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Immunology and Infection

प्रोटोजोआ परजीवी संक्रमण के लिए प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया का सहवर्ती अलगाव

Published: March 18, 2020 doi: 10.3791/60680
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2
1Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Terapia Celular e Molecular (CTCMol), Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से मूत्र एस्ट्रोसाइट और माइक्रोग्लिया कोशिकाओं को निकालने, बनाए रखने और अलग करने का निर्देश देना है, जिसके बाद प्रोटोजोआ परजीवी के साथ संक्रमण होता है।

Abstract

एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया सबसे प्रचुर मात्रा में ग्लिल कोशिकाएं हैं। वे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में शारीरिक सहायता और होमोस्तासिस रखरखाव के लिए जिम्मेदार हैं। संक्रामक रोगों के नियंत्रण में उनकी भागीदारी के बढ़ते सबूत सीएनएस को प्रभावित करने वाले संक्रमणों के प्रति उनकी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए तरीकों में सुधार में उभरते हित को न्यायोचित ठहराते हैं । सीएनएस में ट्राइपानोसोमा क्रूज़ी (टी क्रूज़ी)और टॉक्सोप्लाज्मा गोंडी (टी गोंदी)संक्रमण के प्रभाव को ध्यान में रखते हुए, यहां हम प्रोटोजोआ परजीवी के साथ मेरिन एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया कोशिकाओं को निकालने, बनाए रखने, अलग करने और संक्रमित करने की विधि प्रदान करते हैं। नवजात कॉर्टिस से निकाली गई कोशिकाओं को आवधिक अंतर मीडिया प्रतिस्थापन के साथ 14 दिनों तक विट्रो में बनाए रखा जाता है। एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया यांत्रिक विसोजन द्वारा एक ही निष्कर्षण प्रोटोकॉल से प्राप्त किए जाते हैं। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा फेनोटाइपिंग के बाद, कोशिकाएं प्रोटोजोआ परजीवी से संक्रमित होती हैं। संक्रमण दर विभिन्न समय बिंदुओं पर फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा निर्धारित की जाती है, इस प्रकार प्रोटोज़ोन आक्रमण और प्रतिकृति को नियंत्रित करने के लिए ग्लियल कोशिकाओं की अंतर क्षमता का मूल्यांकन सक्षम करती है। ये तकनीकें संक्रमण के लिए एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया की प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए सरल, सस्ते और कुशल तरीकों का प्रतिनिधित्व करती हैं, आगे न्यूरोइम्यूनोलॉजी विश्लेषण के लिए क्षेत्र खोलती हैं।

Introduction

सीएनएस मुख्य रूप से न्यूरॉन्स और ग्लिल कोशिकाओं1,2,3से बना है । माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स सीएनएस में सबसे प्रचुर मात्रा में ग्लिया कोशिकाएं हैं। माइक्रोग्लिया, निवासी मैक्रोफेज, सीएनएस3,,4में इम्यूनोसक्षम और फागोसाइटिक ग्लिया सेल है, जबकि एस्ट्रोसाइट्स होमोस्टोसिस को बनाए रखने और सहायक कार्यों को लागू करने के लिए जिम्मेदार हैं5।

हाल के साहित्य में न्यूरॉन्स6,7के समर्थन और संरक्षण के लिए जिम्मेदार होने के लिए ग्लियाल कोशिकाओं को शास्त्रीय रूप से जाना जाता है , जिसमें संक्रमण8,9,10 ,,11के प्रति उनकी प्रतिक्रियाएं शामिल हैं ।10 इस प्रकार, उनके कार्यों को व्यक्तिगत रूप से समझने के लिए इन ग्लियल कोशिकाओं को अलग करने के तरीकों को विकसित करने के लिए एक धक्का है।

प्राथमिक संस्कृतियों के बजाय ग्लिअल कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए कुछ वैकल्पिक मॉडल हैं, जैसे अमर सेल वंश और वीवो मॉडल में। हालांकि, अमर कोशिकाओं को आनुवंशिक बहती और रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरने की अधिक संभावना होती है, जबकि वीवो अध्ययनों में सीमित हेरफेर की स्थिति लागू होती है। इसके विपरीत, प्राथमिक संस्कृतियों को संभालना आसान है, बेहतर वीवो कोशिकाओं में समान है और हमें प्रायोगिक कारकों12,,13को नियंत्रित करने की अनुमति भी देता है। यहां, हम एक ही प्रोटोकॉल में मूत्र एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया प्राथमिक कोशिकाओं को निकालने, बनाए रखने और अलग करने के बारे में दिशानिर्देशों का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम इन संस्कृतियों में प्रोटोजोआ संक्रमण के साथ काम करने के तरीके पर भी उदाहरण प्रदान करते हैं।

नवजात चूहों (3 दिन तक पुराने) से निकाली गई सीएनएस कोशिकाओं को अंतर मीडिया पर 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था जो एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया कोशिकाओं के तरजीही विकास की अनुमति देता है। चूंकि माइक्रोग्लिया संलग्न एस्ट्रोसाइट्स से ऊपर आराम करते हैं, इसलिए कोशिका आबादी को कक्षीय इनक्यूबेटर में यांत्रिक रूप से अलग किया गया था। इसके बाद, हमने माइक्रोग्लिया युक्त सभी अधिनेत एकत्र किए और एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने के लिए ट्राइप्सिन जोड़ा। अलग-थलग ग्याल कोशिकाओं का मूल्यांकन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया जाता था और वांछित प्रयोग के अनुसार चढ़ाया जाता था।

हमने इन अलग-थलग पड़े माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स को प्रोटोजोआ परजीवी से कैसे संक्रमित किया जाए, इस पर उदाहरण भी दिए। टी गोंदी एक अत्यधिक न्यूरोट्रोपिक प्रोटोज़ोन है जो टॉक्सोप्लास्मोसिस14के लिए जिम्मेदार है, जबकि टी क्रूज़मैं चागास रोग के लिए जिम्मेदार है जो सीएनएस15,,16में न्यूरोलॉजिकल विकारों के विकास की ओर ले जा सकता है। इसके अलावा, यह भी बताया गया है कि टी गोंदी17,18 या टी क्रूज़ी19,,,20,,21 के साथ संक्रमण इम्यूनोसमझौता रोगियों में मौत का संभवतः कारण थे । इसलिए, प्रोटोजोआ संक्रमणों को नियंत्रित करने में सीएनएस से ग्लियल कोशिकाओं की इम्यूनोलॉजिक भूमिका का व्याख्या बहुत महत्वपूर्ण है।

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Protocol

चूहों से जुड़ी सभी प्रायोगिक प्रक्रियाएं ब्राजील के राष्ट्रीय कानून (11.794/2008) के अनुसार की गई थीं और साओ पाउलो (UNIFESP) के संघीय विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित की गई थीं ।

1. ग्लिल कोशिकाएं निष्कर्षण, रखरखाव और विसोजन

नोट: ग्लिल कोशिकाओं को निकालने के लिए उपयोग किए जाने वाले चूहों की संख्या वांछित प्रयोगों को करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की मात्रा पर निर्भर करती है। इस प्रोटोकॉल में छह नवजात C57BL/6 चूहों से कुल 27 x 107 एस्ट्रोसाइट्स और 4 x 106 माइक्रोग्लिया प्राप्त किए गए थे। सभी प्रक्रियाओं को एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ हालत के तहत किया गया ।

  1. 1 दिन
    1. शुद्ध हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएस) और एचबीएस + 10% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (सामग्री की तालिकादेखें) तैयार करें।
    2. पूरक डुल्बेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) /एफ 12 (10% एफबीएस + 0.08 एम एम पेनिसिलिन + 0.09 मीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन + 12.5 मीटर हेप्स + 30 मीटर सोडियम बाइकार्बोनेट, पीएच 7.2) के साथ इसे फ़िल्टर करें और इसे 0.22 माइक्रोन फिल्टर (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ फ़िल्टर करें।
      नोट: सभी संस्कृति मीडिया को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए, लेकिन प्रयोग शुरू करने से पहले 20 मिन के लिए उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीवार्म करना आवश्यक है।
    3. एक ऑटोक्लेव में सभी सर्जिकल उपकरणों (कैंची, स्पैटुला और चिमटी) को स्टरलाइज करें और प्रक्रिया के दौरान 70% इथेनॉल का उपयोग करें।
    4. नवजात शिशुओं (3 दिन तक पुराने) चूहों को एक सीलबंद कक्ष में रखें जिसमें गहन संज्ञाहरण के लिए 5 मिन के लिए आइसोफ्लोरीन से लथपथ कपास शामिल है।
    5. माउस पिल्ला को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और जानवर को कैंची से काट लें।
    6. इसे खोलने और मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए कपाल के साथ कैंची के साथ sagittal कट (पूर्वकाल के पीछे) बनाओ। चिमटी का उपयोग कर मस्तिष्क से खोपड़ी अलग। मस्तिष्क की अखंडता को बनाए रखने के लिए माइक्रो स्पैटुला का उपयोग करके मस्तिष्क को हटा दें।
    7. मस्तिष्क को सूखी पेट्री डिश (6 सेमी व्यास) में रखें। एक माइक्रो स्पैटुला का उपयोग करघ्णा बल्ब और सेरिबैलम निकालें। एक और पेट्री डिश (6 सेमी व्यास) एचबीएस + 10% FBS (2 mL/पेट्री डिश) युक्त करने के लिए प्रांतस्था ले जाएँ ।
    8. बाँझ कैंची के साथ छोटे टुकड़ों में मस्तिष्क के ऊतकों में कटौती और एक p1000 माइक्रोपाइपेट का उपयोग कर एचबीएस + 10% FBS के साथ प्रत्येक मस्तिष्क ऊतक हस्तांतरण अलग 15 mL शंकुट्यूब के लिए । सुनिश्चित करें कि अंतिम मात्रा 2 mL/ट्यूब है । यदि नहीं, तो एचबीएस + 10% एफबीएस के साथ पूरा करें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । यदि हां, तो सीएनएस ऊतक के साथ शंकुट्यूब 1 घंटे तक बर्फ पर रखा जाना चाहिए।
    9. कटे हुए मस्तिष्क के ऊतकों को एचबीएसएस + 10% एफबीएस (प्रति ट्यूब) के 3 mL के साथ और डेक्सेशन के बाद धोएं। अतिशयोक्ति को सावधानी से हटा दें। इस स्टेप को 3 बार दोहराएं।
      नोट: इस कदम का उद्देश्य मलबे को हटाना और निकाले गए ऊतकों को ठीक करना है।
    10. कटे हुए मस्तिष्क के ऊतकों को शुद्ध एचबीएस (प्रति ट्यूब) के 3 mL से धोएं और डेक्सेशन के बाद, ध्यान से अधिनेत को हटा दें। इस स्टेप को 3 बार दोहराएं।
      नोट: इस कदम का उद्देश्य पिछले वॉश से शेष सीरम को हटाना है, क्योंकि कोशिकाओं को अगले चरण में ट्राइप्सिनाइज्ड किया जाएगा।
    11. 30 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 00
      नोट: इस कदम का उद्देश्य एकत्र ऊतक को पचाना है।
    12. ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए, ऊतक को एचबीएसएस + 10% एफबीएस की ट्यूब प्रति 3 mL से धोएं और ऊतक के विनाश के बाद, ध्यान से अधिनेत को हटा दें। इस स्टेप को 3 बार दोहराएं।
    13. शुद्ध एचबीएसएस की ट्यूब के प्रति 3 mL के साथ ऊतक धोएं और ध्यान से अधिनेत ः हटा दें। इस कदम को 2 बार दोहराएं।
    14. शुद्ध एचबीएसएस की ट्यूब प्रति 7 मिलीएल जोड़ें और पिपेट में लगातार मार्ग के माध्यम से ऊतक को समरूप करें: पहले 10 मिलीग्राम सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ, इसके बाद 5 मिलीएल और अंत में p1000 माइक्रोपाइपेट के साथ।
    15. समरूपता के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 450 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र ट्यूब।
    16. अधिनायक को त्यागें और प्रति ट्यूब एचबीएस + 10% एफबीएस के 4 mL के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।
    17. इष्टतम सेल संस्कृति आसंजन के लिए एक पूर्वशोधित टी-75 फ्लास्क करने के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
      नोट: प्रत्येक जानवर से ऊतक प्रति फ्लास्क प्रक्रिया करें।
    18. इनक्यूबेटर में फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस और पालन के लिए 30 मिन के लिए 5% सीओ2 रखें।
    19. पूरक डीएमईएम/एफ12 प्रति फ्लास्क और इनक्यूबेट का 10 मिलील 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर जोड़ें ।
      नोट: अंतिम मात्रा 14 mL प्रति फ्लास्क है।
  2. 3 दिन
    1. टी-75 फ्लास्क से संस्कृति माध्यम के 7 मिलीएल निकालें और ताजा पूरक DMEM/F12 के 7 mL जोड़ें ।
      नोट: फ्लास्क में बहुत सारे सेलुलर मलबे और बादल दिखने वाले दिखाई देंगे।
  3. 5 दिन
    1. टी-75 फ्लास्क से सभी माध्यम निकालें और ताजा पूरक DMEM/F12 के 14 मिलीएल जोड़ें ।
      नोट: मलबे और गैर-अनुयायी कोशिकाओं को हटाने के लिए फ्लास्क से मध्यम को प्रतिस्थापित किया जाता है।
    2. प्रत्येक ४८ एच के बाद, supernatant के 6 mL हटा दें और संस्कृति के दिन 14 तक ताजा पूरक DMEM/F12 माध्यम के 7 mL जोड़ें ।
  4. दिन 14
    1. अधिज्ञ के 6 mL को हटाने और ताजा पूरक DMEM/F12 मध्यम के 7 mL जोड़ने के बाद, टी-७५ फ्लैक्स कसकर बंद करो ।
    2. एस्ट्रोसाइट्स से मैकेनिकल रूप से माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए उन्हें 200 आरपीएम और 37 डिग्री सेल्सियस पर फर्श कक्षीय शेखर में रखें।
  5. दिन 15
    1. शेखर से फ्लास्क लें और सेल विसोशन को अनुकूलित करने और माइक्रोग्लिया की अधिकतम संख्या को काटने के लिए उन्हें अपने माध्यम से सख्ती से धोएं। फिर, अधिष्ठाता (माइक्रोग्लिया युक्त) इकट्ठा करें और 50 मीटर शंकुई ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
    2. इसके बाद, एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने के लिए प्रत्येक फ्लास्क में ट्राइप्सिन के 4 mL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए पूरक डीएमईएम/एफ 12 के प्रति फ्लास्क 5 मिलील जोड़ें । फ्लास्क को अपने माध्यम से धोएं और सामग्री को 50 मीटर शंकुट्यूब पर स्थानांतरित करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 450 x ग्राम पर डिसोसिएटेड माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स युक्त सभी ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें।
    5. अधिस्थान त्यागें। 1 mL में माइक्रोग्लिया गोली और पूरक DMEM/F12 के 10 mL में एस्ट्रोसाइट्स को फिर से निलंबित करें ।
    6. एक Neubauer कक्ष या एक स्वचालित सेल काउंटर में सेल गिनती के लिए आगे बढ़ें । एक उपयुक्त फ्लैट नीचे सेल संस्कृति प्लेट में वांछित घनत्व पर पूरक DMEM/F12 के साथ कोशिकाओं को प्लेट (इष्टतम सेल लगाव के लिए पूर्वनिर्धारित; सामग्री की तालिकादेखें) । 37 डिग्री सेल्सियस और 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट कोशिकाओं को संलग्न करने की अनुमति देने के लिए।
      नोट: प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा उनकी शुद्धता की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक सेल आबादी का 1.5 x 106 आरक्षित करें।
    7. सेल आबादी की शुद्धता को सत्यापित करने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण करें।
      नोट: हम माइक्रोग्लिया CD11b+/CD45 +/GFAP-और एस्ट्रोसाइट्स CD11b-/CD45-/GFAP+पर विचार करें ।+- -- Iba1 और TMEM119 धुंधला पूरी तरह से माइक्रोग्लिया22की विशेषता के लिए विचार किया जा सकता है ।
    8. प्रवाह साइटोमेट्री परख के नियंत्रण के रूप में एक FMO (Fluorescence Minus One)23 और प्रत्येक सेल आबादी (एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया) के लिए एक अनदाग नमूना जोड़ें ।
    9. प्रत्येक सेल आबादी के लिए, प्रत्येक दाग और अनदाग नमूनों के लिए 5 x 105 कोशिकाओं को आरक्षित करें। एफएमओ के लिए, माइक्रोग्लिया की दो अन्य ट्यूबों को आरक्षित करें जिसमें प्रत्येक 2.5 x 105 कोशिकाएं हैं और 5 x 105 एस्ट्रोसाइट्स की एक और ट्यूब भी आरक्षित करती हैं।
      नोट: चूंकि माइक्रोग्लिया संख्या एक सीमित कारक हो सकती है, इसलिए अनदाग और एफएमओ नियंत्रण के लिए कम कोशिकाओं का उपयोग करना संभव है।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 450 x ग्राम पर सभी माइक्रोट्यूब अपकेंद्रित्र। सुपरनेट को त्यागें और FACS बफर (फॉस्फेट-बफरेड लवलिन (पीबीएस) + 0.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) + 2 एम ईटीए, पीएच 7.2) के 500 माइक्रोन/माइक्रोट्यूब के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।
    11. 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 x ग्राम पर सभी माइक्रोट्यूब अपकेंद्रित करें। सुपरनेट को त्यागें और 100 माइक्रोन/माइक्रोट्यूब के साथ गोली को एंटी-सीडी16/सीडी32 (क्लोन 93) (1:50) के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट।
    12. 500 माइक्रोट्यूब में एफएसीएस बफर का 500 माइक्रोन/माइक्रोट्यूब जोड़ें और 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 x ग्राम पर अपकेंद्री डालें। एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया धुंधला ट्यूबों को फिर से निलंबित करें और सतह मार्कर मिश्रण के 50 माइक्रोन/माइक्रोट्यूब के साथ एस्ट्रोसाइट एफएमओ ट्यूब भी: एंटी-सीडी45 (पीई, क्लोन 30-F11) और एंटी-सीडी11बी (eFluor 450, क्लोन M1/70) (दोनों 1: 100 पर पतला) ।
    13. अनदाग कोशिकाओं के लिए, FACS बफर की एक ही मात्रा के साथ फिर से निलंबित। माइक्रोग्लिया एफएमओ के लिए प्रत्येक माइक्रोग्लिया ट्यूब को एंटी-सीडी45 या एंटी-सीडी11बी के साथ इनक्यूबेट करें। 20 मिन के लिए सभी नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    14. प्रति माइक्रोट्यूब के 500 माइक्रोन जोड़ें। 5 न्यूनतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 450 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 न्यूनतम के लिए 100 माइक्रोन/माइक्रोट्यूब ऑफ फिक्सेशन बफर (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ पैलेट को फिर से निलंबित करें।
    15. परमीबिलाइजेशन बफर 1x (सामग्री की तालिकादेखें) के 500 माइक्रोन/माइक्रोट्यूब जोड़ें और अंधेरे में 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    16. सेंट्रलाइज सभी माइक्रोट्यूब 450 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए। सुपरनेटेंट को डिस्कार्ड करें। एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया धुंधला ट्यूबों को फिर से निलंबित करें और 1x परमीबिलाइजेशन बफर में 1:100 कमजोर पड़ने में इंट्रासेलर एंटीबॉडी एंटी-जीएफएपी (एपीसी, क्लोन GA5) के ५० माइक्रोन/माइक्रोट्यूब के साथ माइक्रोग्लिया एफएमओ ट्यूब भी । अनदाग कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट एफएमओ के लिए, एफएसीएस बफर की एक ही मात्रा के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। अंधेरे में 30 मिन के लिए सभी सैंपल 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    17. 1x परमीबिलाइजेशन बफर के 500 माइक्रोन/माइक्रोट्यूब जोड़कर सभी ट्यूबों को धोएं। 450 x ग्रामपर सभी माइक्रोट्यूब को सेंट्रलाइज करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए। प्रत्येक माइक्रोट्यूब को एफएसीएस बफर के 200 माइक्रोट्यूब में फिर से निलंबित करें। फ्लो साइटोमीटर पर 1 x 105 इवेंट/सैंपल प्राप्त करें।
    18. विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं को पहले CD11b x CD45 और फिर GFAP हिस्टोग्राम पर गेट किया जाना चाहिए।
      नोट: फाटक निर्धारित करने के लिए अनदाग और एफएमओ नियंत्रण उपयोगी होते हैं।

2. संक्रमण दरों का संक्रमण और मूल्यांकन

  1. टी गोंदी के साथ ग्लिल कोशिकाओं का संक्रमण
    1. प्लेट 3 x 104 माइक्रोग्लिया या 37 डिग्री सेल्सियस पर पूरक DMEM/F12 के साथ एस्ट्रोसाइट्स और 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 एक पूर्व शोधित 96-अच्छी तरह से फ्लैट प्लेट (सामग्री की तालिकादेखें) में।
    2. टी से टैचिज़ोइट्स के साथ प्रत्येक सेल आबादी को संक्रमित करें। गोंडी आरएच तनाव 1:1 (परजीवी:कोशिका) के संक्रमण (MOI) की बहुलता पर पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) व्यक्त करने के पूरक RPMI (3% FBS + ०.१६ mM Penicillin + 0.18 mM Streptomycin + 12.5 m HEPES + 30 m सोडियम बाइकार्बोनेट, पीएच 7.2) (सामग्री की तालिकादेखें) । 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट।
    3. फिर, अधिरत्न को त्यागें और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में पतला 1% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 100 माइक्रोन/वेल जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें।
    4. पीएफए को पीएच 7.2 पर पीबीएस के 100 माइक्रोन/वेल से बदलें।
    5. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए पीबीएस पीएच 7.2 (1:1,000) में पतला डीएपीआई (5 मिलीग्राम/mL) के 50 μL/well पाइपिंग द्वारा सुपरनेटेंट और दाग कोशिकाओं के नाभिक को ध्यान से हटा दें।
    6. पीबीएस (पीएच 7.2) के 100 माइक्रोन/वेल के साथ डीएपीआई धुंधला समाधान को बदलें और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा इसका विश्लेषण करें।
  2. टी क्रूज़ी के साथ ग्लिल कोशिकाओं का संक्रमण
    1. प्लेट 3 x 104 माइक्रोग्लिया या 37 डिग्री सेल्सियस पर पूरक DMEM/F12 के साथ एस्ट्रोसाइट्स और 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 एक पूर्व शोधित 96-अच्छी तरह से फ्लैट प्लेट (सामग्री की तालिकादेखें) में।
      नोट: संक्रमण के हर समय बिंदु के लिए, एक अलग प्लेट का उपयोग करें।
    2. 5:1 (परजीवी:कोशिका) के एमओआई में टी क्रूज़ी वाई तनाव से ट्राइपोमास्टिगोट्स के साथ ग्लियल कोशिकाओं को संक्रमित करें 200 माइक्रोन/अच्छी तरह से पूरक आरपीएमआई और इनक्यूबेट में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 के लिए 2 घंटे के लिए पतला।
      नोट: यह कदम परजीवी द्वारा सेल आक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है।
    3. सभी अलौकिक को हटा दें और सभी अतिरिक्त कोशिकीय परजीवी को हटाने के लिए पूरक आरपीएमआई के 200 माइक्रोन/वेल को जोड़कर कुओं को धोएं। अधिसंचलक निकालें और ताजा पूरक आरपीएमआई के 200 माइक्रोन/वेल जोड़ें।
      नोट: यह कदम उन सभी परजीवीओं को हटाने का इरादा रखता है जिन्होंने अनुयायी कोशिकाओं पर आक्रमण नहीं किया था।
    4. ग्लिल कोशिकाओं11में टी क्रूज़ी प्रतिकृति का मूल्यांकन करने के लिए 2 एच, 48 एच और 96 एच के लिए संक्रमित कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    5. हर बार बिंदु के बाद, अलौकिक को हटा दें और कमरे के तापमान पर 15 न्यूनतम के लिए मेथनॉल के 100 μL/अच्छी तरह से कोशिकाओं को ठीक करें और फिर मेथनॉल को पीबीएस (पीएच 7.2) के 100 माइक्रोन/वेल के साथ बदलें।
    6. निर्धारण के बाद, प्रतिरक्षण परख के लिए कोशिकाओं को इस प्रकार तैयार करें।
      1. ऑटोफ्लोरेसेंस से बचने के लिए 100 माइक्रोन/वेल ऑफ 50 मीटर एनएच4सीएल के साथ 15 मिन के लिए पीबीएस (पीएच 8.0) में इनसेल का इलाज करें। 100 माइक्रोन/वेल ऑफ पीबीएस जोड़कर कोशिकाओं को धोएं और तुरंत निकालें (इस कदम को 3 बार दोहराएं)।
      2. इसके बाद, 15 00 टन के लिए पीबीएस में पतला 100 माइक्रोन/वेल डालकर कोशिकाओं को परमीबिलाइज करें। 100 माइक्रोन/बीबीएस के कुएं को जोड़कर कोशिकाओं को धोएं और तुरंत इसे हटा दें (इस कदम को 3 बार दोहराएं)।
      3. फिर, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस [पीएच 7.2]) में पतला 100 μL/अच्छी तरह से अवरुद्ध समाधान (5% गैर वसा दूध + 2% बीएसए पीबीएस में पतला के साथ सेल संस्कृति को इनक्यूबेट करें। पीबीएस के 100 माइक्रोन/वेल जोड़कर कोशिकाओं को धोएं और तुरंत इसे हटा दें (इस चरण को 3 बार दोहराएं)।
      4. amastigotes दाग करने के लिए, 30 μL के साथ इनक्यूबेट/अच्छी तरह से गैर वाणिज्यिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAb) 2C2 विरोधी Ssp-4 प्रोटीन (1:200) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए समाधान अवरुद्ध करने में पतला ।
      5. पीबीएस के 100 माइक्रोन/वेल जोड़कर कोशिकाओं को धोएं और तुरंत इसे हटा दें (इस चरण को 3 बार दोहराएं)। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में पतला माध्यमिक विरोधी माउस एंटीबॉडी (1:500) के 30 μL/अच्छी तरह से प्लेट इनक्यूबेट ।
        नोट: गैर वाणिज्यिक mAb 2C2 विरोधी एसएसपी-4 प्रोटीन माइक्रोबायोलॉजी, इम्यूनोलॉजी और साओ पाउलो के संघीय विश्वविद्यालय के परजीवी विज्ञान विभाग से प्रो डॉ रेनाटो ए मोर्टारा से एक तरह का उपहार था ।
      6. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए पीबीएस पीएच 7.2 (1:1,000) में पतला डीएपीआई (5 मिलीग्राम/mL) के 50 μL/well जोड़कर सुपरनेटेंट और दाग नाभिक को ध्यान से हटा दें।
      7. पीबीएस पीएच 7.2 के 100 माइक्रोन/वेल के साथ डीएपीआई धुंधला समाधान को बदलें और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा इसका विश्लेषण करें।

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Representative Results

14वें दिन, ग्लियल कोशिकाओं संस्कृति(चित्रा 1ए)यांत्रिक वियोजन से गुजरना पड़ा । सीडी11बी, सीडी45 और जीएफएपी मार्कर के अनुसार प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा अलग-थलग सेल आबादी का विश्लेषण किया गया था। हम एस्ट्रोसाइट आबादी के लिए 89.5% की शुद्धता और माइक्रोग्लिया आबादी के लिए 96.6%(चित्रा 1बी)का निरीक्षण कर सकते हैं। अलगाव के बाद, कोशिकाओं को एक ९६-अच्छी तरह से फ्लैट प्लेट में चढ़ाया गया था और 24 घंटे के बाद वे संबंधित संक्रमण प्रोटोकॉल के अनुसार टी क्रूज़ी या टी गोंदीई से संक्रमित होने के लिए तैयार थे । यहां हमने इन ग्लियल कोशिकाओं में संक्रमण दर मूल्यांकन के उदाहरण के रूप में टी क्रूज़ी का एक समय-पाठ्यक्रम संक्रमण प्रदान किया।

एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया (3 x 104 कोशिकाएं/अच्छी तरह से) 2-96 घंटे(चित्रा 2)के लिए MOI = 5:1 (परजीवी:सेल) पर टी क्रूज़ी से संक्रमित थे । संक्रमण दर का मूल्यांकन प्रतिकार द्वारा कोशिकाओं की संख्या और डीएनए इंटरकालेटर (डीएपीआई) से दागित परजीवी की संख्या की गणना करके किया गया था। संक्षेप में, हम देख सकते हैं कि टी क्रूज़ी इसी तरह की दरों पर माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स पर आक्रमण करने में सक्षम है। इसके अलावा, टी क्रूज़ी दोनों कोशिका प्रकारों में प्रतिकृति, 96 घंटे पोस्ट संक्रमण (पी) पर उच्चतम संक्रमण दर तक पहुंचने। दिलचस्प बात यह है कि 96 बजे संक्रमण दर माइक्रोग्लिया की तुलना में एस्ट्रोसाइट्स में अधिक स्पष्ट है, यह सुझाव देते हुए कि माइक्रोग्लिया कोशिकाएं परजीवी प्रतिकृति को एस्ट्रोसाइट की तुलना में अधिक कुशलता से नियंत्रित करने में सक्षम हैं, जैसा कि हमने पहले11वर्णित किया था।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स या परजीवी व्यक्त करने वाले आनुवंशिक रूप से संशोधित परजीवी का उपयोग इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी में सुधार कर सकता है, क्योंकि वे सेल नाभिक(चित्रा 3)से बेहतर प्रतिष्ठित हैं। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट परजीवी की संक्रमण दर प्रवाह साइटोमेट्री जैसी अन्य तकनीकों द्वारा निर्धारित की जा सकती है। यहां हमने टी गोंदी आरएच तनाव के उदाहरण प्रदान किए हैं, जो वाईएफपी(चित्रा 3ए)और टी क्रूज़ी वाई तनाव को गैर-वाणिज्यिक mAb 2C2 विरोधी Ssp-4 प्रोटीन(चित्रा 3बी)के साथ दाग ित करते हैं।

कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल बताता है कि मूत्र माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स प्राथमिक कोशिकाओं को कैसे निकालना, बनाए रखना और संक्रमित किया जाए, जो अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है, उदाहरण के लिए, कृत्रिम कोशिकाओं की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं प्रोटोजोआ संक्रमण के लिए संक्षेप में स्पष्ट रूप से स्पष्ट यहाँ.

Figure 1
चित्रा 1: प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया कोशिकाएं। (A)संस्कृति के 14वें दिन C57BL/6 मूत्र ग्लियल कोशिकाओं की छवियां उल्टे माइक्रोस्कोप (400x) द्वारा प्राप्त की गई थीं । लाल तीर एस्ट्रोसाइट्स की परत को इंगित करता है और काला तीर माइक्रोग्लिया को इंगित करता है। (ख)यांत्रिक विच्छेदन के बाद, एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया को फ्लोरोसेंट एंटी-सीडी11बी, एंटी-सीडी45 और एंटी-जीएफएपी के साथ (5 x 105 कोशिकाओं) को दाग दिया गया और फ्लो साइटोमेट्री (1 x 105 कोशिकाओं के अधिग्रहण) द्वारा मूल्यांकन किया गया। एस्ट्रोसाइट्स को CD11b-/CD45-और GFAP+ कोशिकाएं माना जाता है, जबकि माइक्रोग्लिया CD11b+/CD45+ और-GFAP-कोशिकाएं हैं ।- - कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ग्याल कोशिकाओं में टी क्रूज़ी संक्रमण का समय-पाठ्यक्रम। C57BL/6 चूहों से एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया टी क्रूज़ी वाई (MOI = 5:1) से संक्रमित थे । 2 एच, 48 एच और 96 एच के बाद, कक्षों को मेथनॉल के साथ तय किया गया था और सेल नाभिक मार्कर DAPI (नीला) और एंटी-GFAP (लाल) के साथ दाग दिया गया था। छवियां उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (400x) द्वारा प्राप्त की गई थीं। कोशिकाओं के अंदर एमास्टिगोट्स की संख्या और संक्रमित कोशिकाओं की आवृत्ति का मूल्यांकन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) द्वारा किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: फ्लोरोसेंट प्रोटोज़ोन परजीवी के साथ एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया संक्रमण। (A)C57BL/6 चूहों से 3 x 104 एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया संक्रमित थे (MOI = 1:1) टी गोंदी आरएच YFP (ग्रीन) के साथ ४८ घंटे के लिए, कक्षों 1% पीएफए के साथ तय किया गया और DAPI (नीले) के साथ दाग । (ख)C57BL/6 चूहों से 3 x 104 एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया को 96 घंटे के लिए टी क्रूज़ी वाई के साथ संक्रमित किया गया था, और कक्षों को शुद्ध मेथनॉल के साथ तय किया गया था और DAPI (ग्रीन) और mAb 2C2 विरोधी Ssp-4 (नारंगी) के साथ दाग दिया गया था। छवियों को एक उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

अलग-अलग जैविक संदर्भों में अलग-थलग पड़े ग्लिल कोशिकाओं के कार्यों का अध्ययन करने के महत्व का पिछले दो दशकों में विस्तार किया गया है । न्यूरॉन्स से परे सीएनएस को समझना अभी भी सेल बायोलॉजी में एक बढ़ता हुआ क्षेत्र है, विशेष रूप से संक्रमण या भड़काऊ स्थितियों8,,9,,24के तहत। ग्लियल कोशिकाएं न केवल न्यूरॉन्स भौतिक समर्थन (जैसा कि पहले से जाना जाता था) के लिए महत्वपूर्ण हैं, बल्कि कई अन्य शारीरिक स्थितियों जैसे न्यूरॉन एनर्जी सप्लाई, न्यूरोमेटाबोलिज्म, प्रतिरक्षा निगरानी, सिनैप्टिक छंटाई, ऊतक को आकार देने और मॉड्यूलेशन जैसे3,,25,,26,,27,,28,,29में भी महत्वपूर्ण हैं।

चूंकि खगोल विज्ञान और माइक्रोग्लिया को संक्रमण या बाँझ सूजन के दौरान अलग ढंग से संग्राहक किया जा सकता है, इसलिए इन ग्लिल कोशिकाओं की व्यक्तिगत और सापेक्ष भूमिका को समझना बहुत महत्वपूर्ण है। हालांकि माइक्रोग्लिया सीएनएस में मोनोन्यूक्लियर फागोसाइट सिस्टम (एमपीएस) का प्रतिनिधित्व करने के लिए जाने जाते हैं, एस्ट्रोसाइट्स को सीएनएस प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं8में एक निर्णायक खिलाड़ी के रूप में भी वर्णित किया गया है। संक्रमण और/या सूजन के संदर्भ में प्रत्येक ग्लियल सबसेट की भूमिका की तुलना करने के लिए, उन्हें एक ही निष्कर्षण और शर्तों से प्राप्त करना अनिवार्य है । संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स की प्रभावक प्रतिक्रियाओं के बारे में कुछ रिपोर्टें हैं, विशेष रूप से प्रोटोज़ोन परजीवी के संबंध में। इस अर्थ में, हमने हाल ही में माइक्रोग्लिया में टी क्रूज़ी प्रतिकृति के नियंत्रण के लिए NLRP3 इंफ्लेममसम की आवश्यकता का प्रदर्शन किया, लेकिन नाइट्रिक ऑक्साइड (नहीं) स्राव11से जुड़े तंत्र द्वारा एस्ट्रोसाइट्स में नहीं।

यह प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करता है जो प्रसवोत्तर (3 दिन पुराने) चूहों से दो सबसे प्रचुर मात्रा में ग्लियल कोशिकाओं की आबादी, एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया निकालने पर केंद्रित है। 3 दिन से पुराने नवजात चूहों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन हमने अनुभव किया कि दोनों कोशिकाओं की उपज समय के साथ थोड़ी कम हो जाती है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। हमारी विधि एस्ट्रोसाइट्स या माइक्रोग्लिया अलगाव के लिए पहले वर्णित प्रोटोकॉल से अलग है क्योंकि हमने एक ही निष्कर्षण में दोनों सेल प्रकारों को प्राप्त करने और अलग करने पर ध्यान केंद्रित किया, एक ही शर्तों के तहत, इस प्रकार प्रयोगात्मक जानवरों के उपयोग को अनुकूलित करता है और प्रतिरक्षा संदर्भों में उन कोशिकाओं के लिए सापेक्ष भूमिका के अध्ययन में सुधार होता है। इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल ने दोनों सेल प्रकारों की उपज को भी अनुकूलित किया। यील्ड आमतौर पर 3-5 x 106 एस्ट्रोसाइट्स और 3-5 x 105 माइक्रोग्लिया प्रति फ्लास्क होता है। इसकी तुलना अन्य प्रोटोकॉलों से करें जो प्रति टी-75 फ्लास्क अधिक जानवरों का उपयोग करके कम कोशिकाओं में परिणाम देते हैं (कुछ प्रोटोकॉल प्रति फ्लास्क 2-3 जानवरों का उपयोग करते हैं)30,,31।

इस प्रोटोकॉल का एक और लाभ अलग एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय है। 14 दिनों के भीतर परिपक्व माइक्रोग्लिया प्राप्त करना संभव है। वास्तव में, यह उजागर करना महत्वपूर्ण है कि, जैसा कि फ्लोड और कॉम्ब्स ने प्रदर्शित किया, 14 दिनों से पुराने माइक्रोग्लिया साइटोकिन्स को स्रावित करने की क्षमता कम करते हैं; यह बहुत न्यूरोइम्यूनोलॉजिकलसंदर्भ30में इस पर विचार महत्वपूर्ण है . इस तथ्य के बावजूद कि एस्ट्रोसाइट के लिए परिपक्व निर्मातापूरी तरह से समझ में नहीं आते हैं, GFAP का उपयोग काफी हद तक उत्तरदायी और सक्रिय एस्ट्रोसाइट्स की विशेषता के लिए किया जाता है। कुछ प्रोटोकॉल संस्कृति के 21 या 28 दिनों के बाद ही 90% GFAP सकारात्मक कोशिकाओं के स्तर को प्राप्त करते हैं। इस कारण से, हमने एक विधि का प्रस्ताव किया जो प्रदान की गई थी, कोशिकाएं जो इम्यूनोअनुत्तरदायी हैं और ज्यादातर 7-14 दिनों के भीतर परिपक्व होती हैं। हालांकि शुद्धता एस्ट्रोसाइट31 और माइक्रोग्लिया30दोनों के लिए अन्य तरीकों की तुलना में कम हो सकती है, मुख्य ध्यान एक सहवर्ती निष्कर्षण में अधिक मात्रा में माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स प्राप्त करना था। हम समझते है कि सेल आबादी आगे हल किया जा सकता है या कॉलम जुदाई के साथ अलग करने के लिए अपनी शुद्धता में सुधार होगा । इसके लिए, अतिरिक्त सेल मार्कर शामिल किए जा सकते हैं, जैसे कि माइक्रोग्लिया के लिए Iba1 या TMEM119; एस्ट्रोसाइट्स के लिए एक्वापोरिन-4 या S100B, ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स के लिए सीसी 1 या O4 और न्यूरॉन्स के लिए NeuN22,,31,,32,,33। हालांकि, प्रोटोकॉल के अंत में एक महत्वपूर्ण सेल हानि पर विचार किया जाना चाहिए।

इस प्रकार, हमने एक कुशल और सस्ते प्रोटोकॉल में माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स को सहवर्ती रूप से प्राप्त करने के लिए एक संशोधित विधि प्रदान की। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल न्यूरोइम्यूनोलॉजिकल संदर्भों में ग्लियल सबसेट के तुलनात्मक अध्ययन की अनुमति देने वाली एक महान उपज के फायदे प्रदान करता है, जैसा कि टी क्रूज़ी और टी गोंडी संक्रमण के दौरान यहां सचित्र है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम संघीय साओ पाउलो विश्वविद्यालय (UNIFESP) से प्रोफेसर डॉ रेनाटो ए मोर्टारा को mAb 2C2 विरोधी Ssp-4 के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को फंडाकाओ डी एम्पारो à पेस्क्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो (FAPESP, अनुदान 2017/25942-0 से केआरबी), कॉन्सेल्हो नैसिनल डी डेसेनवोल्विमेंटो सिएंटिफिको ई टेक्नोलोकोको (सीएनपीक्यू, से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था केआरबी को अनुदान 402100/2016-6), इंस्टीटो नैसिनल डी सिएनसिया ई टेक्नोलोगिया डी वैसिनास (INCTV/CNPq) और कूर्डेनकाकाओ डी एपरफेकोमेंटो डी पेस्सोल डी निवेल सुपीरियर (कैप्स, फाइनेंस कोड 001) । M.P.A. CNPq से फैलोशिप प्राप्त करता है, A.L.O.P. CAPES से फैलोशिप प्राप्त करता है, और I.S.F. और L.Z.M.F.B. FAPESP से फैलोशिप प्राप्त करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% Ethanol Dinâmica Química Contemporânea Cat: 2231 Sterilize
75 cm2 Flask Corning Cat: 430720U Plastic material
96 well cell culture plate Greiner Cellstar Cat: 655090 Cell culture
Ammonium Chloride (NH4Cl) Dinâmica Química Contemporânea Cat: C10337.01.AH Remove autofluorescence
Anti-GFAP antibody Abcam Cat.: ab49874 Immunofluorescence antidoby
Bottle Top Filter 0.22 μmm CA Corning Cat: 430513 Culture medium filter
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich Cat: A7906 FACS Buffer preparation
CD11b (FITC) BD Pharmigen Cat.: 553310 Flow cytometry antibody
CD45 (PE) Invitrogen Cat.: 12-0451-83 Flow cytometry antibody
Centrifuge Eppendorf Cat: 5810R Centrifugation
Centrifuge Eppendorf 5415R Centrifugation
Class II biosafety cabinet Pachane Cat: 200 Biosafety cabinet for sterile procedures
CO2 Incubator ThermoScientific Model: 3110 Primary cells maintenance
Conical tubes 15 mL Corning Cat: 430766 Plastic material
Conical tubes 50 mL Corning Cat: 352070 Plastic material
Countess automated cell counter Invitrogen Cat: C10281 Cell counter
DAPI Invitrogen Cat.: D1306 Immunofluorescence antidoby
Digital Microscope Camera Nikon Cat: DS-RI1 Capture images on microscope
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco Cat: 12800-058 Cell culture medium
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich Cat: E9884 FACS Buffer preparation
F12 Nutrient Mixture Gibco Cat: 21700-026 Cell culture medium
FACS Canto II BD Biosciences Unavaiable Flow cytometer
Fetal Bovine Serum (FBS) LGC Biotechnology Cat: 10-bio500-1 Cell culture medium supplement
Flow Jo (software) Flow Jo Version: Flow Jo_9.9.4 Data analysis
Fluorescence intenselight Nikon Cat: C-HGFI Fluorescence source
GFAP (APC) Invitrogen Cat.: 50-9892-82 Flow cytometry antibody
Goat - anti-mouse IgG (FITC) Kirkeegood&Perry Lab (KPL) Cat.: 172-1806 Immunofluorescence antidoby
HBSS - Hank's Balanced Salt Solution Gibco Cat: 14175079 Cell culture medium
HEPES Sigma Aldrich Cat: H4034 Cell culture medium supplement
IC Fixation Buffer Invitrogen Cat: 00-8222-49 Cell fixation for Flow Citometry
Inverted microscope Nikon Model: ECLIPSE TS100 Microscope
Isoflurane Cristália Cat: 21.2665 Inhaled anesthetic
Methanol Synth Cat: 01A1085.01.BJ Fixation for Immunofluorescence
Micro spatula ABC stainless Unavaiable Surgical material
Microtube 1.5 mL Axygen Cat: MCT-150-C Plastic material
Monoclonal antibody (mAb) 2C2 anti-Ssp-4 Non commercial Non commercial Immunofluorescence antidoby
Multichannel Pipette (p200) Corning Cat: 751630124 Pipette reagents
NIS Elements Software Nikon Version 4.0 Acquire and analyse images
Non-fat milk Nestlé Cat: 9442405 Blocking solution for immunofluorescence
Orbital Shaker Incubator ThermoScientific Model: 481 Cat: 11 Dissociate microglia from astrocytes
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich Cat: P6148 Fixation for Immunofluorescence
PBS Non commercial Non commercial Neutral Buffer
Penicillin G Sigma Aldrich Cat: P-7794 Cell culture medium supplement
Permeabilization Buffer (10x) Invitrogen Cat: 00-8333-56 Cell permeabilization for Flow Citometry
Petri dish 60 mm x 15 mm (Disposable, sterile) Prolab Cat: 0303-8 Plastic material
pH meter Kasvi K39-1014B Calibrate pH solution
RPMI 1640 Medium Gibco Cat: 31800-014 Cell culture medium
Scissors ABC stainless Cat: LO9-W4 Surgical material
Serological pipette 10 mL Corning Cat: 4101 Plastic material
Serological pipette 5 mL Corning Cat: 4051 Plastic material
Single Channel Pipette (p1000) Gilson Pipetman Cat: F123602 Pipette reagents
Single Channel Pipette (p200) Gilson Pipetman Cat: F123601 Pipette reagents
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich Cat: S6297 Cell culture medium supplement
Streptomycin sulfate salt Sigma Aldrich Cat: S9137 Cell culture medium supplement
Triton X-100 Sigma Aldrich Cat: T9284 Permeabilization for immunofluorescence
Trypsin Gibco Cat: 27250-018 Digestive enzyme
Tweezers ABC stainless Cat: L28-P4-172 Surgical material
Water Bath Novatecnica Model: 09020095 Digeste tissue at 37 °C with trypsin

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References

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इम्यूनोलॉजी एंड इंफेक्शन इश्यू 157 ग्लिया सेल्स एस्ट्रोसाइट्स माइक्रोग्लिया प्रोटोजोआ इंफेक्शन टी क्रूजी, टी गोंदी
प्रोटोजोआ परजीवी संक्रमण के लिए प्राथमिक एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया का सहवर्ती अलगाव
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Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., … More

Pacheco, A. d. O. L., Amaral, M. P., de Farias, I. S., Bottino, L. Z. M. F., Bortoluci, K. R. Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection. J. Vis. Exp. (157), e60680, doi:10.3791/60680 (2020).

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