Summary
Vi beskriver isolasjon, spredning og plating av dental pulp (DP) primære celler med trigeminus (TG) nevroner dyrket på toppen overliggende transwell filtre. Cellulære responser av DP-celler kan analyseres med immunfluorescens eller RNA/ proteinanalyse. Immunofluorescens av nevronale markører med konfokal mikroskopi tillater analyse av nøysome utvekstresponser.
Abstract
Tanninervation gjør det mulig for tennene å føle trykk, temperatur og betennelse, som alle er avgjørende for bruk og vedlikehold av tannorganet. Uten sensorisk innervering ville daglige muntlige aktiviteter forårsake uopprettelig skade. Til tross for sin betydning, har rollene av innervering i tannutvikling og vedlikehold i stor grad blitt oversett. Flere studier har vist at DP-celler utskiller ekstracellulære matriseproteiner og paracrine signaler for å tiltrekke seg og veilede TG-aksoner inn og gjennom tannen. Imidlertid har få studier gitt detaljert innsikt i kryssforløpet mellom DP mesenchyme og nevronale afferents. For å løse dette gapet i kunnskap har forskere begynt å bruke medkulturer og en rekke teknikker for å undersøke disse interaksjonene. Her demonstrerer vi de mange trinnene som er involvert i å co-culturing primære DP-celler med TG nevroner spredt på en overliggende transwell filter med stor diameter porer for å tillate aksonal vekst gjennom porene. Primære DP-celler med genet av interesse flankert av loxP-nettsteder ble benyttet for å lette gensletting ved hjelp av et Adenovirus-Cre-GFP recombinase-system. Ved hjelp av TG-nevroner fra Thy1-YFP-musen tillatt for presis afferent bildebehandling, med uttrykk godt over bakgrunnsnivåer ved konfokal mikroskopi. DP-svarene kan undersøkes via protein- eller RNA-innsamling og -analyse, eller alternativt gjennom immunfluorescerende flekker av DP-celler belagt på flyttbare glassdekk. Media kan analyseres ved hjelp av teknikker som proteomiske analyser, selv om dette vil kreve albumin uttømming på grunn av tilstedeværelsen av føtal storfe serum i media. Denne protokollen gir en enkel metode som kan manipuleres for å studere morfologiske, genetiske og cytoskeletale responser fra TG-nevroner og DP-celler som svar på det kontrollerte miljøet i en co-kulturanalyse.
Introduction
Tanninervation gjør det mulig for tennene å føle trykk, temperatur og betennelse, som alle er avgjørende for bruk og vedlikehold av tannorganet. Unnlatelse av å føle tannsmerter forbundet med tannkaries og traumer fører til sykdomsprogresjon. Dermed er riktig innervering et krav for normal tannvekst, funksjon og omsorg.
Mens de fleste organer er fullt funksjonelle og innervated av fødselstidspunktet, strekker tannutviklingen seg inn i voksenlivet, med tanninervation og mineralisering som forekommer i konsert under postnatale stadier1,2. Interessant, tannmassen (DP) mesenchyme utskiller i utgangspunktet avstøtende signaler under embryogenese for å hindre akson inntreden i det utviklende tannorganet, som senere skifter til sekresjon av tiltrekkende faktorer som tannen nærmer utbrudd3,4. Under postnatale stadier, afferent aksoner fra trigeminus (TG) nerve trenge inn og gjennom tannen rundt dentin deponering begynner (anmeldt i Pagella, P. et al.5). Flere in vivo studier har vist at neuronal-mesenchymal interaksjoner guide tann inervation i mus (anmeldt i Luukko, K. et al.6), men få detaljer om molekylære mekanismer er tilgjengelig.
Celleco-kulturer gir kontrollerte miljøer der etterforskere kan manipulere interaksjoner mellom nevronale og mesenchymale populasjoner. Co-kultur eksperimenter gjør det mulig å dykke dypere inn i signalveiene guiding tann inervation og utvikling. Imidlertid presenterer flere av de konvensjonelle metodene som brukes til å studere celler i co-kultur tekniske utfordringer. For eksempel kan krystallfiolett farging av nøysom utvekst ikke-spesifikt flekker Schwann celler inkludert i TG bunt dispersjoner, og det kan være topper i fargeintensitet med relativt små svar7. Mikrofluidiske kamre tilbyr et attraktivt alternativ, men er betydelig dyrere enn transwell filtre8,9 og bare tillate undersøkelse av nevronale svar på DP sekreter. For å løse disse problemene har vi utviklet en protokoll som gjør det mulig for: a) presis farging og avbildning av TG nøysom tgrowth som svar på DP-sekreter, b) genetisk modifisering av DP-celler og / eller TG nevroner for å undersøke spesifikke signalveier, og c) undersøkelse av DP cellesvar på faktorer utskilt av TG nevroner. Denne protokollen gir muligheten til å undersøke nettopp flere funksjoner av tanninervation i det kontrollerte miljøet til en in vitro co-kultur analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter med mus ble godkjent av UAB Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Plate forberedelse
MERK: Coverslips kan brukes til å bilde DP-celler på slutten av analysen. Pass på at platelokket er på under alle inkubasjons- og sinsingtrinn utenfor den sterile vevskulturhetten for å forhindre kontaminering under prøvebehandling.
-
Tilberedning av dekkslip
- Autoklav sirkulære dekkslips.
- Filtrer ultrarent vann under panseret.
- Overfør dekkslipsene til en 24-brønnplate og dekk hver med 400 μL på 0,1 mg/ml poly-D-lysin.
- La coverslips å suge, nedsenket i 5 min, på en rocker på 12 rpm eller orbital shaker på 40-50 rpm. Pass på at lokket er på for å unngå kontaminering.
- Skyll dekkslips med filtrert ultrarent vann i ca 5 min på en rocker på 12 rpm eller shaker på 50 rpm. Gjenta.
- La dekkskliene tørke i minst 2 timer under hetten med platelokket av for å lette fordampningen. Disse dekkslappene skal brukes innen 48 timer.
- Seed DP-celler på toppen av dekkslips og prosess på slutten av analysen for immunofluorescens (pkt. 3.3).
-
Filtre for belegg
- Fortynn laminin til 10 μg/ml. Filtrer det fortynnede lamininet under panseret.
- Pipette 450-500 μL på 10 μg/ml laminin i hver brønn på en 24-brønnsplate.
- Plasser transwell filter, 3 μm porøsitet, i en brønn slik at den kontakter laminin oppløsning og la den i en 37 ° C inkubator for enten 2 timer eller over natten. Filterporer bør tillate noe av løsningen å spre og belegge både toppen og bunnen av filteret. Disse filtrene skal brukes innen 48 timer eller kjøles ned ved 4 °C i opptil 1 uke.
2. Celleplating med valgfri genetisk manipulasjon
- Mus: Genetisk endring av DP-celler kan utføres (men er ikke nødvendig) for å studere mesenchymal-neuronale interaksjoner. Se pkt. 2.3 og 2.4 for foreslåtte genetiske variasjoner.
- DP disseksjon, dispersjon og plating (Figur 1)
MERK: Bruk ultrafine, rette kanttang for DP-disseksjon. De ultra-fine kantene vil tillate brukeren å kile forcep kanten mellom mineralisert struktur og DP vev.- Harvest P5-P8 mus. På dette stadiet bør tennene mineralisere, og roten er åpen.
- Bedøve neonatene via hypotermi ved å plassere dem i en tallerken i kjøleskapet på 4 °C til de ikke lenger beveger seg eller reagerer på berøring. Euthanize nyfødte ved halshugging og i samsvar med IACUC prosedyrer på det angitte anlegget.
- Forbered en 3-5 ml aliquot på 0,25% trypsin-EDTA i et 50 ml konisk rør for å samle DP fra hver mus. Dette vil lette fordøyelsen av tannmasse fra postnatale mus. Bruk mer enn 3 ml hvis du fordøyer vev fra mer enn 10 postnatale mus.
- Plasser hodet på en engangs underpute slik at munnen er mot taket og bunnen av nakken er flatt på arbeidsflaten. Bruk et barberblad i en sagebevegelse for å skille mandible fra maxilla.
- Du kan eventuelt fjerne tungen enten med saks eller med tang for å gi enklere tilgang til jekslene.
- Plasser det åpnede hodet i en tallerken på toppen av en steril gasbindpute og plasser prøven under et disseksjonsmikroskop (Figur 1D).
- Fjern alveolærbevevet rundt første jeksler. Submandibulære tenner er ikke fullstendig utbrøt på dette punktet. Sett tang inn i alveolæråpning og erter vevet bort fra tannen mot den buccal (kinnet) eller lingual (tunge) siden av munnen. Maxillary tenner vil kreve full fjerning av kløften rundt tannen for eksponering og fjerning.
- Overfør forsiktig den submandibulære og maksillære første jekslene (M1s) til en egen cellekulturrett med 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Gjenta 2.2.4-2.2.8 til alle M1s er samlet inn. Hold parabolen som inneholder M1s på is under høstingen.
- Fjern Emalje ytre organ (EOE) rundt utsiden av hver M1. Dette kan alternativt gjøres etter trinn 2.2.11.
- Med et sett med tang, roter M1 slik at cusps er nede og den åpne roten er utsatt. Det vil være en oval åpning på bunnen av tannen, og ugjennomsiktig DP vev innkapslet av et tynt lag av dentin og emalje.
- Bruk tuppen av tangene, løsne DP forsiktig ved å kjøre en arm av pinsettene rundt den indre omkretsen av det mineraliserte vevet. Fjern DP-vev ut av den mineraliserte strukturen og overfør den til en tredje tallerken som inneholder 1x PBS. Fjern EOE hvis den ikke allerede var separert (Figur 1E).
- Overfør alt DP-vev til 0,25% trypsin-EDTA i et 50 ml konisk rør. Vortex blandingen og legg i et 37 °C varmt vannbad i 10 min. Dette kan gjøres med de samme pinsett eller med lange, hetteglass tang. Vevet vil være vanskelig å spre og vil kreve virvlende hver 3-4 min. IKKE overstige 10 min trypsinisering siden trypsin kan skade cellemembraner.
- Under en steril hette legger du til oppvarmede co-kulturmedier (tabell 1) til et endelig forhold på minst 1:1-medier for å trypsin for å inaktivere enzymet. Større forhold staller er akseptabelt hvis det er ønskelig med mer vevsdispersjon.
- Pipette mediet opp og ned flere ganger med en 10 ml pipette for å spre DP ytterligere i media. Vær forsiktig så du unngår store bobler. Fullstendig dispersjon er nesten umulig på grunn av det klissete innholdet i vevet. Det er imidlertid heller ikke nødvendig siden cellene vil migrere utover fra vevet når de er belagt.
- Overfør 1 ml av den spredte DP til hver brønn av en 24-brønns vevskulturplate(figur 1F).
- Plasser platen i en inkubator ved 37 °C og la cellene feste og migrere ut fra det uspredte vevet i 48 timer før du bytter medier. Primærceller må platelegges ved relativt høye konsentrasjoner for å nå 85-90% samløpet innen 1 uke. Hvis dette ikke oppnås etter 1 uke, kast platen.
- Valgfri genetisk manipulering av DP-celler
- For å endre cellesignalveier, høstDP-celler fra genetiske knockoutmus eller fra mus der et gen av interesse er flankert av loxP-områder. I sistnevnte tilfelle kan genet slettes ved hjelp av Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) rekombinase for å fjerne det flankerte genet, som beskrevet nedenfor. Bruk Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) som et kontrollvirus for å sikre at virusinfeksjonen ikke forårsaker mobilrespons.
MERK: Ad-eGFP styres av CMV-arrangørforsterkeren, noe som er veldig sterkt. Ad-Cre-GFP er regulert av en IRES, en intern regulatorisk region mellom Cre og GFP, som ikke er veldig sterk. Dette resulterer i lysere fluorescens i Ad-eGFP-celler enn Ad-Cre-GFP-celler. Bekreft tilsvarende infeksjonsnivåer basert på det totale antallet celler som fluorescerer, ikke på nivåene av cellulær fluorescens. - Forbered 500 μL med medisomme som inneholder virus og 10 μg/ml polybren per brønn. Polybren hjelper med virusinfeksjon i celler nær samløpet10. Denne protokollen er basert på et mangfold av infeksjon (MOI) på 100 for Ad-eGFP og 200 Ad-Cre-GFP for effektiv geninfeksjon med liten eller ingen effekt på cellelevedyktighet. Det estimerte cellenummeret er 4 x 104 celler/brønn av en 24-brønnsplate:
- Bland mediden ei kort virvlende eller pipettering, og tilsett 500 μL til hver brønn.
- Etter 24 timer, legg til ytterligere 500 μL co-kultur media som ikke inneholder ekstra polybren eller virus.
- Etter totalt 48 timer, aspirervirusholdige medier og erstatte med friske co-kultur media. På dette punktet kan TG-nevroner legges til på toppen av transbrønnfiltre.
- For å endre cellesignalveier, høstDP-celler fra genetiske knockoutmus eller fra mus der et gen av interesse er flankert av loxP-områder. I sistnevnte tilfelle kan genet slettes ved hjelp av Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) rekombinase for å fjerne det flankerte genet, som beskrevet nedenfor. Bruk Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) som et kontrollvirus for å sikre at virusinfeksjonen ikke forårsaker mobilrespons.
- Trigeminusnevrondisseksjon, dispersjon og plating
MERK: I denne protokollen ble avbildningen av nøyitret utvekst i co-kultur med DP-celler optimalisert ved hjelp av ungdom (6 uker gammel) B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J mus. Sentrale og perifere nervesystemer av Thy1-YFP mus har en gul fluorescerende protein (YFP) tag hvis uttrykk begynner rundt P6-P10 i nevroner og øker eksponentielt gjennom nervesystemet under postnatal og voksenliv11,12. YFP og GFP har bevart sekvenser som gjør at disse nervene kan være farget med anti-GFP antistoffer, noe som resulterer i en pan-neuronal flekk. Til syvende og sist tillater disse musene bedre visualisering og kvantifisering av nevronene som brukes og dyrkes i cellekultur.- Euthanize ungdomsmus med karbondioksid etterfulgt av cervical dislokasjon.
- Decapitate musene og fjern huden fra skallen. Sørg for å inkludere tilsvarende antall menn og kvinner.
- Sett spissen av et par mikrodissekere saks inn i bunnen av skallen. Skjær langs skallens sagittale sutur (figur 1A).
- Lag fire små horisontale kutt: to langs koronar suturene ved ørene, og to langs lambdoid suturene ved foten av skallen. Dette bør skape to klaffer av bein.
- Bruk tang ene til å skrelle tilbake de to klaffene av bein. Dette bør avsløre hjernen.
- Fjern hjernen. Overfør hodet til en vevkulturrett med 1x PBS og legg under mikroskopet.
- Finn TG ganglia, som er lett synlig i gnagere13, plassert i dura saken mellom hjernen og beinet i maxillary prosessen (Figur 1B).
- Skjær de tre grenene som reiser til øynene, maxillae og mandible og overføre ganglia til kald 1x PBS ved hjelp av rett kant fine tang. Hold parabolen som inneholder TG-gangliapå is under høsting.
- Når alle TG-bunter er høstet, overføre ganglia til en 50 ml konisk rør som inneholder 5 mg / ml sterilt-filtrert kollagenase type II ved hjelp av hetteglass tang.
- Vortex kollagenkolene med TG-bunten og legg røret i et 37 °C vannbad i 25-30 min. I løpet av denne tiden, ta det koniske røret ut av vannbadet, virvel, og gå tilbake til badet hver 5-10 min.
- Sentrifuge kollagenkolene-TG nevron løsning for 2 min ved 643 x g.
- Under en vevskulturhette, forsiktig aspirer kollagenkolene med en mikropipette.
- Tilsett 5 ml 1% steril-filtrert trypsin type II og vortex. Plasser det koniske røret i et 37 °C vannbad i 5 min.
- Sentrifuge trypsin-TG-blandingen i 5 min ved 643 x g. Fjern den øverste delen av trypsin med en mikropipette, slik at TG-nevronene ikke fjernes. Det vil fortsatt være væske i røret.
- Legg til nok medier til å deaktivere gjenværende trypsin (med et 1:1 eller lavere forhold mellom trypsin til medier).
- Tell antall celler og fortynn løsningen til 200 000 celler/ml (250 μL celleholdige 50 000 celler).
- Plasser belagte transbrønnfiltre fra avsnitt 1.2 i brønner med DP.
- Fortynn celleholdig løsning slik at det er 200.000 celler/ ml. Pipette 250 μL på transbrønnfilteret, og kultur cellene ved 37 °C over natten (figur 1F).
- Neste dag, erstatte media med 1 ml co-kultur media med 1 μM uridin og 15 μM 5'-fluor-2'deoxyuridine å stoppe over-spredning av mesenchymal celler som kan hindre nøysommelig utvekst. Valgfritt: Legg til vekstfaktorer eller inhibitorer i dette mediet hvis du forsøker ytterligere manipulering.
- Kultur cellene for flere ønskede tidspunkter. Denne protokollen ble optimalisert for 5 totale kulturdager med media endret bare på dag 2 for å legge til mitotiske hemmere. Lengre tidsperioder krever flere medieendringer.
3. Eksempel innsamling og behandling
- Trigeminusfarging
- Pipette 1 ml aliquots av sterile 1x PBS i en 24-brønnplate under en vevskulturhette for hvert transbrønnfilter som skal behandles.
- Fjern væsken på toppen av filteret fjernes med en 200-1000 μL pipette, vær forsiktig med å la cellelag være intakt. Vedlagte celler skal forbli vedlagte og ikke-tilknyttede celler vil løsne under denne milde pipetteringen. Et vakuumfilter kan skade cellelaget og anbefales ikke for aspirasjon.
- Overfør filteret til 1x PBS-platen, og pass på å fjerne det øverste laget av medier som nevnt i forrige trinn.
- Legg platen med alle transbrønnfiltre og lokk på en rocker klokken 12 rpm eller 40-50 rpm på en orbital shaker i 10 min.
- Aspirer PBS, inkludert det øverste laget som beskrevet ovenfor, tilsett 500 μL 1xPBS og plasser på rockeren eller orbital shaker en ekstra 5-10 min skyll.
- Aspirer 1x PBS igjen og erstatte med 4% paraformaldehyd (PFA). Bruk minst 500 μL slik at hele filteroverflaten er nedsenket. Plasser platen på en rocker på 12 rpm eller orbital shaker på 40-50 o/min ved romtemperatur i 1 time.
- Fjern PFA og skyll platene to ganger i 5-10 min hver på en rocker med 500 μL av 1x PBS.
- Blokker med 10 % storfeserumalbumin (BSA) + 5 % geit/eselserum, avhengig av det sekundære antistoffvertsdyret, i 0,05 % Tween-1xPBS (PBST). Bruk 450-500 μL oppløsning slik at filteret er nedsenket i væsken.
MERK: På dette stadiet kan disse platene lagres ved 4 °C i flere måneder for å behandle på et senere tidspunkt. Bruk parafilm til å forsegle platen for å sikre at fordampning ikke oppstår, og kontroller regelmessig for fordampning slik at filterflatene forblir nedsenket. - Fjern blokken og tilsett 450-500 μL primærantistoff i 1% BSA-PBST uten ekstra skyll. Inkuber ved 4 °C over natten, forsiktig gynge.
- Fjern primær antistoffoppløsning og skyll med 500 μL 1xPBST på en rocker, 3 ganger, ved romtemperatur
- Fjern PBST, tilsett sekundært antistoff og inkuber på en rocker over natten ved 4 °C innpakket i aluminiumsfolie for å beskytte fluoropforer mot lysnedbrytning. Skyll igjen, 3 ganger, med 1x PBST på en rocker ved romtemperatur. Erstatt med 1x PBS.
MERK: På dette punktet kan platen lagres i flere måneder ved 4 °C hvis den er pakket inn i aluminiumsfolie for å forhindre fluoropfornedbrytning. Bruk parafilm til å forsegle platen for å sikre at fordampning ikke oppstår, og kontroller regelmessig for fordampning slik at filterflatene forblir nedsenket. Det er best å bilde innen en måned. - For optimal bildebehandling, bruk Thy1-YFP mus nevroner med en anti-GFP antistoff for å spesielt flekke nevronale afferents godt over bakgrunnsnivåer. Bruk Anti-Neurofilament 200 til nøyaktig flekkaksonale strukturer hvis Thy1-YFP-mus ikke er tilgjengelige.
- Bildet etter ønske. Filtre trenger ikke å være belagt og kan i stedet plasseres på toppen av en dekkslip eller lysbilde for bildebehandling med et omvendt mikroskop.
MERK: Filterområdene inneholder ikke afferentstrukturer. Ta flere bilder med en z-stack dybde som fanger alle afferent strukturer. Bruk sømprogramvare for å visualisere den nøyde utveksten over store områder, eller (helst) hele filterområder.
- RNA, protein og medieinnsamling
- Mens transwell-filtrene behandles, samle inn media i RNAse/DNAse-frie rør og fryse for senere analyser (ELISA, proteomikk osv.).
- Umiddelbart etter medieinnsamling, aliquot lysis buffer eller Radio Immuno Precipitation Assay (RIPA) buffer med proteinase og fosfatase hemmere inn i brønnene. Denne protokollen ble optimalisert for 100 μL/brønn i en 24-brønnsplate.
- Tillat buffere å lyse celler i 5 min, skrap deretter hvert filter med en ny pipettespiss, og samle celleprøvene i RNAse/ DNAse-frie rør. Frys lysis for fremtidige analyser (semi-kvantitativ og / eller kvantitativ PCR, vestlig blot, etc.).
- Valgfri immunfluorescens av tannmasseceller:
- Løft forsiktig dekkslips fra avsnitt 1.1 med tang og overfør dem til forskjellige brønner med 4 % PFA i 1 t med gynge.
- Aspirer PFA og skyll dekkslappene to ganger med 1x PBS. Følg dette med permeabilisering, blokkering og immunfluorescens for markører av interesse med standard immunfluorescensteknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse resultatene viser at TG nøyritt utvekst ble økt i nærvær av primære DP-celler i den underliggende brønnen sammenlignet med kontroll av TG nøysom monkultur (Figur 2A,C). Det er noen analyse-til-analyse variabilitet i nøysom metriinvekst. Dermed bør en TG nevron monokultur inkluderes i alle analyser som en kontroll for å oppdage basalnivåene av nøyrite utvekst. Primærceller fra Tgfbr2f/f-musen ble brukt i denne protokollen etter infeksjon av Ad-Cre-GFP og Ad-EGFP ble bekreftet i tilsvarende antall celler (Figur 2D). Ad-eGFP fungerte som en kontroll viral vektor. Ad-Cre-GFP slettet det flankerte genet, Tgfbr2, som demonstrert av semi-kvantitativ pcR (figur 2E). I kulturer med Transforming vekstfaktor beta reseptor 2 (Tgfbr2) sletting, nøysom meanger utvekst ble redusert (Figur 2A-C).
Vi benyttet Thy1-YFP mus TG nevroner og farget dem med en anti-GFP antistoff som produserte svært spesifikke og lyse bilder av aksonale strukturer godt over denne bakgrunnen, som vist i figur 2. Dette tillot spesifikk farging av nevronale markører uten ikke-spesifikk farging av ikke-nevronale celler ved å bruke tidligere rapporterte metoder som krystallfiolett7. De store porene i filtrene kan autofluoresce og/eller samle sekundære antistoffer og redusere presisjonen til aksonalavbildning (figur 3). Mens Thy1-YFP nevroner med immunofluorescens drastisk forbedrer avbildningen, ytterligere bakgrunn kan fjernes med auto-tersonering programvare og deretter kvantifisert. Vi anbefaler også å utføre immunfluorescens for Neurofilament 200 basert på våre foreløpige funn (ikke vist) så vel som andre8,9 hvis Thy1-YFP mus ikke er tilgjengelig.
Figur 1: En skjematisk av musen disseksjon for å få celler for co-kultur. (A) Et diagram over hvor du skal kutte for å åpne museskallen og finne TG nerver, vist i svart i den siste skildringen. Saks angir hvor du skal sette inn saksetipsene for å kutte langs de stiplede linjene. (B) Et kombinert darkfield- og GFP-bilde som viser Thy1-YFP+ TG nerver sirklet i hvitt. (C) Dissekert TG ganglia kan deretter spres og dyrkes, som vist i F. (D) Den mandible av en P7 mus, med tang holder mandible på venstre og alveolar bein ryggene som inneholder ubrutttenner på hver side av tungen. (E) DP vev (sirklet) ekstrahert fra mineralisert struktur (topp), og emalje ytre epitel (nederst) som ble fjernet for å spre og plate i en vev kulturbehandlet plate, som vist i F. Bilder vises ikke for å skalere. DP-celler ble spredt og vokst til samløpet før du legger til TG-nevroner. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative resultater fra co-kultur. - Jeg har ikkenoe å si. Thy1-YFP TG nevroner ble dyrket i transwell filtre med 3 μm porer på toppen primære Tgfbr2f / f DP celler. Immunfluorescerende farging ble utført for YFP-proteinet ved hjelp av et anti-GFP antistoff for å gi svært spesifikk farging av nevronale strukturer over hele filteret. De maksimale projeksjonene på 100 μm z-stack konfokal mikroskopi bilder på 10x ble samlet og sydd med søm programvare. TG nevroner demonstrerte betydelig mer utvekst når co-cultured med DP-celler (A) enn når dyrket alene (C). Nøyriterisk utvekst ble ikke indusert når nevroner ble kokulturert med DP-celler infisert med Ad-Cre-GFP for å slå ned Tgfbr2 (B). Skala bar = 1000 μm. Tilsvarende antall celler infisert med Ad-eGFP og Ad-Cre-GFP er vist i (D). Skala bar = 125 μm. Semi-kvantitativpcr bekreftet Tgfbr2 KD (E). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Tekniske problemer presentert i afferent bildebehandling. (A) Brightfield bildebehandling av transwell filtre etter krystallfiolett farging av cellepopulasjoner. Store porer er utbredt. Den store pilen peker på en celle som viser mesenchymal morfologi, mens den lille pilen peker til en celle av nevronal morfologi. Krystallfiolett farget begge cellene uten bias. (B) Immunfluorescerende farging av β3 tubulin med et Alexa-488 sekundært antistoff viste ikke-spesifikk farging av flere celler, noe som gjør avbildning av afferent strukturer vanskelig. Bilder er representative og ble gjentatt over flere analyser for å optimalisere avbildningen som vises i figur 2. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
| Komponent | Volum | Konsentrasjon | |
| MEM α Leilighet | 440 ml | ||
| Varmeinaktivert føtal storfe serum | 50 ml | 10% | |
| 100x L-glutamin | 5 ml | 1x (andre) | |
| Penicillin-streptomycin 100 x | 5 ml | 1x (andre) | |
| Endre medier på dag 2 med mitotiske hemmere ved disse endelige konsentrasjonene | |||
| Uridin (andre) | 1 μM | ||
| 5'-Fluor-2'deoxyuridine | 15 μM (15 μM) | ||
Tabell 1: Co-kultur media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De daglige aktivitetene i munnhulen krever at tennene føler ytre stimuli og intern betennelse for å tillate riktig bruk og vedlikehold. Begrenset informasjon er imidlertid bare tilgjengelig når det gjelder signalene som driver utviklingsprosessene for tanninervasjon. Denne protokollen gir en metode for å isolere og co-kultur primære DP-celler og TG nevroner for å studere krysskommunikasjon mellom de to populasjonene. Flere variabler ble optimalisert og la åpne ytterligere veier for forskning, som beskrevet nedenfor.
Kontroller er viktige på hvert trinn i denne analysen. Et transwell-filter med TG-nevroner uten underliggende DP-celler bør inkluderes i hver analyse for å gi en grunnlinje for TG-vekst. Ved sletting av et flankert gen av interesse med en Ad-Cre-GFP recombinase, bør et kontrollvirus som bare uttrykker fluorescerende markør, brukes til å bekrefte at tilsvarende antall celler er infisert. Mens vi demonstrerte høye infeksjonsnivåer med minimal celledød ved henholdsvis 100 og 200 MOI for Ad-eGFP og Ad-Cre-GFP, bør hvert laboratorium optimalisere dette trinnet. Fordi fluorescerende proteiner kan festes til forskjellige promotorer og derfor forårsake differensialuttrykk tilsvarende antall infiserte, bør fluorescerende celler telles. Den generelle intensiteten av fluorescenser er irrelevant fordi den ikke nøyaktig gjenspeiler infeksjonsstatusen. Det er viktig å demonstrere sletting av genet, som vist med semi-kvantitativ PCR i denne protokollen (Figur 2). Selv om denne protokollen ikke adresserte dette emnet, viste tidligere forskning at kontrollanalyser med andre cellelinjer kunne inkluderes for å demonstrere at den nøyde utveksten er spesielt indusert av co-kultur med DP-celler8.
Fordi denne protokollen benytter primære celler, er det flere stadier der forurensning kan innføres. For å unngå dette bør alle reagenser steriliseres. I tillegg anbefales det at eksperimenter for hver variabel kjøres i duplikat eller triplicate for å tillate fjerning av et filter og sterilisering av en forurenset brønn uten fullstendig svikt i analysen.
Coverslips må være belagt med poly-D-lysin og/ eller en ekstracellulær matrise protein for å sikre DP celle vedheking. Mens cellene i utgangspunktet feste, virusinfeksjon forårsaker celle løfte død på ubestrøke coverslips og hindrer genetisk manipulering av co-kultur analyse.
Det er godt etablert at ikke-nevronale celler, som Schwann-celler fra TG-ganglia, kan påvirke overlevelsen av nevronale celler i kultur14,15,16. I denne protokollen ble nevronal overlevelse optimalisert ved å legge til 1 μM uridin og 15 μM 5-fluor-2'deoxyuridine. Uten tilsetning av disse antimtotiske midlene for å hemme Schwann cellespredning, vil nøyriteutvekst ikke forekomme. Det er ukjent om tilstedeværelsen av disse senescent Schwann cellene i co-kultur endre nevronal respons. Isolere murine nevroner krever flere ekstra trinn, og protokoller er tilgjengelig for etterforskere som ønsker å fjerne denne variabelen17. I begge tilfeller etterligner nevrondispersjon noe en axotomy og kan betraktes som å representere skade / reparasjon18 mer enn utvikling. Videre studier ville være nødvendig for å bestemme forskjellene mellom in vivo aksonal vekst fra fascicles versus aksonal vekst fra individuelle nevroner in vitro, og disse er ikke adressert i denne protokollen.
Denne protokollen tar 1-3 uker fra start til slutt. Mens det er mulig å bruke DP-celler som krever mer enn 1 uke for å nå 85-90% samløpet, anbefales det at celler ses med høy nok tetthet for å nå samløpet innen få dager siden disse cellene deler seg veldig sakte forbi det punktet. Dette krever vanligvis rundt 5-7 P5-8 mus per rad av en 24-brønnplate. Denne protokollen ble optimalisert for totalt 5 dager med co-kultur, da media med fenol rød begynte å skifte farge. Mediene bør endres hvis lengre analyser er ønsket.
Flere co-kultur analyser har blitt utført for å demonstrere nøysom utvekst som svar på faktorer utskilt av DP utskilles faktorer med standardECM-belagt vev kultur plater3,19,20,21 eller mikrofluidiske kamre 8,22,23. Denne protokollen gir flere fordeler fremfor disse metodene. For eksempel krever TG ganglia og DP vev co-kultur et bestemt romlig forhold for nøyder å føle og svare på kortdistanse paracrine signaler. Med organkultur er bare nøyitrene i ganglia nærmest DP-vevet i stand til å reagere3, mens de spredte TG-nevronene som brukes i denne protokollen, er kultivert i lik avstand fra DP-cellene under. For det andre kan organkulturer introdusere vevnekrose på grunn av mangel på oksygen og næringsstoffer tilgjengelig i store prøver24. Kokulturen til spredte celler fjerner denne muligheten. Noen co-kulturer inkludert nevroner krever nevronale medier3,22 som kan spille en dominerende rolle i å fremme nøysom mekulturer. Denne protokollen legger ikke til nevronspesifikke vekstfaktorer, og dermed åpner for en evaluering av den direkte sammenhengen mellom paracrine signaler fra de underliggende DP-cellene og nøysomme utvekstresponser. Det er verdt å merke seg at co-kultur media mangler også komponenter for å fremme mineralisering, for eksempel beta-glycerophosphate. Dette gjør det mulig for etterforskerne å avgjøre hvordan nøyder kan skille ut signaler for å oppmuntre til mineralisering. Det begrenser imidlertid også studien ved bare å inkludere mindre differensierte DP-celler uten mineraliserende odontoblaster som vanligvis ville være tilstede i vivo.
Koloimetriske svar fra tidligere forskning7,8 ikke avgrense Schwann celle bidrag eller demonstrere neuronal morfologi siden krystall fiolett ikke-spesifikt flekker alle celler. Immunfluorescerende flekker av filtre kan føre til høye bakgrunnsnivåer som gjør afferent bildebehandling vanskelig (Figur 2). Den nåværende protokollen gjør det mulig for presis farging av nevronale afferents ved å bruke Thy1-YFP TG nevroner og en anti-GFP antistoff og gir et signal lyst nok til å generere store bilder av vekst gjennom en hel figur (Figur 3). Det er mulig å bruke andre nevronale markører, for eksempel Anti-Neurofilament 200, hvis Thy1-YFP mus ikke er tilgjengelige.
Til slutt, ved hjelp av primære DP-celler fra mus med gener av interesse flankert av loxP nettsteder gir enkel og effektiv sletting av disse genene med en Ad-Cre-GFP system. I fremtidige studier kan Ad-Cre recombinase-systemet brukes på TG-nevronene hvis de har et gen av interesse flankert av loxP-nettsteder. Dette vil lette studier på hvordan paracrine signaler fra den nevronale befolkningen påvirker DP-celler, spesielt hvis DP-cellene ses på toppen av dekkslips (Seksjon 1.1). Fremtidige studier kan benytte andre manipulasjoner, for eksempel tillegg av farmakologiske hemmere og/eller vekstfaktorer. Det er også mulig å endre denne protokollen for å inkludere migrasjonsstudier ved hjelp av 8 μm porøsitet transwell filtre.
Til slutt, denne transwell co-kultur analyse utnytte nevroner og DP celler tillater undersøkelse av flere cellulære parametere. Dette gjør det mulig å utvide kunnskapenom mesenchymal-neuronal interaksjoner som fremmer og støtter tanninnervering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av a) National Institutes of Health / NIAMS (tilskuddsnummer R01 AR062507 og R01 AR053860 til RS), b) University of Alabama ved Birmingham Dental Academic Research Training (DART) stipend (nummer T90DE022736 (PI MacDougall)) til SBP fra National Institute of Dental og Craniofacial Research / National Institutes of Health, c) en UAB Global Center for Craniofacial, Oral and Dental Disorders (GC-CODED) Pilot og mulighet tilskudd til SBP og d) National Institute of Dental og Craniofacial Forskning/Nasjonale institutter for helse K99 DE024406 tilskudd til SBP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
References
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
- Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
- Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
- de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
- Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114 (2015).
- Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
- Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
- Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
- Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
- Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
- Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558 (2013).
- Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
- Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, Clifton, N.J. 229-251 (2017).
- Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
- Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799 (2016).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326 (2014).
- Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).
