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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Gleichzeitige Isolierung von Primärastrozyten und Mikroglia bei Protozoenparasiten-Infektion

Published: March 18, 2020 doi: 10.3791/60680
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2
1Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
* These authors contributed equally

Summary

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, zu unterweisen, wie man murine Astrozyten- und Mikrogliazellen aus dem zentralen Nervensystem extrahiert, aufrechterhält und dissoziiert, gefolgt von einer Infektion mit Protozoenparasiten.

Abstract

Astrozyten und Mikroglia sind die am häufigsten vorkommenden Gliazellen. Sie sind verantwortlich für physiologische Unterstützung und Homöostase-Wartung im Zentralnervensystem (ZNS). Die zunehmenden Beweise für ihre Beteiligung an der Bekämpfung von Infektionskrankheiten rechtfertigen das sich abzeichnende Interesse an der Verbesserung der Methoden zur Isolierung primärer Astrozyten und Mikroglia, um ihre Reaktionen auf Infektionen, die das ZNS betreffen, zu bewerten. Unter Berücksichtigung der Auswirkungen der Trypanosoma cruzi (T. cruzi) und Toxoplasma gondii (T. gondii) Infektion im ZNS, hier bieten wir eine Methode, um zu extrahieren, zu pflegen, zu dissoziieren und murine Astrozyten und Mikrogliazellen mit ProtozoenParasiten zu infizieren. Extrahierte Zellen aus neugeborenen Kortiken werden 14 Tage lang in vitro mit periodischem Differentialmedienersatz gehalten. Astrozyten und Mikroglia werden aus dem gleichen Extraktionsprotokoll durch mechanische Dissoziation gewonnen. Nach der Phänotypisierung durch Durchflusszytometrie werden Zellen mit Protozoenparasiten infiziert. Die Infektionsrate wird durch Fluoreszenzmikroskopie zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt, wodurch die Differenzfähigkeit von Gliazellen zur Kontrolle der protozoischen Invasion und Replikation bewertet wird. Diese Techniken stellen einfache, kostengünstige und effiziente Methoden dar, um die Reaktionen von Astrozyten und Mikroglia auf Infektionen zu untersuchen und das Feld für weitere neuroimmunologische Analysen zu öffnen.

Introduction

Das ZNS besteht hauptsächlich aus Neuronen und Gliazellen1,2,3. Mikroglia und Astrozyten sind die am häufigsten vorkommenden Gliazellen im ZNS. Microglia, das ansässige Makrophagen, ist die immunkompetente und phagozytische Gliazelle im ZNS3,4, während Astrozyten für die Aufrechterhaltung der Homöostase verantwortlich sind und unterstützende Funktionen ausüben5.

Obwohl Gliazellen klassisch bekannt sind, verantwortlich für die Unterstützung und den Schutz der Neuronen6,7, neu entstehende Funktionen dieser Zellen wurden in der jüngsten Literatur beschrieben, einschließlich ihrer Reaktionen auf Infektionen8,9,10,11. Daher gibt es einen Vorstoß, Methoden zu entwickeln, um diese Gliazellen zu isolieren, um ihre Funktionen individuell zu verstehen.

Es gibt einige alternative Modelle, um Gliazellen zu untersuchen, anstatt Primärkulturen, wie verewigte Zelllinien und In-vivo-Modelle. Verewigte Zellen unterliegen jedoch eher genetischen Driften und morphologischen Veränderungen, während In-vivo-Studien begrenzte Manipulationsbedingungen auferlegen. Umgekehrt sind Primärkulturen einfach zu handhaben, ähneln besser in vivo Zellen und ermöglichen es uns auch, experimentelle Faktoren zu kontrollieren12,13. Hier beschreiben wir Richtlinien, wie man murine Astrozyten und Mikroglia-Primärzellen im selben Protokoll extrahiert, pflegt und dissoziiert. Darüber hinaus bieten wir auch Beispiele, wie mit Protozoeninfektionen in diesen Kulturen zu arbeiten.

ZNS-Zellen, die aus neonatalen Mäusen (bis zu 3 Tage alt) extrahiert wurden, wurden 14 Tage lang auf differentialen Medien kultiviert, die das bevorzugte Wachstum von Astrozyten und Mikrogliazellen ermöglichen. Da Mikroglia über den angeschlossenen Astrozyten ruht, wurden Zellpopulationen in einem Orbital-Inkubator mechanisch dissoziiert. Als nächstes sammelten wir alle Überstande, die Mikroglia enthielten, und fügten Trypsin hinzu, um Astrozyten zu lösen. Isolierte Gliazellen wurden phänotypisch durch Durchflusszytometrie ausgewertet und nach dem gewünschten Experiment plattiert.

Wir lieferten auch Beispiele, wie man diese isolierten Mikroglia und Astrozyten mit Protozoenparasiten infiziert. T. gondii ist ein hochneurotroper Protozoen, der für Toxoplasmose14verantwortlich ist, während T. cruzi für die Chagas-Krankheit verantwortlich ist, die zur Entwicklung neurologischer Störungen im ZNS15,16führen kann. Darüber hinaus wurde auch berichtet, dass eine Infektion mit T. gondii17,18 oder T. cruzi19,20,21 die mutmaßliche Todesursache bei immungeschwächten Patienten waren. Daher ist die Aufklärung der immunologischen Rolle von Gliazellen aus dem ZNS bei der Kontrolle von Protozoeninfektionen von großer Bedeutung.

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Protocol

Alle experimentellen Verfahren mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem brasilianischen Nationalgesetz (11.794/2008) durchgeführt und von den Institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschüssen (IACUC) der Föderalen Universität von Sao Paulo (UNIFESP) genehmigt.

1. Glial Cells Extraktion, Wartung und Dissoziation

HINWEIS: Die Anzahl der Mäuse, die für die Extraktion von Gliazellen verwendet werden, hängt von der Menge der Zellen ab, die für die Durchführung der gewünschten Experimente erforderlich sind. In diesem Protokoll wurden insgesamt 2,7 x 107 Astrozyten und 4 x 106 Mikroglia von sechs neonatalen C57BL/6-Mäusen gewonnen. Alle Eingriffe wurden unter sterilem Zustand in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II durchgeführt.

  1. Tag 1
    1. Bereiten Sie reines Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS) und HBSS + 10% des wärmeinaktivierten fetalen Rinderserums (FBS) vor (siehe Materialtabelle).
    2. Ergänzendes Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 (10% FBS + 0,08 mM Penicillin + 0,09 mM Streptomycin + 12,5 mM HEPES + 30 mM Natriumbicarbonat, pH 7,2) vorbereiten und mit einem 0,22 m Filter filtern (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Alle Kulturmedien sollten bei 4 °C gespeichert werden, aber es ist notwendig, sie bei 37 °C für 20 min vorzuwärmen, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
    3. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente (Schere, Spachtel und Pinzette) in einem Autoklaven und verwenden Sie 70% Ethanol während des Eingriffs.
    4. Neugeborene (bis zu 3 Tage alt) Mäuse in eine versiegelte Kammer mit mit Isofluran getränkter Baumwolle für 5 min für eine tiefe Anästhesie.
    5. Den Mauswelpen mit 70% Ethanol besprühen und das Tier mit einer Schere enthaupten.
    6. Machen Sie sagittalen Schnitt (posterior bis vorder) mit einer Schere entlang des Schädels, um es zu öffnen und das Gehirn auszusetzen. Trennen Sie den Schädel vom Gehirn mit einer Pinzette. Entfernen Sie das Gehirn mit einem Mikrospachtel, um die Integrität des Gehirns zu erhalten.
    7. Legen Sie das Gehirn in eine trockene Petrischale (6 cm Durchmesser). Entfernen Sie die Olfaktor-Lampe und Kleinhirn mit einem Mikro-Spachtel. Bewegen Sie den Kortex auf eine andere Petrischale (6 cm Durchmesser), die HBSS + 10% FBS (2 ml/Petrischale) enthält.
    8. Schneiden Sie das Hirngewebe mit einer sterilen Schere in kleine Stücke und übertragen Sie mit einer p1000-Mikropipette jedes Hirngewebe mit HBSS + 10% FBS in verschiedene 15 ml konische Röhren. Stellen Sie sicher, dass das Endvolumen 2 ml/Rohr beträgt. Wenn nicht, komplett mit HBSS + 10% FBS.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Wenn ja, müssen konische Röhren mit ZNS-Gewebe bis zu 1 h auf Eis gelegt werden.
    9. Waschen Sie das geschnittene Hirngewebe mit 3 ml HBSS + 10% FBS (pro Tube) und nach der Dekantierung. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
      HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, die Trümmer zu entfernen und das extrahierte Gewebe zu bergen.
    10. Waschen Sie das geschnittene Hirngewebe mit 3 ml reinem HBSS (pro Tube) und entfernen Sie nach der Dekantierung vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
      HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, das verbleibende Serum aus den vorherigen Wärjahren zu entfernen, da Zellen im nächsten Schritt versucht werden.
    11. Fügen Sie 3 ml Trypsin pro Rohr hinzu und legen Sie es 30 min lang in ein Wasserbad bei 37 °C, indem Sie die Rohre alle 5 min sanft schütteln. Vermeiden Sie Blasen, indem Sie die Rohre invertieren oder abrupt mischen.
      HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, das gesammelte Gewebe zu verdauen.
    12. Um das Trypsin zu inaktivieren, waschen Sie das Gewebe mit 3 ml pro Tube HBSS + 10% FBS und entfernen Sie nach der Dekantierung des Gewebes vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
    13. Waschen Sie das Gewebe mit 3 ml pro Tube reinen HBSS und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 Mal.
    14. Fügen Sie 7 ml pro Tube reinen HBSS hinzu und homogenisieren Sie das Gewebe durch aufeinanderfolgende Passagen in Pipetten: zuerst mit der 10 ml serologischen Pipette, gefolgt von der 5 ml und schließlich mit der mikropipette p1000.
    15. Nach der Homogenisierung Zentrifugenrohre bei 450 x g für 5 min bei 4 °C.
    16. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 4 ml HBSS + 10% FBS pro Rohr wieder auf.
    17. Übertragen Sie Zellen in einen vorbehandelten T-75-Kolben für eine optimale Zellkulturhaftung (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Verarbeiten Sie Gewebe von jedem Tier pro Kolben.
    18. Legen Sie den Kolben bei 37 °C und 5%CO2 für 30 min zur Haftung in den Inkubator.
    19. 10 ml zusätzliches DMEM/F12 pro Kolben hinzufügen und bei 37 °C und 5%CO2brüten.
      HINWEIS: Das endige Volumen beträgt 14 ml pro Kolben.
  2. Tag 3
    1. Entfernen Sie 7 ml Kulturmedium aus dem T-75 Kolben und fügen Sie 7 ml frisch ergänztDM/F12 hinzu.
      HINWEIS: Die Kolben enthalten eine Menge zellulärer Trümmer und ein trübes Aussehen.
  3. Tag 5
    1. Entfernen Sie das gesamte Medium aus dem T-75-Kolben und fügen Sie 14 ml frisch ergänztdmEM/F12 hinzu.
      HINWEIS: Medium wird aus den Kolben ersetzt, um Schmutz und nicht anhaftende Zellen zu entfernen.
    2. Nach je 48 h 6 ml des Überstandes entfernen und 7 ml frisch ergänztes DMEM/F12 Medium bis zum 14. Tag der Kultur hinzufügen.
  4. Tag 14
    1. Nach dem Entfernen von 6 ml des Überstandes und Zugabe von 7 ml frisch ergänztem DMEM/F12 Medium, schließen Sie die T-75-Flaschen fest.
    2. Legen Sie sie in den Boden Orbital-Shaker bei 200 Umdrehungen pm und 37 °C über Nacht, um Mikroglia mechanisch von Astrozyten zu trennen.
  5. Tag 15
    1. Nehmen Sie die Kolben aus dem Shaker und waschen Sie sie kräftig mit ihrem eigenen Medium, um die Zelldissoziation zu optimieren und die maximale Anzahl von Mikroglia zu ernten. Dann sammeln Sie den Überstand (enthält Mikroglia) und übertragen Sie in ein 50 ml konisches Rohr.
    2. Als nächstes 4 ml Trypsin in jeden Kolben geben und 5 min bei 37 °C inkubieren, um die Astrozyten zu lösen.
    3. Fügen Sie 5 ml pro Kolben von ergänztem DMEM/F12 hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Waschen Sie die Kolben mit ihrem eigenen Medium und übertragen Sie den Inhalt in ein 50 ml konisches Rohr.
    4. Zentrifugieren Sie alle Röhren, die dissoziierte Mikroglia und Astrozyten bei 450 x g für 5 min bei 4 °C enthalten.
    5. Entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie das Mikrogliapellet in 1 ml und die Astrozyten in 10 ml ergänztem DMEM/F12 wieder aus.
    6. Fahren Sie mit der Zellzählung in einer Neubauer-Kammer oder einem automatischen Zellzähler fort. Die Zellen mit ergänztem DMEM/F12 mit der gewünschten Dichte in einer geeigneten flachen Bodenzellkulturplatte (vorbehandelt für optimale Zellanhaftung; siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h, damit sie sich anbringen können.
      HINWEIS: Reservieren Sie 1,5 x 106 jeder Zellpopulation, um ihre Reinheit durch Durchflusszytometrie zu bestätigen.
    7. Führen Sie eine zytometrische Flussanalyse durch, um die Reinheit der Zellpopulationen zu überprüfen.
      HINWEIS: Wir betrachten microglia CD11b+/CD45+/GFAP- und Astrozyten CD11b-/CD45-/GFAP+. Iba1 und TMEM119 Färbung könnte in Betracht gezogen werden, um Microglia22vollständig zu charakterisieren.
    8. Fügen Sie einen FMO (Fluoreszenz Minus One)23 und eine unbefleckte Probe für jede Zellpopulation (Astrozyten und Mikroglia) als Steuerung des Durchflusszytometrie-Assays hinzu.
    9. Reservieren Sie für jede Zellpopulation 5 x 105 Zellen für jede gefärbte und ungefärbte Probe. Reservieren Sie für FMO zwei weitere Mikroglia-Röhren mit jeweils 2,5 x 105 Zellen und eine weitere Röhre mit 5 x 105 Astrozyten.
      HINWEIS: Da Mikroglia-Zahlen ein begrenzender Faktor sein können, ist es möglich, weniger Zellen für ungefärbte und FMO-Kontrollen zu verwenden.
    10. Zentrifugieren Sie alle Mikroröhrchen bei 450 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 500 l/Mikrorohr FACS-Puffer (Phosphat-gepufferte Kochchen (PBS) + 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) + 2 mM EDTA, pH 7,2) wieder auf.
    11. Zentrifugieren Sie alle Mikroröhrchen bei 450 x g bei 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 100 l/Mikrorohr Anti-CD16/CD32 (Klon 93) (1:50) im FACS-Puffer verdünnt auf. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    12. Fügen Sie allen Mikroröhrchen und Zentrifugen bei 450 x g bei 4 °C für 5 min 5 l/Mikrorohr FACS-Puffer hinzu. Resuspend Astrozyten und Mikroglia-Färberohre und auch Astrozyten-FMO-Röhrchen mit 50 L/Mikroröhre von Oberflächenmarkern mischen: Anti-CD45 (PE, Klon 30-F11) und Anti-CD11b (eFluor 450, Klon M1/70) (beide bei 1: 100 im FACS-Puffer verdünnt).
    13. Setzen Sie bei nicht befleckten Zellen mit dem gleichen Volumen des FACS-Puffers erneut ab. Für Microglia FMO, inkubieren Sie jedes Mikroglia-Rohr mit Anti-CD45 oder Anti-CD11b. Inkubieren Sie alle Proben bei 4 °C für 20 min im Dunkeln.
    14. Fügen Sie 500 L FACS-Puffer pro Mikrorohr hinzu. Zentrifuge bei 450 x g bei 4 °C für 5 min. Den Überstand entsorgen und das Pellet mit 100 l/Mikrorohr Fixationspuffer (siehe Materialtabelle)20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln wieder aufhängen.
    15. Fügen Sie 500 l/Mikroröhre Permeabilisationspuffer 1x (siehe Materialtabelle) und inkubieren bei 4 °C für 5 min im Dunkeln.
    16. Zentrifugieren Sie alle Mikroröhrchen bei 450 x g bei 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspend Astrozyten und Mikroglia-Färberohre sowie Mikroglia-FMO-Röhren mit 50 L/Mikrorohr intrazellulärer Antikörper-GFAP (APC, Klon GA5) in einem 1:100-Verdünnungspuffer. Für ungefärbte Zellen und Astrozyten-FMO, resuspendieren Sie die Zellen mit dem gleichen Volumen des FACS-Puffers. Alle Proben bei 4 °C für 30 min im Dunkeln inkubieren.
    17. Waschen Sie alle Rohre, indem Sie 500 l/Mikrorohr des 1x Permeabilisationspuffers hinzufügen. Zentrifugieren Sie alle Mikroröhrchen bei 450 x g, für 5 min bei 4 °C. Setzen Sie jedes Mikrorohr in 200 L FACS-Puffer aus. Erfassen Sie 1 x 105 Ereignisse/Probe auf dem Durchflusszytometer.
    18. Zur Analyse müssen Zellen zuerst auf CD11b x CD45 und dann auf GFAP-Histogramm abgegrenzt werden.
      HINWEIS: Unstained und FMO-Steuerelemente sind nützlich, um Tore zu bestimmen.

2. Infektion und Bewertung der Infektionsraten

  1. Infektion von Gliazellen mit T. gondii
    1. Platte 3 x 104 Mikroglia oder Astrozyten mit ergänztem DMEM/F12 bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h in einer vorbehandelten 96-Well-Flachplatte (siehe Materialtabelle).
    2. Infizieren Sie jede Zellpopulation mit Tachyzoiten aus T. gondii RH-Stamm, der gelbes fluoreszierendes Protein (YFP) bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 1:1 (Parasit:Zelle) in 200 l/Well des ergänzten RPMI (3% FBS + 0,16 mM Penicillin + 0,18 mM Streptomycin + 12,5 mM HEPES + 30 mM Natriumbicarbonat) verdünnt pH 7.2) (siehe Materialtabelle). Bei 37 °C und 5%CO2 für 48 h inkubieren.
    3. Entsorgen Sie dann den Überstand und fixieren Sie die Zellen, indem Sie 100 L/Well von 1% Paraformaldehyd (PFA) hinzufügen, das in PBS bei 4 °C für 24 h verdünnt wird.
    4. Ersetzen Sie PFA mit 100 L/Well von PBS bei pH 7,2.
    5. Entfernen Sie vorsichtig die Kerne der Überstände und Fleckenzellen, indem Sie 50 l/Well von DAPI (5 mg/ml) in PBS pH 7.2 (1:1,000) für 1 min bei Raumtemperatur im Dunkeln verdünnt pipetieren.
    6. Ersetzen Sie die DAPI-Färbelösung durch 100 L/Well von PBS (pH 7.2) und analysieren Sie sie durch Fluoreszenzmikroskopie.
  2. Infektion von Gliazellen mit T. cruzi
    1. Platte 3 x 104 Mikroglia oder Astrozyten mit ergänztem DMEM/F12 bei 37 °C und 5%CO2 für 24 h in einer vorbehandelten 96-Well-Flachplatte (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Verwenden Sie für jeden Zeitpunkt der Infektion eine andere Platte.
    2. Infizieren Sie die Gliazellen mit Trypomastigoten aus DemT. cruzi Y-Stamm bei einem MOI von 5:1 (Parasiten:Zelle) in 200 L/Well des ergänzten RPMI verdünnt und bei 37 °C und 5%CO2 für 2 h inkubieren.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig für die Zellinvasion durch den Parasiten.
    3. Entfernen Sie alle Überstand und waschen Sie die Brunnen durch Hinzufügen von 200 L / Well von ergänzten RPMI, um alle extrazellulären Parasiten zu entfernen. Entfernen Sie Dener und fügen Sie 200 L / Well von frisch ergänzten RPMI.
      HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, alle Parasiten zu entfernen, die nicht in die anhaftenden Zellen eindringten.
    4. Inkubieren Sie infizierte Zellen für 2 h, 48 h und 96 h, um die T. cruzi-Replikation in Gliazellen11zu bewerten.
    5. Nach jedem Zeitpunkt den Überstand entfernen und die Zellen mit 100 l/Well Methanol für 15 min bei Raumtemperatur fixieren und dann Methanol durch 100 l/Well von PBS (pH 7,2) ersetzen.
    6. Nach der Fixierung bereiten Sie die Zellen wie folgt auf den Immunfluoreszenztest vor.
      1. Um eine Autofluoreszenz zu vermeiden, behandeln Sie die Zellen mit 100 l/Well von 50 mM NH4Cl in PBS (pH 8.0) für 15 min. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 100 L/Well von PBS hinzufügen und sofort entfernen (wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal).
      2. Als nächstes permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie 100 L/Well von 0,5% Triton in PBS für 15 min verdünnt hinzufügen. Waschen Sie Zellen, indem Sie 100 L/Well von PBS hinzufügen und sofort entfernen (wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal).
      3. Dann inkubieren Sie die Zellkultur mit 100 l/Well der Blockierlösung (5% fettfreie Milch + 2% BSA in PBS [pH 7.2]) für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 100 L/Well von PBS hinzufügen und sofort entfernen (wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal).
      4. Um Amastigoten zu färben, inkubieren Sie mit 30 l/well von nicht-kommerziellen monoklonalen Antikörpern (mAb) 2C2 Anti-Ssp-4 Protein (1:200) in Blockierlösung für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt.
      5. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 100 L/Well von PBS hinzufügen und sofort entfernen (wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal). Inkubieren Sie die Platte mit 30 l/well des sekundären Anti-Maus-Antikörpers (1:500), der in PBS für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt wird.
        HINWEIS: Das nicht-kommerzielle mAb 2C2 Anti-Ssp-4-Protein war ein freundliches Geschenk von Prof. Dr. Renato A. Mortara vom Institut für Mikrobiologie, Immunologie und Parasitologie der Föderalen Universität von Sao Paulo.
      6. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und die Fleckenkerne, indem Sie 50 l/Well von DAPI (5 mg/ml) in PBS pH 7.2 (1:1,000) für 1 min bei Raumtemperatur im Dunkeln verdünnt hinzufügen.
      7. Ersetzen Sie die DAPI-Färbelösung durch 100 L/Well von PBS pH 7.2 und analysieren Sie sie durch Fluoreszenzmikroskopie.

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Representative Results

Am14. Tag wurde die Glialzellenkultur (Abbildung 1A) einer mechanischen Dissoziation unterzogen. Isolierte Zellpopulationen wurden durch Durchflusszytometrie nach CD11b-, CD45- und GFAP-Markern analysiert. Wir konnten eine Reinheit von 89,5% für die Astrozytenpopulation und 96,6% für die Mikrogliapopulation beobachten (Abbildung 1B). Nach der Isolierung wurden die Zellen in eine 96-Well-Flachplatte plattiert und nach 24 h waren sie bereit, sich mit T. cruzi oder T. gondii nach den jeweiligen Infektionsprotokollen zu infizieren. Hier haben wir eine Zeit-Kurs-Infektion von T. cruzi als Beispiel für die Infektionsrate-Bewertung in diesen Gliazellen zur Verfügung gestellt.

Astrozyten und Mikroglia (3 x 104 Zellen/Well) wurden mit T. cruzi bei MOI = 5:1 (Parasiten:Zelle) für 2–96 h infiziert(Abbildung 2). Die Infektionsrate wurde durch Immunfluoreszenz bewertet, indem die Anzahl der Zellen und die Anzahl der parasiten mit einem DNA-Intercalator (DAPI) gefärbt wurden. Kurz gesagt, wir konnten beobachten, dass T. cruzi in der Lage ist, Mikroglia und Astrozyten mit ähnlichen Raten zu überfallen. Darüber hinaus repliziert sich T. cruzi in beiden Zelltypen und erreicht mit 96 h nach einer Infektion die höchste Infektionsrate (p.i.). Interessanterweise ist die Infektionsrate bei 96 h p.i. bei Astrozyten stärker ausgeprägt als in Mikroglia, was darauf hindeutet, dass Mikrogliazellen in der Lage sind, die Parasitenreplikation effizienter zu kontrollieren als Astrozyten, wie wir zuvor11beschrieben haben.

Es ist wichtig zu beachten, dass die Verwendung von genetisch veränderten Parasiten, die fluoreszierende Reporter oder Parasiten mit spezifischen fluoreszierenden Antikörpern gekennzeichnet sind, die Immunfluoreszenzmikroskopie verbessern könnte, da sie besser vom Zellkern unterschieden werden (Abbildung 3). Darüber hinaus kann die Infektionsrate von fluoreszierenden Parasiten durch andere Techniken wie Durchflusszytometrie bestimmt werden. Hier stellten wir Beispiele für T. gondii RH-Stamm konstitutiv auszudrücken YFP (Abbildung 3A) und T. cruzi Y Stamm mit nicht-kommerziellen mAb 2C2 Anti-Ssp-4 Protein gefärbt (Abbildung 3B).

Insgesamt beschreibt dieses Protokoll, wie man murine Mikroglia und Astrozyten-Primärzellen extrahiert, aufrechterhält, dissoziiert und infiziert, was ein mächtiges Werkzeug sein könnte, um beispielsweise Immunreaktionen von Gliazellen auf Protozoeninfektionen zu untersuchen, wie kurz aufgeklärt Hier.

Figure 1
Abbildung 1: Primäre Astrozyten und Mikrogliazellen. (A) Bilder von C57BL/6 murinen Gliazellen am14. Kulturtag wurden mit einem invertierten Mikroskop (400x) gewonnen. Der rote Pfeil zeigt die Schicht der Astrozyten und der schwarze Pfeil zeigt die Mikroglia an. (B) Nach mechanischer Dissoziation wurden Astrozyten und Mikroglia (5 x 105 Zellen) mit fluoreszierendem Anti-CD11b, Anti-CD45 und Anti-GFAP gefärbt und mittels Durchflusszytometrie (1 x 105 Zellen Erfassung) bewertet. Astrozyten werden als CD11b-/CD45- und GFAP+ Zellen betrachtet, während Mikroglia CD11b+/CD45+ und GFAP- Zellen sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Zeitverlauf der T. cruzi-Infektion in Gliazellen. Astrozyten und Mikroglia von C57BL/6 Mäusen wurden mit T. cruzi Y infiziert (MOI = 5:1). Nach 2 h, 48 h und 96 h wurden die Kammern mit Methanol fixiert und mit Zellkernmarker DAPI (blau) und Anti-GFAP (rot) gebeizt. Die Bilder wurden mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop (400x) gewonnen. Die Anzahl der Amastigoten in den Zellen und die Häufigkeit infizierter Zellen wurden von der Fluoreszenzmikroskop-Software bewertet (siehe Tabelle der Materialien). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Astrozyten und Mikroglia-Infektion mit fluoreszierenden protozoischen Parasiten. (A) 3 x 104 Astrozyten und Mikroglia von C57BL/6 Mäusen wurden infiziert (MOI = 1:1) mit T. gondii RH YFP (grün) für 48 h, Kammern wurden mit 1% PFA fixiert und mit DAPI (blau) gebeizt. (B) 3 x 104 Astrozyten und Mikroglia von C57BL/6 Mäusen wurden infiziert (MOI = 5:1) mit T. cruzi Y für 96 h, und Kammern wurden mit reinem Methanol fixiert und mit DAPI (grün) und mAb 2C2 anti-Ssp-4 (orange) gefärbt. Die Bilder wurden mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die Bedeutung der Untersuchung isolierter Gliazellen in unterschiedlichen biologischen Kontexten hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten ausgeweitet. Das Verständnis des ZNS über Neuronen hinaus ist immer noch ein wachsendes Feld in der Zellbiologie, vor allem bei Infektionen oder entzündlichen Erkrankungen8,9,24. Gliazellen sind nicht nur für die körperliche Unterstützung der Neuronen (wie es früher bekannt war), sondern auch in vielen anderen physiologischen Situationen wie Neuronenenergieversorgung, Neurostoffwechsel, Immunüberwachung, synaptische Beschnitt, Formgebung und Modulation des Gewebes, unter anderem3,25,26,27,28,29.

Da Astrozyten und Mikroglia während einer Infektion oder sterilen Entzündung differenziell moduliert werden können, ist es von großer Bedeutung, die individuelle und relative Rolle dieser Gliazellen zu verstehen. Obwohl Mikroglia bekanntermaßen das mononukleare Phagozytensystem (MPS) in ZNS darstellt, wurden Astrozyten auch als ein entscheidender Akteur in den CNS-Immunantworten beschrieben8. Um die Rolle jeder Glial-Teilmenge im Zusammenhang mit Infektionen und/oder Entzündungen zu vergleichen, ist es zwingend erforderlich, sie aus der gleichen Extraktion und den gleichen Bedingungen zu erhalten. Es gibt nur wenige Berichte über die Effektorreaktionen von Mikroglia und Astrozyten zur Bekämpfung von Infektionen, insbesondere in Bezug auf protozoische Parasiten. In diesem Sinne haben wir vor kurzem die Anforderung von NLRP3-Entzündung zur Kontrolle der T. cruzi-Replikation in Mikroglia demonstriert, aber nicht in Astrozyten durch einen Mechanismus mit Stickstoffmonoxid (NO) Sekretion11.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die sich darauf konzentriert, die beiden am häufigsten vorkommenden Gliazellenpopulationen, Astrozyten und Mikroglia, von postnatalen (bis zu 3 Tage alten) Mäusen zu extrahieren. Neugeborene Mäuse, die älter als 3 Tage alt sind, können verwendet werden, aber wir haben erlebt, dass die Ausbeute beider Zellen im Laufe der Zeit leicht abnimmt (Daten werden nicht angezeigt). Unsere Methode unterscheidet sich von zuvor beschriebenen Protokollen für Astrozyten oder Mikroglia-Isolierung, weil wir uns darauf konzentriert haben, beide Zelltypen unter den gleichen Bedingungen unter den gleichen Bedingungen zu erhalten und zu isolieren, wodurch die Verwendung von Versuchstieren optimiert und die Untersuchung der relativen Rolle dieser Zellen in immunologischen Kontexten verbessert wird. Darüber hinaus optimierte unser Protokoll auch die Ausbeute beider Zelltypen. Die Ausbeute beträgt in der Regel 3–5 x 106 Astrozyten und 3–5 x 105 Mikroglia pro Kolben. Vergleichen Sie dies mit anderen Protokollen, die dazu führen, dass weniger Zellen mehr Tiere pro T-75-Kolben verwenden (einige Protokolle verwenden 2–3 Tiere pro Kolben)30,31.

Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Zeit, die benötigt wird, um isolierte Astrozyten und Mikroglia zu erhalten. Innerhalb von 14 Tagen ist es möglich, reife Mikroglia zu erhalten. In der Tat ist es wichtig zu betonen, dass, wie Flode und Combs gezeigt haben, Mikroglia älter als 14 Tage eine verminderte Fähigkeit zur Sekretion von Zytokinen darstellen; es ist sehr wichtig, dies in neuroimmunologischen Kontexten zu berücksichtigen30. Trotz der Tatsache, dass die reifen Macher für Astrozyten nicht vollständig verstanden werden, wird GFAP weitgehend verwendet, um reaktionsschnelle und aktive Astrozyten zu charakterisieren. Einige Protokolle erreichen Werte von 90% GFAP-positiven Zellen erst nach 21 oder 28 Tagen Kultur. Aus diesem Grund schlugen wir eine Methode vor, die vorsah, Zellen, die immunreagierend sind und meist innerhalb von 7-14 Tagen reifen. Obwohl die Reinheit niedriger sein kann als andere Methoden für Astrozyten31 und Mikroglia30, lag der Hauptfokus darauf, Mikroglia und Astrozyten in größeren Mengen in einer gleichzeitigen Extraktion zu erhalten. Wir verstehen, dass Zellpopulationen weiter sortiert oder isoliert werden könnten, mit Spaltentrennung, um ihre Reinheit zu verbessern. Dazu können zusätzliche Zellmarker wie Iba1 oder TMEM119 für Mikroglia enthalten sein; Aquaporin-4 oder S100B für Astrozyten, CC1 oder O4 für Oligodendrozyten und NeuN für Neuronen22,31,32,33. Ein wichtiger Zellverlust am Ende des Protokolls sollte jedoch in Betracht gezogen werden.

So haben wir eine modifizierte Methode zur Verfügung gestellt, um gleichzeitig Mikroglia und Astrozyten in einem effizienten und billigen Protokoll zu erhalten. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll die Vorteile einer großen Ausbeute, die vergleichende Studien von gliarischen Teilmengen in neuroimmunologischen Kontexten ermöglicht, wie hier bei der T. cruzi- und T. gondii-Infektion veranschaulicht.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Professor Dr. Renato A. Mortara von der Föderalen Universität von Sao Paulo (UNIFESP) für mAb 2C2 anti-Ssp-4. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von Fundao de Amparo , Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP, Stipendium 2017/25942-0 an K.R.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientéfico e Tecnolégico (CNPq, 402100/2016-6 an K.R.B.), das Instituto Nacional de Ciéncia e Tecnologia de Vacinas (INCTV/CNPq) und Coordenaéo de Aperfeiéoamento de Pessoal de Nével Superior (CAPES, Finanzkodex 001). M.P.A. erhält ein Stipendium von CNPq, A.L.O.P. erhält ein Stipendium von CAPES und I.S.F und L.Z.M.F.B. ein Stipendium von FAPESP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol Dinâmica Química Contemporânea Cat: 2231 Sterilize
75 cm2 Flask Corning Cat: 430720U Plastic material
96 well cell culture plate Greiner Cellstar Cat: 655090 Cell culture
Ammonium Chloride (NH4Cl) Dinâmica Química Contemporânea Cat: C10337.01.AH Remove autofluorescence
Anti-GFAP antibody Abcam Cat.: ab49874 Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 μmm CA Corning Cat: 430513 Culture medium filter
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich Cat: A7906 FACS Buffer preparation
CD11b (FITC) BD Pharmigen Cat.: 553310 Flow cytometry antibody
CD45 (PE) Invitrogen Cat.: 12-0451-83 Flow cytometry antibody
Centrifuge Eppendorf Cat: 5810R Centrifugation
Centrifuge Eppendorf 5415R Centrifugation
Class II biosafety cabinet Pachane Cat: 200 Biosafety cabinet for sterile procedures
CO2 Incubator ThermoScientific Model: 3110 Primary cells maintenance
Conical tubes 15 mL Corning Cat: 430766 Plastic material
Conical tubes 50 mL Corning Cat: 352070 Plastic material
Countess automated cell counter Invitrogen Cat: C10281 Cell counter
DAPI Invitrogen Cat.: D1306 Immunofluorescence antidoby
Digital Microscope Camera Nikon Cat: DS-RI1 Capture images on microscope
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco Cat: 12800-058 Cell culture medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich Cat: E9884 FACS Buffer preparation
F12 Nutrient Mixture Gibco Cat: 21700-026 Cell culture medium
FACS Canto II BD Biosciences Unavaiable Flow cytometer
Fetal Bovine Serum (FBS) LGC Biotechnology Cat: 10-bio500-1 Cell culture medium supplement
Flow Jo (software) Flow Jo Version: Flow Jo_9.9.4 Data analysis
Fluorescence intenselight Nikon Cat: C-HGFI Fluorescence source
GFAP (APC) Invitrogen Cat.: 50-9892-82 Flow cytometry antibody
Goat - anti-mouse IgG (FITC) Kirkeegood&Perry Lab (KPL) Cat.: 172-1806 Immunofluorescence antidoby
HBSS - Hank's Balanced Salt Solution Gibco Cat: 14175079 Cell culture medium
HEPES Sigma Aldrich Cat: H4034 Cell culture medium supplement
IC Fixation Buffer Invitrogen Cat: 00-8222-49 Cell fixation for Flow Citometry
Inverted microscope Nikon Model: ECLIPSE TS100 Microscope
Isoflurane Cristália Cat: 21.2665 Inhaled anesthetic
Methanol Synth Cat: 01A1085.01.BJ Fixation for Immunofluorescence
Micro spatula ABC stainless Unavaiable Surgical material
Microtube 1.5 mL Axygen Cat: MCT-150-C Plastic material
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 Non commercial Non commercial Immunofluorescence antidoby
Multichannel Pipette (p200) Corning Cat: 751630124 Pipette reagents
NIS Elements Software Nikon Version 4.0 Acquire and analyse images
Non-fat milk Nestlé Cat: 9442405 Blocking solution for immunofluorescence
Orbital Shaker Incubator ThermoScientific Model: 481 Cat: 11 Dissociate microglia from astrocytes
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich Cat: P6148 Fixation for Immunofluorescence
PBS Non commercial Non commercial Neutral Buffer
Penicillin G Sigma Aldrich Cat: P-7794 Cell culture medium supplement
Permeabilization Buffer (10x) Invitrogen Cat: 00-8333-56 Cell permeabilization for Flow Citometry
Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) Prolab Cat: 0303-8 Plastic material
pH meter Kasvi K39-1014B Calibrate pH solution
RPMI 1640 Medium Gibco Cat: 31800-014 Cell culture medium
Scissors ABC stainless Cat: LO9-W4 Surgical material
Serological pipette 10 mL Corning Cat: 4101 Plastic material
Serological pipette 5 mL Corning Cat: 4051 Plastic material
Single Channel Pipette (p1000) Gilson Pipetman Cat: F123602 Pipette reagents
Single Channel Pipette (p200) Gilson Pipetman Cat: F123601 Pipette reagents
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich Cat: S6297 Cell culture medium supplement
Streptomycin sulfate salt Sigma Aldrich Cat: S9137 Cell culture medium supplement
Triton X-100 Sigma Aldrich Cat: T9284 Permeabilization for immunofluorescence
Trypsin Gibco Cat: 27250-018 Digestive enzyme
Tweezers ABC stainless Cat: L28-P4-172 Surgical material
Water Bath Novatecnica Model: 09020095 Digeste tissue at 37 °C with trypsin

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References

  1. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
  2. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  3. Jäkel, S., Dimou, L. Glial Cells and Their Function in the Adult Brain: A Journey through the History of Their Ablation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 1-17 (2017).
  4. Streit, W. J. Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS. Glia. 40 (2), 133-139 (2002).
  5. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends in Neuroscience. 32 (12), 638-647 (2009).
  6. Virchow, R. Die Cellularpathologie in ihrer Begründung auf physiologische and pathologische Gewebelehre. Verlag von August Hirschfeld, Berlin. , (1858).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  8. Samartino, C. G., et al. Brucella abortus induces the secretion of proinflammatory mediators from glial cells leading to astrocyte apoptosis. American Journal of Pathology. 176 (3), 1323-1338 (2010).
  9. Jamilloux, Y., et al. Inflammasome activation restricts Legionella pneumophila replication in primary microglial cells through flagellin detection. Glia. 61 (4), 539-549 (2013).
  10. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
  11. Pacheco, A. L., et al. The impairment in the NLRP3-induced NO secretion renders astrocytes highly permissive to T. cruzi replication. Journal of Leukocyte Biology. 160 (1), 201-207 (2019).
  12. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
  13. Lian, H., Roy, E., Zheng, H. Protocol for Primary Microglial Culture Preparation. Bio-Protocol. 6 (21), 1-10 (2016).
  14. Lüder, C. G. K., Giraldo-Velásquez, M., Sendtner, M., Gross, U. Toxoplasma gondii in primary rat CNS cells: Differential contribution of neurons, astrocytes, and microglial cells for the intracerebral development and stage differentiation. Experimental Parasitology. 92 (1), 23-32 (1999).
  15. Chagas, C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1 (2), (1909).
  16. Berkowitz, A. L., Raibagkar, P., Pritt, B. S., Mateen, F. J. Neurologic manifestations of the neglected tropical diseases. Journal of Neurological Sciences. 349 (1), 20-32 (2015).
  17. Jones, J. L., et al. Toxoplasmic encephalitis in HIV-infected persons: risk factors and trends. The Adult/Adolescent Spectrum of Disease Group. AIDS. 10 (12), 1393-1399 (1996).
  18. Luft, B. J., et al. Toxoplasmic Encephalitis in Patients with the Acquired Immunodeficiency Syndrome. New England Journal of Medicine. 329 (14), 995-1000 (1993).
  19. Madalosso, G., et al. Chagasic meningoencephalitis: Case report of a recently included AIDS-defining illness in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo. 46 (4), 199-202 (2004).
  20. Rocha, A., et al. Pathology of patients with Chagas’ disease and acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 50 (3), 261-268 (1994).
  21. Yasukawa, K., et al. Case report: Trypanosoma cruzi meningoencephalitis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (1), 84-85 (2014).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  23. Roederer, M. Compensation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 22 (1), (2002).
  24. Silva, A. A., et al. Priming astrocytes with TNF enhances their susceptibility to Trypanosoma cruzi infection and creates a self-sustaining inflammatory milieu. Journal of Neuroinflammation. 14 (182), (2017).
  25. Tsacopoulos, M., Evêquoz-Mercier, V., Perrottet, P., Buchner, E. Honeybee retinal glial cells transform glucose and supply the neurons with metabolic substrate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8727-8731 (1988).
  26. Nagase, M., Takahashi, Y., Watabe, A. M., Kubo, Y., Kato, F. On-site energy supply at synapses through monocarboxylate transporters maintains excitatory synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2605-2617 (2014).
  27. Buckman, L. B., Thompson, M. M., Moreno, H. N., Ellacott, K. L. J. Regional astrogliosis in the mouse hypothalamus in response to obesity. Journal of Comparative Neurology. 521 (6), 1322-1333 (2013).
  28. Vesce, S., Bezzi, P., Volterra, A. The active role of astrocytes in synaptic transmission. Cellular and Molecular Life Sciences. 56 (11-12), 991-1000 (1999).
  29. Arcuri, C., Mecca, C., Bianchi, R., Giambanco, I., Donato, R. The Pathophysiological Role of Microglia in Dynamic Surveillance, Phagocytosis and Structural Remodeling of the Developing CNS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 191 (2017).
  30. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  31. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079 (2013).
  32. Sarkar, S., et al. Rapid and refined CD11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility. Journal of Visualized Experiments. (122), e55364 (2017).
  33. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (66), e3814 (2012).

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Immunologie und Infektion Ausgabe 157 Gliazellen Astrozyten Mikroglia Protozoeninfektion T. cruzi T. gondii
Gleichzeitige Isolierung von Primärastrozyten und Mikroglia bei Protozoenparasiten-Infektion
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Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., … More

Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., de Farias, I. S., Bottino, L. Z. M. F., Bortoluci, K. R. Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection. J. Vis. Exp. (157), e60680, doi:10.3791/60680 (2020).

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