Summary
このプロトコルの全体的な目標は、マウスアストロサイトおよびミクログリア細胞を中枢神経系から抽出、維持、解離し、続いて原虫寄生虫に感染する方法を指示することである。
Abstract
アストロサイトとミクログリアは、最も豊富なグリア細胞です。彼らは中枢神経系(CNS)における生理学的支援およびホメオスタシスの維持を担当する。感染症の制御に関与した証拠の増加は、CNSに影響を与える感染症に対する彼らの反応を評価するために、原発性アストロサイトおよびミクログリアを分離する方法論の改善に対する新たな関心を正当化する。CNSにおけるトリパノソーマ・クルジ(T.クルジ)およびトキソプラズマ・ゴンディ(T.ゴンディ)感染の影響を考慮して、ここではマウスアストロサイトおよびミクログリア細胞を原虫寄生虫で抽出、維持、解別、感染させる方法を提供する。新生児皮質から抽出された細胞は、周期的な差動培地交換で14日間インビトロで維持される。アストロサイトとミクログリアは、機械的解離により同じ抽出プロトコルから得られる。フローサイトメトリーによるフェノタイピングの後、細胞は原虫寄生虫に感染する。感染率は異なる時点での蛍光顕微鏡によって決定され、したがって、原虫の浸潤および複製を制御するグリア細胞の差動能力の評価を可能にする。これらの技術は、感染症に対するアストロサイトおよびミクログリアの応答を研究するための簡単で安価で効率的な方法を表し、さらなる神経免疫学分析のための分野を開く。
Introduction
CNSは主にニューロンとグリア細胞11、2、32で3構成されています。ミクログリアおよびアストロサイトは、CNSにおいて最も豊富なグリア細胞である。ミクログリアは、マクロファージの居住者であり、CNS3,4における免疫担当および貪食性グリア細胞3であり、4一方、アストロサイトは恒常性を維持し、支持機能を発揮する役割を担う。
,グリア細胞は、ニューロン6,77の支持と保護を担う古典的な役割を6担っていると公知であるにもかかわらず、これらの細胞の新たな機能は、感染88、9、10、119,10に対するそれらの応答を含む最近の文献に記載されている。11したがって、これらのグリア細胞を分離してそれらの機能を個別に理解する方法を開発するプッシュがあります。
不死化細胞系や生体内モデルなど、一次培養ではなくグリア細胞を研究するための代替モデルがいくつかあります。しかし、不死化細胞は遺伝的漂流および形態学的変化を受ける可能性が高く、生体内研究では限られた操作条件を課す。逆に、一次培養は扱いやすく、生体細胞に似ており、実験因子12,13,13を制御することもできます。ここでは、同じプロトコルでマウスアストロサイトおよびミクログリア一次細胞を抽出、維持、解別する方法に関するガイドラインを説明する。また、これらの培養物における原虫感染の働き方についても紹介しています。
新生児マウスから抽出したCNS細胞(3日齢まで)を、アストロサイトおよびミクログリア細胞の優等成長を可能にする微分培地上で14日間培養した。ミクログリアは付着した星状細胞の上に残るため、細胞集団は軌道インキュベーターで機械的に解光された。次に、ミクログリアを含む上澄みをすべて採取し、トリプシンを添加してアストロサイトを取り外した。単離グリア細胞をフローサイトメトリーにより平年的に評価し、所望の実験に従ってめっきした。
我々はまた、原生動物寄生虫にこれらの孤立したミクログリアおよびアストロサイトに感染する方法の例を提供した。T. gondiiはトキソプラズマ症14を担う非常に神経性のプロトゾアンであり、T. cruzi は CNS15, 16,16における神経疾患の発症につながる可能性があるシャーガス病の原因です。さらに、T. gondii17,18またはT. cruzi19,20,,21による感染が免疫不全患者の推定死因であったことも報告されています。したがって、原生動物感染を制御する上でのCNSからのグリア細胞の免疫学的役割の解明は非常に重要である。
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Protocol
マウスを含むすべての実験的手順は、ブラジルの国家法(11.794/2008)に従って行われ、サンパウロ連邦大学(UNIFESP)の機関動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. グリア細胞の抽出、維持、解離
注: グリア細胞抽出に使用されるマウスの数は、目的の実験を行うために必要な細胞の量によって異なります。このプロトコルでは、合計2.7 x 10 7アストロサイトと4 x 10 6ミクログリアが6匹の新生児C57BL/6マウスから得られた。6すべての手順は、クラスIIバイオセーフティキャビネットで無菌状態で行われた。
- 1日目
- 純粋なハンクのバランス塩溶液(HBSS)とHBSS + 熱不活性化ウシ血清(FBS)の10%を準備します(材料表を参照)。
- 補足されたダルベッコの修正イーグルミディアム(DMEM)/F12(10%FBS + 0.08 mMペニシリン+ 0.09 mMストレプトマイシン+ 0.09 mmstreptomycin + 12.5 mM HEPES + 30 mMナトリウム炭酸ナトリウム、pH 7.2)を準備し、0.22μmフィルターでフィルタリングします(材料の表を参照)。
注:すべての培養培地は4°Cで保存する必要がありますが、実験を開始する前に37°Cで20分間プリウォームする必要があります。 - オートクレーブ内のすべての手術器具(はさみ、へら、ピンセット)を殺菌し、処置の間に70%エタノールを使用する。
- イゾフルランを浸した綿を含む密閉されたチャンバーに新生児(3日まで)マウスを5分間入れて深遠な麻酔をします。
- 70%エタノールでマウスの子犬をスプレーし、はさみで動物を切断します。
- 頭蓋骨に沿ってはさみで矢状カット(前部に後ろ)を作り、それを開いて脳を露出させます。ピンセットを使用して頭蓋を脳から分離します。脳の完全性を維持するためにマイクロヘラを使用して脳を削除します。.
- 乾燥したペトリ皿(直径6cm)に脳を入れます。マイクロヘラを使用して嗅球と小脳を取り除きます。HBSS + 10% FBS (2 mL/ペトリ皿) を含む別のペトリ皿(直径6cm)に皮質を移動します。
- 滅菌はさみで小片に脳組織をカットし、p1000マイクロピペットを使用して、HBSS + 10%FBSを持つ各脳組織を異なる15 mL円錐形チューブに移します。最終容積が2 mL/チューブであることを確認します。ない場合は、HBSS + 10% FBS を使用して完了します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。その場合、CNS組織を有する円錐管は、1時間までの氷の上に置かれなければならない。 - 切断した脳組織を3 mLのHBSS + 10%FBS(チューブあたり)で洗浄し、デカンテーション後に洗います。上清を慎重に取り除いてください。この手順を 3 回繰り返します。
注:このステップは、破片を除去し、抽出された組織を回復することを目的としています。 - 切断した脳組織を3 mLの純粋なHBSS(チューブあたり)で洗浄し、デカンテーション後、上清を慎重に除去します。この手順を 3 回繰り返します。
注:このステップは、細胞が次のステップでトリプシン化されるように、以前のスケミから残りの血清を除去することを目的としています。 - 1チューブあたり3mLのトリプシンを加え、37°Cの水浴に30分間静かに振り、5分ごとにチューブを振り回します。
注:このステップは、収集した組織を消化することを目的としています。 - トリプシンを不活性化するには、HBSS + 10%FBSのチューブあたり3mLで組織を洗浄し、組織の脱栓後、上清を慎重に除去する。この手順を 3 回繰り返します。
- 純粋なHBSSのチューブあたり3 mLで組織を洗浄し、慎重に上清を除去します。この手順を 2 回繰り返します。
- 純粋なHBSSの管あたり7 mLを加え、ピペットの連続した通路を通して組織を均質化する:最初に10 mL血清学的ピペットで、次いで5 mL、最後にp1000マイクロピペットで。
- 均質化後、遠心管を4°Cで5分間450xgで行う。 g
- 上清を捨て、4 mLのHBSS + 1管10%FBSでペレットを再懸濁します。
- 細胞を前処理したT-75フラスコに移して、最適な細胞培養接着を行う(材料表を参照)。
注:フラスコごとの各動物から組織を処理します。 - フラスコを37°Cで、5%CO2で30分間付着2します。
- 1 フラスコあたり 10 mL の DMEM/F12 を加え、37 °C と 5% CO2でインキュベートします。
注意:最終ボリュームはフラスコあたり14 mLです。
- 3日目
- T-75フラスコから7mLの培養培地を取り出し、新鮮な補充されたDMEM/F12の7 mLを加えます。
注:フラスコには、多くの細胞の破片と曇りの外観が含まれます。
- T-75フラスコから7mLの培養培地を取り出し、新鮮な補充されたDMEM/F12の7 mLを加えます。
- 5日目
- T-75フラスコからすべての培地を取り出し、新鮮な補充されたDMEM / F12の14 mLを追加します。
注:媒体は破片および非付着細胞を取除くためにフラスコから取り替えられる。 - 各48時間後、上清の6mLを除去し、培養14日目まで新鮮な補充DMEM/F12培地の7 mLを加える。
- T-75フラスコからすべての培地を取り出し、新鮮な補充されたDMEM / F12の14 mLを追加します。
- 14日目
- 上清の6 mLを除去し、新鮮な補充DMEM/F12培地の7 mLを加えた後、T-75フラスコをしっかりと閉じます。
- 200 rpm と 37 °C の床軌道シェーカーに一晩置き、天文学からミクログリアを機械的に解離します。
- 15日目
- シェーカーからフラスコを取り出し、細胞解離を最適化し、ミクログリアの最大数を収穫するために、独自の媒体で精力的に洗浄します。次いで、上清(ミクログリアを含む)を回収し、50mL円錐管に移す。
- 次に、各フラスコに4mLのトリプシンを加え、アストロサイトを剥離するために37°Cで5分間インキュベートする。
- トリプシンを不活性化するために、補充されたDMEM / F12のフラスコあたり5 mLを加えます。独自の媒体でフラスコを洗浄し、50 mL円錐管に内容物を移します。
- 遠心分離機 450 x gで解約したミクログリアとアストロサイトを含む全てのチューブを 4 °Cで 5 分間行う。
- 上清を捨てます。マイクログリアペレットを1 mLに、アストロサイトを10mLのDMEM/F12を再懸濁します。
- ノイバウアーチャンバーまたは自動セルカウンターでセルカウントに進みます。適切な平底細胞培養プレートで所望の密度で補充されたDMEM/F12をセルにプレートする(最適な細胞付着のために前処理;材料表を参照)。細胞を37°Cでインキュベートし、24時間CO2で5%のCO2をインキュベートし、それらを取り付けることができます。
注:各細胞集団の1.5 x 106を予約し、フローサイトメトリーによって純度を確認してください。 - フローサイトメトリック解析を実行して、細胞集団の純度を検証します。
注: マイクログリア CD11b+/CD45+/GFAP-およびアストロサイト CD11b-/CD45-/GFAP+を検討します。Iba1およびTMEM119染色は、ミクログリア22を完全に特徴付けるために考慮されるかもしれない。 - フローサイトメトリーアッセイの制御として、FMO(蛍光マイナス1)23および各細胞集団(占星術およびミクログリア)に対する未染色サンプルを加える。
- 各細胞集団について、染色されたサンプルと染色されていないサンプルごとに5 x 105個のセルを予約します。FMOの場合、2.5 x 105細胞を含むミクログリアの他の2つのチューブを予約し、さらに5 x 105アストロサイトの別のチューブを予約します。
注意: ミクログリア数は制限因子となり得るため、染色されていないコントロールやFMOコントロールに使用するセルは少なくなります。 - 遠心分離機 450 x gで 4 °C で 5 分間すべてのマイクロチューブ。上清を捨てて、FACSバッファー(リン酸緩衝生理食塩分(PBS)+0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)+2 mM EDTA、pH 7.2)の500 μL/マイクロチューブでペレットを再懸濁します。
- 4°Cで450 x gのすべてのマイクロチューブを5分間遠心分離し、上澄み液を捨て、100 μL/マイクロチューブの抗CD16/CD32(クローン93)(1:50)をFACSバッファーで希釈してペレットを再中断します。室温で10分間インキュベートします。
- 5分間4°Cで450 x gでFACSバッファーの500 μL/マイクロチューブを加えます。再懸濁アストロサイトおよびミクログリア染色チューブおよび50 μL/マイクロチューブの表面マーカーミックス付きのアストロサイトFMOチューブ:抗CD45(PE、クローン30-F11)および抗CD11b(eFluor 450、クローンM1/70)(FACSバッファで1:100で希釈)。
- 染色されていないセルの場合は、同じ量の FACS バッファで再中断します。ミクログリアFMOの場合は、各マイクログリアチューブに抗CD45または抗CD11bをインキュベートし、4°Cで全てのサンプルを暗闇の中で20分間インキュベートします。
- マイクロチューブあたり500 μLのFACSバッファを追加します。450 x gで 4 °C で 5 分間遠心分離機 400 x G 上清を捨て、100 μL/マイクロチューブの固定バッファー (材料表を参照) で、暗い室温で 20 分間ペレットを再中断します。
- 500 μL/マイクロチューブのパーメビライゼーションバッファー 1x (材料表を参照) を加え、暗闇の中で 5 分間 4 °C でインキュベートします。
- 4°Cで450×gで全てのマイクロチューブgを5分間遠心分離します。細胞内抗体抗体の50 μL/マイクロチューブを有するアストロサイトおよびミクログリアFMOチューブを1x透過バッファーで1:100希釈で再懸濁します。染色されていない細胞およびアストロサイトFMOの場合、同じ量のFACSバッファーを持つ細胞を再中断します。4°Cで全てのサンプルを暗闇の中で30分間インキュベートします。
- 1xパーメアビライゼーションバッファーの500 μL/マイクロチューブを加えて、すべてのチューブを洗浄します。遠心分離機 450 x gですべてのマイクロチューブ、 4 °C で 5 分間.各マイクロチューブを200 μLのFACSバッファで再中断します。フローサイトメーターで1 x 105のイベント/サンプルを取得します。
- 分析のために、細胞はCD11b x CD45に最初にゲートされ、次にGFAPヒストグラムにゲート付けされなければならない。
注: 未染色および FMO コントロールは、ゲートを決定するのに便利です。
2. 感染率の評価
- T.ゴンディによるグリア細胞の感染
- プレート 3 x 104ミクログリアまたはアストロサイト 37 °C で DMEM/F12 を補充し、前処理された 96 ウェルフラットプレートで 24 時間の 5% CO2 (材料表を参照) を使用します。
- Tからタキゾアイトで各細胞集団に感染する。黄色蛍光タンパク質(YFP)を発現する黄色の蛍光タンパク質(YFP)株は、200 μL(寄生虫:細胞)で希釈された1:1(寄生虫:細胞)を補ったRPMI(3%FBS + 0.16 mMペニシリン+ 0.18 mMストレプトマイシン+ 12.5mM HEPES + 30 mM重炭酸ナトリウム、 pH 7.2) (資料一覧を参照)。37°Cで、5%CO2で48時間インキュベートする。2
- その後、上清を捨て、4°Cで24時間PBSで希釈した1%パラホルムアルデヒド(PFA)の100μL/ウェルを加えて細胞を固定します。
- PH 7.2でPFAをPBSの100 μL/wellに置き換えます。
- PBS pH 7.2 (1:1,000) で暗い温度で 1 分間希釈した DAPI (5 mg/mL) の 50 μL/ウェルを慎重に除去し、上清および染色細胞の核を除去します。
- DAPI染色液をPBS(pH 7.2)の100 μL/wellに置き換え、蛍光顕微鏡で分析します。
- T.クルージによるグリア細胞の感染
- プレート 3 x 104ミクログリアまたはアストロサイト 37 °C で DMEM/F12 を補充し、前処理された 96 ウェルフラットプレートで 24 時間の 5% CO2 (材料表を参照) を使用します。
注: 感染の各時点で、異なるプレートを使用してください。 - 5:1(寄生虫:細胞)のMOIでT.クルジY株のトリポマスチゴトをグリア細胞に感染させ、27°Cで200μL/ウェル希釈し、37°Cでインキュベートし、2時間のCO2を5%でインキュベートします。
注:このステップは、寄生虫による細胞の侵入のために重要です。 - すべての上清を取り除き、すべての細胞外寄生虫を除去するために、補充されたRPMIの200 μL/wellを加えることによってウェルを洗浄します。上清を取り除き、新鮮な補充されたRPMIの200 μL/wellを加えます。
注: この手順では、接着細胞に侵入しなかったすべての寄生虫を削除します。 - 感染した細胞を2時間、48時間および96時間インキュベートし、グリア細胞11におけるT.クルジ複製を評価する。
- 各時点の後、上清を取り除き、室温で15分間メタノールの100 μL/ウェルで細胞を固定し、メタノールをPBS(pH 7.2)の100 μL/ウェルに交換します。
- 固定後、免疫蛍光アッセイ用の細胞を以下のように調製する。
- 自己蛍光を避けるために、PBS(pH 8.0)で15分間希釈した50mMNH4Clの100μL/ウェルで細胞を15分間処理し、PBSの100 μL/ウェルを加えてすぐに細胞を洗浄し、すぐに取り除きます(このステップを3回繰り返します)。
- 次に、PBSで希釈した0.5%トリトンの100μL/ウェルを15分間添加して細胞を透過させ、PBSを100μL/ウェルに加えてすぐに細胞を洗浄し、すぐに取り除きます(このステップを3回繰り返します)。
- 次に、100 μL/ウェルのブロッキング溶液(5%非脂肪乳+ 2%BSAをPBSで希釈したBSA)を室温で1時間培養します。PBSの100 μL/ウェルを加えて細胞を洗浄し、すぐに取り除きます(このステップを3回繰り返します)。
- アマスチゴトを染色するために、非商用モノクローナル抗体(mAb)2C2抗Ssp-4タンパク質(1:200)を室温で1時間ブロッキング溶液に希釈して30μL/wellでインキュベートします。
- PBSの100 μL/ウェルを加えて細胞を洗浄し、すぐに取り除きます(このステップを3回繰り返します)。PBSで1時間室温で希釈した2次抗マウス抗体(1:500)の30μL/wellでプレートをインキュベートします。
注:非商業的なmAb 2C2抗Ssp-4タンパク質は、サンパウロ連邦大学微生物学、免疫学、寄生虫学科のレナート・A・モルタ博士からの親切な贈り物でした。 - PBS pH 7.2 (1:1,000) で希釈した DAPI (5 mg/mL) の 50 μL/ウェルを暗い室温で 1 分間加えて、上清と染色核を慎重に除去します。
- DAPI染色液をPBS pH 7.2の100 μL/wellに置き換え、蛍光顕微鏡で分析します。
- プレート 3 x 104ミクログリアまたはアストロサイト 37 °C で DMEM/F12 を補充し、前処理された 96 ウェルフラットプレートで 24 時間の 5% CO2 (材料表を参照) を使用します。
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Representative Results
14日目に、グリア細胞培養(図1A)が機械的解離を行った。CD11b、CD45およびGFAPマーカーに従って、細胞集団をフローサイトメトリーで分析した。アストロサイトの人口は89.5%、ミクログリア集団では96.6%の純度を観察できた(図1B)。単離後、細胞は96ウェルの平板にメッキされ、24時間後にそれぞれの感染プロトコルに従ってT.クルージまたはT.ゴンディによって感染する準備ができていた。ここでは、これらのグリア細胞における感染率評価の一例として、T.クルジの経時感染を提供した。
アストロサイトとミクログリア(3 x 104細胞/ウェル)は、2〜96時間のMOI = 5:1(寄生虫:細胞)でT.クルージに感染した(図2)。感染率は、DNAインターカレーター(DAPI)で染色された細胞数と寄生虫数を数えることによって免疫蛍光によって評価した。簡単に言えば、T.クルージが同様の速度でミクログリアとアストロサイトに侵入できることを観察することができました。さらに、T.クルジは両方の細胞タイプで複製し、感染後96時間で最も高い感染率に達する(p.i.)。興味深いことに、p.i.96 hで感染率はミクログリアよりもアストロサイトでより顕著であり、ミクログリア細胞は、前述の11のように、アストロサイトよりも効率的に寄生虫複製を制御できることを示唆している。
特定の蛍光抗体で標識された蛍光レポーターまたは寄生虫を発現する遺伝子組換え寄生虫を使用すると、細胞核と区別が良いため、免疫蛍光顕微鏡を改善できることに注意することが重要である(図3)。また、蛍光寄生虫の感染率は、フローサイトメトリーなどの他の技術によって決定することができる。ここでは、YFP(図3A)およびT.クルジY株を非商用mAb 2C2抗Ssp-4タンパク質で染色した構成的に発現するT.ゴンディRH株の例を提供した(図3B)。
全体として、このプロトコルは、マウスミクログリアおよびアストロサイト原発細胞を抽出、維持、解負、感染させる方法を記述しており、例えば、原虫感染に対するグリア細胞の免疫応答を短時間解明する強力なツールとなり得るここは。
図1:初等星状細胞およびミクログリア細胞(A)培養14日目のC57BL/6マウスグリア細胞の画像は、逆顕微鏡(400x)により得られた。赤い矢印はアストロサイトの層を示し、黒い矢印はミクログリアを示します。(B)機械的解離後、アストロサイトとミクログリアを蛍光抗CD11b、抗CD45および抗GFAPで染色し、フローサイトメトリー(1 x 105細胞取得)により評価した。5 5アストロサイトはCD11b- /CD45-およびGFAP++細胞と見なされ、ミクログリアはCD11b+ /CD45+およびGFAP-細胞である。- ++この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:グリア細胞におけるT.クルジ感染の経時経過C57BL/6マウスからのアストロサイトおよびミクログリアは、T.クルージY(MOI=5:1)に感染した。2時間、48時間及び96時間後、チャンバーをメタノールで固定し、細胞核マーカーDAPI(青)および抗GFAP(赤色)で染色した。画像は、反転蛍光顕微鏡(400x)によって得られた。細胞内のアマスティゴトの数と感染細胞の頻度を蛍光顕微鏡ソフトウェアで評価した(材料表参照)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:蛍光原虫寄生虫によるアストロサイトおよびミクログリア感染。(A)C57BL/6マウスから3 x 104アストロサイトおよびミクログリアが感染した(MOI=1:1)T.ゴンディRHYFP(緑色)を48時間、チャンバーを1%PFAで固定し、DAPI(青色)で染色した。(B)C57BL/6マウスから3 x 104アストロサイトおよびミクログリアをT.クルジYで96時間感染させ、チャンバーを純メタノールで固定し、DAPI(緑色)およびmAb 2C2抗Ssp-4(オレンジ)で染色した。画像は、反転蛍光顕微鏡を用いて取得した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この20年間で、別個の生物学的文脈における単離グリア細胞機能の研究の重要性が拡大しています。ニューロンを超えてCNSを理解することは、細胞生物学において、特に感染症や炎症性の状態88、9、249,24の下でまだ成長している分野です。グリア細胞は、ニューロンの物理的サポート(以前に知られていたように)だけでなく、ニューロンエネルギー供給、神経代謝、免疫監視、シナプス剪定、組織の形成および変調など、他の多くの生理学的状況においても重要であり、とりわけ33、25、26、27、28、29である。,25,26,27,28,29
アストロサイトとミクログリアは感染や無菌炎症の間に差動変調することができるので、これらのグリア細胞の個々および相対的な役割を理解することは非常に重要である。ミクログリアはCNSにおいて単核食細胞系(MPS)を表わすものが知られているが、CNS免疫応答8において、アストロサイトも極めて重要な果たすものとして説明されている。感染および/または炎症の文脈における各グリアサブセットの役割を比較するためには、同じ抽出および条件からそれらを得ることが必須である。特に原虫寄生虫に関しては、感染を制御するためのミクログリアおよびアストロサイトのエフェクター応答に関する報告はほとんどない。この意味で、我々は最近、一酸化窒素(NO)分泌を伴うメカニズムによるミクログリアのT.クルジ複製の制御にNLRP3インフレマソームの要件を実証した。
このプロトコルは、出生後(3日齢)のマウスから、最も豊富な2つのグリア細胞集団、アストロサイトおよびミクログリアを同時に抽出することに焦点を当てた方法を記述する。3日齢より古い新生児マウスを使用することができますが、両方の細胞の収量が時間の経過とともにわずかに減少する(データは示されていません)。我々の方法は、同じ条件下で同じ抽出で両方の細胞型を取得および単離することに焦点を当てたため、アストロサイトまたはミクログリア分離のための以前に説明したプロトコルとは異なり、実験動物の使用を最適化し、免疫学的文脈におけるそれらの細胞の相対的な役割の研究を改善した。さらに、我々のプロトコルは、両方の細胞タイプの収率を最適化しました。収量は、通常3-5 x 106アストロサイトとフラスコあたり3〜5 x 105ミクログリアです。これを他のプロトコルと比較すると、T-75フラスコあたりより多くの動物を使用する細胞が少なくなる(一部のプロトコルはフラスコあたり2〜3匹の動物を使用する)30,,31.
このプロトコルのもう一つの利点は、孤立したアストロサイトおよびミクログリアを得るために必要な時間である。14日以内に成熟したミクログリアを得ることができる。実際、FlodeとCombsが示したように、14日より古いミクログリアはサイトカインを分泌する能力が低下していることを強調することが重要です。神経免疫学的文脈で、これを考慮することは非常に重要です30.アストロサイトの成熟したメーカーが完全に理解されていないにもかかわらず、GFAPは応答性と活性アストロサイトを特徴付けるために主に使用されます。いくつかのプロトコルは、培養21日または28日後にのみ90%GFAP陽性細胞のレベルを達成する。そのため、7~14日以内に免疫反応性を持ち、成熟する細胞を提供する方法を提案しました。この純度は、アストロサイト31およびミクログリア30の両方の他の方法よりも低くすることができるが、主な焦点は、付随的抽出においてミクログリアおよびアストロサイトをより多量に得る事であった。細胞集団は、その純粋性を向上させるためにカラム分離によってさらに分類または分離することができることを理解しています。このためには、マイクログリア用の Iba1 や TMEM119 などの追加のセル マーカーが含まれる場合があります。アストロサイトのアクアポリン-4またはS100B、オリゴデンドロサイトのCC1またはO4、ニューロン22、31、32、3331,32,33のNeuN。22ただし、プロトコルの最後に重要なセル損失を考慮する必要があります。
このように、効率的かつ安価なプロトコルでミクログリアとアストロサイトを併せ得るための改変方法を提供した。さらに、このプロトコルは、T.クルージおよびT.ゴンディ感染中にここに示すように、神経免疫学的文脈におけるグリアサブセットの比較研究を可能にする大きな収量の利点を提供する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
サンパウロ連邦大学(UNIFESP)のレナート・A・モルタ教授にmAb 2C2反Ssp-4をありがとうございました。この作品は、フンダサン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(FAPESP、K.R.B.への助成金2017/25942-0)、コンセルホ・ナシオナル・デ・デセンボルヴィメント・シエンティフィコ・エ・テクノロジコ(CNPq、 402100/2016-6をK.R.B.に付与し、インスティトゥート・ナシオナル・デ・シエンシア・エ・テクノロジア・デ・ヴァシナス(INCTV/CNPq)、クールデナサン・デ・アペルフェイソアメント・デ・ペソアル・デ・ニーヴェル・スペリオール(CAPES、金融コード001)を付与します。M.P.A.はCNPqからフェローシップを受け、A.L.O.P.はCAPESからフェローシップを受け、I.S.FとL.Z.M.F.B.はFAPESPからフェローシップを受けます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% Ethanol | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: 2231 | Sterilize |
| 75 cm2 Flask | Corning | Cat: 430720U | Plastic material |
| 96 well cell culture plate | Greiner Cellstar | Cat: 655090 | Cell culture |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Dinâmica Química Contemporânea | Cat: C10337.01.AH | Remove autofluorescence |
| Anti-GFAP antibody | Abcam | Cat.: ab49874 | Immunofluorescence antidoby |
| Bottle Top Filter 0.22 μmm CA | Corning | Cat: 430513 | Culture medium filter |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | Cat: A7906 | FACS Buffer preparation |
| CD11b (FITC) | BD Pharmigen | Cat.: 553310 | Flow cytometry antibody |
| CD45 (PE) | Invitrogen | Cat.: 12-0451-83 | Flow cytometry antibody |
| Centrifuge | Eppendorf | Cat: 5810R | Centrifugation |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | Centrifugation |
| Class II biosafety cabinet | Pachane | Cat: 200 | Biosafety cabinet for sterile procedures |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Model: 3110 | Primary cells maintenance |
| Conical tubes 15 mL | Corning | Cat: 430766 | Plastic material |
| Conical tubes 50 mL | Corning | Cat: 352070 | Plastic material |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | Cat: C10281 | Cell counter |
| DAPI | Invitrogen | Cat.: D1306 | Immunofluorescence antidoby |
| Digital Microscope Camera | Nikon | Cat: DS-RI1 | Capture images on microscope |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | Cat: 12800-058 | Cell culture medium |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | Cat: E9884 | FACS Buffer preparation |
| F12 Nutrient Mixture | Gibco | Cat: 21700-026 | Cell culture medium |
| FACS Canto II | BD Biosciences | Unavaiable | Flow cytometer |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | LGC Biotechnology | Cat: 10-bio500-1 | Cell culture medium supplement |
| Flow Jo (software) | Flow Jo | Version: Flow Jo_9.9.4 | Data analysis |
| Fluorescence intenselight | Nikon | Cat: C-HGFI | Fluorescence source |
| GFAP (APC) | Invitrogen | Cat.: 50-9892-82 | Flow cytometry antibody |
| Goat - anti-mouse IgG (FITC) | Kirkeegood&Perry Lab (KPL) | Cat.: 172-1806 | Immunofluorescence antidoby |
| HBSS - Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | Cat: 14175079 | Cell culture medium |
| HEPES | Sigma Aldrich | Cat: H4034 | Cell culture medium supplement |
| IC Fixation Buffer | Invitrogen | Cat: 00-8222-49 | Cell fixation for Flow Citometry |
| Inverted microscope | Nikon | Model: ECLIPSE TS100 | Microscope |
| Isoflurane | Cristália | Cat: 21.2665 | Inhaled anesthetic |
| Methanol | Synth | Cat: 01A1085.01.BJ | Fixation for Immunofluorescence |
| Micro spatula | ABC stainless | Unavaiable | Surgical material |
| Microtube 1.5 mL | Axygen | Cat: MCT-150-C | Plastic material |
| Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 | Non commercial | Non commercial | Immunofluorescence antidoby |
| Multichannel Pipette (p200) | Corning | Cat: 751630124 | Pipette reagents |
| NIS Elements Software | Nikon | Version 4.0 | Acquire and analyse images |
| Non-fat milk | Nestlé | Cat: 9442405 | Blocking solution for immunofluorescence |
| Orbital Shaker Incubator | ThermoScientific | Model: 481 Cat: 11 | Dissociate microglia from astrocytes |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | Cat: P6148 | Fixation for Immunofluorescence |
| PBS | Non commercial | Non commercial | Neutral Buffer |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | Cat: P-7794 | Cell culture medium supplement |
| Permeabilization Buffer (10x) | Invitrogen | Cat: 00-8333-56 | Cell permeabilization for Flow Citometry |
| Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) | Prolab | Cat: 0303-8 | Plastic material |
| pH meter | Kasvi | K39-1014B | Calibrate pH solution |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | Cat: 31800-014 | Cell culture medium |
| Scissors | ABC stainless | Cat: LO9-W4 | Surgical material |
| Serological pipette 10 mL | Corning | Cat: 4101 | Plastic material |
| Serological pipette 5 mL | Corning | Cat: 4051 | Plastic material |
| Single Channel Pipette (p1000) | Gilson Pipetman | Cat: F123602 | Pipette reagents |
| Single Channel Pipette (p200) | Gilson Pipetman | Cat: F123601 | Pipette reagents |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | Cat: S6297 | Cell culture medium supplement |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma Aldrich | Cat: S9137 | Cell culture medium supplement |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | Cat: T9284 | Permeabilization for immunofluorescence |
| Trypsin | Gibco | Cat: 27250-018 | Digestive enzyme |
| Tweezers | ABC stainless | Cat: L28-P4-172 | Surgical material |
| Water Bath | Novatecnica | Model: 09020095 | Digeste tissue at 37 °C with trypsin |
References
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