Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ויזואליזציה של מקרופאג Lytic תא המוות במהלך זיהום פטרת העוברים באמצעות מיקרוסקופ אינטרטל

Published: January 9, 2019 doi: 10.3791/60698
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, 2School of Life Sciences, Bengbu Medical College

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקה להמחיש התנהגות מקרופאג ומוות העובריים מתחלקים במהלך הזיהום של מריחיידק של פטרת . צעדים להכנת חיידקים, זיהום העוברים, ומיקרוסקופ ה, כלולים. טכניקה זו עשויה להיות מיושמת על התבוננות של התנהגות תאית ומוות בתרחישים דומים הכרוכים זיהום או דלקת סטרילית.

Abstract

Zebrafish הוא אורגניזם מודל מעולה לחקר התנהגות התא החיסונית מולדת בשל טבעו שקוף הסתמכות אך ורק על מערכת החיסון שלה מולדת במהלך ההתפתחות המוקדמת. Zebrafish מריחיידק מארנום (מ. מרנום) מודל זיהום כבר הוקמה היטב ללמוד תגובה חיסונית מארחים נגד זיהום פטרת. יש כבר הציע כי שונים סוגי מוות מקרופאג cell יוביל לתוצאות מגוונות של זיהום בקטריאלי. כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ המקרופאג להתבונן במוות התאים בתוך עוברי דגים בעקבות זיהום מ. מרנום . Zebrafish הקווים הטרנסגניים במיוחד בתוויות מקרופאגים ו נויטרופילים נגועים באמצעות מיקרוהזרקה שרירית של fluorescently אופן שכותרתו M. marinum באמצע המוח או המטען. עוברים מזוהמים העוברי דגים הם רכוב לאחר מכן על התכה נמוכה ההיתוך ונצפתה על ידי המיקרוסקופיה בממדים X-Y-Z-T. מכיוון שהדמיה לטווח ארוך מחייבת שימוש בכוח לייזר נמוך כדי למנוע הלבנת ופוטורעילות, מומלץ לבטא מאוד את הביטוי. פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה של התהליכים הדינאמיים ב vivo, כולל העברת תאים חיסוניים, אינטראקציה עם הפתוגן מארח, ומוות תאים.

Introduction

זיהום פטרת הוכח לגרום למוות תא החיסון מארח1. למשל, זן מחליש יהיה להפעיל אפופטוזיס במקרופאגים ולהכיל את הזיהום. עם זאת, זן המוני יהיה להפעיל את המוות התא lytic, גרימת הפצת חיידקים1,2. בהתחשב ההשפעה האלה סוגים שונים של מוות תאים יש על מארח התגובה נגד פטרת, התבוננות מפורטת של מקרופאג cell מוות במהלך זיהום פטרת ב vivo הוא צורך.

השיטות הקונבנציונליות למדידת מוות תאי הן להשתמש בכתמי תאים מתים, כגון V, tunel, או אקרידיין אורנג '/propidium יודידה כתמים3,4,5. עם זאת, שיטות אלה אינן מסוגלים לשפוך אור על התהליך הדינמי של מוות התאים בvivo. האבחנה של מוות תאים בתוך מבחנה כבר הונחה על ידי הדמיה חיה6. עם זאת, האם התוצאות מחקות במדויק את התנאים הפיסיולוגיים נותרים ברורים.

Zebrafish כבר מודל מצוין עבור לימוד מארח נגד פטרת תגובות. יש מערכת חיסונית שימור מאוד דומה לזה של בני אדם, הגנום מניפולציות בקלות, והעוברים המוקדמים הם שקופים, אשר מאפשר הדמיה חיה7,8,9. לאחר ההדבקה עם מ. מרנום, בוגרים מסוג זברפיש מבנים טיפוסיים של גרגירומת מבוגרים, ויוצריםבצורת מבנה שכגרגירומה מוקדםמבנים 9,10. התהליך הדינמי של האינטראקציה הטבועה תא החיסונית בקטריה כבר נחקרו בעבר במודל דג זברה M. מרנום מודל11,12. עם זאת, בשל הדרישה גבוהה מרחבית ברזולוציה הזמנית, הפרטים המקיפים את מותם של תאים חיסוניים מולדים להישאר במידה מוגדרת ברובו.

כאן אנו מתארים כיצד להמחיש את התהליך של מוות תא מקרופאג lytic המופעל על ידי זיהום פטרת בvivo. פרוטוקול זה עשוי להיות גם להחיל על התנהגות תאית הvivo במהלך פיתוח ודלקת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Zebrafish גדלו תחת תנאים סטנדרטיים בהתאם הנחיות בעלי חיים מעבדה לסקירה אתית של בעלי חיים רווחה (GB/T 35823-2018). כל ניסוי דג זברה במחקר זה אושרו (2019-A016-01) וניהל ב שנגחאי הציבור בריאות קלינית המרכז, אוניברסיטת fudan.

1. M. מרנום תא יחיד הכנה לרשת (איור 1)

  1. הפשרת Cerulean-פלורסנט M. marinum גליצרול מלאי מ-80 ° c והאיחסן לוחית 7h10 אגר עם 10% (v/v) oadc, 0.25% גליצרול ו 50 Μg/mL hygromycin. מודקת את הצלחת ב 32 ° c עבור כ 10 ימים.
  2. בחר מושבה המבטא זריחה חיובית והאיחסן 3 מ ל של 7H9 בינוני עם 10% OADC, 0.5% גליצרול, ו 50 μg/mL hygromycin.
    1. מודדקת את החיסונים ב 32 ° צ' ו 100 מהפכות לדקה (rpm) עבור 4 – 6 ימים עד התרבות מגיעה לשלב לוגריתמי (OD600 = 0.6 – 1.0).
    2. תת-תרבות (1:100) ב 30 מ ל של טריים 7H9 בינוני עם 10% OADC, 0.5% גליצרול, 0.05% יצירת רצף-80, ו-50 μg/mL עד OD600 מגיע ~ 1.0.
      הערה: לאיכות התרבות הגבוהה ביותר, מומלץ לשלב זה צעד תת-תרבות. בניסיון שלנו, הוספת שיבוט ישירות לנפח גדול של בינוני יוביל היווצרות של גושים חיידקיים.
  3. לאסוף תאים M. מרנום כמתואר להלן.
    1. צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 10 דקות כדי לאסוף את M. מרנום כמו גלולה. למחוק את כל אבל 300 μL של supernatant ולהשתמש בו כדי להשעות מחדש את הגלולה.
    2. הוסף 3 mL של 7H9 בינוני עם 10% גליצרול כדי להשהות עוד יותר את הגלולה, ולאחר מכן sonicate את ההשעיה באמבט מים ב 100 W ב 15 s ON, 15 s ביטול עבור סכום כולל 2 דקות.
      הערה: המטרה של sonication היא להשיג תא בודד המגון לצורך האירשת, אשר תמנע חסימה של מחט המיקרו הזרקה.
  4. להעביר את ההשעיה חיידקים 10 mL מזרק, ואז לעבור דרך מסנן 5 יקרומטר כדי להסיר את כל הגושים בקטריאלי.
  5. למדוד את הצפיפות האופטית (OD) של ההשעיה באמצעות ספקטרוסקופיה ולדלל אותו OD600 = 1.0 עם מדיה 7H9 המכיל 10% גליצרול. לחלק את ההשעיה לתוך 10 μL הבליטים ולאחסן ב-80 ° c מקפיא לשימוש עתידי.
  6. לאשר את הריכוז החיידקי של האינוניות (cfu/mL) על ידי דילול סדרתי ציפוי של מלאי בקטריאלי על הצלחת 7H10 אגר המכיל 10% (v/v) של OADC, 0.5% של גליצרול, ו 50 μg/mL של hygromycin.

2. הכנה לעובר בדגים

  1. , אחד מיום לפני ההשרצה. להקים זוגות מתרבים בחדר הרבייה
    הערה: הוסף רק זוג אחד לכל חדר רבייה.
  2. לאסוף את העוברים בבוקר למחרת בתוך 1 h הפריה הפוסט (hpf). בזהירות לשטוף את העוברים עם מים מזוקקים ולהעביר עד 100 עוברים לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ המכיל 30 מ ל של E3 מדיום. מודטה ב 28.5 ° c.
  3. לאחר 12 שעות, להתבונן תחת מיקרוסקופ ולהשליך ביצים לא מופרות או פגום.
  4. ב 24 hpf, לשנות את המדיום ל-E3 בינונית טרייה עם N-פניylourea (PTU, 0.2 nM הריכוז הסופי) כדי למנוע את התפתחותם של פיגמנט. מודטה את העוברים ב 28.5 ° c עד העוברים מוכנים מיקרוהזרקה.

3. זיהום באמצעות מיקרו הזרקה חיידקית

  1. הכנת בורוסיליקט מחטי זכוכית מיקרוקפילר כפי שמתואר קודם לכן בהתייחסות13.
  2. עוברי דג שעוברים הרכבה לזיהום
    1. מיקרוגל 100 mL של 1% (w/v) ו 100 mL של 0.5% (w/v) התכה נמוכה ההיתוך בינונית E3 עד הצמח נמס לחלוטין. לחלק לצינורות mL 1 מ"ל ולאחסן ב 4 ° צ' לשימוש עתידי.
    2. לפני השימוש, לחמם את הצמח ב 95 מעלות צלזיוס בלוק חימום עד שהוא נמס לחלוטין. שמור על הצמח בצורה נוזלית על-ידי הצבתו בבלוק של 45 ° c (איור 2).
    3. הרכבה לזיהום תוך-שרירית באזור הגזע
      1. צור את שכבת agarose התחתונה על-ידי שפיכת 0.5 mL של 1% (w/v) התעוררה באופן שווה על שקופית זכוכית. מניחים על תיבת קרח או משטח קר עבור 3 דקות כדי לגבש.
      2. העבר את עוברי הדג (48 – 72 hpf) ב מי ביצה עם tricaine (200 μg/mL) ו-PTU עבור 5 דקות לפני ההרכבה. מקום עד 60 דג זברה עוברים על השכבה התחתונה agarose ולהניח אותם בזהירות לתוך שתי שורות (איור 2ב).
      3. הסר את המים הנותרים על השכבה התחתונה agarose עם נייר טישו לפני הוספת 0.3 mL של 0.5% (w/v) agarose כדי ליצור את השכבה העליונה. ודא כי העוברים מוטבעים לחלוטין בתוך הצמח. החזר את שקופית הזכוכית אל תיבת הקרח שוב כדי לחזק את הצמח ולמנוע התייבשות.
      4. לשמור על השכבה העליונה של agarose לחות על ידי כיסוי פני השטח עם תוספת E3 מי ביצה.
    4. הרכבה לזיהום מוחי בינוני
      1. לכסות את החריץ של מיקרוסקופ יחיד מיקרוסקופית זכוכית שקופית עם 1% (w/v) agarose, ולאחר מכן להעביר את 4 – 6 עוברים מורדם לתוך הצמח.
      2. מקמו את ראשו של כל עובר כלפי מעלה בזהירות עם מחט של 10 גר' (איור 2ג).
      3. לאחר כל מיקומי העוברים קבועים, להעביר את שקופית הזכוכית לתיבת קרח או משטח קר כדי לאפשר לחזק את הצמח.
        הערה: הימנע מדילול ההיתוך נמוך על ידי מזעור נפח של העברת מים ביצה עם העוברים.
  3. הכנת חיידקים לזיהום
    1. הוסף 1 μl של מסוננים סטרילי-פנול אדום (10x) ל 10 μl סדרת מחלקים של מלאי חיידקי (עשה בשלב 1) ולערבב על ידי vortexing בקצרה.
      הערה: ניתן לכוונן את הריכוז הסופי באמצעות ה-PBS הסטרילית.
    2. Sonicate ההכנה באמצעות 100 W ב -10 s ON, 10 s כבוי עבור 1 דקות כדי לשבור את כל הגושים שייתכן שנוצרו14.
  4. זיהום באמצעות מיקרו-הזרקה
    1. כוונן את המיקרו-מזרק והמיקרומניפולציה למיקום הנכון ולהגדרה של מיקרוהזרקה כפי שדווח בעבר על13.
    2. העברה 3 μL של הכנה חיידקית באמצעות מטעין מיקרו לתוך המחט מוכן (ראה שלב 3.1). הפיפטה לאט ובזהירות כדי להימנע מיצירת בועות אוויר.
    3. עבור זיהום אזור הגזע, להזריק 100 cfu לתוך אזור הגזע (איור 3א). הימנע מהזרקת חיידקים לתוך מיתר הנוטוקורד.
      הערה: cfu להזרקה מוערך על ידי הנוסחה cfu = ריכוז מלאי חיידקי x דילול גורם x הזרקה droplet. Cfu בפועל הוא אישר על ידי ציפוי טיפה אחת של בקטריות בצלחת 7H10 אגר המכיל 10% (v/v) של OADC, 0.5% של גליצרול, ו 50 μg/mL של hygromycin.
    4. עבור זיהום המוח האמצע, להזריק על 500 cfu לתוך האזור המוח אמצע (איור 3ב).
    5. לאחר המיקרוהזרקה, שוטפים בזהירות את העוברים לתוך מי ביצה טריים עם פיפטה פלסטיק.
      הערה: העוברים הר בצלחת הזכוכית בתחתית בהקדם האפשרי כדי לכסות את התצפית של התגובה המוקדמת מאוד מולדת התא החיסונית.

4. הדמיה חיה של הזיהום

  1. הרכבה לדגים להדמיה חיה
    1. העברה עד 10 העוברים tricaine-מ, לאמצע התחתונה זכוכית 35 mm צלחת. התעלם מאמצעי E3 נוסף.
    2. לכסות את הצלחת עם 1% התכה נמוכה בנקודה והאוריינט העוברים בזהירות באמצעות המחט 10 G. מקרין את הקערה בתחתית הזכוכית על קרח 10 כדי לחזק את הצמח.
      הערה: לצורך הזרקת מוח מוחית, יש לרכוב על עוברים בתוך הצמח כאשר הראש מופנה כלפי מעלה (איור 4א). עבור האזור גזע הזיהום הפנימי, העוברים צריך להיות מותקן בתוך הצמח (איור 4ב).
    3. ברגע שהוא התחזק לחלוטין, לכסות את agarose עם שכבה של מי ביצה (פלוס 1 x tricaine ו PTU).
  2. שלושה צבעים ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית
    הערה: השלבים הבאים מופעלים על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצויד 63.0 x 1.40 הנפט היעד UV עדשה.
    1. הגדר את טמפרטורת חדר הסביבה עד 28.5 ° c. מניחים כמה נייר טישו רטוב בתוך החדר כדי לספק לחות ולמנוע אידוי של מי ביצה (משלים איור 1).
    2. מניחים את הצלחת 35 מ"מ זכוכית בתחתית עם דג דג זברה בחדר הסביבה.
    3. פתח את התוכנה הקונקלית ואתחל את הבמה. עבור אל מטרת ה-UV של 63.0 x 1.40 שמן, ואתר את הדגים באמצעות ערוץ השדה הבהיר עם מסנן ניגודיות דיפרנציאלי (DIC).
    4. פתח את 405 דיודות, ארגון (20% כוח), ו DPSS 561 לייזר nm. הגדרת עוצמת הלייזר והגדרות הספקטרום המתאימות.
      הערה: להלן הגדרות הספקטרום עבור Cerulean (עירור = 405 nm; פליטה = ~ 456 – 499 nm), eGFP (עירור = 488 nm; פליטה = ~ 500 – 550 ננומטר), DsRed2 (עירור = 561 nm; פליטה = ~ 575 – 645 nm) (משלים איור 2B).
    5. בחר את "XYZ" "סריקה סדרתית" מצב הרכישה ולהגדיר את הפורמט תמונות "512 x 512 פיקסלים" (איור משלים 2a).
    6. עבור אל 'מצב נתונים חי'. למקד את המיקום של הדגים הראשונים ולסמן את מיקום "התחל" ו "סוף" Z. חזור על תהליך זה עבור כל אחד מהעוברים הנותרים. ניתן להוסיף "השהה" בסוף התוכנית (איור משלים 2 ג).
    7. הגדר את הלולאה ואת מחזור התוכנית.
    8. . שמור את הקובץ

5. תא יחיד UV הקרנה לגרום אפופטוזיס והדמיה חיה

  1. דג הר כפי שמתואר בשלב 4.1.
  2. הדמיה של אזור אמצע המוח של 3 ימים הפריה (dpf) מקרופאג העובר הספציפי Tg (mfap4-eGFP) 15
  3. בחר את האזור של העניין של ממקרופאג אחד בודד התווית ולסרוק ב-400 Hz מהירות 6% לייזר UV כוח עבור 50 s.
    הערה: מהירות הסריקה והזמן צריכים להיות ממוטבים בהתאם למיקרוסקופ הבודד. זמן סריקה צריך להיות ממוטב כדי לגרום נזק DNA נרחב כי לאחר מכן לגרום היעד תאים אפופטוזיס, אבל לא photobleach כל התא.
  4. חזור על השלב שלעיל כדי להקרין תאי יעד נוספים.
  5. בצע הדמיית זמן הדמיה של אזור אמצע המוח כמתואר בסעיף 4.

6. עיבוד תמונה

  1. בצע "הטלה מקסימלית" עבור התמונות שנרכשו.
  2. חפש וסמן את המיקום והשעה של תרשימי XY בתאי היעד תחת התצוגה "הקרנה מקסימלית".
  3. חזור אל התצוגה הרגילה כדי לחפש ולסמן את מיקום Z של תאי היעד.
  4. חתוך את תמונת השכבה הבודדת של תאי היעד.
  5. יצא את ערוץ הכיסוי והשדה הבהיר כסרטוני וידאו בתבנית AVI.
  6. חתוך את אזור העניינים של ערוץ הכיסוי והשדה הבהיר ב-ImageJ.
  7. לשלב את שני קטעי וידאו בשלב האחרון אנכית ולשמור כמו וידאו אחד בפורמט AVI ב-ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זיהום פטרת יכול להפעיל תגובות מארח שונים מבוסס על נתיבי זיהום. בפרוטוקול זה, עוברי דג דג זברה נגועים על ידי הזרקת מיקרותוך שרירית של חיידקים המסומנים fluorescently לתוך המוח האמצע או המטען (איור 3) ונצפתה על ידי הדמיה מוקד חי. זיהום באמצעות שני המסלולים הללו יהיה באופן מקומי להגביל את הזיהום גרימת גיוס התא החיסונית מולדים מוות התאים הבאים.

המחשה של הפרטים של מוות תא החיסון הטבוע הוא מאתגר. מוות תאי ליטיק מתרחש על חלון זמן קצר מאוד ודורש מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה כדי להתבונן. כמו כן, התנועתיות הגבוהה של תאים חיסוניים מולדים מאפשרת להם לנדוד אל מחוץ לאזור התצפית. בפרוטוקול זה, אנו פותרים בעיה זו על-ידי התבוננות בעוברים מרובים במקביל. מערך של עוברי דג זברה יכול להיות רכוב על מיקרוסקופ זכוכית אחת שקופית לזיהום, עד 10 עוברים ניתן לרכוב על אותו 35 mm זכוכית התחתון המנה עבור הדמיה חיה (איור 4). על ידי ניצול של מודל נתונים חי של מיקרוסקופ קונפוקלית יותר מעובר אחד ניתן לצפות בו זמנית. זה משפר את היעילות של הדמיה חיה מגדיל מאוד את ההסתברות של לכידת כל תהליך המוות של תאים ליטיים.

המערכת החיסונית מולדת היא השורה הראשונה של הגנה מפני זיהום פטרת, ושני רכיבים מרכזיים הם מקרופאג ו נויטרופילים. כאן אנו משתמשים דיווחו בעבר tg (coro1a: egfp; lyzDsRed2) ו Tg (mpeg1: loxp-dsredx-loxp-egfp; lyz: egfp) כדי להבדיל בין מקרופאגים ואת נויטרופילים ב vivo16,17,18. מקרופאג הכבדות עם חיידקים הפכו עגול ומוצג תנועתיות מופחתת, עם נפיחות cytoplasmic בסופו של דבר, התנפחות של קרום התא, והפצה מהירה של התוכן cytoplasmic. אירועים אלה הם שינויים אופייניים מורפולוגיים של מוות תאי lytic כפי שדווחו בעבר (איור 5A)16. הקרנה UV שימש להפעלת תאים כדי לעבור אפופטוזיס ב דג זברה20,21. בהתאם לרעיון הזה, מקרופאגים אולטרא סגול הראו פנוטיפים אופייניים לתא האפוטוטיק, כגון הצטמקות התאים, פיצול גרעיני ועיבוי כרומטין (איור 5b)22,23. בשילוב עם השימוש Cerulean-פלורסנט M. marinum19, שלושה צבעים חיים הדמיה של האינטראקציה בין מקרופאג, נויטרופילים, ו -M. marinum הושגה בvivo. הבחנו גם כי מקרופאגים יכולים באופן פעיל phagocytose והפצת M. marinum (איור משלים 3 א). עם זאת, נויטרופילים היתה יכולת phagocytic מוגבלת ובמהירות עברה מוות של תאים מבלי ברור engorgement שחתת (איור משלים 3 ב). נויטרופילים יכול להיות מופעל על ידי phagocyציטוזה של רק מעטים מת M. marinum כי לא מבטאים Cerulean-פלואורסצנטית, או פשוט על ידי phagocyציטוזה של פסולת תא מת מוגבלת.

Figure 1
איור 1: תרשים סכמטי של הכנה לחיידק התא בודד. תא יחיד Cerulean-פלורסנט M. marinum מניות הופקו בעקבות התהליך המתואר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תרשים של העובר הכפיש הרכבה למיקרו הזרקה. (א) תרשים סכמטי של תהליך ההרכבה. (ב) עוברי-דג שעברו מהצד האחר לזיהום של אזור הגזע. (ג) עוברי הדגים המופרשים בראשם כלפי מעלה לזיהום המוח המראשי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מיקום מיקרוהזרקה. (א) החץ האדום מציין את אתר ההזרקה להידבקות באזור הגזע. (ב) החץ האדום מציין את אתר ההזרקה של זיהום המוח באמצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הרכבה של עוברי דגים עבור הדמיה חיה. (א) עבור זיהום המוח באמצע, עוברי הדגים היו רכוב עם ראשם כלפי מטה. (ב) עבור הזיהום באזור טרונק, עוברי הדגים היו רכוב באופן צמוד עם אתר ההזרקה קרוב לתחתית המנה התחתונה זכוכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שינויים טיפוסיים מורפולוגיים בזיהום M. marinum המושרה מקרופאג lytic מוות תאים UV המושרה מקרופאג אפופטוזיס. (A) פקיעה הזמן הדמיה של מקרופאג (Mac) שעברו מוות התא lytic פעם הוא הרבה מאוד עם M. marinum. המוח המימדי של 3 dpf Tg (coro1a: eGFP; lyzDsRed2) העובר דג נגוע על ידי Cerulean-פלורסנט M. marinum (~ 500 cfu) באמצעות מיקרו הזרקה. ניתן לספק תמונות הן עבור ערוץ הכיסוי (החלונית העליונה) והן ערוץ DIC (החלונית התחתונה). T 00:00 הוא 5 h 20 דקות לאחר ההדבקה. קווים מקווקווים לבנים = קו מיתאר של קרום התא; קווים מקווקווים שחור = ציטופלסמה נפיחות; חיצים שחורים = קרום התא מקרע; קווים אדומים מקווקווים = איבד במהירות תוכן cytoplasmic. (ב) הדמיית זמן הדמיה של מקרופאג UV הקרינה. תא אחד GFP + באזור אמצע המוח של 3 dpf Tg (mfap4: eGFP) הוא הוקרן על ידי UV ואחריו הדמיה הזמן לפקיעה. קווים מקווקווים לבנים = קו מיתאר של קרום התא; חיצים שחורים = הפיצול הגרעיני ועיבוי הכרוטין. סרגל קנה מידה = 15 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Figure 1
משלים איור 1: תא סביבתי להגדיר להדמיה חיה. (א) הגדיר את הבקר הדיגיטלי כדי לשמור על הטמפרטורה ב-28.5 ° c. (ב) הגדיר מגבונים רטובים בתוך התא כדי לספק לחות ולמנוע אידוי של מי ביצה. (ג) לסגור את המכסה של התא ולחכות לפחות 30 דקות לייצוב טמפרטורה לפני תחילת הדמיה חיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Figure 2
איור משלים 2: הגדרת פאנל confocal וקד להדמיה חיה. (A) ייצוג של הגדרת לוח הרכישה. (ב) ייצוג הגדרות כוח לייזר וספקטרום. (ג) ייצוג של משימות מרובות והגדרת לולאה במצב נתונים חיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplemental Figure 3
באיור משלים 3: מקרופאגים הפצת זיהום ו נויטרופילים לעבור למוות תא לאחר הידבקות מ. מרנום . (א) מקרופאג להפיץ מ. מרנום בתא המטען של 2 dpf Tg (coro1a: egfp; lyz: DsRed2) דג זברה העובר נגוע על ידי Cerulean-פלורסנט M. מרנום (~ 100 cfu). (ב) נויטרופילים שעברו מוות בתאי lytic ללא ברור מ ' מרנום לאדן באזור הגזע של 3 dpf Tg (mpeg1: אורוlg; lytic) דג זברה העובר נגוע על ידי Cerulean-פלורסנט M. מרנום (~ 100 cfu) באמצעות מיקרו הזרקה. צבע ירוק מוקצה ל-אירווינג lg וצבע אדום מוקצה ל-eGFP להדמיה טובה יותר של תהליך המוות של תאי ליטיק. חיצים בציאן מציינים תאי יעד. חיצים בצבע אדום על התאים העומדים לשחרר תוכן הציטופלסמה במסגרת הבאה. חיצים בצבע ירוק על התאים המתים כי איבדו רק את התוכן הציטופלסמה שלהם. סרגל קנה מידה = 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 1
וידאו 1: מקרופאג מלאים במידה רבה עם מ. מרנום עובר מוות בתאים, הקשור לאיור 5a. הדמיה Time (63 x המטרה) עבור 9 דקות ו 18 s ב 3 מסגרות לשנייה (fps) של אזור אמצע המוח של 3 dpf Tg (coro1a: egfp; lyzDsRed2) דג זברה העובר נגוע Cerulean-פלורסנט M. מרנום. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

Figure 1
וידאו 2: מקרופאג עובר ואפופטוזיס לאחר הקרנה UV, הקשורים באיור 5B. זמן הדמיה ההדמיה (63 x המטרה) של 74 דקות ב 6 fps של אזור אמצע המוח של 3 dpf Tg (mfap4: eGFP) העובר דג. תא GFP אחד באזור המוח האמצע של העוברים הוא הוקרן על ידי UV ואחריו הדמיה הזמן לפקיעה. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

Figure 1
וידאו 3: מקרופאג מפיץ את מ. מרנום, הקשורים לדמות משלימה 3a. הדמיה Time (63 x המטרה) של 24 דקות ב 3 fps של אזור העורק של 2 dpf Tg (coro1a: egfp; lyz: DsRed2) דג זברה העובר נגוע Cerulean-פלורסנט M. מרנום. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

Figure 1
וידאו 4: נויטרופילים עובר מוות תאים מבלי לברור M. marinum engorgement שחתה, הקשורים באיור 3b. זמן הדמיה ההדמיה (63 x המטרה) של 7 דקות 30 s ב 3 fps של אזור הגזע של 3 dpf Tg (mpeg1: ליסטס; lyz: egfp) דג זברה העובר נגוע עם Cerulean-פלורסנט M. מרנום. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה של מוות מקרופאג במהלך זיהום פטרת. מבוסס על גורמים כגון שלמות קרום התא, זיהום מונחה תאים מוות יכול להיות מחולק אפופטוזיס ו-lytic מוות התא24,25. המוות התאי lytic הוא מלחיץ יותר עבור האורגניזם מאשר אפופטוזיס, כי זה מפעיל תגובה דלקתית חזקה 24,25. התבוננות של מוות תאי lytic ב vivo הוא קשה, בשל הדרישה של רזולוציה גבוהה מרחבית בזמן, הגדרות מיקרוסקופ מיקוד הנכון, וביטוי טרנסגניים חזק.

מיקרוהזרקה נכונה דורשת מספר שלבים קריטיים. מלאי חיידקי חייב להיות sonicated ביסודיות כדי להסיר את כל הגושים לפני ההזרקה. שיפרנו את ההרכבה בדגים להזרקה על ידי הטבעה על שקופית זכוכית בין שתי שכבות של התכה נמוכה. לאחר החלת השכבה השנייה של הצמח, השקופית מועברת לקופסת קרח או למשטח קר כדי להאיץ את המיצוק ולמנוע התייבשות של הצמח. אם העוברים צריכים להיות מותקן על שקופיות שונות, הקפד לשמור על השכבה העליונה של agarose לחות על ידי הוספת מי ביצה נוספת.

עבור הדמיה חיה, עדשה אובייקטיבית ברזולוציה גבוהה נדרש כדי לבחון את הפרטים של מוות תאים. דרישה זו מלווה תמיד במרחק עבודה קצר, ולכן מחייב את הצבת אתר הזיהום קרוב לשקופית המכסה. עדשת מים ארוכה של מרחק עבודה הוא אידיאלי לדימות רקמות עמוקות יותר יאפשר מקום נוסף להרכבה נכונה העובר. הדמיה חיה מורחבת באמצעות לייזר עם עוצמה גבוהה יגרום נזק לרקמות או מותו של העובר. לכן, חשוב מאוד לשמור על עוצמת הלייזר נמוך ככל האפשר כדי למנוע הלבנת ורעילות. ביטוי מאוד חזק יכול להקל על ההתבוננות באמצעות לייזר בעוצמה נמוכה. מכיוון GFP ביטוי הוא חזק יותר tg (coro1a: egfp) מ tg (mpeg1: egfp), השתמשנו Tg (coro1a: Egfp; lyz: DsRed2) במקום tg (mpeg1: egfp; lyz: DsRed2) במחקר זה. הגדרת תחנת עבודה ניידת למיקרו הזרקה קרוב למכונת הקונמוקד היא הטובה ביותר להתבוננות בתגובות מהירות. מצמרר את ההיתוך הנמס נמוך על הקרח כדי להאיץ את זמן מיצוק יכול גם לעזור להפחית את הזמן בין הזרקה לחיות הדמיה.

בפרוטוקול זה, אנו מתמקדים בהתבוננות בהתנהגות מקרופאג. עם זאת, המחקר המפורט של התנהגות נויטרופילים במהלך זיהום פטרת יכול גם להיות אינפורמטיבי. למשל, איך נויטרופילים מסחטות מלכודות (רשתות) מעורבים הריגת פטרת החילוץ נשאר לא מוגדר ברובו. שילוב טכניקת הדימות המתואר בפרוטוקול זה עם חלבון היסטון תיוג הטרנסגניים יהיה מאוד להקל על ויזואליזציה של רשתות בvivo.

נכון לעכשיו, דג דג זברה מוכרים כמערכת חזקה מאוד לחקר התנהגות תא החיסונית מולדת. נתונים סטטיסטיים של phagocyציטוזה ואת המוות התאים ניתן להשיג באמצעות פרוטוקול זה. בשילוב עם כלי העריכה החזקים ביותר של גנים הזמינים כיום, פרוטוקול זה יכול לספק פלטפורמה יעילה להבנת עוד יותר את ההשפעה של מגוון גורמים באינטראקציה של הפתוגן-מארח ב-vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים לד ר זילונג ון על שיתוף זנים הדגים, ד ר. סטפן Oehlers וד ר. דוד טובין על שיתוף M. marinum משאבים קשורים הקשורות, Yuepeng הוא לסיוע בהכנת הדמות. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81801977) (B.Y.), תוכנית ההדרכה לנוער מצטיינים של הנציבות העירונית של שנגחאי (2018yq54) (B.Y.), תוכנית השייט של שנגחאי (18yf1420400) (B.Y.), והקרן הפתוחה של המעבדה מפתח שנגחאי של שחפת (2018

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Tween-80 Sigma P1379
10 mL syringe Solarbio YA0552
10% OADC BD 211886
3-aminobenzoic acid Sigma E10521
5 μm filter Mille X SLSV025LS
50 μl/ml hygromycin Sangon Biotech A600230
7H10 BD 262710
7H9 BD 262310
A glass bottom 35 mm dish In Vitro Scientific D35-10-0-N
Agarose Sangon Biotech A60015
Confocal microscope Leica TCS SP5 II
Enviromental Chamber Pecon temp control 37-2 digital
Eppendorf microloader Eppendorf No.5242956003
Glass microscope slide Bioland Scientific LLC 7105P
Glycerol Sangon Biotech A100854
Incubator Keelrein PH-140(A)
M.marinum ATCC BAA-535
Microinjection needle World Precision Instruments IB100F-4
Microinjector Eppendorf Femtojet
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
msp12:cerulean Ref.: PMID 25470057; 27760340
Phenol red Sigma P3532
PTU Sigma P7629
Single concavity glass microscope slide Sail Brand 7103
Sonicator SCICNTZ JY92-IIDN
Spectrophotometer (OD600) Eppendorf AG 22331 Hamburg
Stereo Microscope OLYMPUS SZX10
Tg(mfap4:eGFP) Ref.: PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) Ref.: PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) Ref.: PMID 27424497; 17477879

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
  2. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
  3. Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
  4. Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
  5. Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
  6. Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
  7. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
  8. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  9. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  10. Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
  11. Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
  12. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  13. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  14. Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
  15. Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
  16. Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
  17. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
  18. Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
  19. Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
  20. Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
  21. van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
  22. Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
  23. Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
  24. Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
  25. Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 143 זיהום בקטריאלי מיקרוסקופ מקרופאג נויטרופילים מוות תאים דג זברה
ויזואליזציה של מקרופאג Lytic תא המוות במהלך זיהום פטרת העוברים באמצעות מיקרוסקופ אינטרטל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Niu, L., Wang, C., Zhang, K., Kang,… More

Niu, L., Wang, C., Zhang, K., Kang, M., Liang, R., Zhang, X., Yan, B. Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e60698, doi:10.3791/60698 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter