Summary
Представлен удобный, быстрый и экономичный метод измерения доли побочных популяционных клеток в сплошных опухолевых клеточных линиях.
Abstract
Раковые стволовые клетки (CSC) являются важной причиной роста опухоли, метастазирования и рецидива. Выделение и идентификация ЦСК имеют большое значение для исследования опухолей. В настоящее время для идентификации и очистки ЦСК из опухолевых тканей и опухолевых клеточных линий используется несколько методик. Разделение и анализ клеток боковой популяции (SP) являются двумя из широко используемых методов. Методы основаны на способности CSC быстро вытеснять флуоресцентные красители, такие как Hoechst 33342. Отток красителя связан с транспортерами АТФ-связывающей кассеты (ABC) и может ингибироваться ингибиторами транспортера ABC. Описаны методы окрашивания культивируемых опухолевых клеток Hoechst 33342 и анализа доли их SP-клеток методом проточной цитометрии. Этот анализ удобен, быстр и экономичен. Данные, полученные в этом анализе, могут способствовать лучшему пониманию влияния генов или других внеклеточных и внутриклеточных сигналов на свойства стволов опухолевых клеток.
Introduction
Раковые стволовые клетки (CSC) представляют собой подмножества клеток с способностью к самообновлению и множественным дифференцировыванием, которые играют жизненно важную роль в росте опухоли, метастазировании и рецидиве1,2. В настоящее время было идентифицировано, что CSC существуют при различных злокачественных опухолях, включая рак легких, головного мозга, поджелудочной железы, предстательной железы, молочной железы и печени3,4,5,6,7,8,9. Идентификация CSC в этих опухолях в основном основана на присутствии поверхностных маркерных белков, таких как высокая и / или низкая экспрессия CD44, CD24, CD133 и Sca-19,10,но уникальный маркер, который может отличить CSC от не-CSC, до сих пор не сообщалось. В настоящее время несколько методов используются для выявления и очистки ЦСК в опухолевой ткани или клеточных линиях опухоли. Эти методы разработаны на основе специфических свойств CSC. Среди них анализы и сортировка клеток боковой популяции (SP) являются двумя из широко используемых методов.
SP-клетки были первоначально обнаружены Goodell et al.11,когда они характеризовали гемопоэтические стволовые клетки в клетках костного мозга мыши. Когда клетки костного мозга мыши были помечены флуоресцентным красителем Hoechst 33342, небольшая группа клеток Hoechst 33342 с тусклым окрашиванием появилась на двумерном точечном графике анализа проточной цитометрии. Hoechst 33342 является ДНК-связывающим красителем и имеет, по меньшей мере, два режима связывания, которые приводят к различным спектральным характеристикам. При просмотре флуоресцентного излучения на двух длинах волн одновременно можно выявить несколько популяций12. В их анализе Hoechst 33342 возбуждался при 350 нм, а флуоресценция измерялась с помощью полосового фильтра 450/20 нм (BP) и 675 нм краевого фильтра длинных проходов (EFLP)11. По сравнению со всей популяцией клеток костного мозга, эта группа клеток была обогащена гемопоэтическими стволовыми клетками, называемыми SP-клетками11. КЛЕТКИ SP способны быстро вытеснять Hoechst 33342. Отток этого красителя связан с АТФ-связывающими кассетными (ABC) транспортерами13,которые могут ингибироваться некоторыми агентами, такими как ФумитреморгинС14,Верапамил и Резерпин15,16. После этого различные пропорции SP-клеток были обнаружены в различных тканях, органах, опухолевых тканях и опухолевых клеточных линиях17,18,19. Эти SP-клетки имеют много характеристик стволовых клеток17,19.
Эта рукопись описывает маркировку и окрашивание культивированных опухолевых клеток Hoechst 33342 и анализ SP-клеток методом проточной цитометрии. Кроме того, показана оптимизация концентрации Hoechst 33342 и правильный выбор блокатора для конкретной линии опухолевых клеток с использованием этого подхода. Наконец, продемонстрировано влияние сигналов продвижения или ингибирования стволовойсти на долю SP в опухолевых клетках. Экспериментальные примеры демонстрируют, что анализ SP может быть использован для изучения влияния различных сигналов, таких как экспрессия генов, небольшие ингибиторы, активаторы, цитокины и хемокины, на стволовую опухоль. По сравнению с другими методами выделения и очистки ЦСК, такими как сортировка CD44+/ CD24- популяция, анализ альдегиддегидрогеназы (ALDH) и анализы образования опухолевой сферы, этот метод проще для манипуляций и является экономически эффективным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клеточная подготовка
- Переваривание и нейтрализация клеток
- Засейте опухолевые клетки (такие как клетки MDA-MB-231) в 6-колодежную пластину и культивированы в инкубаторе с 37 °C, снабженном 5% CO2.
- Собирают клетки, когда их плотность достигает около 90%. Тщательно аспирировать культурную среду и промыть клетки в 2 раза 3 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения влияния ингибиторов сигнальных путей (например, ингибитора FRA1) или активаторов (например, активатора STAT3) на особенности стволовости опухолевых клеток опухолевые клетки засевают в пластину из 6 скважин и предварительно лечат ингибиторами или активаторами в течение определенного периода времени до сбора урожая. - Добавьте 500 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА в каждую скважину из 6-й пластины, поместите пластину в инкубатор при 37 °C на 1-3 минуты (мин) и осторожно постучите по пластине, чтобы отсоединить клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное пищеварение повлияет на профиль SP из-за изменения жизнеспособности клеток. - Добавьте 3 мл PBS, дополненного 2% фетальной бытовой сывороткой (FBS), в каждую скважину из 6-й пластины, чтобы прекратить пищеварение, и осторожно пипеткой клеток вверх и вниз в 3-5 раз, чтобы диспергировать клеточные сгустки.
- Добавьте 0,5 мл клеточной суспензии в одну скважину новой пластины из 6 скважин и исследуйте ее под микроскопом. Если наблюдаются клеточные сгустки, пропустите клеточную суспензию через клеточный сетчатый фильтр 70 мкМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это необязательный шаг. - Перенесите ячейки в центрифужную трубку 15 мл. Центрифужные ячейки при 200 х г в течение 5 мин до грануляционных ячеек. Удалите супернатант и повторно суспендируем их в 3 мл PBS, дополненных 2% FBS. Пипетка клеток вверх и вниз в 3–5 раз тщательно перемешать.
- Количество ячеек
- Добавьте 50 мкл клеточной суспензии в микроцентрифужную трубку 1,5 мл и смешайте ее с 50 мкл раствора трипанового синего цвета. Пипетку 10 мкл смеси подсчитывают количество живых клеток с помощью стандартного метода, такого как гемоцитометр.
- Разбавляют клетки в PBS, дополненные 2% FBS до конечной концентрации 1 х 106 клеток/мл. Добавьте 1 мл клеточной суспензии в пробирку с круглым дном полистирола 5 мл и подготовьте две пробирки для образцов.
2. Окрашивание клеток с помощью Hoechst 33342
- Добавьте Hoechst 33342 в одну пробирку, чтобы достичь соответствующей конечной концентрации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, соответствующая концентрация Hoechst 33342 составляет 3 мкг/мл для клеток MDA-MB-231. - Добавляют блокатор (например, фумитреморгин С, верапамил или резерпин) в другую пробирку до соответствующей конечной концентрации и инкубируют трубку при 37°С в течение 30 мин перед добавлением той же концентрации Hoechst 33342, как описано на этапе 2.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для ячеек MDA-MB-231 подходящим блокатором является резерпин (40 мкМ). Резерпин используется в качестве блокирующего элемента управления для проверки отсутствия ячеек в закрытой зоне SP. - Подготовьте несколько пробирок, содержащих клетки, и добавьте Hoechst 33342 к различным градиендокам концентрации. После анализа проточной цитометрии выберите правильную концентрацию в соответствии с профилем и пропорцией СП.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это необязательный шаг, используемый для определения правильной концентрации Hoechst 33342. - Подготовьте несколько пробирок, содержащих клетки, добавьте блокатор к различным градиентриям концентрации, инкубируйте пробирки при 37 °C в течение 30 мин, затем добавьте Hoechst 33342 до соответствующей концентрации. После анализа проточной цитометрии выберите правильную концентрацию в соответствии с отсутствием клеток в закрытой зоне SP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это необязательный шаг, используемый для определения правильной концентрации блокиратора. - Поместите трубки в инкубатор при 37 °C и инкубировать их в течение 60 мин, встряхивая трубки каждые 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательное встряхивание трубок важно для окрашивания, поскольку оно обеспечивает полный контакт между клетками и красителем для улучшения результатов окрашивания. - После инкубации центрифугируют клетки при 200 х г,4 °C в течение 5 мин, и тщательно аспирируют супернатант, потому что клетки образуют очень рыхлые и нестабильные гранулы.
- Повторно суспендировать клетки каждой трубки в 1 мл ледяного PBS, дополненного 2% FBS, и пипетку клеток вверх и вниз в 3-5 раз тщательно перемешать. Добавьте 1 мкл 1 мг/мл йодида пропидия (PI) к суспензии каждой трубки для идентификации мертвых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на этом этапе должны выполняться при 4 °C, чтобы ингибировать отток Hoechst 33342 из опухолевых клеток. Трубки должны быть защищены от прямого воздействия света.
3. Анализ методом проточной цитометрии
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по использованию программного обеспечения проточного цитометра (см. Таблицу материалов)описаны в этом разделе и на дополнительных рисунках 1–10.
- В программном обеспечении проточного цитометра нажмите кнопку FOLDER. Нажмите кнопку Эксперимент, затем выберите Новый эксперимент (Дополнительный рисунок 1A,B).
- Нажмите кнопку ОК. "Experiment_001" будет отображаться под ПАПКОЙ (Дополнительный рисунок 2A,B).
- Нажмите кнопку Experiment_001, чтобы изменить имя папки на определенное имя (например, "20191118-SP"). Нажмите кнопку Ввод. Новое имя ("20191118-SP") будет отображаться в папке FOLDER (дополнительный рисунок 3A,B).
- Нажмите кнопку «Новый образец», чтобы добавить образец в новую папку эксперимента («20191118-SP»). Нажмите кнопку Новая трубка, чтобы добавить трубку к образцу. Нажмите кнопку Стрелка (Дополнительный рисунок 4A-C).
- Нажмите кнопку Parameters (Параметры) и настройте параметры проточногоцитометра (Дополнительный рисунок 5).
- Используйте 610-нм дихроичное зеркальное короткопроходное (DMSP) для разделения длин волн излучения. Используйте фильтр BP 450/20 нм для сбора синей флуоресценции и EFLP 675 нм для сбора красной флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Hoechst 33342 возбуждается УФ-лазером на 355 нм, а PI возбуждается на 488 нм.
- Используйте 610-нм дихроичное зеркальное короткопроходное (DMSP) для разделения длин волн излучения. Используйте фильтр BP 450/20 нм для сбора синей флуоресценции и EFLP 675 нм для сбора красной флуоресценции.
- Запустите образцы клеток на проточной цитометр.
ПРИМЕЧАНИЕ: SP-клетки могут быть отсортированы с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) в стерильных условиях. В общей сложности 100 000-500 000 клеток должны быть собраны для последующих экспериментов.- Запустите клетки, окрашенные Hoechst 33342 на проточном цитометре.
- Поместите на цитометр трубки, содержащие клетки, окрашенные Hoechst 33342.
- Нажмите кнопку Dot Plot, чтобы отобразить точечный график, затем щелкните ось X и установите для нее значение «FSC-A»; щелкните ось Y и установите для нее значение "PI-A". Отображение точечной диаграммы области импульса прямого рассеяния (FSC-A, ось X, установленная в линейный режим) по сравнению с флуоресценцией PI (ось Y установлена на логарифмическую шкалу). Отрегулируйте напряжение, чтобы показать живые клетки в правой части и неживые клетки, которые ярко окрашены PI, в верхнем левом углу. Затем установите полигональные ворота для исключения мертвых клеток и клеточногомусора (рисунок 1A),нажав кнопку Polygon Gate для защиты подмножества P1, также известного как подмножество FSC-A, PI-A(дополнительный рисунок 6A,B).
- Нажмите кнопку Dot Plot, чтобы отобразить точечный график, щелкните ось X и установите для нее значение «FSC-A»; щелкните ось Y и установите для нее значение "FSC-W". Отображение точечной диаграммы FSC-A (ось X) и ширины импульса прямого рассеяния (FSC-W, ось Y). Щелкните правой кнопкой мыши точечный график, нажмите кнопку P1 под кнопкой Показать популяции. Нажмите кнопку Прямоугольные ворота, чтобы создать прямоугольный затвор для шлюза подмножества P2 (также известного как подмножество FSC-A, FSC-W). Это исключит ячейки с большими объемами(дополнительные рисунки 7A-C и 1A).
- Нажмите кнопку Dot Plot, чтобы отобразить точечный график, щелкните ось X и установите для нее значение «SSC-A»; щелкните ось Y и установите для нее значение "SSC-W". Отображение точечной диаграммы области импульса бокового рассеяния (SSC-A, ось X) и ширины импульса бокового рассеяния (SSC-W, ось Y). Щелкните правой кнопкой мыши точечный график и нажмите кнопку P2 в разделе Показать популяции. Затем нажмите кнопку «Прямоугольный затвор», чтобы создать прямоугольный затвор для шлюза подмножества P3 (также известного как подмножество SSC-A, SSC-W). Это позволит получить клеточную популяцию с равномерной гранулярностью(дополнительные рисунки 8A-C и 1A).
- Нажмите кнопку Dot Plot, чтобы отобразить точечный график, щелкните ось X и установите для нее значение "Hoechst Red-A"; щелкните ось Y и установите для нее значение "Hoechst Blue-A". Отображение точечного графика Hoechst Red-A (ось X) и Hoechst Blue-A (ось Y). Щелкните правой кнопкой мыши точечную диаграмму, нажмите кнопку P3 под кнопкой Показать популяции. Нажмите кнопку Polygon Gate, чтобы создать полигональные ворота для шлюза подмножества P4 (также известного как Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A подмножество). Щелкните правой кнопкой мыши точечную диаграмму, нажмите кнопку Показать иерархию населения, чтобы отобразить иерархию населения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точечный график покажет три различные популяции: 1) популяция фазы G0-G1 вблизи центра графика; 2) популяция фазы S-G2/M в правом верхнем углу; 3) СП. Затем SP загорожается для дальнейшего анализа(дополнительные рисунки 9A-D и 1A). Если точечный график Hoechst Red-A против Hoechst Blue-A не показывает профиль SP, аналогичный показанному на рисунке 1A,напряжения должны регулироваться до тех пор, пока не будет виден аналогичный профиль. Между тем, отрегулируйте все вышеуказанные ворота соответствующим образом. - После определения области затвора ячеек SP щелкните Получить данные, чтобы собрать 20 000–100 000 событий из каждого образца для анализа процента Ячеек SP(дополнительный рисунок 10).
- Запустите окрашенные Клетками Hoechst 33342, обработанными блокатором на проточном цитометре.
- Поместите трубки, содержащие блокиратор, на цитометр и запустите ячейки, используя те же напряжения и затворы, чтобы дополнительно проверить, правильно ли выбраны напряжения и затворы.
ПРИМЕЧАНИЕ: По сравнению с окрашиванием Hoechst 33342, только очень небольшая часть клеток, если таковая имеется, должна появиться в закрытой области SP(рисунок 1B). - Соберите 20 000–100 000 событий из каждого образца, чтобы проанализировать процент SP-клеток.
- Поместите трубки, содержащие блокиратор, на цитометр и запустите ячейки, используя те же напряжения и затворы, чтобы дополнительно проверить, правильно ли выбраны напряжения и затворы.
- Запустите клетки, окрашенные Hoechst 33342 на проточном цитометре.
4. Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по использованию программного обеспечения для анализа проточной цитометрии (см. Таблицу материалов)описаны в этом разделе и дополнительных рисунках 11–16.
- Скопируйте файлы в формате fcs на компьютер, откройте программное обеспечение для анализа проточной цитометрии и перетащите один файл образца в программное обеспечение(дополнительный рисунок 11A,B).
- Затворные ячейки и получение процента SP ячеек.
- Дважды щелкните этот образец файла,щелкните ось X и установите для него значение "FSC-A"; щелкните ось Y и установите для нее значение "PI-A". Затем создайте полигональные затворы и нажмите кнопку OK, чтобы получить подмножество FSC-A, PI-A(дополнительный рисунок 12A-E).
- Дважды щелкните файл подмножества FSC-A, PI-A,щелкните ось X и установите для него значение "FSC-A"; щелкните ось Y и установите для нее значение "FSC-W". Затем создайте прямоугольный затвор и нажмите кнопку OK, чтобы получить подмножество FSC-A, FSC-W(дополнительный рисунок 13A-E).
- Дважды щелкните файл подмножества FSC-A, FSC-W,щелкните ось X и установите для него значение "SSC-A"; щелкните ось Y и установите для нее значение "SSC-W". Затем создайте прямоугольный затвор и нажмите кнопку OK, чтобы получить подмножество SSC-A, SSC-W(дополнительный рисунок 14A-E).
- Дважды щелкните файл подмножества SSC-A, SSC-W,щелкните ось X и установите для него значение "Hoechst Red-A"; щелкните ось Y и установите для нее значение "Hoechst Blue-A". Затем создайте полигональные затворы и нажмите кнопку OK, чтобы получить подмножество Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A(дополнительный рисунок 15A-E).
- Откройте редактор макетов, нажав кнопку Открыть редактор макетов. Перетащите файл подмножества SSC-A, SSC-W в редактор макетов, затем нажмите кнопку Щелкните, чтобы сохранить окно макета в файл, чтобы сохранить результаты изображения(Дополнительный рисунок 16A-C).
- Сохраните рабочую область, чтобы сохранить информацию о защите при закрытии программного обеспечения.
- Выполняйте анализ t-тестов с помощью программного обеспечения для статистического анализа, чтобы сравнить разницу между двумя группами. Значение P < 0,05 было определено как статистически значимое.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
По этому методу были проведены четыре экспериментальных анализа СП. В первом мы обнаружили долю SP-клеток в MDA-MB-231, который является тройной отрицательной клеточной линией рака молочной железы человека, в нормальных условиях. После подсчета клеток Hoechst 33342 добавляли в одну трубку, содержащую 1х 10 6 клеток до конечной концентрации 3 мкг/мл. Резерпин и Hoechst 33342 добавляли в другую пробирку до конечных концентраций 40 мкМ и 3 мкг/мл соответственно. PI был добавлен в обе трубки. Точечный график FSC-A (ось X) против PI-A (ось Y) показал три популяции: 1) PI-положительную популяцию клеток, которая представляла мертвые клетки; 2) клеточный мусор; и 3) основной популяцией были PI-отрицательные клетки, которые подвергались дальнейшему анализу(рисунок 1А,В). Для анализа доли sp-клеток использовалась одноячечная популяция, закрытая от точечного графика FSC-A (ось X) против FSC-W (ось Y) и точечногографика SSC-A (ось X) против SSC-W (ось Y) (ось Y). Ячейки SP были закрыты от точечного графика Hoechst Red-A (ось X) против Hoechst Blue-A (ось Y), и их процент составил около 0,9% в ячейках MDA-MB-231(рисунок 1A). Тем не менее, Резерпин значительно уменьшил долю клеток SP(рисунок 1B),подтверждая, что окраска ворот для SP является правильной.
Второй эксперимент заключался в определении подходящей концентрации окрашивания Hoechst 33342 в клетках MDA-MB-435. После подсчета клеток Hoechst 33342 добавляли к 1 х10 6 клеткам, которые были суспендированы в 1 мл PBS, дополненных 2% FBS, к различным градиеннорам концентрации, включая 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 и 4 мкг/мл. Как показано на рисунке 2А,когда концентрация Hoechst 33342 была слишком низкой (т.е. 0,5, 1, 1,5 мкг/мл), было трудно отличить SP-клетки от других клеточных популяций, потому что многие клетки находились в тускло окрашенном состоянии. Когда концентрация Hoechst 33342 была слишком высокой (т.е. 2,5, 3, 3,5, 4 мкг/мл), доля SP-клеток уменьшалась до тех пор, пока она не исчезла. Таким образом, 2 мкг/мл Hoechst 33342 была лучшей концентрацией для АНАЛИЗА SP в клетках MDA-MB-435. Кроме того, для определения правильного блокатора для этой клеточной линии Hoechst 33342 и блокатор (Верапамил или Резерпин) добавляли к 1 х 106 клеткам, которые были суспендированы в 1 мл PBS, дополненного 2% FBS, до конечных концентраций 2 мкг/мл и 40 мкМ соответственно. Как показано на фиг.2В,около 0,4% клеток вытесняют краситель после лечения верапамилом. Однако после лечения резерпином соотношение снизилось примерно до 0,1%(рисунок 2C). Из этого эксперимента Резерпин считался более подходящим блокатором для этой клеточной линии.
В третьем примере клетки A549 (клетки аденокарциномы легкого человека) предварительно обработали активатором STAT3-Коливелином20 (100 нМ) в течение 48 часов (h). Сигнальный путь STAT3 важен для продвижения стволовых особенностей опухолевых клеток21. Как показано на рисунке 3,доля SP-клеток увеличивалась при стимуляции коливелином.
В последнем примере клетки T47D (клетки рака молочной железы человека) предварительно обработали ингибитором FRA1 0,1 мкМ-SKLB816 (также называемым 13an) в течение 48 ч22. FRA1 является зарегистрированным привратником эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМТ) и участвует в регуляции стволовой опухоли23. Как показано на фиг.4,доля SP-клеток уменьшилась из-за лечения ингибитором FRA1.
Рисунок 1: Стратегия гастировки клеток MDA-MB-231 в SP-анализе. (A)Стратегия гаширования клеток MDA-MB-231, которые были окрашены Hoechst 33342 (3 мкг/мл) и йодида пропидия (PI, 1 мкг/мл). (B)Стратегия гаширования клеток MDA-MB-231, которые обрабатывали резерпином (40 мкМ) и окрашивали Hoechst 33342 (3 мкг/мл) и PI (1 мкг/мл). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Оптимизация концентрации Hoechst 33342 и выбор блокатора в ячейках MDA-MB-435. (A) Результаты анализа SP клеток MDA-MB-435, которые были окрашены Hoechst 33342 (Hoechst) при различных градиентах концентрации (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 мкг/мл) вместе с PI (1 мкг/мл). (B) Результат анализа SP клеток MDA-MB-435, которые обрабатывали верапамилом (40 мкМ) и окрашивали Hoechst 33342 (2 мкг/мл) и PI (1 мкг/мл). (C)Результат анализа SP клеток MDA-MB-435, которые обрабатывали резерпином (40 мкМ) и окрашивали Hoechst 33342 (2 мкг/мл) и PI (1 мкг/мл). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Доля SP-клеток была увеличена активатором STAT3 в ячейках A549. (A)Результаты анализа SP ячеек A549, предварительно обработанных активатором STAT3-Коливелином (100 нМ) или его управлением транспортным средством (Ctrl)-H2O в течение 48 ч. Клетки A549, обработанные Резерпином (45 мкМ), использовались в качестве блокирующего контроля. Клетки A549 окрашивали Hoechst 33342 (7 мкг/мл) и PI (1 мкг/мл). (B)Статистические результаты доли SP-клеток в клетках A549, обработанных коливелином (100 нМ), и его контроле транспортного средства. Данные представлены в виде среднего + стандартной погрешности среднего (SEM), n = 3 для каждой группы. "*" означает P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Доля SP-клеток ингибировалась ингибитором FRA1 в клетках T47D. (A) Результаты анализа SP клеток T47D, предварительно обработанных SKLB816 (0,1 мкМ) или его управлением транспортным средством (Ctrl)-DMSO в течение 48 ч. В качестве блокирующего контроля использовали клетки T47D, обработанные резерпином (40 мкМ). Клетки T47D окрашивали Hoechst 33342 (8 мкг/мл) и PI (1 мкг/мл). (B) Статистические результаты доли SP-клеток в клетках T47D, обработанных SKLB816 (0,1 мкМ) и его контроле транспортного средства. Данные представлены в виде среднего + SEM, n = 3 для каждой группы. "*" означает P < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Инструкции к программному потого цитометра шаг No 3.1. (A) Нажмите кнопку ПАПКА. (B) Нажмите кнопку Эксперимент, а затем нажмите кнопку Новый эксперимент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 2: Инструкции к программному обеспечению проточного цитометра шаг No 3.2. (A) Нажмите кнопку OK. (B) Experiment_001 отображается в папке ПАПКА. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 3: Инструкции к программному обеспечению проточного цитометра шаг No 3.3. (A) Нажмите кнопку Experiment_001, чтобы изменить имя Experiment_001 на определенное имя (например, «20191118-SP»). (B) Нажмите кнопку Enter. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 4: Инструкции для программного обеспечения проточного цитометра шаг No 3.4. (A) Нажмите кнопку Новый образец. (B) Нажмите кнопку New Tube( Новая трубка. (C) Нажмите кнопку Стрелка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 5: Инструкции для программного обеспечения проточного цитометра шаг No 3.5. (A) Нажмите кнопку Параметры, чтобы настроить параметры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 6: Инструкции для программного обеспечения проточного цитометра шаг No 3.6.1.2. (A) Нажмите кнопку Dot Plot, чтобы отобразить точечный график, щелкните ось X и установите для нее значение "FSC-A"; нажмите на ось Y и установите для нее значение "PI-A". (B) Нажмите кнопку Polygon Gate, чтобы создать полигональные ворота для шлюза подмножества P1 (также известного как подмножество FSC-A, PI-A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 7: Инструкции к программному обеспечению проточной цитометрии шаг No 3.6.1.3. (A) Нажмите кнопку Dot Plot, чтобы отобразить точечный график, щелкните ось X и установите для нее значение "FSC-A"; нажмите на ось Y и установите для нее значение "FSC-W". (B) Щелкните правой кнопкой мыши точечный график и нажмите кнопку P1 в разделе Показать популяции. (C) Нажмите кнопку Прямоугольный затвор, чтобы создать прямоугольный затвор для шлюза подмножества P2 (также известного как подмножество FSC-A, FSC-W). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 8: Инструкции для программного обеспечения проточных цитометров шаг No 3.6.1.4. (A) Нажмите кнопку Dot Plot, чтобы отобразить точечный график, щелкните ось X и установите для нее значение "SSC-A"; щелкните ось Y и установите для нее значение "SSC-W". (B) Щелкните правой кнопкой мыши точечный график и нажмите кнопку P2 под кнопкой Показать популяции. (C) Нажмите кнопку Прямоугольный затвор, чтобы создать прямоугольный затвор для шлюза подмножества P3 (также известного как подмножество SSC-A, SSC-W). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 9: Инструкции для программного обеспечения проточного цитометра шаг No 3.6.1.5. (A) Нажмите кнопку Dot Plot, чтобы отобразить точечный график, щелкните ось X и установите для нее значение "Hoechst Red-A"; щелкните ось Y и установите для нее значение "Hoechst Blue-A". (B) Щелкните правой кнопкой мыши точечный график и нажмите кнопку P3 под кнопкой Показать популяции. (C) Нажмите кнопку Polygon Gate, чтобы создать полигональные ворота для шлюза подмножества P4 (также известного как Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A подмножество). (D) Щелкните правой кнопкой мыши точечный график, затем нажмите кнопку Показать иерархию населения, чтобы отобразить иерархию населения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 10: Инструкции для программного обеспечения проточного цитометра шаг No 3.6.1.6. (A) Нажмите кнопку «Получить данные», затем соберите 20 000–100 000 событий из каждого образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 11: Инструкции по программному анализу проточной цитометрии шаг No 4.1. (A) Откройте программное обеспечение для анализа проточной цитометрии и перетащите один файл образца в программное обеспечение. (B) Образец файла импортирован. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 12: Инструкции по программному анализу проточной цитометрии шаг No 4.2.1. (A) Дважды щелкните этот образец файла. (B) Щелкните ось X и установите для него значение "FSC-A"; щелкните ось Y и установите для нее значение "PI-A". (C) Нажмите кнопку Создать полигональные ворота, чтобы создать полигональные ворота. (D) Нажмите кнопку OK, чтобы получить подмножество FSC-A, PI-A. (E) Получено подмножество FSC-A, PI-A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 13: Инструкции по программному анализу проточной цитометрии шаг No 4.2.2. (A) Дважды щелкните файл подмножества FSC-A, PI-A. (B) Щелкните ось X и установите для него значение "FSC-A"; щелкните ось Y и установите для нее значение "FSC-W". (C) Нажмите кнопку Создать прямоугольный затвор, чтобы создать прямоугольный затвор. (D) Нажмите кнопку OK, чтобы получить подмножество FSC-A, FSC-W. (E) Получено подмножество FSC-A, FSC-W. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 14: Инструкции по программному анализу проточной цитометрии шаг No 4.2.3. (A) Дважды щелкните файл подмножества FSC-A, FSC-W. (B) Щелкните ось X и установите для него значение "SSC-A"; щелкните ось Y и установите для нее значение "SSC-W". (C) Нажмите кнопку Создать прямоугольные ворота, чтобы создать прямоугольные ворота. (D) Нажмите кнопку OK, чтобы получить подмножество SSC-A, SSC-W. (E)Получено подмножество SSC-A, SSC-W. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 15: Инструкции по программному анализу проточной цитометрии шаг No 4.2.4. (A) Дважды щелкните файл подмножества SSC-A, SSC-W. (B) Щелкните ось X и установите для него значение "Hoechst Red-A"; щелкните ось Y и установите для нее значение "Hoechst Blue-A". (C) Нажмите кнопку Создать полигональные ворота, чтобы создать полигональные ворота. (D) Нажмите кнопку OK, чтобы получить подмножество Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A. (E) Получено подмножество Hoechst Red-A, Hoechst Blue-A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Дополнительный рисунок 16: Инструкции по программному анализу проточной цитометрии шаг No 4.2.5. (A) Нажмите кнопку Открыть редактор макета, чтобы открыть редактор макета. (B) Перетащите файл примера подмножества SSC-A, SSC-W в редактор макета. (C) Нажмите кнопку Щелкните, чтобы сохранить окно макета в файл, чтобы сохранить результаты изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько ключевых моментов, которые следует иметь в виду для анализа SP. Во-первых, это выбор правильного блокиратора, такого как Верапамил или Резерпин, для каждой клеточной линии, потому что «затворное» расположение КЛЕТОК SP определяется в соответствии с положением, в котором большое количество SP-клеток исчезает после добавления блокатора. Для клеточной линии MDA-MB-231 reserpine работает хорошо. Однако для других клеточных линий различные блокаторы могут работать лучше.
Вторая — концентрация Hoechst 33342. Процент SP-клеток увеличивался по мере снижения концентрации окрашивания Hoechst 33342, как показали репрезентативные данные. Это явление можно объяснить кинетикой поглощения красителя24. Изменения концентрации красителя влияют на обогащение Hoechst 33342 в клетках. Таким образом, концентрация окрашивания Hoechst 33342 тесно связана с результатами анализа SP. Кроме того, поглощение и изгнание Hoechst 33342 варьируются между типами клеток. Таким образом, надлежащие концентрации Hoechst 33342 должны быть изучены для различных клеточных линий перед анализом SP.
Третьим является хороший коэффициент вариации (CV) проточный цитометр, который также критичен для анализа SP25. Мощность УФ-лазера является важным критерием для улучшения резюме12. Этот протокол использует коммерческий проточные цитометры (см. Таблицу материалов)для выполнения анализа SP. В этом инструменте с кюветными проточными ячейками мы использовали ультрафиолетовый лазер мощностью 15 мВт, чтобы получить лучшие резюме. В целом, относительно высокая мощность УФ-лазера обеспечивает оптимальные резюме. Например, 50–100 мВт обеспечивают оптимальный сигнал Хохста на реактивных воздушных приборах12. Некоторые лазеры обеспечивают более низкую УФ-мощность, что может снизить резюме. В этих случаях хорошее лазерное выравнивание имеет решающее значение.
Последнее – это влияние других факторов во время эксперимента. Состояние клеток, температура, время окрашивания, работа проточной цитометрии и другие факторы также могут влиять на пропорцию и качество анализа SP. Например, изменения жизнеспособности клеток во время приготовления клеточных суспензий будут влиять на соотношение SP-клеток. Поэтому перед выполнением анализа СП необходимо изучить наилучшие экспериментальные условия. Учитывая вышеуказанные факторы, отношение SP одной и той же клеточной линии, измеренное разными лабораториями, может быть различным. Например, сообщалось, что пропорции клеток MDA-MB-231 и A549 составляют ~0,1%-4,8%26,27,28,29 и ~0,8%-18%30,31,32,33,34соответственно.
Исследователи могут модифицировать этот анализ для различных применений, таких как изучение других линий опухолевых клеток или опухолевых клеток, полученных от первичного пациента. Если протокол не работает хорошо для тестируемых клеток, исследователи могут использовать клетки MDA-MB-231 в качестве положительного контроля и окрашивать клетки в соответствии с заданными спецификациями. Поскольку этот протокол очень чувствителен к концентрации Hoechst 33342, температуре окрашивания и времени и т. Д., Исследователи должны тщательно проверить все эти условия. Процент SP во многих типах опухолевых клеточных линий человека относительно низок (~ 0%–37%)19,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Если наблюдается чрезмерно высокий или низкий процент SP, это может быть связано с неподходящими концентрациями Hoechst 33342 или используемого блокатора. Если проблема, по-видимому, связана с проточным цитометром, следует получить техническую поддержку.
Хотя использование SP для анализа и разделения CSC является высокоэффективным, оно все же имеет определенные ограничения. Во-первых, это его высокая чувствительность к условиям окрашивания12. Многие факторы, такие как концентрация Hoechst 33342, состояние клеток, температура, время окрашивания, работа проточной цитометрии и выбор блокатора, могут влиять на качество анализа SP. Второй – цитотоксический эффект Hoechst 33342. Hoechst 33342 является ДНК-связывающим красителем, но токсичен для клеток, когда он достигает высоких концентраций и, таким образом, снижает активность клеток37.
Таким образом, АНАЛИЗ СП является одним из наиболее часто используемых методов в последние годы для выявления и очистки CSC в линиях опухолевых клеток. Хотя метод имеет некоторые ограничения, в отсутствие конкретных поверхностных маркеров CSC он по-прежнему является методом удобного, быстрого и экономически эффективного обогащения CSC. Этот метод полезен для изучения биологических функций ЦОК и для идентификации специфических поверхностных маркеров. Более того, обнаруживая влияние различных сигналов на отношение SP опухолевых клеток, он может дать ключи к регуляторному влиянию этих сигнальных путей на особенности CSC и облегчить открытие новых механизмов, которые в конечном итоге могут направлять таргетную терапию опухолей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Фондом естественных наук Китая 81572599, 81773124 и 81972787; Фонд естественных наук города Тяньцзинь (Китай) 19JCYBJC27300; Тяньцзиньская народная больница и Грант на совместные исследования Университета Нанькай 2016rmnk005; Фонды фундаментальных исследований для центральных университетов, Нанькайского университета 63191153.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5 mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino] -2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
References
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Batlle, E., Clevers, H.
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death & Differentiation. 15 (3), 504-514 (2008).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathologica. 50 (4), 357-368 (2012).
- Bailey, J. M., et al. DCLK1 marks a morphologically distinct subpopulation of cells with stem cell properties in preinvasive pancreatic cancer. Gastroenterology. 146 (1), 245-256 (2014).
- Hurt, E. M., Kawasaki, B. T., Klarmann, G. J., Thomas, S. B., Farrar, W. L. CD44+ CD24(-) prostate cells are early cancer progenitor/stem cells that provide a model for patients with poor prognosis. British Journal of Cancer. 98 (4), 756-765 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Schulenburg, A., et al. Cancer stem cells in basic science and in translational oncology: can we translate into clinical application. Journal of Hematology & Oncolcology. 8, 16 (2015).
- Park, J. W., Park, J. M., Park, D. M., Kim, D. Y., Kim, H. K. Stem Cells Antigen-1 Enriches for a Cancer Stem Cell-Like Subpopulation in Mouse Gastric Cancer. Stem Cells. 34 (5), 1177-1187 (2016).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Goodell, M. A. Stem cell identification and sorting using the Hoechst 33342 side population (SP). Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit9 18 (2005).
- Begicevic, R. R., Falasca, M. ABC Transporters in Cancer Stem Cells: Beyond Chemoresistance. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362 (2017).
- Rabindran, S. K., Ross, D. D., Doyle, L. A., Yang, W., Greenberger, L. M. Fumitremorgin C reverses multidrug resistance in cells transfected with the breast cancer resistance protein. Cancer Research. 60 (1), 47-50 (2000).
- Takara, K., et al. Differential effects of calcium antagonists on ABCG2/BCRP-mediated drug resistance and transport in SN-38-resistant HeLa cells. Molecular Medicine Reports. 5 (3), 603-609 (2012).
- Matsson, P., Pedersen, J. M., Norinder, U., Bergstrom, C. A., Artursson, P. Identification of novel specific and general inhibitors of the three major human ATP-binding cassette transporters P-gp, BCRP and MRP2 among registered drugs. Pharmaceutical Research. 26 (8), 1816-1831 (2009).
- Challen, G. A., Little, M. H. A side order of stem cells: the SP phenotype. Stem Cells. 24 (1), 3-12 (2006).
- Wu, C., Alman, B. A. Side population cells in human cancers. Cancer Letters. 268 (1), 1-9 (2008).
- Patrawala, L., et al. Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic. Cancer Research. 65 (14), 6207-6219 (2005).
- Yamada, M., et al. Nasal Colivelin treatment ameliorates memory impairment related to Alzheimer's disease. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 2020-2032 (2008).
- Marotta, L. L., et al. The JAK2/STAT3 signaling pathway is required for growth of CD44(+)CD24(-) stem cell-like breast cancer cells in human tumors. Journal of Clinical Investigation. 121 (7), 2723-2735 (2011).
- Zhang, C. H., et al. From Lead to Drug Candidate: Optimization of 3-(Phenylethynyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine Derivatives as Agents for the Treatment of Triple Negative Breast Cancer. Journal of Medicnal Chemistry. 59 (21), 9788-9805 (2016).
- Tam, W. L., et al. Protein kinase C alpha is a central signaling node and therapeutic target for breast cancer stem cells. Cancer Cell. 24 (3), 347-364 (2013).
- Ibrahim, S. F., Diercks, A. H., Petersen, T. W., van den Engh, G. Kinetic analyses as a critical parameter in defining the side population (SP) phenotype. Experimental Cell Research. 313 (9), 1921-1926 (2007).
- Petriz, J. Flow cytometry of the side population (SP). Current Protocol in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 23 (2013).
- Hiraga, T., Ito, S., Nakamura, H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhibits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential. Oncology Reports. 25 (1), 289-296 (2011).
- Shen, W., et al. ICAM3 mediates inflammatory signaling to promote cancer cell stemness. Cancer Letters. 422, 29-43 (2018).
- Koh, S. Y., Moon, J. Y., Unno, T., Cho, S. K. Baicalein Suppresses Stem Cell-Like Characteristics in Radio- and Chemoresistant MDA-MB-231 Human Breast Cancer Cells through Up-Regulation of IFIT2. Nutrients. 11 (3), 624 (2019).
- Lee, H., Park, S., Kim, J. B., Kim, J., Kim, H. Entrapped doxorubicin nanoparticles for the treatment of metastatic anoikis-resistant cancer cells. Cancer Letters. 332 (1), 110-119 (2013).
- Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Science. 107 (4), 433-443 (2016).
- Wei, H., et al. The mechanisms for lung cancer risk of PM2.5 : Induction of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell properties in human non-small cell lung cancer cells. Environmental Toxicology. 32 (11), 2341-2351 (2017).
- Prasanphanich, A. F., White, D. E., Gran, M. A., Kemp, M. L. Kinetic Modeling of ABCG2 Transporter Heterogeneity: A Quantitative, Single-Cell Analysis of the Side Population Assay. PLoS Computational Biology. 12 (11), 1005188 (2016).
- Han, H., et al. An endogenous inhibitor of angiogenesis inversely correlates with side population phenotype and function in human lung cancer cells. Oncogene. 33 (9), 1198-1206 (2014).
- Loebinger, M. R., Sage, E. K., Davies, D., Janes, S. M. TRAIL-expressing mesenchymal stem cells kill the putative cancer stem cell population. British Journal of Cancer. 103 (11), 1692-1697 (2010).
- Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Chen, A. Y., Yu, C., Gatto, B., Liu, L. F. DNA minor groove-binding ligands: a different class of mammalian DNA topoisomerase I inhibitors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 90 (17), 8131-8135 (1993).
