뇌, 췌장, 전립선, 유방암 및간암3,4,5,6,7,8,9를포함한 다양한 악성종양에존재하는 것으로 확인되었습니다. 이들 종양에서 CSC의 식별은 주로 CD44, CD24, CD133 및 Sca-19,10의높은 및/또는 낮은 발현과 같은 표면 마커 단백질의 존재에 기초하지만, 비-CSC로부터 CSC를 구별할 수 있는 독특한 마커는 지금까지 보고되지 않았다. 현재, 몇몇 기술은 종양 조직 또는 종양 세포주에서 CSCs를 확인하고 정화하기 위하여 이용됩니다. 이러한 기술은 CS의 특정 특성을 기반으로 설계되었습니다. 그 중에서도, 측면 집단(SP) 세포의 소법과 정렬은 일반적으로 사용되는 두 가지 방법이다.
SP 세포는 원래 구델 외11에의해 발견되었다, 그들은 마우스 골수 세포에서 조혈 줄기 세포를 특성화 할 때. 마우스 골수 세포가 형광염 호흐트 33342로 표지되었을 때, Hoechst 33342 의 작은 그룹은 유동 세포 분석법의 2차원 도표 플롯에 나타났다. Hoechst 33342는 DNA 결합 염료이고 다른 스펙트럼 특성으로 이끌어 내는 적어도 2개의 결합 모드가 있습니다. 동시에 두 파장에서 형광 방출을 볼 때, 다중 인구는12를드러낸다. 이들의 분석에서 Hoechst 33342는 350nm에서 흥분되었고 형광은 450/20 nm 대역 패스(BP) 필터 및 675 nm 엣지 필터 롱패스(EFLP)11을사용하여 측정하였다. 골수 세포의 전체 인구와 비교하여, 세포의이 그룹은 SP 세포(11)에게불린 조혈 줄기 세포로 풍부하게 되었다. SP 세포는 Hoechst 33342를 급속하게 추방할 수 있습니다. 이 염료의 효능은 ATP 결합 카세트 (ABC)수송기 (13)와관련이 있으며, 이는 Fumitremorgin C14,Verapamil 및 Reserpine15,16과같은 일부 에이전트에 의해 억제 될 수 있습니다. 그 후, SP 세포의 상이한 비율은 다양한 조직, 장기, 종양 조직 및 종양 세포주17,18,19에서검출되었다. 이들 SP 세포는줄기세포(17,19)의많은특성을갖는다.
이 원고는 Hoechst 33342 의 배양 된 종양 세포의 라벨링 및 염색 및 유동 세포측정에 의한 SP 세포의 분석을 설명합니다. 더욱이, 이러한 접근법을 이용하여 특정 종양 세포주에 대한 Hoechst 33342 농도 및 적절한 차단제 선택의 최적화가 도시된다. 마지막으로, 종양 세포에서 SP의 비율에 대한 줄기 촉진 또는 억제 신호의 효과가 입증된다. 실험적인 예는 SP의 분석이 종양 줄기에 유전자 발현, 작은 억제제, 활성제, 사이토카인 및 화학과 같은 다양한 신호의 효과를 탐구하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. CD44 +/CD24의 정렬과 같은 CSC의격리 및 정화를 위한 다른 방법에 비해 인구, 알데히드 탈수소효소(ALDH) 분석 및 종양 구형성 분석, 이 방법은 조작이 용이하며 비용 효율적입니다.
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Protocol
1. 셀 준비
- 세포 소화 및 중화
- 종자 종양 세포(예: MDA-MB-231 세포)는 6웰 플레이트에서, 5%CO2로공급되는 37°C 인큐베이터에서 배양한다.
- 그들의 밀도가 대략 90%에 도달할 때 세포를 수확합니다. 배양 배지를 철저히 흡인시키고 3mL의 인산염 완충식식염수(PBS)로 세포를 2x 세척한다.
참고: 종양 세포의 줄기 기능에 대한 신호 경로 억제제 (예를 들어, FRA1 억제제), 또는 활성제 (예를 들어, STAT3 활성제)의 효과를 검사하기 위해 종양 세포는 6 웰 플레이트에 시드되고 수확하기 전에 일정 시간 동안 억제제 또는 활성기로 전처리됩니다. - 6웰 플레이트의 각 웰에 0.25%의 500 μL을 추가하고, 플레이트를 37°C에서 37°C에서 1-3분(분)에 넣고 부드럽게 플레이트를 눌러 세포를 분리합니다.
참고: 장기간 소화는 세포 생존가능성의 변화로 인한 SP 프로필에 영향을 미칩니다. - PBS3mL을 6웰 플레이트의 각 웰에 2% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충하여 소화를 종료하고 세포를 위아래로 3~5배 씩 부드럽게 피펫하여 세포 덩어리를 분산시다.
- 새로운 6 웰 플레이트의 한 웰에 세포 현탁액의 0.5 mL을 추가하고 현미경으로 검사합니다. 세포 덩어리가 관찰되면 70 μM 세포 스트레이너를 통해 셀 서스펜션을 전달합니다.
참고: 이것은 선택적 단계입니다. - 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 이송합니다. 탄환 세포에 5 분 동안 200 x g에서 원심 분리기 세포. 상체를 제거하고 2 % FBS로 보충 PBS의 3 mL에서 다시 중단합니다. 셀을 위아래로 3-5배 위아래로 피펫하여 철저히 섞습니다.
- 셀 수
- 셀 서스펜션의 50 μL을 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 넣고 50 μL 트라이팬 블루 용액과 혼합합니다. 파이펫 10 μL 혼합물은 혈혈계와 같은 표준 방법을 사용하여 살아있는 세포의 수를 계산한다.
- PBS의 세포를 2% FBS로 희석하여 1 x 106 세포/mL의 최종 농도로 희석합니다. 5mL 폴리스티렌 라운드 하단 테스트 튜브에 셀 서스펜션 1mL을 추가하고 2개의 샘플 튜브를 준비합니다.
2. 호흐트스트 33342를 곁들인 세포 염색
- Hoechst 33342를 한 튜브에 추가하여 적절한 최종 농도에 도달합니다.
참고: 예를 들어, Hoechst 33342의 적절한 농도는 MDA-MB-231 세포에 대한 3 μg/mL이다. - 블로커(예를 들어, Fumitremorgin C, Verapamil, 또는 레서핀)를 다른 튜브에 적절한 최종 농도로 추가하고 37°C에서 30분 동안 튜브를 배양한 후 2.1 단계에서 설명된 바와 같이 Hoechst 33342의 동일한 농도를 추가한다.
참고: MDA-MB-231 세포의 경우 적절한 차단제는 레서핀(40 μM)입니다. 레서핀은 게이트된 SP 영역에 셀이 없는지 확인하기 위해 차단 컨트롤로 사용됩니다. - 세포를 포함하는 몇몇 관을 준비하고 다른 농도 그라데이션에 Hoechst 33342를 추가합니다. 유동 세포 분석 후, SP의 프로파일 및 비율에 따라 적절한 농도를 선택합니다.
참고: 이것은 Hoechst 33342의 적절한 농도를 정의하는 데 사용되는 선택적 단계입니다. - 세포를 포함하는 여러 튜브를 준비하고, 다른 농도 그라데이션에 차단기를 추가하고, 37°C에서 30분 동안 튜브를 배양한 다음, Hoechst 33342를 적절한 농도로 추가합니다. 유동 세포 분석 후, 게이트 된 SP 영역에서 세포의 부재에 따라 적절한 농도를 선택합니다.
참고: 이것은 차단기의 적절한 농도를 정의하는 데 사용되는 선택적 단계입니다. - 튜브를 37°C 인큐베이터에 놓고 60분 동안 배양하여 10분마다 튜브를 흔들어 보냅니다.
참고: 튜브를 철저히 흔들어두는 것은 더 나은 염색 결과를 위해 세포와 염료 사이의 완전한 접촉을 보장하기 때문에 염색에 중요합니다. - 인큐베이션 후, 세포를 200 x g,4°C에서 5분 동안 원심분리하고, 셀이 매우 느슨하고 불안정한 펠릿을 형성하기 때문에 주체를 조심스럽게 흡인한다.
- 2% FBS와 파이펫으로 보충 된 얼음 차가운 PBS의 1 mL에서 각 튜브의 세포를 다시 중단 3-5 배 완전히 혼합. 죽은 세포를 식별하기 위해 각 튜브의 현탁액에 1 mg / mL 프로피듐 요오드 (PI)의 1 μL을 추가합니다.
참고: 이 단계의 모든 절차는 종양 세포로부터 Hoechst 33342의 효능을 억제하기 위해 4°C에서 수행되어야 합니다. 튜브는 빛에 직접 노출되지 않도록 보호되어야 합니다.
3. 유동 세포측정에 의한 분석
참고: 유동 세포계 소프트웨어 의 사용에 대한 지침(재료 표참조)은 이 섹션및 보충 수치 1-10에설명되어 있습니다.
- 흐름 사이토미터 소프트웨어에서 폴더 버튼을 클릭합니다. 실험 버튼을 클릭한 다음 새 실험(추가 그림 1A,B)을클릭합니다.
- 확인 버튼을 클릭합니다. "Experiment_001"는 폴더 아래에 표시됩니다(보충 도 2A,B).
- 폴더 이름을 특정 이름으로 변경하려면 Experiment_001 단추를 클릭합니다(예: "20191118-SP"). 입력을클릭합니다. 새로운 이름("20191118-SP")은 폴더(추가 그림 3A,B)아래에표시됩니다.
- 새 표본 버튼을 클릭하여 새 실험 폴더에 표본을 추가합니다("20191118-SP"). 새 튜브 버튼을 클릭하여 시편에 튜브를 추가합니다. 화살표 머리 버튼을 클릭(보충 그림 4A-C).
- 매개 변수 버튼을 클릭하고 흐름 사이토미터의 매개 변수를 설정합니다(보충도 5).
- 610 nm 디크로이크 미러 쇼트 패스(DMSP)를 사용하여 방출 파장을 분리합니다. 450/20 nm BP 필터를 사용하여 파란색 형광과 675 nm EFLP를 수집하여 적색 형광을 수집합니다.
참고 : Hoechst 33342는 355 nm에서 UV 레이저로 흥분하고 PI는 488 nm에서 흥분됩니다.
- 610 nm 디크로이크 미러 쇼트 패스(DMSP)를 사용하여 방출 파장을 분리합니다. 450/20 nm BP 필터를 사용하여 파란색 형광과 675 nm EFLP를 수집하여 적색 형광을 수집합니다.
- 흐름 세포계에서 셀 샘플을 실행합니다.
참고: SP 세포는 멸균 조건 하에서 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 정렬될 수 있다. 후속 실험을 위해 총 100,000-500,000개의 세포를 수집해야 합니다.- 유동 세포계에 Hoechst 33342로 염색된 세포를 실행합니다.
- 세포계에 Hoechst 3342로 염색된 세포를 포함하는 튜브를 놓습니다.
- 점 도면 단추를 클릭하여 점 플롯을 표시한 다음 X축을 클릭하고"FSC-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고"PI-A"로설정합니다. PI 형광(Y축은 로그리스믹 스케일로 설정된 Y축)과 전방 분산 펄스 영역(FSC-A, X축 설정)의 도트 플롯을 표시합니다. 전압을 조정하여 오른쪽의 살아있는 세포와 왼쪽 상단 모서리에 PI로 밝게 염색된 비살아있는 세포를 표시합니다. 이어서, 다각형 게이트버튼을 클릭하여 P1 서브셋을 게이트하여 다각형게이트(도 1A)를제외하는 다각형 게이트를 설치하여 FSC-A, PI-A 서브세트(보충도도 6A,B)라고도한다.
- 점 도표 단추를 클릭하여 점 플롯을 표시하고 X축을 클릭하고"FSC-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고"FSC-W"로 설정합니다. FSC-A(X축)의 도트 플롯과 전방 산란 펄스 폭(FSC-W, Y축)을 표시합니다. 도트 플롯을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 채우기 표시 버튼 아래의 P1 버튼을 클릭합니다. 직사각형 게이트 버튼을 클릭하여 P2 하위 집합(FSC-A, FSC-W 하위 집합이라고도 함)을 게이트하는 직사각형 게이트를 만듭니다. 이렇게 하면 대용량셀(보조도 7A-C 및 도 1A)이제외됩니다.
- 점 도표 단추를 클릭하여 점 플롯을 표시하고 X축을 클릭하고"SSC-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고"SSC-W"로설정합니다. 측면 산란 펄스 영역(SSC-A, X축)과 측면 산란 펄스 폭(SSC-W, Y축)의 도트 플롯을 표시합니다. 도트 플롯을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 채우기 표시 버튼 아래의 P2 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 직사각형 게이트 버튼을 클릭하여 직사각형 게이트를 만들어 P3 하위 집합(SSC-A, SSC-W 하위 집합이라고도 함)을 게이트합니다. 이것은 균일한 세분성을 가진 세포 집단을 얻을 것이다(보충 도 8A-C 및 도 1A).
- 점 도표 단추를 클릭하여 점 플롯을 표시하고 X축을 클릭하고"Hoechst Red-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고"Hoechst Blue-A"로설정합니다. Hoechst Red-A(X축)와 Hoechst Blue-A(Y축)의 도트 플롯을 표시합니다. 도트 플롯을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 채우기 표시 버튼 아래의 P3 버튼을 클릭합니다. 다각형 게이트 버튼을 클릭하여 P4 하위 집합(Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A 하위 집합이라고도 함)을 게이트하는 다각형 게이트를 만듭니다. 도트 플롯을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 인구 계층 구조 표시 버튼을 클릭하여 인구 계층 구조를 표시합니다.
참고: 도트 플롯은 그래프 의 중심 근처에 G0-G1 위상 인구: 1) 세 가지 다른 인구를 표시합니다; 2) 오른쪽 상단 모서리 근처의 S-G2/M 상 인구; 3) SP. 그런 다음 SP가 추가 분석을 위해 문이있습니다(추가 도 9A-D 및 도 1A). Hoechst Red-A 대 Hoechst Blue-A의 도트 플롯이 도 1A에표시된 것과 유사한 SP 프로파일을 표시하지 않으면 유사한 프로파일이 나타날 때까지 전압을 조정해야 합니다. 한편, 그에 따라 위의 모든 게이트를 조정합니다. - SP 셀의 게이트 영역을 결정한 후 데이터 수집을 클릭하여 각 샘플에서 20,000-100,000개의 이벤트를 수집하여 SP 셀의 백분율(보충도 10)을분석합니다.
- 유동 세포계에서 차단기로 처리된 Hoechst 33342 염색 세포를 실행합니다.
- 사이토미터에 차단기를 포함하는 튜브를 배치하고 동일한 전압과 게이트를 사용하여 세포를 실행하여 전압과 게이트가 적절하게 선택되었는지 여부를 추가로 확인합니다.
참고: Hoechst 33342 염색단독과 비교하여, SP(도1B)의게이트 영역에 나타나는 세포의 극히 작은 비율만이 나타난다. - SP 세포의 백분율을 분석하기 위하여 각 견본에서 20,000-100,000의 이벤트를 수집합니다.
- 사이토미터에 차단기를 포함하는 튜브를 배치하고 동일한 전압과 게이트를 사용하여 세포를 실행하여 전압과 게이트가 적절하게 선택되었는지 여부를 추가로 확인합니다.
- 유동 세포계에 Hoechst 33342로 염색된 세포를 실행합니다.
4. 데이터 분석
참고: 유동 세포분석 소프트웨어 의 사용에 대한 지침(재료표참조)은 이 섹션및 보충 수치 11–16에 설명되어 있습니다.
- fcs 형식으로 파일을 컴퓨터에 복사하고, 흐름 세포 분석 소프트웨어를 열고, 하나의 샘플 파일을 소프트웨어로 드래그합니다(보조도 11A,B).
- 게이트 셀및 SP 세포의 백분율을 얻습니다.
- 이 샘플 파일을두 번 클릭하고 X 축을 클릭하고"FSC-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고"PI-A"로설정합니다. 그런 다음 다각형 게이트를 만들고 확인 버튼을 클릭하여 FSC-A, PI-A 하위 집합(보충도 12A-E)을얻습니다.
- FSC-A, PI-A 하위 집합 파일을두 번 클릭하고 X축을 클릭하고"FSC-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고"FSC-W"로 설정합니다. 그런 다음 직사각형 게이트를 만들고 확인 버튼을 클릭하여 FSC-A, FSC-W 하위 집합(보충도 13A-E)을얻습니다.
- FSC-A, FSC-W 하위 집합 파일을두 번 클릭하고 X 축을 클릭하고"SSC-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고"SSC-W"로설정합니다. 그런 다음 직사각형 게이트를 만들고 확인 버튼을 클릭하여 SSC-A, SSC-W 하위 집합(보충도 14A-E)을얻습니다.
- SSC-A, SSC-W 하위 집합 파일을두 번 클릭하고 X축을 클릭하고"Hoechst Red-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고"Hoechst Blue-A"로설정합니다. 그런 다음 다각형 게이트를 만들고 OK 버튼을 클릭하여 Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A 하위 집합(보충도 15A-E)을얻습니다.
- 레이아웃 편집기 열기 단추를 클릭하여 레이아웃 편집기열기를 엽니다. SSC-A, SSC-W 하위 집합 파일을 레이아웃 편집기로 드래그한 다음 클릭하여 레이아웃 창을 저장하여 이미지 결과(추가그림 16A-C)를저장합니다.
- 소프트웨어를 닫을 때 게이팅 정보를 유지하려면 작업 영역을 저장합니다.
- 통계 분석 소프트웨어로 t-test 분석을 수행하여 두 그룹 간의 차이를 비교합니다. P < 0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 정의되었다.
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Representative Results
이 방법에 따라 4개의 실험SP 분석이 수행되었다. 첫 번째 하나에서, 우리는 정상 조건하에서, 3중 음성 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231에 있는 SP 세포의 비율을 검출했습니다. 세포 계수 후 Hoechst 33342를 1 x 106 세포를 포함하는 하나의 튜브에 첨가되어 3 μg/mL의 최종 농도를 하였다. 레서핀과 호흐트스트 33342는 각각 40 μM 및 3 μg/mL의 최종 농도에 다른 튜브에 첨가되었다. PI는 두 튜브에 추가되었습니다. FSC-A(X축) 대 PI-A(Y축)의 도트 플롯은 3개의 집단을 나타냈다: 1) 죽은 세포를 나타내는 PI 양성 세포 집단; 2) 세포 파편; 및 3) 주요 인구는 PI-음수 세포였으며, 이는 추가분석(도 1A,B)을받았다. FSC-A(X축)의 도트 플롯에서 게이트된 단일 세포 집단과 FSC-W(Y축) 및 SSC-W(Y축)대 SSC-A(X축)의 도트 플롯(Y축)을 사용하여 SP 셀의 비율을 분석하였다(도1A,B). SP 세포는 Hoechst 적색A(X축)와 Hoechst Blue-A(Y축)의 점도플롯에서 문이 있었고, 그 비율은 MDA-MB-231세포(그림 1A)에서약 0.9%였다. 그러나, 레서핀은 SP셀(도 1B)의비율을 크게 감소시키고, SP용 게이트 페인팅이 정확하다는 것을 뒷받침한다.
두 번째 실험은 MDA-MB-435 세포에서 Hoechst 33342의 적절한 염색 농도를 결정하는 것이었습니다. 세포 계수 후 Hoechst 33342는 1 x 106 세포에 첨가되었으며, PBS의 1mL에서 2% FBS로 보충되어 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 및 4 μg/mL을 포함한 다른 농도 그라데이션에 첨가되었습니다. 도 2A에도시된 바와 같이, Hoechst 33342의 농도가 너무 낮았을 때(즉, 0.5, 1, 1.5 μg/mL), 세포가 많이 어둡게 얼룩진 상태이기 때문에 다른 세포 집단과 SP 세포를 구별하기 어려웠다. Hoechst 33342의 농도가 너무 높았을 때 (즉, 2.5, 3, 3.5, 4 μg/mL), SP 세포의 비율이 사라질 때까지 감소하였다. 따라서, 2 μg/mL Hoechst 33342는 MDA-MB-435 세포에서 SP 분석을 위한 제일 농도였다. 또한, 이러한 세포주에 대한 적절한 차단제를 결정하기 위해 Hoechst 33342 및 블로커(Verapamil 또는 Reserpine)를 1 x 106 세포에 첨가하였고, 이는 PBS의 1mL에서 2% FBS로 보충되어 각각 2μg/mL 및 40 μM의 최종 농도로 첨가되었다. 도 2B에도시된 바와 같이, 세포의 약 0.4%가 Verapamil 치료 후 염료를 추방하였다. 그러나, 레서핀 치료 후, 비율은 약 0.1 %로 떨어졌다(그림 2C). 이 실험에서, Reserpine는 이 세포주에 더 적합한 차단제로 간주되었습니다.
세 번째 예에서, A549 세포(인간 폐 아데노시노종 세포)는 STAT3 활성제-Colivelin20(100 nM)으로 48시간(h)으로 전처리하였다. STAT3 신호 경로는 종양세포(21)의줄기 특징을 증진시키는 데 중요하다. 도 3에도시된 바와 같이, Colivelin 자극시 SP 세포의 비율이 증가하였다.
마지막 예에서, T47D 세포(인간 유방암 세포)는 48 h22에대해 0.1 μM FRA1 억제제-SKLB816(또한 명명된 13an)으로 전처리되었다. FRA1은 상피-중간엽 전이(EMT)의 보고된 게이트키퍼이며 종양줄기(23)의조절에 관여한다. 도 4에도시된 바와 같이, SP 세포의 비율은 FRA1 억제제의 치료에 의한 감소하였다.
그림 1: SP 분석에서 MDA-MB-231 세포의 게이팅 전략. (A)HOEchst 33342 (3 μg/mL) 및 프로피듐 요오드 (PI, 1 μg/mL)로 염색 된 MDA-MB-231 세포의 게이팅 전략. (b)MDA-MB-231 세포의 게이팅 전략, 이는 레서핀 (40 μM)로 처리되고 Hoechst 33342 (3 μg/mL) 및 PI (1 μg/mL)로 염색하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MDA-MB-435 세포에서 Hoechst 33342 농도 및 차단제 의 선택최적화. (A)다른 농도 그라데이션에서 Hoechst 33342 (Hoechst)로 염색 된 MDA-MB-435 세포의 SP 분석 결과는 PI (1 μg/mL)와 함께 다른 농도 그라데이션 (0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4 μg/mL)로 염색하였다. (B)베라파밀(40 μM)으로 처리되고 Hoechst 33342(2 μg/mL) 및 PI(1 μg/mL)로 염색된 MDA-MB-435 세포의 SP 분석 결과. (C)REserpine (40 μM)으로 처리되고 Hoechst 33342 (2 μg/mL) 및 PI (1 μg/mL)로 염색된 MDA-MB-435 세포의 SP 분석 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: SP 세포의 비율은 A549 세포에서 STAT3 활성제에 의해 강화되었다. (A)STAT3 활성제-Colivelin (100 nM) 또는 48h에 대한 차량 제어(Ctrl)-H2O로 전처리된 A549 세포의 SP 분석 결과. Reserpine (45 μM)으로 처리된 A549 세포는 차단 제어로 사용되었다. A549 세포는 Hoechst 33342 (7 μg/mL) 및 PI (1 μg/mL)로 염색하였다. (B)Colivelin (100 nM) 및 차량 제어로 처리 된 A549 세포에서 SP 세포의 비율의 통계 적 결과. 데이터는 평균 + 표준 오류(SEM), n = 3각 그룹에 대해 표시됩니다. "*"는 P < 0.05를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: SP 세포의 비율은 T47D 세포에서 FRA1 억제제에 의해 억제되었다. (A)48h용 SKLB816(0.1 μM) 또는 차량 제어(Ctrl)-DMSO로 전처리된 T47D 세포의 SP 분석 결과. Reserpine (40 μM)으로 처리된 T47D 세포는 차단 제어로 사용되었다. T47D 세포는 Hoechst 33342 (8 μg/mL) 및 PI (1 μg/mL)로 염색하였다. (b)SKLB816(0.1 μM)으로 처리된 T47D 세포내SP 세포의 비율과 차량 제어의 통계적 결과. 데이터는 각 그룹에 대해 평균 + SEM, n = 3으로 표시됩니다. "*"는 P < 0.05를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 흐름 사이토미터 소프트웨어 단계 번호 3.1에 대한 지침. (A) 폴더 버튼을 클릭합니다. (B) 실험 버튼을 클릭한 다음 새 실험 버튼을 클릭합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 2: 흐름 사이토미터 소프트웨어 단계 번호 3.2에 대한 지침. (A)확인 버튼을 클릭합니다. (B) Experiment_001 폴더아래에 표시됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 3: 흐름 사이토미터 소프트웨어 단계 번호 3.3에 대한 지침. (A) Experiment_001 버튼을 클릭하여 Experiment_001 이름을 특정 이름(예: "20191118-SP")으로 변경합니다. (B)입력 버튼을 클릭합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 4: 흐름 사이토미터 소프트웨어 단계 번호 3.4에 대한 지침. (A) 새 표본 버튼을 클릭합니다. (B) 새 튜브 버튼을 클릭합니다. (C)화살표 헤드 버튼을 클릭합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 5: 흐름 사이토미터 소프트웨어 단계 번호 3.5에 대한 지침. (A) 매개 변수 버튼을 클릭하여 매개 변수를 설정합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 6: 흐름 사이토미터 소프트웨어 단계 번호 3.6.1.2에 대한 지침. (A) 도트 플롯 버튼을 클릭하여 점 플롯을 표시하고 X축을 클릭하고"FSC-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고 "PI-A"로설정합니다. (B) 다각형 게이트 버튼을 클릭하여 P1 하위 집합(FSC-A, PI-A 하위 집합이라고도 함)을 게이트하는 다각형 게이트를 만듭니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 7: 흐름 사이토미터 소프트웨어 단계 번호 3.6.1.3에 대한 지침. (A) 도트 플롯 버튼을 클릭하여 점 플롯을 표시하고 X축을 클릭하고 "FSC-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고 "FSC-W"로설정합니다. (B)점 플롯을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 채우기 표시 버튼 아래의 P1 버튼을 클릭합니다. (C) 직사각형 게이트 버튼을 클릭하여 P2 하위 집합(FSC-A, FSC-W 하위 집합이라고도 함)을 게이트하는 직사각형 게이트를 만듭니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 8: 흐름 사이토미터 소프트웨어 단계 번호 3.6.1.4에 대한 지침. (A) 도트 플롯 버튼을 클릭하여 점 플롯을 표시하고 X축을 클릭하고"SSC-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고"SSC-W"로설정합니다. (B)도트 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 채우기 표시 버튼 아래의 P2 버튼을 클릭합니다. (C) 직사각형 게이트 버튼을 클릭하여 P3 하위 집합(SSC-A, SSC-W 하위 집합이라고도 함)을 게이트하는 직사각형 게이트를 만듭니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 9: 흐름 사이토미터 소프트웨어 단계 번호 3.6.1.5에 대한 지침. (A) 점 플롯 버튼을 클릭하여 점 플롯을 표시하고 X축을 클릭하고"Hoechst Red-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고"Hoechst Blue-A"로설정합니다. (B)점 플롯을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 채우기 표시 버튼 아래의 P3 버튼을 클릭합니다. (C) 다각형 게이트 버튼을 클릭하여 P4 하위 집합(Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A 하위 집합이라고도 함)을 게이트하는 다각형 게이트를 만듭니다. (D)점 도표를 마우스 오른쪽 단추로 클릭한 다음 인구 계층 구조 표시 버튼을 클릭하여 인구 계층 구조를 표시합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 10: 유동 세포계 소프트웨어 단계 번호 3.6.1.6에 대한 지침. (A) 데이터 수집 버튼을 클릭한 다음 각 샘플에서 20,000-100,000개의 이벤트를 수집합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 11: 유동 세포 분석 소프트웨어 단계 번호 4.1에 대한 지침. (A)유동 세포 분석 분석 소프트웨어를 열고 하나의 샘플 파일을 소프트웨어로 드래그합니다. (B)샘플 파일이 가져온다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 12: 유동 세포 분석 소프트웨어 단계 번호 4.2.1에 대한 지침. (A)이 샘플 파일을 두 번 클릭합니다.(B) X축을 클릭하고"FSC-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고"PI-A"로설정합니다. (C) 다각형 게이트 만들기 버튼을 클릭하여 다각형 게이트를 만듭니다. (D) 확인 버튼을 클릭하여 FSC-A, PI-A 하위 집합을 가져옵니다. (E)FSC-A, PI-A 하위 집합이 얻어진다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 13: 유동 세포 측정 분석 소프트웨어 단계 번호 4.2.2에 대한 지침. (A) FSC-A, PI-A 하위 집합 파일을 두 번 클릭합니다.(B) X축을 클릭하고"FSC-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고"FSC-W"로 설정합니다. (C) 직사각형 게이트를 만들기 위해 직사각형 게이트 버튼을클릭합니다. (D) 확인 버튼을 클릭하여 FSC-A, FSC-W서브셋을 획득합니다. (E)FSC-A, FSC-W 서브세트가 얻어진다.
보충 도 14: 유동 세포 측정 분석 소프트웨어 단계 번호 4.2.3에 대한 지침. (A) FSC-A, FSC-W 하위 집합 파일을 두 번 클릭합니다.(B) X축을 클릭하고"SSC-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고"SSC-W"로설정합니다. (C) 직사각형 게이트 만들기 버튼을 클릭하여 직사각형 게이트를 만듭니다. (D) 확인 버튼을 클릭하여 SSC-A, SSC-W 하위 집합을 가져옵니다. (E)SSC-A, SSC-W 서브세트가 얻어진다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 15: 유동 세포 분석 소프트웨어 단계 번호 4.2.4에 대한 지침. (A) SSC-A, SSC-W 하위 집합 파일을 두 번 클릭합니다.(B) X축을 클릭하고"Hoechst Red-A"로설정합니다. Y축을 클릭하고"Hoechst Blue-A"로설정합니다. (C) 다각형 게이트 만들기 버튼을 클릭하여 다각형 게이트를 만듭니다. (D) 확인 버튼을 클릭하여 Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A 하위 집합을 얻습니다. (E)Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A 하위 집합이 획득됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 16: 유동 세포 분석 소프트웨어 단계 번호 4.2.5에 대한 지침. (A) 레이아웃 편집기 열기 버튼을 클릭하여 레이아웃 편집기를 엽니다. (B) SSC-A, SSC-W 하위 집합 샘플 파일을 레이아웃 편집기로드래그합니다. (C) 클릭하여 레이아웃 창을 저장하여 이미지 결과를 저장합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
SP 분석기의 경우 몇 가지 핵심 사항이 있습니다. 첫 번째는 각 세포주에 대해 베라파밀 또는 레서핀과 같은 적절한 차단제의 선택이며, SP 세포의 "게이트" 위치는 차단기의 첨가 후 많은 수의 SP 세포가 사라지는 위치에 따라 결정되기 때문이다. MDA-MB-231 세포주, 레서핀은 잘 작동합니다. 그러나, 다른 세포주에 대 한, 다른 차단제 더 나은 작동 수 있습니다.
두 번째는 Hoechst 33342의 농도입니다. 대표적인 데이터가 나타난 바와 같이 Hoechst 33342의 염색 농도가 감소함에 따라 SP 세포의 비율이 증가했습니다. 이러한 현상은 염료 섭취운동학(24)에의해 설명될 수 있다. 염료 농도의 변화는 세포에서 Hoechst 3342의 농축에 영향을 미칩니다. 따라서 Hoechst 33342 염색 농도는 SP 분석결과와 밀접한 관련이 있다. 더욱이, Hoechst 33342의 섭취 및 추방은 세포 모형 사이에서 다릅니다. 따라서, Hoechst 33342의 적절한 농도는 SP 분석 전에 상이한 세포주를 위해 탐구될 필요가 있다.
세 번째는 SP분석(25)에도중요한 유동 사이토미터의 변형(CV)의 양호한 계수이다. UV 레이저 전력은 더 나은 CV12에대한 중요한 기준이다. 이 프로토콜은 SP 분석기를 수행하기 위해 상용 유량 사이토미터(재료 표참조)를 사용합니다. 이 큐벳 유량 셀 기기에서는 15mW의 힘으로 UV 레이저를 사용하여 최고의 이력서를 얻었습니다. 일반적으로 상대적으로 높은 UV 레이저 전력은 최적의 이력서를 제공합니다. 예를 들어, 50-100 mW는 제트 인에어악기(12)에최적의 Hoechst 신호를 제공한다. 일부 레이저는 낮은 UV 전력을 제공하므로 CV를 줄일 수 있습니다. 이러한 경우, 좋은 레이저 정렬은 중요 하다.
마지막은 실험 중 다른 요인의 영향입니다. 세포 상태, 온도, 염색 시간, 유동 세포측정기 의 작동 및 기타 요인은 또한 SP 분석의 비율 그리고 질에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 세포 현탁액의 제조 중 세포 생존율의 변화는 SP 세포의 비율에 영향을 미칩니다. 따라서 SP 분석을 수행하기 전에 최상의 실험 조건을 탐색해야 합니다. 상기 요인을 고려하여, 상이한 실험실에 의해 측정된 동일한 세포주들의 SP 비율이 다를 수 있다. 예를 들어, MDA-MB-231 세포 및 A549 세포의 비율은 각각 ~0.1%-4.8%26,27,28, 29및 ~0.8%-18%30,31,32,33,34로보고되었다.
연구원은 다른 종양 세포주, 또는 1 차적인 환자 유래 종양 세포의 연구 결과와 같은 다른 응용을 위한 이 분석을 수정할 수 있습니다. 프로토콜이 시험되는 세포에 대해 잘 작동하지 않는 경우, 연구원은 주어진 사양에 따라 세포를 양성 제어로 MDA-MB-231 세포를 사용하고 얼룩질 수 있습니다. 이 프로토콜은 Hoechst 33342, 염색 온도 및 시간 등의 농도에 매우 민감하기 때문에 연구자들은 이러한 모든 조건을 면밀히 확인해야합니다. 많은 유형의 인간 종양 세포주에서 SP의 비율은 상대적으로 낮습니다(~0%-37%)19,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. SP의 지나치게 높거나 낮은 비율이 관찰되는 경우, 그것은 Hoechst 33342 또는 차단기 사용의 부적절한 농도 때문일 수 있습니다. 문제가 흐름 세포계와 관련이 있는 것으로 보인다면 기술 지원을 받아야 합니다.
SP를 사용하여 CSC를 분석하고 분리하는 것은 매우 효율적이지만 여전히 일정한 제한이 있습니다. 첫 번째는 염색 조건에 그것의 높은 감도12입니다. Hoechst 33342의 농도, 세포 상태, 온도, 염색 시간, 유동 세포측정및 차단기 선택 등의 많은 요인이 SP 분석의 품질에 영향을 줄 수 있다. 두 번째는 Hoechst 33342의 세포 독성 효과입니다. Hoechst 33342는 DNA 결합 염료이지만 고농도에 도달하여 세포활성(37)을감소시 세포에 독성이 있다.
요약하자면, SP 분석은 종양 세포주에서 CSC를 식별하고 정화하기 위해 최근 몇 년 동안 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다. 이 방법에는 몇 가지 제한이 있지만 특정 CS 표면 마커가 없는 경우 여전히 CSC의 편리하고 신속하고 비용 효율적인 농축을 위한 방법입니다. 이 방법은 CSC의 생물학적 기능을 연구하고 특정 표면 마커의 식별에 유용합니다. 더욱이, 종양 세포의 SP 비율에 대한 다양한 신호의 효과를 검출함으로써, CSCs 기능에 대한 이러한 신호 경로의 조절 효과에 대한 단서를 제공하고, 궁극적으로 종양의 표적 치료를 유도할 수 있는 새로운 메커니즘의 발견을 용이하게 할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 81572599, 81773124, 81972787 대한 중국 자연과학 재단의 지원을 받았습니다. 천진시 자연과학재단(중국) 19JCYBJC27300; 천진인민병원 & 난카이대학 협력연구보조금 2016rmnk005; 중앙 대학, 난카이 대학 63191153 대한 기본 연구 기금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5 mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
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