Summary
Detta protokoll presenterar ett detaljerat förfarande för att förbereda biologiska kryomplar för synkrotronbaserade röntgenabsorptionsspektroskopiexperiment. Vi beskriver alla steg som krävs för att optimera provberedning och kryokonservering med exempel på protokollet med cancer- och växtplanktonceller. Denna metod ger en universell standard för prov kryoberedning.
Abstract
Studien av grundämnen med röntgenabsorptionsspektroskopi (XAS) är av särskilt intresse när man studerar metallers roll i biologiska system. Provberedning är ett viktigt och ofta komplext förfarande, särskilt för biologiska prover. Även om röntgenspecieringstekniker används i stor utsträckning har inget detaljerat protokoll ännu spridits för användare av tekniken. Vidare är kemisk tillståndsmodifiering oroande, och kryobaserade tekniker rekommenderas för att analysera de biologiska proverna i deras nästan infödda hydratiserade tillstånd för att ge maximal bevarande av cellernas eller vävnadernas kemiska integritet. Här föreslår vi ett cellulärt beredningsprotokoll baserat på kryobevarade prover. Det demonstreras i en fluorescens med hög energiupplösning upptäckt röntgenabsorptionsspektroskopistudie av selen i cancerceller och en studie av järn i fytoplankton. Detta protokoll kan användas med andra biologiska prover och andra röntgentekniker som kan skadas av bestrålning.
Introduction
Studien av cellulära biotransformationer av väsentliga eller giftiga element kräver specieringstekniker med hög känslighet och bör minimera provberedningssteg som ofta är benägna att modifiera kemiska arter.
Fysiologiska element som selen och järn är kända för att vara särskilt svåra att specificera på grund av deras komplexa kemi, olika förmågor hos selen- eller järnarterna och deras låga koncentration i ppm (mg / kg) eller till och med under ppm-intervallet. Således kan studien av speciering av dessa element av XAS vara extremt utmanande. Synkrotron XAS och särskilt hög energiupplöst fluorescensdetekterat XAS (HERFD-XAS), som möjliggör ett mycket lågt signal-till-bakgrundsförhållande1, finns tillgängliga vid synkrotronkällor för att specificera mycket utspädda element i komplexa biologiska matriser 2,3. Konventionella fluorescens-XAS-mätningar kan utföras med hjälp av en energiupplöst solid state-detektor (SSD) med en energibandbredd ~ 150–250 eV, på CRG-FAME-strålröret vid European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, medan HERFD-XAS-mätningar behöver en kristallanalysatorspektrometer (CAS), med en energibandbredd ~ 1–3 eV, på CRG-FAME-UHD-strålröret vid ESRF2 . Fluorescensfotoner diskrimineras med avseende på sin energi med elektroniska respektive optiska processer.
Provet kryoberedning är viktigt för att bevara strukturer och upprätthålla sammansättningskemisk integritet, vilket möjliggör analys nära det biologiska ursprungstillståndet5. Dessutom tillåter analyser som utförs vid kryogena temperaturer så låga som 10 K med flytande heliumkryogen kylning (LN2) strålningsskador att sakta ner och bevara elementär speciering för XAS. Även om vissa recensioner av XAS-tekniker som tillämpas på biologiska prover rapporterar nödvändigheten av att förbereda och analysera prover under kryogena förhållanden (t.ex. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), beskriver ingen av dem tydligt det relaterade detaljerade protokollet. I denna publikation beskrivs en metod för kryoberedning av cancerceller och planktonmikroorganismer för HERFD-XAS-speciering av Se8 och Fe9 vid kryogen temperatur.
God praxis för provberedning och miljö under toppmoderna XAS-spektroskopimätningar kräver 1) en installation; 2) ett analysförfarande som begränsar effekterna av strålskador så mycket som möjligt; och 3) ett prov (eller modellföreningsreferens) så homogent som möjligt med avseende på röntgenfotonstrålens strålstorlek. Det första objektet beaktas genom att utföra förvärvet vid låg temperatur med användning av en flytande heliumkryostat. Den andra posten behandlas genom att utföra varje förvärv på ett nytt område av provet genom att flytta det med avseende på strålen. Slutligen, med tanke på det tredje villkoret, konditioneras prover (pellets) och referenser (pulver) i pressade bulkpellets för att begränsa porositeter och inhomogeniteter så mycket som möjligt och för att undvika grovhet med avseende på strålstorleken på röntgensondprovytan. Vi förklarar hur protokollet behandlar alla dessa punkter.
Vi använde human prostata cellinje PC-3 (hög metastatisk potential) och äggstockscelllinje OVCAR-3 (som står för upp till 70% av alla äggstockscancerfall) för att undersöka de antiproliferativa egenskaperna mot cancerceller hos selennanopartiklar (Se-NP) och Phaeodactylum tricornutum diatom som modellart för att undersöka järnbindning i fytoplankton.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av humana PC-3 och OVCAR-3 cancercellspellets för selenspeciering
OBS: Följande protokoll är anpassat från Weekley et al.10. Alla steg måste utföras under en cellodlingshuv under biosäkerhetsnivå 2-förhållanden och begränsningar, med hjälp av aseptiska tekniker.
- Räkna cellerna med hjälp av en Malassez cellräkningskammare. Frö 150 000–200 000 celler per kolv för PC-3-cellinjen och 300 000 celler för OVCAR-3-cellinjen.
- Fröceller i T-75-kolvar (tre kolvar per tillstånd för att ha tredubblingar) i adekvat cellodlingsmedia (tabell 1) under den laminära flödeshuven.
- Låt cellkulturerna växa i en inkubator vid 37 °C och en fuktad atmosfär med 5 % CO2 tills de når 80 % sammanflöde. Vanligtvis fördubblas PC-3 prostatacancercellinjer efter 24 timmar medan OVCAR-3 äggstockscancer cellinjer tar 72 h. Kolvarna måste lämnas i inkubatorn.
- Späd under tiden de Se-NP som används för behandling till en slutlig koncentration som motsvarar IC20 (hämmande koncentration för att uppnå 20% celldöd) som har förutbestämts av MTT-analysen (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid) för cytotoxicitetsbedömning. Dessa koncentrationer är specifika för varje Se-NP-typ men också specifika för den studerade cellinjen.
- Placera nanopartikelstocklösningen (2 mg/ml bovint serumalbumin [BSA] eller kitosanbelagd Se-NP) i ett ultraljudsvattenbad i 30 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Späd Se-NP-lösningen genom seriella utspädningar i komplett cellodlingsmedium för att nå arbetskoncentrationer. Mellan varje utspädning, virvel i 1 min.
- Förbered en selenpositiv kontroll med utspätt selensalt för behandling.
- Bered en vattenhaltig stamlösning av natriumselenit (1 mg/ml) i ett 15 ml polypropenrör. Blanda 1 mg natriumselenitpulver med 1 ml ultrarent vatten.
- Vortex stamlösningen i 1 min.
- Späd natriumselenitstocklösningen genom seriella utspädningar i fullständigt cellodlingsmedium för att nå arbetskoncentrationer.
OBS: Glöm inte att pipettera flera gånger före varje utspädning för att homogenisera lösningen.
- Utsätt cancercellerna för selenbehandlingar.
OBS: Denna del av protokollet måste upprepas för varje nanopartikel (NP) som testas. Här är NP: erna av två typer, BSA och chitosanbelagda Se-NP, plus kontrollerna. Natriumselenitlösningen är den positiva kontrollen och ingen behandling är den negativa kontrollen.- Öppna de tre T-75-kolvarna som innehåller cellerna i den laminära flödeshuven.
- Avlägsna mediet och tvätta cellerna försiktigt 2x med 5 ml uppvärmd (37 °C) fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt försiktigt 15 ml av behandlingen i varje kolv med hjälp av en automatisk pipett utrustad med 25 ml sterila plastpipetter på undersidan av kolven och inte direkt på cellskiktet. Placera locken på kolvarna. Stäng inte locken ordentligt.
OBS: Som beskrivs i steg 1.3 och 1.4 måste behandlingslösningarna ha återsuspenderats i förväg för att homogeniseras. - Lämna de tre kolvarna horisontellt i en inkubator vid 37 °C och en atmosfär fuktad med 5 %CO2 i 24 timmar.
- Framställning av cellpellets
- Tvätta försiktigt cellerna 2x med 5 ml uppvärmd PBS (37 °C) direkt i T75-kolvarna.
- Tillsätt 6 ml uppvärmt cellodlingsmedium (37 °C) på cellskiktet i T-75-kolven med hjälp av en pipettpojke utrustad med 10 ml sterila plastpipetter.
- Samla cellerna genom försiktig skrapning med en cellskrapa. Använd en cellskrapa per kolv.
- Använd en pipettpojke och en 10 ml pipett, aspirera vätskan och spola tillbaka cellen / mediet på kolvytan för att samla alla celler. Upprepa detta steg flera gånger för att dissociera och individualisera cellerna. Samla upp mediet som innehåller cellerna i ett 15 ml polypropenrör.
- Snurra ner vid 250 x g i 5 min vid RT. Aspirera supernatanten.
- Skölj cellerna genom att återsuspera dem i 5 ml PBS.
- Snurra ner vid 250 x g i 5 min vid RT. Aspirera supernatanten och upprepa steg 1.6.5 och 1.6.6 2x för att bli av med alla återstående spår av behandlingen.
- Resuspendera cellerna i 1 ml PBS och överför dem till ett 1,5 ml polypropenrör. Slutligen snurra ner dem vid 250 x g i 5 minuter vid RT. Figur 1 representerar cellpelletsen som erhållits efter centrifugering och kassering av supernatanten.
- Ta försiktigt bort alla PBS-supernatanten med en 200 μL pipett.
OBS: Var försiktig så att du inte rör vid och skadar cellpelleten. Helst bör pelleten vara 2-3 mm hög eller tjock, med en diameter av 3-6 mm. För PC-3-cellinjen krävs 9 x 106–10 x 106 celler för analysen. För OVCAR-3-cellinjen krävs 8 x 106–9 x 106 celler (figur 1). Vissa celler kommer sannolikt att gå förlorade under de efterföljande buffertsköljningsstegen. Ju högre cellnummer, desto bättre blir pelleten.
- Blixtfrysning av cellpellets
- Kasta den nedre delen av 1,5 ml röret som innehåller pelleten i flytande kväve (LN2) till cellpelletens nivå.
- I en handskfack som är helt rensad med en inert atmosfär som kvävgas, samla upp cellpelleten genom att försiktigt knacka på 1,5 ml-röret på den plana ytan av ett LN 2-kylt kopparblock (figur 2). Pelleten samlas sedan upp utan cellförlust.
OBS: Använd kryoskyddsutrustning, labbrock, slutna skor, kryohandskar och ansiktsskydd eller skyddsglasögon för LN2-hantering . - Vid behov kan en LN2-kyld nål användas för att hjälpa till att ta ut pelleten.
OBS: Den resulterande frysta cellpelleten kan fragmenteras. Dessa steg måste utföras inom några minuter och förlita sig på forskarens fingerfärdighet och hastighet. - De frysta pelletsdimensionerna måste passa kryostatprovhållaren. Med hjälp av den beskrivna utrustningen kan provet användas direkt om cellpelleten är större än 2 mm hög och något mindre än hålet på provhållaren som används för XAS. Om så inte är fallet, eller om en plan yta för analysen önskas, måste en cylindrisk pellet i bulk beredas, som fortfarande håller pelleten i fryst tillstånd. Om cellpelleten är fragmenterad kan följande steg användas idealiskt i en handskfack helt renad med en inert atmosfär.
- Beredning av de bulkfrysta cylindriska pelletsen
- Sänk ner alla delar av en manuell hydraulpress som kommer att vara i kontakt med provet i LN2 (figur 3A; pelletsformar med en diameter på 3 eller 5 mm, form, kolv/ tråddragning).
- Överför de snabbt frysta pelletsfragmenten till formen laddad med lämpliga pelletsformar (figur 3B).
- Snabbpelletera med hydraulpressen. Användning av 1,5 ton för en pellets med en diameter på 5 mm eller 0,5 ton för en pellet med en diameter på 3 mm är tillräcklig (figur 3C).
OBS: Efter varje pelletsberedning med hydraulpressen måste alla material tinas och torkas ordentligt med kvävgas för att undvika problem med återstående frost och fuktighet. - Samla bulkpelleten av frysta celler snabbt och placera den i ett adekvat kryorör för förvaring.
- Förvara den tillbaka i LN2-tanken för långtidsförvaring.
- Överför och montera kryopellets för analys. Pelleten som lagras i ett LN2-kylt kryorör överförs till en 77 K förkyld kryostatprovhållare i flytandeN2 (figur 4, som används för ett CRG-FAME-UHD-strålrör). Detta steg bör utföras så snabbt som möjligt men kan ta några minuter. Överför sedan provhållaren till kryostaten och håll den vid 10 K under hela XAS-analysen.
OBS: Steg 1.9.3 och 1.9.6 är svåra eftersom de måste göras snabbt för att undvika frostbildning som blockerar kolven och formen. Ett alternativ är att utföra dessa steg under ett plasttält helt rensat med kvävgas. Den2-svala kopparmassan LN gör att pelleten kan hållas frusen.
2. Beredning av planktoncellerna för järnspeciering
OBS: Syntetiskt havsvatten som användes för detta protokoll framställdes genom tillsats av ultrarena vattenhavsalter, morfolinpropansulfonsyra, ammoniumnitrat, natriumnitrat, natriummetasilikatpentahydrat, natriumfosfatmonobasiskt, vitaminbestånd, spårmetallbestånd, antibiotikabestånd och HEPES-buffert vid pH = 7,9. Koncentrationerna av varje komponent anges i materialförteckningen. Detaljer om kulturen finns i Sutak et al.11
- Centrifugera en P. tricornutum diatomkultur i ett 50 ml polypropenrör vid 1 100 x g i 6 minuter och överför pelleten till en kolv med färskt medium.
- Låt kulturen växa i syntetiskt havsvatten i en tillväxtkammare i 24 timmar.
- Centrifugera planktonkulturen i 6 minuter vid 1 100 x g och överför pelleten till ett friskt medium som innehåller Fe-citrat (1 μM i den slutliga odlingen). Inkubera i 72 timmar.
- Förbered planktoncellerna
- Centrifugera cellerna i 3 min vid 1 100 x g och skölj med medium utan järn.
- Överför pelleten till ett 1,5 ml polypropenrör, tvätta med ultrarent vatten och centrifugera 2x i 3 minuter vid 1 100 x g. Ta bort supernatanten.
- Sänk den nedre delen av 1,5 ml polypropenrör som innehåller pelleten i LN2 enligt beskrivningen i steg 1.8.
- Överför de frysta cellerna i en LN2 frusen formare och tryck snabbt med en XRF-pelletspress (figur 3 och figur 7) enligt beskrivningen i steg 1.9.
- Ta bort pelleten och förvara den i en LN2-tank för långvarig lagring.
- Följ steg 1.9.6 (se figur 4 för överföring till kryostatprovhållaren).
3. Beredning och mätning av referensföreningar
OBS: Referensföreningar (fasta eller flytande) som är representativa för arten och som förväntas finnas i det biologiska systemet måste beredas och analyseras av XAS för jämförelse med experimentella biologiska prover. Referensspektra finns också idatabaserna 12,13,14 och kan användas förutsatt att mätförhållandena (t.ex. spektral upplösning) liknade de experimentella proverna.
- För referenser i vattenlösning, väg initiala föreningar i pulverform eller flytande form under anaerobt tillstånd eller inert atmosfär. Förbered redoxkänsliga referenser i en inert atmosfär (dvs. i en anaerob handskfack eller i en Schlenk-linje, se figur 5 och figur 6) för att undvika oxido-reduktiv reaktion och för att bevara föreningens kemiska integritet, som kan vara mycket reaktiv och instabil i omgivande luft). Här framställdes alla selenreferenser med hjälp av en Schlenk-linje och avgasat ultrarent vatten (figur 6). Flytande FeIII-malat och ferritin framställdes vid omgivande luft.
- Blanda med lämplig lösning för att nå en slutlig koncentration på 1% vikt av det studerade elementet (dvs selen eller järn) för uppsamling i fluorescensläge.
Ultrarent vatten är den mest använda lösningen för att förbereda XAS-referenser. Tillsats av glycerol (15%–20%) krävs för vätskor uppmätta med standard XAS-fluorescens för att förhindra artefakter som härrör från röntgendiffraktion av iskristaller och bevarad kvalitet på XAS-signalen som samlats in med solid state-detektorn. För HERFD-XAS är glycerol dock inte obligatoriskt. Med hjälp av en kristallanalysatorspektrometer istället för en solid state-detektor väljs energin med en extremt hög upplösning och diffraktionen inducerad av iskristaller påverkar inte datainsamlingen av det studerade elementet1. - Bevara och förvara den beredda lösningen i en förseglad Schlenk-ballong (figur 5) eller i ett 1,5 ml polypropenrör tills den mäts under samma förhållanden som proverna.
- För fasta referenser, väg selen eller järnmodell sammansatta pulver i omgivande luft eller i en handskfack om arten är redoxkänslig. Här framställdes fasta FeII-referenser (FeII-acetat och vivianit) i en gasformigN2-handskfack medan FeIII (Fe(OH)3 och FeIII-fosfat) framställdes vid omgivande luft.
- Väg bortnitridpulver med hög renhet och blanda med modellföreningarna pulver för att nå en slutkoncentration på 1% vikt av det studerade elementet (figur 7A).
- Slipa till ett fint pulver med en mortel i minst 15 min.
- Placera pulverblandningen i gjutaren för att bereda pellets med hydraulpressen (figur 7B, liknande figur 3A för provpelleten).
- Stäng formaren med kolven (figur 7C, liknande figur 3B för provpelleten).
- Tryck för att erhålla bulkpelleten (figur 7D, liknande figur 3C för provpelleten).
- Förvara de beredda bulkpelletsen i handskfacket tills de analyseras under samma förhållanden som proverna.
OBS: Bulkpelleten fastnar ibland på kolvarna, beroende på till exempel pulverkompacitet. Att ta bort den mjukt utan att bryta den kan då vara svårt. I så fall måste följande procedur med polyimidskivor (t.ex. Kapton) användas. - Sätt en droppe etanol på varje sida av kolvarna som kommer i kontakt med pulvret (figur 8A).
- Förbered två polyimidskivor med en diameter som är något mindre än kolvarna. Polyimidtjockleken måste vara 10-25 μm (tunnare blir svår att manipulera, tjockare absorberar för mycket av röntgenfotonerna under analysen).
- Sätt skivorna på kolvarna. De kommer att hålla fast vid kapillärverkan (figur 8B).
- Montera formen med kolven, tillsätt pulvret och sätt i den andra kolven (figur 8C).
- Tryck (se steg 3.11) och ta bort den komprimerade bulkpelleten från kolvarna.
OBS: De solida referenserna kan monteras på den kryostatspecifika provhållaren som proverna (se steg 1.8.6). Vätskereferenserna kan monteras på den kryostatspecifika provhållaren. Se figur 9A för en CRG-FAME kryostatprovhållare. Samma procedur kan tillämpas med hjälp av en CRG-FAME-UHD-provhållare, som visas i figur 4D, med hjälp av följande procedur. - Montering av vätskereferens på kryostatprovhållaren.
- Ställ in polyimidtejpen (t.ex. Kapton) (25 μm tjock) för att täta ena sidan av hålet på provhållaren vid RT (figur 9B).
- Använd en spruta och fyll hålrummet långsamt med lösningen tills den når toppen. Undvik bubblor. Behållaren måste fyllas (figur 9C, vänster).
- Försegla den andra sidan av hålrummet med tejpen (figur 9C, höger).
- Kasta den förseglade provhållaren i LN2 (figur 9D, T0–T3).
- En termisk reaktion inducerar LN 2-bubblande. Vänta tills bubblingen slutar och signalerar slutet på reaktionen (figur 9D,T3–T5).
- Överför provhållaren vid 77 K till strålrörets kryostat innan datainsamlingen påbörjas (figur 9D, T6) eller lagras i LN2 Dewar.
OBS: Den frysta lösningen är väl spridd i hålrummet och bildar en enhetlig och homogen pellet (figur 9D, T7).
4. HERFD-XAS: mätförfarande
- Optimera alla kristaller från CAS i Bragg-förhållanden med avseende på fluorescenslinjens energi av intresse. Denna procedur kan utföras med en koncentrerad referensförening.
- Kalibrera den infallande monokromatiska strålenergin med hjälp av en referens för vilken absorptionskantens energiposition är känd (vanligtvis en ren metallfolie). Denna referens kan placeras i ett andra steg efter provet, i dubbelt överföringsläge, för att kunna kontrollera kalibreringen för varje erhållen spektra och så småningom justera dem efter behandlingen.
- Placera provet i en flytande heliumkryostat för biologiska prover enligt det lämpliga förfarande som beskrivs i steg 1.9.6.
- Stäng experimenthyttan enligt synkrotronens säkerhetsregler.
- Utför XAS-inhämtningen på ett energiområde som täcker den valda absorptionskanten.
- Efter varje spektralförvärv, flytta provet minst dubbelt så stort som strålstorleken i rörelseriktningen innan du påbörjar ett nytt förvärv.
OBS: I detta fall utfördes mätningar med Ge (440) kristaller för att välja Fe Ka1-linjen och med Ge (844) kristaller för att välja Se Ka1-linjen. Strålstorleken på provet var 200 x 100 μm² (H x V Full Width Half Maximum). Provrörelsen mellan varje förvärv var 500 μm i båda riktningarna, för att undersöka strukturell homogenitet och analysera ett nytt område fritt från tidigare möjliga strålningsskador varje gång. Enskilda spektra jämförs och slås samman om de är överlagringsbara i bruset. Mätningen stoppas för ett givet prov när kvaliteten på det sammanslagna spektrumet är korrekt. Sedan kan dataanalys utföras med vilken programvara som helst som är dedikerad till XAS-analys, särskilt de som tillåter en linjärkombinationsanpassning av normaliserade spektra, till exempel Athena och Artemis (Demeter-programvarugrupp)15, SixPack16 eller Viper17. Fullständiga och detaljerade förklaringar av XAS-analys faller utanför detta protokolls räckvidd och finns i de senaste artiklarna18,19, några av dem mer specifikt ägnade åt biologiska prover20. Selenium XANES referensspektra finns redan samlade i SSHADE-spektradatabasen21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Huvudsyftet med dessa preparat var att undersöka interaktionen mellan selennanopartiklar (Se-NP) och cancerceller, och järnbindning och sekvestrering i växtplankton.
HERFD-XANES-spektra av selen i initialt tillstånd (BSA Se-NP) och i celler inkuberade i näringsmedium (BSA Se-NP efter 24 timmars inkubation) visas i figur 10. Resultaten visade att selen i de initiala Se-NP: erna var närvarande som både Se (0) och selenitliknande former, medan efter interaktioner med PC-3-celler selen i celler huvudsakligen var närvarande som Se (0), vilket visar en förändring av selenarter i celler. För järn visade HERFD-XANES-referensspektra distinkta kantpositioner beroende på järnoxidationstillståndet, med reducerade järnarter förskjutna till låga energivärden (figur 11). Två på varandra följande spektra som samlats in på samma position som en kiselalgspellets var likartade, vilket indikerar att strålskador var begränsade mellan två förvärv vid användning av en He-kryostat vid 10 K. Dessutom var spektra från olika positioner av kiselalgspelleten (här tre positioner) identiska, vilket visade att provpelleten var homogen och att spektra kunde medelvärdesberäknas för att erhålla ett bättre signal-brusförhållandespektrum (genomsnittligt spektrum). Det genomsnittliga spektrumet för kiselalger visar kantfunktioner som mestadels motsvarar Fe (III). Linjärkombinationsmontering av referensspektra utfördes sedan för att kvantifiera andelen järnarter som beskrivs i Sarret et al.6.
Figur 1: Typiska cellpellets. De 1,5 ml polypropenrören (OVCAR-3-celler vänster, PC-3-celler höger) innehållande 8 x 106 celler respektive 1 x 107 celler. Upphovsman: Caroline Bissardon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Beredning i anaerob handskfack .(A) Anaerob handskfack innehållande ett (B) 1,5 ml polypropenrörställ (blått) helt nedsänkt i flytande LN2. Vätskan LN2 presenteras inte på bilden för tydlighetens skull. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schema för cellpelletering. (A) Provpellets i pressen före lastning. (B) Prov under lastning. C) Prov på bulkpellets efter lastning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Montering av kryoprovet/kryoproverna. Montering i provhållaren som är specifik för BM16 XAS strålrör vid ESRF. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Anoxisk beredning av referenslösning. Exempel på selenreferenspreparat lagrade i Schlenk-ballonger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Inställning för anoxisk beredning av referenslösningar. Installation av Schlenk-rampen med avgasat ultrarent vatten i flaskan till höger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Beredning i fast referenspellet. Beredning av pressade cylindriska pellets för pulverföreningar antingen i omgivande luft eller under handskfacket. A) Referenspulvrets vikt. (B) Pulvret i pressstödets cylindriska hål. (C) Stängt pressstöd. (D) Tryckning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Beredning av en fast referenspellet med användning av polyimidskivor. Framställning av pressad cylindrisk pellet för klibbiga eller spröda pulverföreningar. (A) En droppe etanol på varje sida av kolvarna som kommer att vara i kontakt med pulvret gör att polyimidskivorna på kolvarna kan hålla fast vid dem (B). Formaren är monterad med kolven. Därefter kan pulvret deponeras och formen kan stängas med den andra kolven (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Förberedelsesteg för kryostatprovhållaren för en vätskereferens eller ett vätskeprov. För att få bilden klar togs bilder utanför handskfacket och utan farliga ämnen. Här använde vi ddH2O vatten. Vid behov kan denna beredning göras under en handskfack eller inert atmosfär (N2) plasttält. (B) Placera polyimidtejp på den böjda ytan för att täta hålet. (C) Injicera långsamt referenslösningarna droppe för droppe med en spruta tills hålrummet är fyllt. Inga luftbubblor får finnas kvar. Försegla det andra hålet med polyimidband. (D) Störtdykning i LN2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: Se K-edge typisk HERFD-XANES-analys. Se K-edge HERFD-XANES av BSA-belagda Se-NP, som mottagna och lämnade 24 timmar i cellodlingsmedium, och PC-3-celler exponerade för BSA-belagda Se-NP. Spektra förskjuts för tydlighetens skull. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: Fe K-edge typisk HERFD-XANES-analys. Exempel på de spektra som samlats in under vårt experiment på järnspeciering i plankton. De sex övre spektra motsvarar referenserna/standarderna. De överlagrade spektra (i rött och svart) motsvarar två spektra uppsamlade på samma position som pelleten. Spektra märkta pos#1, pos#2 och pos#3 samlades in på tre olika positioner av provpelleten. Spektrumet som kallas Diatoms Average motsvarar de genomsnittliga spektra som samlats in på olika positioner av pelleten och är det prov för vilket speciering måste bestämmas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Produkter | PC3-cellinje | OVCAR3 cellinje |
| ATCC-modifierat RPMI 1640-medium | 445 ml | 394,5 ml |
| Serum från fosterceller | 50 ml | 100 ml |
| Penicillin-Streptomycin | 5 ml | 5 ml |
| Bovint insulin | - | 500 μl |
Tabell 1. Förberedelse av cellodlingsmedier. Cellerna odlas i American Type Culture Collection (ATCC) modifierat RPMI 1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin (PS) för PC-3 prostatacancerceller och med 20% FBS och 1% penicillin-streptomycin och 0,01 mg / ml bovint insulin för OVCAR-3 äggstockscancerceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll användes för att studera den kemiska formen av selen och järn i biologiska prover genom röntgenabsorptionsspektroskopi. Det fokuserar på kryoberedning och lagring av biologiska prover och referensföreningar, liksom på HERFD-XAS-mätningarna.
Kryoberedning och lagring
Kryoberedningen av det biologiska bulkprovpelletset möjliggör bevarande av den kemiska integriteten hos de arter som finns i proverna. Detta är avgörande, eftersom artbildningsförändringar har observerats vid användning av frystorkning eller lufttorkning för beredning6. Detta protokoll bör användas så snart strålröret som valts för mätningar är utrustat med en heliumkryostat.
För referensföreningar är det nödvändigt att arbeta i en anoxisk atmosfär vid användning av redoxkänsliga element för att bevara oxidationstillståndet. Detta kan sedan kontrolleras med variationer i spektralkantens position som visas för järn- och järnreferensföreningar (figur 11).
Denna provberedning kan utföras före synkrotronen eller laboratorieanalysen. I detta fall bör den frysta pelleten eller referensen överföras till ett kryorör och förvaras i en LN2-tank . Denna LN2-lagring är obligatorisk för att ge en skyddande inert miljö och undvika förändringar i de kemiska arterna, särskilt för reaktivt järn eller selenföreningar. Helst bör proverna beredas strax före mätning eller förvaras några dagar före analys. Det är bäst att inte lagra prover under en lång tid (dvs månader).
Kryo-analys
Analys vid låga temperaturer, helst vid 10 K, förespråkas starkt för att bromsa skador som induceras av den intensiva röntgenstrålen, särskilt bildandet av fria radikaler från hydrolysen av vatten, vilket kan skada proteinmatrisen och skapa fotoreduktion av övergångsmetalljoner eller fotoreduktion av element såsom svavel22. Det är bäst att ta hänsyn till dessa möjliga förändringar i den kemiska arten genom snabb förvärv av XAS-spektrumet. Provet bör också skannas för att exponera ett icke-bestrålat område för varje spektrum. Som framgår av de spektra som samlats in på de tre olika positionerna för växtplanktonpelleten (figur 11) avslöjar en sådan strategi kraftfulla spektra, som sedan kan beräknas i genomsnitt för att få ett bättre signal-brusförhållande.
Framtida tillämpningar
I vårt arbete använde vi ett strålrör dedikerat till HERFD-XAS-mätningar (FAME-UHD, ESRF, Frankrike) men detta protokoll för biologisk provberedning kan tillämpas på alla vanliga XAS-strålrör utrustade med en kryostat medan vi använder andra typer av detektorer som multielement Ge Solid-State-Detector eller Silicon-Drift Detector. Det föreslagna arbetsflödet kan också tillämpas på andra kemiska element eller något biologiskt material som förväntas studeras med röntgenabsorptionsspektroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för ekonomiska bidrag till strålrörsutvecklingen av CEMHTI (Orleans, Frankrike, ANR-13-BS08-0012-01) och Labex OSUG@2020 (Grenoble, Frankrike, ANR-10-LABX-0056). FAME-UHD-projektet stöds ekonomiskt av det franska "grand emprunt" EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG-konsortiet och INSU CNRS-institutet. Vi är tacksamma för alla bidrag under experimenten, särskilt alla personer som arbetar med BM30B och BM16. Författarna erkänner european synchrotron radiation facility för tillhandahållande av synkrotronstrålningsstråletid. Vi erkänner också PHYTOMET ANR-projektet för ekonomiskt stöd (ANR-16-CE01-0008) och SEDMAC-projektet för ekonomiskt stöd (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
References
- Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
- Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
- Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
- Bissardon, C., et al. Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China. , Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018).
- Isaure, M. P. Metals in microorganisms: new insights from nano-scale imaging and X-ray absorption spectroscopy. 102nd Canadian Chemistry Conference and Exhibition Environmental Chemistry. Quebec, Canada. , Available from: http://www.ccce2019.ca/environmental-chemistry (2019).
- Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
- Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
- Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
- Schmitt, B., et al. SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure. , Available from: https://www.sshade.eu/ (2018).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
- Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
- Klementiev, K. V.
- Newville, M.
- Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
- Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
- Bissardon, C., Bohic, S., Proux, O. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME. , Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).
