Summary
我々は、トランスウェルフィルター上に培養された三叉(TG)ニューロンを用いた歯科パルプ(DP)一次細胞の分離、分散およびめっきについて述べた。DP細胞の細胞応答は、免疫蛍光またはRNA/タンパク質分析で分析することができる。共焦点顕微鏡を用いた神経細胞マーカーの免疫蛍光は、神経突起の成長応答の解析を可能にする。
Abstract
歯のインナーブは、歯の内部が圧力、温度および炎症を感知することを可能にし、そのすべてが歯器官の使用および維持にとって重要である。感覚的な内膜がなければ、毎日の口腔活動は回復不可能な損傷を引き起こすであろう。その重要性にもかかわらず、歯の発達と維持における内膜の役割はほとんど見過ごされてきた。いくつかの研究は、DP細胞がTG軸索を引き付け、歯全体に導くために細胞外マトリックスタンパク質およびパラクリンシグナルを分泌することを実証している。しかし、DP間質と神経の薬効との間のクロストークに関する詳細な洞察を提供した研究はほとんどありません。この知識のギャップに対処するために、研究者は共文化と様々な技術を活用してこれらの相互作用を調査し始めました。ここでは、大口径の細孔を有するトランスウェルフィルターに分散したTGニューロンを用いて一次DP細胞を共培養し、細孔を通して軸索成長を可能にする複数のステップを実証する。loxP部位によって隣接した目的の遺伝子を有する原発性DP細胞は、アデノウイルス-Cre-GFPリコンビナーゼ系を用いて遺伝子欠失を促進するために利用された。Thy1-YFPマウスのTGニューロンを使用すると、共焦点顕微鏡によるバックグラウンドレベルをはるかに上回る発現を有する正確なアフェレントイメージングが可能となった。DP応答は、取り外し可能なガラスカバースリップにメッキされたDP細胞の免疫蛍光染色を介して、タンパク質またはRNAの収集および分析、または代替的に調査することができる。培地はプロテオーム分析などの手法を用いて分析できますが、これはウシ胎児血清の存在によるアルブミンの枯渇を必要とします。このプロトコルは、共培養アッセイの制御された環境に応答して、TGニューロンおよびDP細胞の形態学的、遺伝的、および細胞骨格応答を研究するために操作することができる簡単な方法を提供する。
Introduction
歯のインナーブは、歯の内部が圧力、温度および炎症を感知することを可能にし、そのすべてが歯器官の使用および維持にとって重要である。虫歯や外傷に伴う歯の痛みを感知しないと、病気の進行につながります。したがって、適切な内線は、正常な歯の成長、機能およびケアのための要件である。
ほとんどの臓器は出生時までに完全に機能し、内臓化されていますが、歯の発達は成人生活にまで及び、出生後段階1、2の間に協調して歯の内膜とミネラル化が起こる。興味深いことに、歯髄(DP)間感覚は、最初は胚発生時に反発シグナルを分泌し、発達中の歯器官への軸索の侵入を防ぎ、後に歯が噴火に近づくにつれて誘引因子の分泌に移行する3,4。出生後の段階では、象牙質沈着が始まる頃に歯牙(TG)神経から逸脱した軸索が歯に浸透する(Pagella,P.いくつかの生体内研究では、神経間葉相互作用がマウスの歯の内膜化を導く(Luukko,K.al.
細胞共培養は、研究者が神経集団と間葉集団間の相互作用を操作できる制御された環境を提供する。共培養実験により、歯のインナーブと発達を導くシグナル伝達経路をより深く掘り下げることができます。しかし、いくつかの従来の方法は、共培養で細胞を研究するために使用される技術的な課題を提示する。例えば、ニューライトの結晶バイオレット染色は、TGバンドル分散液に含まれるシュワン細胞を非特異的に染色することができ、また、比較的小さな応答で色強度のピークが7に有する可能性がある。マイクロ流体室は魅力的なオプションを提供しますが、トランスウェルフィルタ8、9よりもかなり高価であり、DP分泌物に対する神経応答の調査のみを許可します。これらの問題に対処するために、a)DP分泌物に応答したTG神経突起の正確な染色およびイメージング、b)DP細胞および/またはTGニューロンの遺伝子改変による特定のシグナル経路の調査、およびc)TGニューロンによって分泌された因子に対するDP細胞応答の調査を可能にするプロトコルを開発した。このプロトコルは、in vitro共培養アッセイの制御された環境における歯のインナーブの複数の特徴を正確に調査する能力を提供する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
マウスを用いた実験はすべて、UAB機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認された。
1. プレートの準備
注: カバースリップは、アッセイの終了時に DP セルをイメージするために使用できます。サンプル処理中の汚染を防ぐために、滅菌組織培養フードの外側のすべてのインキュベーションとリンスのステップ中にプレート蓋がオンになっていることを確認してください。
-
カバースリップ準備
- オートクレーブ円形カバースリップ。
- フードの下に超純水をフィルターします。
- カバースリップを24ウェルプレートに移し、400 μL 0.1 mg/mLポリDリジンでそれぞれカバーします。
- カバースリップを浸し、5分間浸し、ロッカーの12 rpmまたは40〜50 rpmの軌道シェーカーに浸します。汚れ防止のために蓋が付いてるのを確認してください。
- 12 rpmまたはシェーカーで12rpmまたはシェーカーで50rpmで約5分間、濾過された超純水でカバースリップをすすいでください。繰り返します。
- カバースリップをボンネットの下で少なくとも2時間乾燥させ、プレート蓋をオフにして蒸発を促進します。これらのカバースリップは48時間以内に使用する必要があります。
- 種子DP細胞は、免疫蛍光のためのアッセイの終わりにカバースリップおよびプロセスの上に(セクション3.3)。
-
コーティングフィルター
- ラミニンを10μg/mLに希釈します。希釈したラミニンをフードの下にろ過します。
- ピペット450-500 μL 10 μg/mLラミニンの24ウェルプレートの各ウェルに入ります。
- トランスウェルフィルター、3 μmの多孔度を、ラミニン溶液に接触するようにウェルに入れ、2時間または一晩37°Cのインキュベーターに残します。フィルター孔は、溶液の一部が拡散し、フィルターの上部と下部の両方をコーティングできるようにする必要があります。これらのフィルターは48時間以内に使用するか、最大1週間4°Cで冷蔵する必要があります。
2. 任意遺伝子操作を用いた細胞めっき
- マウス: 間葉神経間相互作用を研究するために、DP細胞の遺伝的変化を行うことができる(しかし必須ではない)。提案された遺伝的変異については、セクション2.3および2.4を参照してください。
- DP解剖、分散液及びめっき(図1)
注: DP 解剖には、超微細なストレートエッジの鉗子を使用してください。超微細なエッジは、ユーザーがミネラル化された構造とDP組織の間の鉗りエッジをくさびすることができます。- 収穫P5-P8マウス。この段階では、歯はミネラル化する必要があり、根は開いています。
- 低体温症で新生児を麻酔し、4°C冷蔵庫の皿に入れ、動かなくなったり触れたりしなくなるまで麻酔します。切断と指定された施設でのIACUC手順に従って新生児を安楽死させる。
- 50 mL円錐形チューブに0.25%トリプシン-EDTAの3-5 mLアリコートを準備し、各マウスからDPを収集します。これにより、出生後マウスからの歯髄の消化が促進されます。10匹を超える出生後マウスから組織を消化する場合は、3 mL以上を使用してください。
- 口が天井に向かい、首の底部が作業面に平らになるように、使い捨て可能な下パッドの上に頭を置きます。顎骨を上顎から分離するには、ソーイングモーションでカミソリの刃を使用してください。
- 必要に応じて、はさみまたは鉗子で舌を取り除き、臼歯へのアクセスを容易にします。
- 開いたヘッドを滅菌ガーゼパッドの上に皿に入れ、標本を解剖顕微鏡の下に置きます(図1D)。
- 最初の臼歯を取り囲む歯槽骨組織を取り除く。この時点で顎下歯は完全には噴出していません。歯槽の開口部に鉗子を挿入し、口の頬(頬)または舌側に向かって歯から組織をいじめる。上顎歯は、暴露および除去のために歯の周りの裂け目を完全に除去する必要があります。
- 下顎下および上顎の最初の臼歯(M1s)を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を有する別の細胞培養皿に穏やかに移す。
- すべての M1 が収集されるまで 2.2.4-2.2.8 を繰り返します。収穫中にM1を含む料理を氷の上に置いてください。
- 各M1の外側を囲むエナメル外器官(EOE)を取り外します。これは、ステップ 2.2.11 の後に行うことができます。
- 一連の鉗子を使用して、M1 を回転させて、カスプが下に置かれ、開いたルートが露出するようにします。歯の底に楕円形の開口部があり、不透明なDP組織が象牙質とエナメル質の薄い層によってカプセル化されます。
- 鉗子の先端を使用して、ミネラル化されたティッシュの内部円周のまわりで鉗子の片腕を動かすことによってDPを緩める。DP組織を鉱物化構造から取り出し、1x PBSを含む第3の皿に移す。EOE がまだ分離されていない場合は、EOE を取り外します (図 1E)。
- 50 mL円錐形チューブで全てのDP組織を0.25%トリプシン-EDTAに移す。混合物をボルテックスし、10分間37°Cの温水浴中に置きます。これは、同じ鉗子または長いバイアル鉗子で行うことができます。組織は分散することが困難であり、すべての3-4分の渦を必要とします。トリプシンは細胞膜に損傷を与える可能性があるため、10分のトリプシンを超えないでください。
- 滅菌フードの下に、酵素を不活性化するために少なくとも1:1の媒体の最終比率に加温された共培養培地(表1)を加える。より大きな比率は、より多くの組織分散が望ましい場合に許容される。
- 10 mLピペットでメディアを複数回上下にピペットし、DPをさらにメディアに分散させます。大きな泡を避けるように注意してください。完全な分散は、組織の粘着性の性質のためにほとんど不可能です。しかし、細胞は一度メッキされると組織から外側に移動するので、また必要ではない。
- 分散したDPの1mLを24ウェル組織培養プレートの各ウェルに移す(図1F)。
- プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、細胞が付着して、媒体を交換する前に48時間、非分散組織から外に移動できるようにします。一次細胞は、1週間以内に85〜90%の合流点に達するために比較的高い濃度でメッキする必要があります。1週間後に達成されない場合は、プレートを廃棄する。
- DP細胞の任意遺伝子操作
- 細胞シグナル伝達経路を変化させるために、遺伝子ノックアウトマウスまたは目的の遺伝子がloxP部位によって横たわるマウスからDP細胞を収穫する。後者の場合、後述のとおり、アデノウイルス-Cre-GFP(Ad-Cre-GFP)リコンビナーゼを用いて遺伝子を除去し、横たわった遺伝子を除去することができる。ウイルス感染が細胞反応を引き起こさないことを保証するために、コントロールウイルスとしてアデノウイルス-eGFP(Ad-eGFP)を使用してください。
注:Ad-eGFPはCMVプロモーターエンハンサーによって制御され、これは非常に強いです。Ad-Cre-GFPは、CreとGFPの間の内部規制地域であるIRESによって規制されていますが、これはあまり強くはありません。この結果、Ad-eGFP 細胞では Ad-Cre-GFP 細胞よりも明るい蛍光が得られます。細胞蛍光のレベルではなく、蛍光を発する細胞の総数に基づいて同等の感染レベルを確認する。 - ウイルスを含む500μLの培地と1ウェルあたり10μg/mLのポリブレンを準備します。ポリブレンは、合流10付近の細胞におけるウイルス感染を補助する。このプロトコルは、Ad-eGFPに対する100の感染(MOI)と200 Ad-Cre-GFPの多重度の感染率に基づいており、細胞生存率にほとんどまたは全く影響を及ぼさない効率的な遺伝子感染を可能にする。推定細胞数は、24ウェルプレートの4 x 10 4細胞/ウェルです。
- 短い渦またはピペットとメディアを混ぜ、各ウェルに500 μLを加えます。
- 24 時間経過後、ポリブレンまたはウイルスを追加しない500 μL の共培養メディアを追加します。
- 合計48時間経過後、ウイルス含有培地を吸引し、新鮮な共培養培地に置き換えます。この時点で、TGニューロンはトランスウェルフィルターの上に追加することができます。
- 細胞シグナル伝達経路を変化させるために、遺伝子ノックアウトマウスまたは目的の遺伝子がloxP部位によって横たわるマウスからDP細胞を収穫する。後者の場合、後述のとおり、アデノウイルス-Cre-GFP(Ad-Cre-GFP)リコンビナーゼを用いて遺伝子を除去し、横たわった遺伝子を除去することができる。ウイルス感染が細胞反応を引き起こさないことを保証するために、コントロールウイルスとしてアデノウイルス-eGFP(Ad-eGFP)を使用してください。
- 三叉神経細胞の解剖、分散およびめっき
注:このプロトコルでは、DP細胞との共培養における神経突起の成長のイメージングは、思春期(6週齢)B6.Cg-Tg()を用いて最適化された。Thy1-YFP)16ジュニア/Jマウス。Thy1-YFPマウスの中枢および末梢神経系には黄色蛍光タンパク質(YFP)タグがあり、その発現はニューロンのP6-P10の周りから始まり、出生後および成人期に神経系全体で指数関数的に増加する11,12.YFPおよびGFPは、これらの神経を抗GFP抗体で染色することを可能にする保存配列を有し、その結果、汎神経染色を生じる。最終的には、これらのマウスは、細胞培養で使用および増殖したニューロンのより良い可視化と定量化を可能にする。- 思春期のマウスを二酸化炭素で安楽死させ、その後に頸部脱臼を行う。
- マウスの首を切り落とし、頭蓋骨から皮膚を取り除きます。男性と女性の同等数を含むようにしてください。
- 一対のマイクロ解剖はさみの先端を頭蓋骨の基部に挿入します。頭蓋骨の矢状縫合糸に沿って切り取ります(図1A)。
- 4つの小さな水平カットを行う:耳でコロナ縫合に沿って2つ、頭蓋骨の基部にラムド縫合糸に沿って2つ。これにより、2 つのボーンのフラップが作成されます。
- 鉗子を使用して、骨の2つのフラップを剥がします。これは脳を明らかにする必要があります。
- 脳を取り除く。1x PBSで組織培養皿に頭部を移し、顕微鏡下に置きます。
- 上顎プロセスの脳と骨の間の硬膜に収容されたげっ歯類13に容易に見えるTG神経節を見つける(図1B)。
- 目、上顎、下顎に移動する3つの枝をカットし、ストレートエッジの細かい鉗子を使用して冷たい1x PBSに神経節を移します。収穫時にTG神経節を含む料理を氷の上に置いてください。
- すべてのTGバンドルが収穫されたら、バイアル鉗子を使用して5 mg / mL滅菌濾過コラゲターゼII型を含む50 mL円錐形チューブに神経節を移します。
- TGバンドルでコラゲターゼをボルテックスし、チューブを37°Cの水浴に25〜30分間入れます。この間、水槽から円錐形のチューブを取り出し、渦を起し、5-10分ごとに浴場に戻ります。
- コラゲターゼ-TGニューロン溶液を643 x gで2分間遠心分離する。
- 組織培養フードの下で、マイクロピペットでコラゲナーゼを優しく吸引する。
- 1%の無菌化トリプシンタイプIIと渦の5 mLを加えます。円錐形のチューブを37°Cの水浴に5分間置きます。
- トリプシン-TGミックスを643 x gで5分間遠心分離する。トリプシンの上部をマイクロピペットで除去し、TGニューロンが除去されないようにします。チューブ内に液体がまだ残っています。
- 残りのトリプシンを非アクティブ化するのに十分なメディアを追加します(メディアに対するトリプシンの比率が1:1以下)。
- 細胞数を数え、溶液を200,000個の細胞/mL(細胞含有50,000個の細胞の250μL)に希釈します。
- セクション1.2からDPを使用してウェルにコーティングされたトランスウェルフィルターを配置します。
- 細胞含有溶液を希釈して、200,000個の細胞/mLになるようにします。トランスウェルフィルター上にピペット250μL、一晩37°Cで細胞を培養した(図1F)。
- 翌日、培地を1μMウリジンと15μM 5'-フルオール-2'デオキシウリジンで1mLのCo培養培地に置き換え、neuriteの成長を妨げる可能性のある間葉系細胞の過剰増殖を止めます。オプション: さらなる操作を試みる場合は、この培地に成長因子または阻害剤を追加します。
- 追加の所望の時間ポイントのために細胞を培養する。このプロトコルは、培養物の合計5日間に最適化され、2日目にのみ培地が改変され、有糸分裂抑制剤が添加された。時間が長いほど、追加のメディア変更が必要になります。
3. サンプル収集と処理
- 三叉染色
- ピペット1mLの無菌1x PBSのアリコートを、処理される各トランスウェルフィルターの組織培養フードの下の24ウェルプレートに入る。
- 200~1,000 μLのピペットで除去し、細胞層をそのまま残すように注意して、フィルターの上の液体を取り除きます。結合された細胞は付着したままで、この穏やかなピペッティングの間に未接続の細胞が緩んでくるはずです。真空フィルターは、細胞層を損傷する可能性があり、吸引には推奨されません。
- フィルターを1x PBSプレートに移し、前のステップで述べたように、メディアの最上層を確実に取り除きます。
- 10分間の軌道シェーカーのロッカー上のすべてのトランスウェルフィルターと蓋付きプレートを12 rpmまたは40〜50 rpmに置きます。
- 上記のように最上層を含むPBSを吸引し、1xPBSの500μLを加え、ロッカーまたは軌道シェーカーに5~10分のリンスを追加します。
- 1x PBSをもう一度吸引し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)に置き換えます。フィルター表面全体が水没するように、少なくとも500μLを使用してください。プレートを12rpmのロッカーに置くか、または1時間室温で40〜50rpmの軌道シェーカーを置きます。
- PFAを取り外し、500μLのPBSを搭載したロッカーでそれぞれ5~10分間、プレートを2回すすいでください。
- 10%ウシ血清アルブミン(BSA)+5%ヤギ/ロバ血清を用いたブロックは、二次抗体宿主動物に応じて、0.05%Tween-1xPBS(PBST)である。フィルターが液体に沈むように、450-500 μLの溶液を使用してください。
注:この段階では、これらのプレートは、後で処理するために数ヶ月間4°Cで保存することができます。パラフィルムを使用してプレートを密封し、蒸発が発生しないようにし、フィルター表面が水没したままになるように定期的に蒸発をチェックします。 - ブロックを取り外し、1%のリンスなしで1%BSA-PBSTに450-500 μLの一次抗体を加えます。4°Cで一晩インキュベートし、穏やかに揺れる。
- 一次抗体溶液を取り除き、ロッカー上の500 μLの1xPBSTを室温で3回洗い流す
- PBSTを取り出し、二次抗体を加え、アルミニウム箔で包まれた4°Cでロッカーに一晩インキュベートして、蛍光色素を光分解から保護します。室温でロッカーに1x PBSTで、再び、3回洗い込みます。1x PBS で置き換えます。
注:この時点で、プレートは、フルオロフォアの劣化を防ぐためにアルミニウム箔で包まれた場合、4 °Cで数ヶ月間保存することができます。パラフィルムを使用してプレートを密封し、蒸発が発生しないようにし、フィルター表面が水没したままになるように定期的に蒸発をチェックします。1ヶ月以内に画像を作成するのが最善です。 - 最適なイメージングのために、抗GFP抗体を有するThy1-YFPマウスニューロンを利用して、バックグラウンドレベルをはるかに上回るニューロンのアフェレントを特異的に染色する。抗神経フィラメント200を使用して、Thy1-YFPマウスが利用できない場合は軸索構造を正確に染色する。
- 必要に応じてイメージ。フィルターはめっきする必要が無く、代わりに反転した顕微鏡で撮像するためにカバースリップまたはスライドの上に置くことができる。
注:フィルタの領域には、アフェレントな構造は含まれません。すべてのアフェレントな構造をキャプチャする Z スタック深度を持ついくつかのイメージを取ります。スティッチング ソフトウェアを使用して、大きな領域、またはフィルタ領域全体にわたるニューライトの成長を視覚化します。
- RNA、タンパク質、および培地収集
- トランスウェルフィルターの処理中に、メディアをRNA酵素/DNAなしチューブに集め、後でアッセイを行うためフリーズします(ELISA、プロテオミクスなど)。
- 培地採取直後に、アリコート・リシス・バッファーまたはラジオ免疫沈殿アッセイ(RIPA)バッファーにプロテイナーゼおよびホスファターゼ阻害剤をウェルに入れます。このプロトコルは、24 ウェルプレートで 100 μL/well 用に最適化されました。
- バッファーが5分間細胞を熱入れ、各フィルターを新しいピペットチップで削り、RNAse/DNAなしチューブに細胞サンプルを集めます。将来のアッセイ(半定量および/または定量PCR、ウェスタンブロットなど)のために、リシスをフリーズします。
- 歯科パルプ細胞の任意免疫蛍光:
- 穏やかに鉗子でセクション1.1からのカバースリップを持ち上げ、ロッキングと1時間の4%PFAと異なる井戸にそれらを移す。
- PFAを吸引し、1x PBSでカバースリップを2回すすすります。標準的な免疫蛍光技術を用いて、目的のマーカーの透過、ブロッキング、および免疫蛍光法を使用してこれに従ってください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
これらの結果は、TGニューライト単一培養の制御と比較して、基礎となるウェル中の一次DP細胞の存在下でTGニューライトの成長が増加したことを示している(図2A、C)。ニューライトの成長には、いくつかのアッセイ・ツー・アッセイの変動があります。したがって、TGニューロン単一培養は、神経突起の成長の基底レベルを検出するためのコントロールとして、すべてのアッセイに含まれるべきです。Ad-Cre-GFPおよびAd-eGFPの感染後にこのプロトコルで使用したTgfbr2f/fマウス由来の一次細胞は、同等の数の細胞で確認された(図2D)。Ad-eGFPは、コントロールウイルスベクターとして役立った。Ad-Cre-GFPは、半定量PCR(図2E)によって示されるように、横並び遺伝子Tgfbr2を削除した。増殖因子β受容体2(Tgfbr2)欠失を変化させる培養では、神経突起の成長は減少した(図2A-C)。
我々は、図2に示すように、この背景の上に非常に特異的で明るい軸索構造の画像を作り出した抗GFP抗体で、Thy1-YFPマウスTGニューロンを利用し、それらを染色した。これにより、結晶バイオレット7などの以前に報告された方法を利用して、非神経細胞の非特異的染色を伴わない神経マーカーの特異的染色を可能にした。フィルター内の大きな孔は、二次抗体を自己蛍光体にしたり蓄積したり、軸索イメージングの精度を低下させることができます(図3)。免疫蛍光を有するThy1-YFPニューロンはイメージングを劇的に改善する一方で、さらにバックグラウンドは自動閾値ソフトウェアで除去し、定量化することができる。また、I1-YFPマウスが利用できない場合は、予備所(図示せず)および他の8、9に基づいてニューロフィラメント200の免疫蛍光を行うことをお勧めします。
図1:マウス解剖の概略図を、共培養用の細胞を得る。(A) マウスの頭蓋骨を開き、最後の描写で黒で示した TG 神経を見つけるために切る場所の図。はさみは、点線に沿って切断するはさみの先端を挿入する場所を示します。(B) 白で囲まれたThy1-YFP+ TG神経を示す暗視野とGFPの画像を組み合わせた。(C) 解剖されたTG神経節は、Fに示すように分散し、培養することができる。(D) P7 マウスの下振れ, 左に下地を保持する鉗子と舌の両側に未噴出の歯を含む歯槽の骨の尾根.(E)DP組織(丸)を鉱物化した構造(上)から抽出し、そして、Fに示すように、組織培養処理プレートに分散し、プレートに除去したエナメル外上皮(底部)を示す。画像は拡大縮小されません。DP細胞を分散し、TGニューロンを添加する前に合流に成長した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:共文化の代表的な結果(A-C)Thy1-YFP TGニューロンは、Tgfbr2f/f DP細胞の上に3μmの細孔を有するトランスウェルフィルターで培養した。免疫蛍光染色は、フィルター全体にわたって神経構造の極めて特異的な染色を提供するために抗GFP抗体を用いてYFPタンパク質に対して行った。10xで100μm zスタック共焦点顕微鏡画像の最大投影を収集し、ステッチングソフトウェアでステッチしました。TGニューロンは、DP細胞(A)と共培養した場合、単独で培養した場合よりも著しく多くの成長を示した(C)。神経突起の増殖は、ニューロンがAd-Cre-GFPに感染したDP細胞と共培養してTgfbr2(B)をノックダウンしたときに誘発されなかった。スケールバー = 1,000 μmAd-eGFPおよびAd-Cre-GFPに感染した細胞の同等数は、(D)に示されています。スケールバー = 125 μm。半定量PCRはTgfbr2 KD (E) を確認しました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: アフェレントイメージングで提示された技術的な困難(A) 細胞集団の結晶バイオレット染色後のトランスウェルフィルターのブライトフィールドイメージング大きな毛穴が流行している。大きな矢印は間葉形態を示す細胞を指し、小さな矢印は神経形態の細胞を指しています。結晶バイオレットは偏りなく両方の細胞を染色した。(B)Alexa-488二次抗体によるβ3チューブリンの免疫蛍光染色は、複数の細胞の非特異的染色を示し、アフェレント構造のイメージングを困難にした。画像は代表的であり、図2に示す画像を最適化するために複数のアッセイを繰り返した。スケールバー = 50 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| コンポーネント | ボリューム | 濃度 | |
| MEM α | 440 mL | ||
| 熱不活性化ウシ血清 | 50 mL | 10% | |
| 100x Lグルタミン | 5 mL | 1倍 | |
| ペニシリン- ストレプトマイシン 100 x | 5 mL | 1倍 | |
| 2日目に、これらの最終濃度で有水分裂抑制剤を用いて培地を交換する | |||
| ウリジン | 1 μM | ||
| 5'-フルオール-2'デオキシウリジン | 15 μM | ||
表1:共培養メディア
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
口腔の日々の活動は、歯が適切な使用と維持を可能にするために外的刺激と内部炎症を感知することを必要とする。しかし、歯の内膜の発達過程を促進する信号に関する情報は限られています。このプロトコルは、2つの集団間の相互通信を研究するために、プライマリDP細胞およびTGニューロンを分離および共培養する方法を提供する。いくつかの変数が最適化され、以下に説明されるように、研究のさらなる道を開いたままにします。
このアッセイの各ステップにおいて、コントロールが重要です。基礎となるDP細胞を含まないTGニューロンを用いてトランスウェルフィルターを全てのアッセイに含めて、TG増殖のベースラインを提供する必要があります。Ad-Cre-GFPリコンビナーゼで対象の横たわった遺伝子を削除する場合、蛍光マーカーのみを発現するコントロールウイルスを使用して、同等の数の細胞が感染していることを確認する必要があります。Ad-eGFPとAd-Cre-GFPの100および200 MOIで、それぞれ最小の細胞死で高レベルの感染を実証しましたが、各ラボはこのステップを最適化する必要があります。蛍光タンパク質は異なるプロモーターに結合できるため、感染した数に相当する異なる発現を引き起こすため、蛍光細胞をカウントする必要があります。蛍光の全体的な強度は、感染状態を正確に反映しないため、無関係である。このプロトコルで半定量PCRで示すように、遺伝子の欠失を実証することが重要です(図2)。このプロトコルはこのトピックに取り組んでいないが、以前の研究では、他の細胞ラインを用いた制御アッセイが含まれることを実証し、神経突起成長がDP細胞8との共培養によって特異的に誘導されることを実証した。
このプロトコルは、プライマリセルを利用するため、汚染を導入することができる複数の段階があります。これを防ぐために、すべての試薬は滅菌濾過する必要があります。さらに、すべての変数の実験は、アッセイの完全な故障なしに汚染された井戸のフィルターおよび滅菌を除去できるように、重複または三重で実行することをお勧めします。
カバースリップは、DP細胞接着を確保するために、ポリDリジンおよび/または細胞外マトリックスタンパク質でコーティングする必要があります。細胞が最初に付着する間、ウイルス感染はコーティングされていないカバースリップで細胞を持ち上げる死を引き起こし、共培養アッセイの遺伝子操作を防ぐ。
TG神経節のシュワン細胞のような非神経細胞が、培養14、15、16の神経細胞の生存に影響を及ぼす可能性が十分に確立されている。このプロトコルでは、ニューロン生存率は、1 μMウリジンおよび15 μM 5-フルオロ-2'デオキシウリジンを添加することによって最適化された。これらの抗mitotic剤を添加してシュワン細胞増殖を阻害しなければ、神経突起は生じない。これらの老化シュワン細胞の存在が神経細胞反応を変化させるかどうかは不明である。マウスのニューロンを分離するには、いくつかの追加の手順が必要です, そしてプロトコルは、この変数を削除したい研究者のために利用可能です17.いずれの場合も、ニューロン分散はいくらかアキソトミーを模倣し、損傷/修復18を表していると考えることができる。さらに研究は、インビクシクルからのインビボ軸索成長とインビトロ内の個々のニューロンからの軸索成長の違いを決定するために必要であり、これらはこのプロトコルでは取り上げられていない。
このプロトコルは、最初から最後まで1〜3週間かかります。85~90%の合流に達するために1週間以上必要なDP細胞を利用することは可能ですが、これらの細胞はその時点を超えて非常にゆっくりと分裂するので、数日以内に合流に達するのに十分な密度で細胞を播種することをお勧めします。これは一般的に、24ウェルプレートの1列あたり約5〜7 P5-8マウスを必要とする。このプロトコルは、合計5日間の共培養のために最適化され、その時点でフェノールレッドの培地が色をシフトし始めた。より長いアッセイが望ましい場合は、メディアを変更する必要があります。
いくつかの共培養アッセイは、標準ECMコート組織培養プレート3、19、20、21、またはマイクロ流体室8、22、23でDP分泌因子によって分泌された因子に応答して、神経突起成長を実証するために行われている。 このプロトコルは、これらの方法に対していくつかの利点を提供します。例えば、TG神経節とDP組織の共培養は、ニューライトが近距離パラクリン信号を感知し応答するために特定の空間関係を必要とする。臓器培養では、DP組織に最も近い神経節の神経突起のみが3に応答することができるのに対し、このプロトコルで使用される分散TGニューロンは、DP細胞から下のDP細胞から等間隔で培養される。第二に、臓器培養は、大サンプル24で利用可能な酸素および栄養の不足による組織壊死を導入することができる。分散細胞の共培養は、この可能性を除去する。ニューロンを含むいくつかの共培養は、神経細胞培地3、22を必要とし、神経突起の成長を促進する上で支配的な役割を果たすことができる。このプロトコルは、ニューロン特異的な成長因子を追加せず、基礎となるDP細胞からのパラクリンシグナルと神経突起成長応答との直接的な関係の評価を可能にする。また、共培養培地には、β-グリセロリン酸などのミネラル化を促進する成分も欠けていることは注目に値する。これにより、研究者は、ニューライトが鉱物化を奨励するために信号を分泌する方法を決定することができます。しかし、それはまた、通常インビボに存在するであろう鉱化性のオドントブラストなしで、分化の少ないDP細胞のみを含めることによって研究を制限する。
以前の研究7,8からの比色応答は、結晶紫が全ての細胞を非特異的に染色するので、シュワン細胞の寄与を示すものではなく、神経形態を示すものではありません。フィルターの免疫蛍光染色は、高いバックグラウンドレベルを生じ、アファーレンスイメージングを困難にする可能性があります(図2)。本プロトコルは、Thy1-YFP TGニューロンと抗GFP抗体を利用して神経の探知剤を正確に染色することを可能にし、図全体を通して大きな成長画像を生成するのに十分な明るい信号を提供する(図3)。抗神経フィラメント200のような他の神経マーカーを利用することができるが、もしThy1−YFPマウスが利用できない場合。
最後に、loxP部位に隣接する目的の遺伝子を有するマウスの一次DP細胞を使用すると、Ad-Cre-GFPシステムを用いてこれらの遺伝子を簡単かつ効率的に欠失することが可能になる。今後の研究では、Ad-Creリコンビナーゼシステムは、loxPサイトに隣接する関心のある遺伝子を持っている場合、TGニューロンに使用される可能性があります。これは、特にDP細胞がカバースリップの上に播種されている場合、ニューロン集団からのパラクリンシグナルがDP細胞にどのような影響を与えるかに関する研究を容易にするであろう(セクション1.1)。今後の研究は、他の操作を利用することができます, 薬理学的阻害薬や成長因子の追加など.また、8 μm の多孔度トランスウェルフィルタを使用して移行研究を含むようにこのプロトコルを変更することも可能です。
結論として、ニューロンとDP細胞を利用したこのトランスウェル共培養アッセイは、複数の細胞パラメータの調査を可能にする。これにより、歯の内膜を促進し、支持する間葉神経相互作用に関する知識の体を広げることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、a)国立衛生研究所/NIAMS(助成金番号R01 AR062507とR01 AR053860からRSへ)、b)アラバマ大学バーミンガム歯科学術研究トレーニング(DART)助成金(番号T90DE022736(PI MacDougall))によって、国立歯科・頭蓋顔面研究研究所/クリオフェイシャル研究研究所/SBPに支援されました。 c) UABグローバル・センター・フォー・クラニオ顔面・口腔・歯科障害センター(GC-CODED)パイロットおよびD)国立歯科頭蓋顔面研究所SBPに対する研究/国立衛生研究所K99 DE024406助成金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
References
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
- Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
- Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
- de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
- Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).
- Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
- Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
- Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
- Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
- Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).
- Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
- Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, Clifton, N.J. 229-251 (2017).
- Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
- Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799 (2016).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).
- Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).
