Summary
Este protocolo apresenta um procedimento detalhado para preparar criosamples biológicas para experimentos de espectroscopia de absorção de raios-X baseados em síncrotrons. Descrevemos todas as etapas necessárias para otimizar a preparação da amostra e a criopreservação com exemplos do protocolo com células cancerígenas e fitoplâncton. Este método fornece um padrão universal de preparação crio-de-amostra.
Abstract
O estudo de elementos com espectroscopia de absorção de raios-X (XAS) é de particular interesse ao estudar o papel dos metais em sistemas biológicos. A preparação da amostra é um procedimento fundamental e muitas vezes complexo, particularmente para amostras biológicas. Embora as técnicas de especiação de raios-X sejam amplamente utilizadas, nenhum protocolo detalhado ainda foi divulgado para os usuários da técnica. Além disso, a modificação do estado químico é preocupante, e técnicas baseadas em crio-claro são recomendadas para analisar as amostras biológicas em seu estado hidratado quase nativo para fornecer a máxima preservação da integridade química das células ou tecidos. Aqui, propomos um protocolo de preparação celular baseado em amostras crio-preservadas. É demonstrado em uma fluorescência detectada por fluorescência de alta resolução de raios-X estudo de espectroscopia de selênio em células cancerosas e um estudo de ferro em fitoplâncton. Este protocolo pode ser usado com outras amostras biológicas e outras técnicas de raio-X que podem ser danificadas por irradiação.
Introduction
O estudo das biotransformações celulares de elementos essenciais ou tóxicos requer técnicas de especiação com alta sensibilidade e deve minimizar as etapas de preparação da amostra que muitas vezes são propensas à modificação de espécies químicas.
Elementos fisiológicos como selênio e ferro são conhecidos por serem particularmente difíceis de especiar devido à sua química complexa, várias stabilidades das espécies de selênio ou ferro, e sua baixa concentração na faixa ppm (mg/kg) ou mesmo sub-ppm. Assim, o estudo da especiação desses elementos pelo XAS pode ser extremamente desafiador. O Síncrotron XAS e especialmente a fluorescência de alta resolução de energia detectada xas (HERFD-XAS), que permite uma relação sinal-fundo muito baixa1, estão disponíveis em fontes síncrotrons para especiar elementos altamente diluídos em matrizes biológicas complexas 2,3. As medidas convencionais de fluorescência-XAS podem ser realizadas usando um detector de estado sólido resolvido com energia (SSD) com uma largura de banda de energia ~150-250 eV, na linha de feixe CRG-FAME no European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, enquanto as medidas HERFD-XAS precisam de um espectrômetro de analisador de cristal (CAS), com uma largura de banda de energia ~1-3 eV, na linha de feixe CRG-FAME-UHD no ESRF2 . Os fótons de fluorescência são discriminados em relação à sua energia com processos eletrônicos ou ópticos, respectivamente.
A crio-preparação amostral é essencial para preservar estruturas e manter a integridade química composicional, permitindo assim análises próximas ao estado nativo biológico5. Além disso, análises realizadas a temperaturas criogênicas tão baixas quanto 10 K usando resfriamento criogênico de hélio líquido (LN2), permitem que os danos causados pela radiação diminuam e preservem a especiação elementar para XAS. Embora algumas revisões sobre técnicas de XAS aplicadas a amostras biológicas informem a necessidade de preparar e analisar amostras em condições criogênicas (por exemplo, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), nenhuma delas descreve claramente o protocolo detalhado relacionado. Nesta publicação, um método de crio-preparação de células cancerosas e microrganismos de plâncton é descrito para a especiação HERFD-XAS de Se8 e Fe9 à temperatura criogênica.
Boas práticas para preparação e ambiente de amostras durante as medições de espectroscopia XAS de última geração requerem 1) uma configuração; 2) procedimento de análise que limite ao máximo os efeitos dos danos causados pela radiação; e 3) uma amostra (ou referência composta modelo) o mais homogênea possível em relação ao tamanho do feixe de fótons de raios-X. O primeiro item é levado em conta realizando a aquisição a uma temperatura baixa, utilizando um criostat de hélio líquido. O segundo item é tratado realizando cada aquisição em uma nova área da amostra, movendo-a com relação à viga. Por fim, considerando a terceira condição, amostras (pelotas) e referências (pós) são condicionadas em pelotas a granel prensadas, a fim de limitar as porosidades e inhomogeneidades tanto quanto possível, e evitar rugosidades em relação ao tamanho do feixe na superfície da amostra sondada por raios-X. Explicamos como o protocolo lida com todos esses pontos.
Usamos a linha de células de próstata humana PC-3 (alto potencial metastático) e a linha de células ovarianas OVCAR-3 (que representa até 70% de todos os casos de câncer de ovário) para investigar as propriedades antiproliferativas em relação às células cancerosas de nanopartículas de selênio (Se-NPs) e diatom de tristórcula de Phaeodactylum como espécie modelo para investigar a sequestração de ferro em filtoplâncton.
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Protocol
1. Preparação das pelotas humanas de células cancerígenas PC-3 e OVCAR-3 para especiação de selênio
NOTA: O seguinte protocolo é adaptado de Weekley et al.10. Todas as etapas devem ser realizadas sob uma capa de cultura celular sob condições e restrições de nível 2 de biossegurança, utilizando técnicas assépticas.
- Conte as células usando uma câmara de contagem de células Malassez. Semente 150.000-200.000 células por frasco para a linha celular PC-3 e 300.000 células para a linha celular OVCAR-3.
- Células de sementes em frascos T-75 (três frascos por condição para ter triplicados) na mídia de cultura celular adequada (Tabela 1) sob a capa de fluxo laminar.
- Deixe as culturas celulares crescerem em uma incubadora a 37 °C e uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 até atingirem 80% de confluência. Normalmente, as linhas de células cancerígenas de próstata PC-3 dobram após 24 h, enquanto as linhas de células cancerígenas de ovário OVCAR-3 tomam 72 h. Os frascos devem ser deixados na incubadora.
- Enquanto isso, diluir os Se-NPs utilizados para o tratamento para uma concentração final que corresponde ao IC20 (concentração inibitória para atingir 20% de morte celular) que foi predeterminado pelo MTT (3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium brometo) para avaliação de citotoxicidade. Essas concentrações são específicas para cada tipo se-NPs, mas também específicas para a linha celular estudada.
- Coloque a solução de caldo nanopartícula (2 mg/mL de albumina de soro bovino [BSA] ou se-NPs revestida de chitosan) em um banho de água de ultrassom por 30 minutos à temperatura ambiente (RT).
- Diluir a solução Se-NPs por diluições seriais em meio de cultura celular completa para atingir concentrações de trabalho. Entre cada diluição, vórtice por 1 min.
- Prepare um controle positivo de selênio com sal de selênio diluído para tratamento.
- Prepare uma solução aquosa de estoque de selenita de sódio (1 mg/mL) em um tubo de polipropileno de 15 mL. Misture 1 mg de pó de selenita de sódio com 1 mL de água ultrapura.
- Vórtice a solução de estoque por 1 min.
- Diluir a solução de estoque de selenita de sódio por diluições seriais em meio de cultura celular completa para atingir concentrações de trabalho.
NOTA: Não se esqueça de encanar várias vezes antes de cada diluição para homogeneizar a solução.
- Exponha as células cancerígenas aos tratamentos de selênio.
NOTA: Esta parte do protocolo deve ser repetida para cada nanopartícula (PN) testada. Aqui, os NPs são de dois tipos, BSA e Se-NPs revestidos de chitosan, além dos controles. A solução de selenita de sódio é o controle positivo e nenhum tratamento é o controle negativo.- Abra os três frascos T-75 contendo as células no capô de fluxo laminar.
- Retire o meio e lave as células suavemente 2x com 5 mL de salina tamponada de fosfato (PBS).
- Suavemente, na parte inferior do frasco e não diretamente na camada celular, adicione 15 mL do tratamento em cada frasco usando uma pipeta automática equipada com pipetas plásticas estéreis de 25 mL. Coloque as tampas nos frascos. Não feche bem as tampas.
NOTA: Conforme descrito nas etapas 1.3 e 1.4, as soluções de tratamento devem ter sido resuspendidas previamente para serem homogeneizadas. - Deixe os três frascos horizontalmente em uma incubadora a 37 °C e uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 por 24 h.
- Preparação das pelotas de célula
- Lave suavemente as células 2x com 5 mL de PBS aquecido (37 °C) diretamente nos frascos T75.
- Adicione 6 mL de cultura celular aquecida (37 °C) na camada celular no frasco T-75 usando um menino pipeta equipado com pipetas plásticas estéreis de 10 mL.
- Colete as células através de raspagem suave usando um raspador de células. Use um raspador de célula por frasco.
- Usando um menino pipeta e uma pipeta de 10 mL, aspire o líquido e lave a célula/meio na superfície do frasco, a fim de coletar todas as células. Repita este passo várias vezes para dissociar e individualizar as células. Colete o meio que contém as células em um tubo de polipropileno de 15 mL.
- Gire a 250 x g por 5 min na RT. Aspire o supernatante.
- Enxágüe as células reutilizando-as em 5 mL de PBS.
- Gire a 250 x g por 5 min na RT. Aspire o supernasciente e repita os passos 1.6.5 e 1.6.6 2x para se livrar de todos os traços restantes do tratamento.
- Resuspenda as células em 1 mL de PBS e transfira-as para um tubo de polipropileno de 1,5 mL. Finalmente, gire-os a 250 x g por 5 min no RT. A figura 1 representa a pelota de célula obtida após a centrifugação e o descarte do supernante.
- Remova suavemente todo o supernatante PBS usando uma pipeta de 200 μL.
NOTA: Tenha cuidado para não tocar e danificar a pelota da célula. O ideal é que a pelota tenha de 2 a 3 mm de altura ou espessura, com diâmetro de 3 a 6 mm. Para a linha celular PC-3, são necessárias células 9 x 106-10 x 106 para o ensaio. Para a linha celular OVCAR-3, são necessárias 8 x 10células 6-9 x 106 (Figura 1). Algumas células provavelmente serão perdidas durante as etapas subsequentes de lavagem de buffer. Quanto maior o número de celular, melhor será a pelota.
- Congelamento relâmpago das pelotas celulares
- Mergulhe a parte inferior do tubo de 1,5 mL contendo a pelota em nitrogênio líquido (LN2) até o nível da pelota celular.
- Em uma caixa de luvas totalmente purgada com uma atmosfera inerte como gás nitrogênio, colete a pelota celular tocando suavemente o tubo de 1,5 mL na superfície plana de um bloco de cobre LN2 refrigerado (Figura 2). A pelota é então coletada sem perda de celular.
NOTA: Use equipamentos de crioproteção, jaleco, sapatos fechados, luvas crio-e um escudo facial ou óculos de segurança para manuseio LN2 . - Se necessário, uma agulha resfriada LN2 pode ser usada para ajudar a tirar a pelota.
NOTA: A pelota de célula congelada resultante pode se fragmentar. Essas etapas devem ser realizadas no espaço de alguns minutos e dependem da destreza e velocidade do pesquisador. - As dimensões da pelota congelada devem se encaixar no suporte da amostra criostat. Utilizando o equipamento descrito, se a pelota celular for maior que 2 mm de altura e ligeiramente menor do que o orifício do suporte de amostra usado para XAS, a amostra pode ser usada diretamente. Se não, ou se uma superfície plana para a análise for desejada, uma pelota cilíndrica a granel deve ser preparada, mantendo a pelota em seu estado congelado. Se a pelota da célula for fragmentada, os seguintes passos podem ser usados idealmente em uma caixa de luvas totalmente purgada com uma atmosfera inerte.
- Preparação das pelotas cilíndricas congeladas a granel
- Mergulhe todas as partes de uma prensa hidráulica manual que estará em contato com a amostra na LN2 (Figura 3A; 3 ou 5 mm de diâmetro morre, molde, pistão/fio puxando).
- Transfira os fragmentos de pelotas rapidamente congelados para o molde carregado com as mortes apropriadas da pelota (Figura 3B).
- Pelota rápida com a prensa hidráulica. O uso de 1,5 toneladas para uma pelota de 5 mm de diâmetro ou 0,5 toneladas para uma pelota de 3 mm de diâmetro é suficiente (Figura 3C).
NOTA: Após cada preparação de pelotas com a prensa hidráulica, todos os materiais precisam ser descongelados e secos adequadamente usando gás nitrogênio para evitar problemas com a geada e umidade restantes. - Colete a pelota a granel de células congeladas rapidamente e coloque-a em um criotubo adequado para armazenamento.
- Armazene-o de volta no tanque LN2 para armazenamento a longo prazo.
- Transfira e monte as cápsulas crio-pelotas para análise. A pelota armazenada em um criotube refrigerado LN2 é transferida para um suporte de amostra criostat pré-cozido de 77 K no líquido N2 (Figura 4, como usado para uma linha de feixe CRG-FAME-UHD). Esta etapa deve ser realizada o mais rápido possível, mas pode levar alguns minutos. Em seguida, transfira o suporte da amostra para o criostat e mantenha-o em 10 K durante toda a análise XAS.
NOTA: As etapas 1.9.3 e 1.9.6 são difíceis porque precisam ser feitas rapidamente para evitar qualquer formação de geada que bloqueie o pistão e o molde. Uma alternativa é realizar esses passos sob uma tenda de plástico totalmente purgada com gás nitrogênio. A massa de cobre2-cool LN permite que a pelota seja mantida congelada.
2. Preparação das células de plâncton para especiação de ferro
NOTA: A água do mar sintética utilizada para este protocolo foi preparada adicionando sais marinhos de água ultrauso, ácido propanesulfônico de morfolino, nitrato de amônio, nitrato de sódio, pentahidrato metasilicato de sódio, monobásico fosfato de sódio, estoque de vitaminas, estoque de metais de traço, estoque de antibióticos e tampão HEPES em pH = 7,9. As concentrações de cada componente estão indicadas na Tabela de Materiais. Detalhes sobre a cultura podem ser encontrados em Sutak et al.11
- Centrifugar uma cultura de diatom p. tricornutum em um tubo de polipropileno de 50 mL a 1.100 x g por 6 min e transfira a pelota em um frasco com meio fresco.
- Deixe a cultura crescer em água do mar sintética em uma câmara de crescimento por 24 horas.
- Centrifugar a cultura do plâncton por 6 min a 1.100 x g e transferir a pelota para um meio fresco contendo fe-citrato (1 μM na cultura final). Incubar por 72 h.
- Prepare as células de plâncton
- Centrifugar as células por 3 min a 1.100 x g e enxágue com meio sem ferro.
- Transfira a pelota para um tubo de polipropileno de 1,5 mL, lave com água ultrauso e centrífuga 2x por 3 min a 1.100 x g. Remova o supernatante.
- Mergulhe a parte inferior do tubo de polipropileno de 1,5 mL contendo a pelota na LN2 , conforme descrito na etapa 1.8.
- Transfira as células congeladas em um molde congelado LN2 e pressione rapidamente usando uma prensa de pelotas XRF (Figura 3 e Figura 7) conforme descrito na etapa 1.9.
- Remova a pelota e armazene-a em um tanque LN2 para armazenamento a longo prazo.
- Siga o passo 1.9.6 (ver Figura 4 para a transferência para o suporte da amostra criostat).
3. Preparação e medição do composto de referência
NOTA: Os compostos de referência (sólidos ou líquidos) representativos da espécie e que se espera que sejam encontrados no sistema biológico devem ser preparados e analisados pelo XAS para comparação com amostras biológicas experimentais. Os espectros de referência também podem ser encontrados em bancos de dados 12,13,14 e podem ser utilizados desde que as condições de medição (por exemplo, resolução espectral) fossem semelhantes às amostras experimentais.
- Para referências em solução aquosa, pese compostos iniciais em pó ou líquido sob condição anaeróbica ou atmosfera inerte. Prepare referências sensíveis ao redox em uma atmosfera inerte (ou seja, em um porta-luvas anaeróbica ou em uma linha Schlenk, consulte a Figura 5 e a Figura 6) para evitar qualquer reação oxido-redutiva e preservar a integridade química do composto, que pode ser altamente reativa e instável no ar ambiente). Aqui, todas as referências de selênio foram preparadas utilizando uma linha Schlenk e água ultrapura desgasificada (Figura 6). Líquido FeIII-malate e ferritina foram preparados no ar ambiente.
- Misture com a solução adequada para alcançar uma concentração final de 1% wt do elemento estudado (ou seja, selênio ou ferro) para coleta no modo fluorescência.
NOTA: A água ultrauso é a solução mais utilizada para preparar referências XAS. A adição de glicerol (15%-20%) é necessária para líquidos medidos usando fluorescência XAS padrão para evitar artefatos decorrentes da difração de raios-X por cristais de gelo e qualidade preservada do sinal XAS coletado com o detector de estado sólido. No entanto, para HERFD-XAS, o glicerol não é obrigatório. Usando um espectrômetro analisador de cristal em vez de um detector de estado sólido, a energia é selecionada com uma resolução extremamente alta e a difração induzida por cristais de gelo não afeta a coleta de dados do elementoestudado 1. - Preserve e armazene a solução preparada em um balão Schlenk selado (Figura 5) ou em um tubo de polipropileno de 1,5 mL até medir nas mesmas condições das amostras.
- Para referências sólidas, pese pós compostos compostos de selênio ou ferro no ar ambiente ou em uma caixa de luvas se a espécie for sensível ao redox. Aqui, referências sólidas feII (Fe II-acetato e vivianite) foram preparadas em um porta-luvas N2 gasosa, enquanto FeIII (Fe(OH)3, e FeIII-fosfato) foram preparados no ar ambiente.
- Pesar pó de nitreto de boro de alta pureza e misturar com os compostos do modelo pós, a fim de alcançar uma concentração final de 1% wt do elemento estudado (Figura 7A).
- Triture em pó fino usando uma argamassa por pelo menos 15 minutos.
- Coloque a mistura em pó no molde para preparar pelotas com a prensa hidráulica (Figura 7B, semelhante à Figura 3A para a pelota de amostra).
- Feche o molde com o pistão (Figura 7C, semelhante à Figura 3B para a pelota amostral).
- Pressione para obter a pelota a granel (Figura 7D, semelhante à Figura 3C para a pelota amostral).
- Armazene as pelotas a granel preparadas no porta-luvas até que sejam analisadas nas mesmas condições das amostras.
NOTA: A pelota a granel às vezes gruda nos pistões, dependendo da compacidade em pó, por exemplo. Removê-lo suavemente sem quebrá-lo, então pode ser difícil. Nesse caso, deve ser utilizado o procedimento a seguir usando discos de poliimida (por exemplo, Kapton). - Coloque uma gota de etanol em cada lado dos pistões que estarão em contato com o pó (Figura 8A).
- Prepare dois discos de poliimida com diâmetro ligeiramente menor que os pistões. A espessura do poliimídeo precisa ser de 10-25 μm (mais fino será difícil de manipular, mais grosso absorverá muito dos fótons de raios-X durante a análise).
- Coloque os discos nos pistões. Eles vão ficar por ação capilar (Figura 8B).
- Monte o molde com o pistão, adicione o pó e coloque no segundo pistão (Figura 8C).
- Pressione (ver o passo 3.11) e remova a pelota a granel compactada dos pistões.
NOTA: As referências sólidas podem ser montadas no suporte de amostra específico do criostat como as amostras (ver passo 1.8.6). As referências líquidas podem ser montadas no suporte de amostra específico do criostat. Consulte a Figura 9A para obter um suporte de amostra de criostat CRG-FAME. O mesmo procedimento pode ser aplicado utilizando um suporte de amostra CRG-FAME-UHD, mostrado na Figura 4D, utilizando o procedimento a seguir. - Montagem de referência líquida no suporte da amostra criostat.
- Defina a fita de poliimida (por exemplo, Kapton) (25 μm de espessura) para selar um lado do orifício no suporte da amostra em RT (Figura 9B).
- Usando uma seringa, encha a cavidade lentamente com a solução até chegar ao topo. Evite bolhas. O reservatório deve ser preenchido (Figura 9C, à esquerda).
- Sele o outro lado da cavidade com a fita (Figura 9C, à direita).
- Mergulhe o suporte de amostra selado em LN2 (Figura 9D, T0-T 3).
- Uma reação termica induz LN2 borbulhando. Aguarde até que o borbulhante pare, sinalizando o fim da reação (Figura 9D, T3-T 5).
- Transfira o titular da amostra em 77 K para o criostat da linha de feixe antes de iniciar a coleta de dados (Figura 9D, T6) ou armazenar no LN2 Dewar.
NOTA: A solução congelada é bem disseminada na cavidade e forma uma pelota uniforme e homogênea (Figura 9D, T7).
4. HERFD-XAS: procedimento de medição
- Otimize todos os cristais do CAS em condições de Bragg em relação à energia de interesse da linha fluorescência. Este procedimento pode ser feito com um composto de referência concentrado.
- Calibrar a energia do feixe monocromático incidente usando uma referência para a qual a posição de energia da borda de absorção é conhecida (tipicamente uma folha metálica pura). Esta referência pode ser posicionada em uma segunda etapa após a amostra, no modo de transmissão dupla, a fim de poder verificar a calibração de cada espectro obtido e, eventualmente, alinhá-los pós-tratamento.
- Posicione a amostra em criostat de hélio líquido para amostras biológicas seguindo o procedimento adequado descrito na etapa 1.9.6.
- Feche a cabana experimental seguindo as regras de segurança síncrotron.
- Realize a aquisição do XAS em uma faixa de energia que cubra a borda de absorção selecionada.
- Após cada aquisição espectral, mova a amostra pelo menos o dobro do tamanho do feixe na direção do movimento antes de iniciar uma nova aquisição.
NOTA: Neste caso, foram realizadas medições utilizando cristais Ge(440) para selecionar a linha Fe Ka1 e utilizando cristais Ge(844) para selecionar a linha Se Ka1. O tamanho do feixe na amostra foi de 200 x 100 μm² (H x V Largura Máxima). O movimento amostral entre cada aquisição foi de 500 μm em ambas as direções, a fim de sondar a homogeneidade estrutural e analisar uma nova área livre de possíveis danos de radiação anteriores a cada vez. Espectros individuais são comparados e mesclados se forem sobreimposáveis dentro do ruído. A medição é interrompida para uma determinada amostra quando a qualidade do espectro fundido está correta. Em seguida, a análise de dados pode ser realizada usando qualquer software dedicado à análise XAS, especialmente aqueles que permitem um encaixe de combinação linear de espectros normalizados, como athena e artemis (grupo de medidor de software)15, SixPack16 ou Viper17. Explicações completas e detalhadas da análise XAS estão fora do escopo deste protocolo e podem ser encontradas em artigos recentes18,19, alguns deles mais especificamente dedicados a amostras biológicas20. Os espectros de referência selenium XANES já estão reunidos no banco de dados de espectros SSHADE21.
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Representative Results
Os principais objetivos dessas preparações foram investigar a interação entre nanopartículas de selênio (Se-NPs) e células cancerosas, e ligação de ferro e sequestro no fitoplâncton.
Os espectros HERFD-XANES do selênio no estado inicial (BSA Se-NPs) e em células incubadas em meio nutritivo (BSA Se-NPs após a incubação de 24 h) são mostrados na Figura 10. Os resultados mostraram que o selênio nos Se-NPs iniciais estava presente tanto como formas se(0) quanto como selenita, enquanto após interações com células PC-3 o selênio nas células estava presente principalmente como Se(0), demonstrando assim uma mudança de espécies de selênio nas células. Para o ferro, os espectros de referências HERFD-XANES apresentaram posições distintas dependendo do estado de oxidação do ferro, com espécies reduzidas de ferro deslocadas para baixos valores energéticos (Figura 11). Dois espectros sucessivos coletados na mesma posição de uma pelota diatoma foram semelhantes, indicando que o dano do feixe foi limitado entre duas aquisições ao usar um He-criostat a 10 K. Além disso, espectros de diferentes posições da pelota diatom (aqui três posições) eram idênticos, demonstrando que a pelota amostral era homogênea, e que o espectro poderia ser mediado para obter um melhor espectro de relação sinal-ruído (espectro médio). O espectro médio para diatomás mostra características de borda correspondentes principalmente a Fe(III). A combinação linear do espectro de referência foi então realizada para quantificar a proporção das espécies de ferro como descrito em Sarret et al.6.
Figura 1: Pelotas de células típicas. Os tubos de polipropileno de 1,5 mL (células OVCAR-3 esquerda, células PC-3 direita) contendo 8 x 106 células e 1 x 107 células, respectivamente. Crédito: Caroline Bissardon. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação em porta-luvas anaeróbicas. (A) Caixa de luvas anaeróbicas contendo um (B) 1,5 mL rack de tubo de polipropileno (azul) inteiramente imerso em LNlíquido 2. O líquido LN2 não é apresentado no quadro para clareza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Esquema de pelotização celular. (A) Amostrar pelota na prensa antes de carregar. (B) Amostra durante o carregamento. (C) Amostra de pelota a granel após o carregamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Montagem da crio-amostra(s). Montagem no suporte de amostra específico para a linha de feixe BM16 XAS no ESRF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Preparação anoxica da solução de referência. Exemplos de preparações de referência de selênio armazenadas em balões Schlenk. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Configuração para preparação anoxica de soluções de referência. Instalação da rampa Schlenk com água ultrapura desgasificada na garrafa à direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Preparação em pelota de referência sólida. Preparação de pelotas cilíndricas prensadas para compostos em pó, tanto no ar ambiente quanto sob o porta-luvas. (A) Peso do pó de referência. (B) O pó no orifício cilíndrico do suporte da prensa. (C) Suporte de imprensa fechado. (D) Pressionando. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Preparação de uma pelota de referência sólida utilizando discos de poliimida. Preparação de pelota cilíndrica prensada para compostos de pó pegajoso ou frágil. (A) Uma gota de etanol em cada lado dos pistões que estarão em contato com o pó permitirá que os discos de poliimida nos pistões grudem neles (B). O molde é montado com o pistão. Em seguida, o pó pode ser depositado, e o molde pode ser fechado com o segundo pistão (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Etapas de preparação para o suporte amostral de criostat para uma referência ou amostra líquida. Para clareza da imagem, fotos foram tiradas fora do porta-luvas e sem substâncias perigosas. Aqui, usamos ddH2O água. Se necessário, esta preparação pode ser feita sob um porta-luvas ou atmosfera inerte (N2) tenda de plástico. (A) Porta-amostras. (B) Coloque fita poliimida na superfície curva para selar o orifício. (C) Injete lentamente as soluções de referência gota a gota usando uma seringa até que a cavidade seja preenchida. Nenhuma bolha de ar deve permanecer. Sele o outro orifício com fita poliimida. (D) Mergulhar na LN2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Se K-edge análise típica HERFD-XANES. Se K-edge HERFD-XANES de Se-NPs revestidos de BSA, como recebido e deixado 24 h em meio de cultura celular, e célula PC-3 exposta a Se-NPs revestidos de BSA. Espectros são deslocados para clareza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Análise típica de HERFD-XANES de ponta Fe K. Exemplo dos espectros coletados durante nosso experimento sobre a especiação de ferro em plâncton. Os seis espectros superiores correspondem às referências/padrões. Os espectros sobrepostos (em vermelho e preto) correspondem a dois espectros coletados na mesma posição da pelota. Os espectros rotulados pos#1, pos#2 e pos#3 foram coletados em três posições diferentes da pelota amostral. O espectro chamado Diatomás Médio corresponde ao espectro médio coletado em várias posições da pelota e é a amostra para a qual a especiação precisa ser determinada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Produtos | Linha celular PC3 | Linha celular OVCAR3 |
| Meio RPMI modificado ATCC 1640 | 445 mL | 394,5 mL |
| Soro bovino fetal | 50 mL | 100 mL |
| Penicilina-Estreptomicina | 5 mL | 5 mL |
| Insulina bovina | - | 500 μL |
Mesa 1. Preparação da mídia de cultura celular. As células são cultivadas na American Type Culture Collection (ATCC) modificada RPMI 1640 médio suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina (PS) para células cancerígenas de próstata PC-3 e com 20% de FBS e 1% penicilina-estreptomicina e 0,01 mg/mL insulina bovina para células cancerígenas ovcar-3.
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Discussion
Este protocolo foi utilizado para estudar a forma química de selênio e ferro em amostras biológicas por espectroscopia de absorção de raios-X. Concentra-se na crio-preparação e armazenamento de amostras biológicas e compostos de referência, bem como nas medições HERFD-XAS.
Crio-preparação e armazenamento
A crio-preparação das pelotas de amostra biológica a granel permite a preservação da integridade química das espécies presentes nas amostras. Isso é crucial, pois foram observadas alterações de especiação ao usar secagem congelante ou secagem de ar para a preparação6. Este protocolo deve ser usado assim que a linha de feixe selecionada para medições estiver equipada com um criostat de hélio.
Para compostos de referência, é necessário trabalhar em uma atmosfera anoxica ao usar elementos sensíveis ao redox para preservar o estado de oxidação. Isso pode então ser verificado com variações na posição de borda espectral, como mostrado para compostos de referência ferroso e férrico (Figura 11).
Esta preparação da amostra pode ser realizada antes da análise síncrotron ou laboratorial. Neste caso, a pelota congelada ou referência deve ser transferida para um crioboto e armazenada em um tanque LN2 . Este armazenamento LN2 é obrigatório para fornecer um ambiente inerte protetor e evitar alterações nas espécies químicas, particularmente para ferro reativo ou compostos seleno. Preferencialmente, as amostras devem ser preparadas pouco antes da medição ou armazenadas alguns dias antes da análise. É melhor não armazenar amostras por um longo período de tempo (ou seja, meses).
Crio-análise
A análise a baixas temperaturas, idealmente em 10 K, é altamente defendida a fim de diminuir os danos induzidos pelo intenso raio-X, particularmente a formação de radicais livres a partir da hidrólise da água, que pode danificar a matriz proteica e criar fotoredução de íons metálicos de transição ou fotoredução de elementos como o enxofre22. É melhor levar em conta essas possíveis mudanças nas espécies químicas através da rápida aquisição do espectro XAS. A amostra também deve ser escaneada para expor uma área não-aniquilada para cada espectro. Como demonstrado pelos espectros coletados nas três diferentes posições da pelota de fitoplâncton (Figura 11), tal estratégia revela espectros poderosos, que podem então ser mediados para obter uma melhor relação sinal-ruído.
Aplicações futuras
Em nosso trabalho, usamos uma linha de feixe dedicada às medições HERFD-XAS (FAME-UHD, ESRF, França), mas este protocolo para preparação biológica de amostras pode ser aplicado em qualquer linha de feixe XAS padrão equipada com um criostata enquanto usa outros tipos de detectores, como multielement Ge Solid-State-Detector ou Silicon-Drift Detector. O fluxo de trabalho proposto também pode ser aplicado a quaisquer outros elementos químicos ou qualquer material biológico que se espera que seja estudado pela espectroscopia de absorção de raios-X.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Somos gratos pelas contribuições financeiras para o desenvolvimento da linha de travesso pelo CEMHTI (Orleans, França, ANR-13-BS08-0012-01) e Labex OSUG@2020 (Grenoble, França, ANR-10-LABX-0056). O projeto FAME-UHD é apoiado financeiramente pelo "grande emprunt" francês EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), pelo consórcio CEA-CNRS CRG e pelo instituto INSU CNRS. Agradecemos todas as contribuições durante os experimentos, especialmente todas as pessoas que trabalham no BM30B e BM16. Os autores reconhecem o Centro Europeu de Radiação Síncrotron para o fornecimento de tempo de radiação síncrotron. Também reconhecemos o projeto PHYTOMET ANR para apoio financeiro (ANR-16-CE01-0008) e o projeto SEDMAC para apoio financeiro (INCA-Plan câncer-ASC16019CS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
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