Summary
Bu protokolün amacı, fare derisinde öldürücü olmayan seviyelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) geçici in vivo üretimini indüklemek ve dokudaki fizyolojik tepkileri daha da teşvik etmektir.
Abstract
Burada, fare derisinde endojen reaktif oksijen türlerinin (ROS) değiştirilebilir in vivo fotojenerasyonunu indüklemek için bir protokol açıklıyoruz. Bu geçici ROS in situ üretimi, kök hücre nişlerinde hücre proliferasyonunu etkili bir şekilde aktive eder ve yanık iyileşmesinin ve saç folikülü büyüme süreçlerinin hızlanmasıyla güçlü bir şekilde ortaya çıktığı gibi doku yenilenmesini uyarır. Protokol, dokuyu endojen ışığa duyarlılaştırıcı protoporfirin IX'un öncülleri ile tedavi eden ve ayrıca sıkı bir şekilde kontrol edilen fizikokimyasal parametreler altında dokuyu kırmızı ışıkla ışınlayan düzenlenebilir bir fotodinamik tedaviye dayanmaktadır. Genel olarak, bu protokol ROS biyolojisini analiz etmek için ilginç bir deneysel araç oluşturmaktadır.
Introduction
Reaktif oksijen türleri (ROS), moleküler oksijenin su oluşturmak üzere kimyasal indirgenmesinin sonucudur ve singlet oksijen, süperoksit anyonu, hidrojen peroksit ve hidroksil radikali 1,2,3'ü içerir. ROS, son derece kimyasal reaktif yapıları nedeniyle çok kısa bir ömre sahiptir. Aerobik organizmalarda, ROS, mitokondrideki aerobik solunumun (elektron taşıma zinciri) önemli bir sızdıran yan ürünü olarak hücrelerin içinde tesadüfen oluşur. Hücrede yüksek seviyelerde ROS'un geçici olarak birikmesi, proteinlerin, lipitlerin ve şekerlerin geri dönüşümsüz inaktivasyonunu ve DNA molekülündemutasyonların ortaya çıkmasına neden olabilecek oksidatif bir stres durumuna neden olur 2,3,4,5. Hücrelerde, dokularda ve tüm organizmalarda oksidatif hasarın kademeli birikimi zamanla istikrarlı bir şekilde artar ve hücre ölüm programlarının, çeşitli patolojilerin ve yaşlanma sürecininindüksiyonu ile ilişkilendirilmiştir 2,3,4,6.
Aerobik organizmalar, hücrelerde ve dokularda aşırı ROS birikiminin üstesinden gelmek için sürekli olarak verimli moleküler mekanizmalar geliştirmiştir. Bu mekanizmalar, süperoksit radikal dismutasyonunu moleküler oksijen ve hidrojen peroksite katalize eden süperoksit dismutaz (SOD) protein ailesinin üyelerini ve ayrıca hidrojen peroksitin daha sonra suya ve moleküler oksijene dönüşümünü katalize etmek için antioksidan havuzu (glutatyon, NADPH, peroksiredoksin, tioredoksin 7,8) kullanan farklı katalazları ve peroksidazları içerir.
Bununla birlikte, birkaç rapor, ROS'un proliferasyon, farklılaşma ve hareketlilikdahil olmak üzere kritik hücre fonksiyonlarını düzenleyen moleküler devrelerin temel bileşenleri olarak rolünü desteklemektedir 2,3,4. Bu kavram, lipoksijenazlar, siklooksijenazlar ve NADPH oksidazlar 9,10 dahil olmak üzere aerobik organizmalarda özel ROS üreten mekanizmaların ilk tanımlanması ve karakterizasyonu ile daha da desteklenmektedir. Bu anlamda, ROS omurgalı embriyo gelişimi sırasında aktif bir rol sergiler 11,12,13 ve bu moleküllerin spesifik in vivo fizyolojik fonksiyonların düzenlenmesinde kilit rolleri, Drosophila14'te hematopoietik progenitörlerin farklılaşma programı, zebra balıklarında iyileşme indüksiyonu veya Xenopus kurbağa yavrularında kuyruk rejenerasyonu 15 dahil olmak üzere farklı deneysel sistemlerde bildirilmiştir . Memelilerde ROS, bir nörosfer modelinde16 nöral kök hücrelerin kendi kendini yenileme / farklılaşma potansiyelinde ve kolorektal kanser başlangıcı sırasında bağırsak kök hücre fonksiyonunun deregülasyonunda17 rol oynamıştır. Deride, ROS sinyalizasyonu epidermal farklılaşma ve cilt kök hücre nişinin ve saç folikülü büyüme döngüsünündüzenlenmesi ile ilişkilendirilmiştir 18,19.
Bu perspektifte, hem normal hem de patolojik koşullarda biyolojik sistemlerde ROS'un fizyolojik rollerini belirlemek için önemli bir deneysel sınırlama, bu moleküllerin hücrelerde ve dokularda kontrollü üretimini indüklemek için yeterli deneysel araçların bulunmamasıdır. Şu anda, çoğu deneysel yaklaşım, çoğunlukla hidrojen peroksit formunda eksojen ROS uygulamasını içermektedir. Yakın zamanda, endojen ışığa duyarlılaştırıcı protoporfirin IX'un öncüllerinin uygulanmasına dayanan fare derisinde geçici, öldürücü olmayan bir in vivo endojen ROS üretimini açmak için deneysel bir yaklaşım uyguladık (PpIX; ör., aminolaevulinik asit veya metil türevi metilaminolevulinat) ve hücre içi moleküler oksijenden yerinde ROS oluşumunu indüklemek için numunenin kırmızı ışıkla daha fazla ışınlanması (Şekil 1). Bu fotodinamik prosedür, yerleşik kök hücre nişlerini uyarmak için etkili bir şekilde kullanılabilir, böylece dokunun rejeneratif programlarını aktive eder 19,20 ve ciltrejeneratif tıbbında yeni terapötik modalitelerin yolunu açar. Burada, saç folikülünün19,21 çıkıntı bölgesindeki uzun süreli 5-bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) etiket tutucu hücrelerin (LRC'ler) sayısındaki artış olarak ölçülen, kök hücre nişlerinin uyarılmasının temsili örneklerini gösteren protokolün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz ve ardından geçici olarak indüklenen rejenerasyon programlarının aktivasyonu (saç büyümesinin hızlanması ve yanık iyileşme süreçleri), C57Bl6 fare suşunun derisinde öldürücü olmayan ROS üretimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fare yetiştiriciliği ve deney prosedürleri, hayvan deneyleri ile ilgili yerel, ulusal, uluslararası mevzuat ve yönergelere uygun olarak yürütülmelidir.
1. Saç büyümesinin indüksiyonu, yanık indüksiyonu ve kuyruk derisi epitelindeki uzun süreli BrdU LRC'lerin tanımlanması
NOT: Aşağıda açıklanan deneysel tasarımlar için 10 günlük veya 7 haftalık C57BL/6 fareler, tercihen yavrular kullanın. Tüm deneysel prosedürlerde, hayvanlar% 3 izofluran inhalasyonu ile uyuşturulacak veya belirtildiği gibi servikal çıkık ile ötenazi yapılacaktır.
- İkinci telojen (dinlenme) fazında farelerin arka derisinde saç büyümesinin indüksiyonu (doğumdan yaklaşık 50. gün)
- % 3 izofluran inhalasyonu ile fareleri uyuşturun. Pedal refleksi (sert ayak parmağı sıkışması) eksikliği ile tam derin anesteziyi onaylayın. Saç kesme makinesi ve tüy dökücü krem kullanarak her bir farede sırt derisinin yan yana iki bağımsız bölgesini tıraş edin (Malzeme Tablosu). Kontrol için sol tarafı, tedavi için sağ tarafı kullanın.
NOT: Tıraştan sonra, alt arka derinin pembemsi olduğunu ve gri/siyah olmadığını, bu fare suşunda melanogenezin ve anajen (büyüme) fazına girişin bir göstergesi olduğunu kontrol edin. - Tüm krem kalıntılarını gidermek için PBS ile iyice yıkayın ve bölüm 2.1'de açıklandığı gibi ölümcül olmayan ROS seviyelerinin geçici yerinde üretiminin indüksiyonuna devam edin.
- Her hayvanda kontrol ve tedavi edilen arka deri bölgelerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini günlük olarak alarak saç folikülü büyümesini kaydedin (örneğin, 5−20x dürbün merceğe bağlı bir HD kamera kullanarak).
- % 3 izofluran inhalasyonu ile fareleri uyuşturun. Pedal refleksi (sert ayak parmağı sıkışması) eksikliği ile tam derin anesteziyi onaylayın. Saç kesme makinesi ve tüy dökücü krem kullanarak her bir farede sırt derisinin yan yana iki bağımsız bölgesini tıraş edin (Malzeme Tablosu). Kontrol için sol tarafı, tedavi için sağ tarafı kullanın.
- İkinci telojen (dinlenme) fazda farelerin arka derisinde 2. derece yanık lezyonlarının indüksiyonu (doğumdan yaklaşık 50. gün)
- Fareleri uyuşturun. Saç kesme makinesi ve tüy dökücü krem kullanarak her bir farede tüm arka deri bölgesini tıraş edin ve tüm krem kalıntılarını gidermek için PBS ile iyice yıkayın.
NOT: Yakma prosedüründen hemen önce 7 mg / ml'yi geçmeyen steril salin içinde% 0.5 (2 mg / ml) lidokain enjeksiyonlarını yerinde uygulayın. - Pirinç bir çubuğu (enine kesiti 1 cm) kaynar suya batırarak 95 °C'de önceden ısıtın ve ardından her farenin sırt arka deri yüzeyinin orta bölgesine 5 saniye boyunca uygulayın.
- Yanık oluşumundan hemen sonra, dehidrasyonu önlemek için hayvanlara 1 mL fizyolojik çözelti (% 0.9 NaCl) ile intraperitoneal olarak elektrikli bir battaniyeye enjekte edin. Hayvanların 24 saat boyunca iyileşmesine izin verin ve bölüm 2.3'te açıklandığı gibi ölümcül olmayan ROS seviyelerinin yerinde geçici üretiminin indüksiyonuna devam edin.
- Her hayvanda kontrol ve tedavi edilen arka deri bölgelerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini günlük olarak alarak yanık yarası ilerlemesini kaydedin (örneğin, 5−20x dürbün merceğe bağlı bir HD kamera kullanarak).
- Fareleri uyuşturun. Saç kesme makinesi ve tüy dökücü krem kullanarak her bir farede tüm arka deri bölgesini tıraş edin ve tüm krem kalıntılarını gidermek için PBS ile iyice yıkayın.
- Kuyruk derisi epitelinde uzun süreli BrdU LRC'lerin üretilmesi ve tanımlanması
- PBS'de çözünmüş 50 mg / kg vücut ağırlığı BrdU ile art arda 4 gün boyunca günde bir kez 10/14 günlük littermatları intraperitoneal (anestezi olmadan) enjekte edin. Etiketleme aşamasından sonra, herhangi bir tedaviden önce farelerin 50-60 gün büyümesine izin verin.
NOT: Her enjeksiyon için yeni bir iğne kullanın. - Doku bütünlüklerinin hazırlanmasından önce farklı zamanlarda kuyruk derisinde geçici in situ öldürücü olmayan ROS üretiminin indüksiyonu için bölüm 2.3'te açıklandığı gibi ilerleyin.
- Kuyruk epidermisinin tamamını hazırlamak için, fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın ve kuyrukları cerrahi makasla klipsleyin.
- Kuyruk boyunca düz bir uzunlamasına kesi yapmak için bir neşter kullanın ve tüm cildi omurgadan tek bir parça olarak soyun. Soyulmuş cildi 37 ° C'de 4 saat boyunca 5 mL tüplerde PBS'de 5 mM EDTA'da inkübe edin ve forseps kullanarak sağlam epidermis tabakalarını dermisten dikkatlice ayırın.
- Dokuyu oda sıcaklığında (RT) en az 72 saat boyunca PBS'de% 4 formaldehit içinde sabitleyin ve uygun antikorları kullanarak BrdU tespitine devam edin.
- Daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, doku bütünlüklerinin hazırlanmasından önce farklı zamanlarda ışık kontrolleri ve fotodinamik tedaviler dahil olmak üzere her deneysel durumda LRC'leri tanımlamak ve ölçmek için floresan/konfokal mikroskopi kullanın19,20.
NOT: Sabit epidermal tabakalar, %0.02 sodyum azid içeren PBS'de 4 °C'de üç aya kadar saklanabilir. Standart histolojik kesit prosedürlerini takiben gerekli proteinlerin immünolokalizasyonu için sabit epidermal tabakalar kullanılabilir.
- PBS'de çözünmüş 50 mg / kg vücut ağırlığı BrdU ile art arda 4 gün boyunca günde bir kez 10/14 günlük littermatları intraperitoneal (anestezi olmadan) enjekte edin. Etiketleme aşamasından sonra, herhangi bir tedaviden önce farelerin 50-60 gün büyümesine izin verin.
2. Fare derisinde ölümcül olmayan ROS seviyelerinin geçici üretiminin indüksiyonu
NOT: Fare derisinde ölümcül olmayan ROS seviyelerinin geçici üretimini indüklemek için, endojen ışığa duyarlılaştırıcı PpIX'in bir öncüsü kullanılarak fotodinamik bir tedavi, bu durumda metil-aminolevulinat (mALA) ve kırmızı ışık kullanılacaktır.
- Arka deride tüylenmenin indüksiyonu için geçici ROS üretimini açmak için, hayvanları bölüm 1.1'de belirtildiği gibi hazırlayın.
- ~25 mg mALA'yı topikal krem şeklinde (Malzeme Tablosu) sağ bölgeye uygulayın, sol tarafı iç kontrol olarak tutarak bireyler arası farklılıklardan kaçının. Karanlıkta 2,5 saat inkübe edin, fazla kremayı PBS ile iyice yıkayın. Anestezi derinliğini doğrulamak için, tamamen iyileşene kadar hayvanları her 10 dakikada bir izleyin.
NOT: Arka deride PpIX üretimi, mavi ışık (407 nm) uyarımı altında kırmızı floresansı ile yerinde test edilmelidir. - Hayvanları uyuşturun.
- Tüm sırt derisini toplam 2.5−4 J /cm2 dozu için yeterli bir kırmızı ışık kaynağı (Malzeme Tablosu) ile ışınlayın. Fareleri tamamen iyileşene kadar elektrikli battaniye üzerinde tutun ve adım 1.1.3'te açıklandığı gibi devam edin.
NOT: Işınım, ışık kaynağı ile doku arasındaki mesafe manipüle edilerek ayarlanmalı ve bir güç enerji ölçer (Malzeme Tablosu) kullanılarak ölçülmelidir. Her hayvanın bağımsız traş bölgelerinden herhangi birinde tam tüy büyümesi gözlemlendiğinde deney bitmiş sayılır. Tüm prosedür sadece tek bir fotoğraf tedavisini içerir.
- ~25 mg mALA'yı topikal krem şeklinde (Malzeme Tablosu) sağ bölgeye uygulayın, sol tarafı iç kontrol olarak tutarak bireyler arası farklılıklardan kaçının. Karanlıkta 2,5 saat inkübe edin, fazla kremayı PBS ile iyice yıkayın. Anestezi derinliğini doğrulamak için, tamamen iyileşene kadar hayvanları her 10 dakikada bir izleyin.
- 2. derece yanık lezyonlarının iyileşmesi için geçici ROS üretimini açmak için, hayvanları bölüm 1.2'de belirtildiği gibi hazırlayın.
- Yanmış yüzey boyunca topikal krem şeklinde ~ 25 mg mALA uygulayın ve yaklaşık 4 mm bitişik dokuyu kaplayın. Karanlıkta 2,5 saat inkübe edin, fazla kremayı PBS ile iyice yıkayın. Anestezi derinliğini doğrulamak için, tamamen iyileşene kadar hayvanları her 10 dakikada bir izleyin.
- Hayvanları uyuşturun.
- Tüm sırt derisini toplam 2.5−4 J /cm2 dozu için yeterli bir kırmızı ışık kaynağı ile ışınlayın. Fareleri tamamen iyileşene kadar elektrikli battaniye üzerinde tutun ve adım 1.2.4'te açıklandığı gibi devam edin.
NOT: Tam yanık iyileşmesi gözlendiğinde her hayvan için deneysel prosedür bitmiş sayılır. Tüm prosedür sadece tek bir fotoğraf tedavisini içerir.
- Kuyruk derisinde geçici ROS üretimini açmak için, fareleri bölüm 1.3'te belirtildiği gibi hazırlayın, dorsal doku alanı boyunca topikal krem şeklinde ~ 25 mg mALA uygulayın ve sırt derisi için bölüm 2.1'de açıklandığı gibi devam edin. Hayvan ötenazisinden 24 saat, 48 saat veya 72 saat önce fotoğraf tedavileri ve ilgili ışık kontrolleri gerçekleştirin ve kuyruk derisinin tüm bağlantılarının daha fazla çıkarılması.
NOT: Tüm deneysel tasarımlarda, antioksidan ROS tutucular kullanarak işlemin ROS bağımlılığını test edin (ör., PBS'de 20 mg / mL'lik bir çözeltinin intraperitoneal enjeksiyonu ile günlük 100 mg / kg vücut ağırlığı N-asetil-sistein aşılanması, pH 7.2, mALA tedavilerinden 5 gün önce başlayarak veya alternatif olarak,% 50 etanol içinde iki doz 100 mg / mL askorbik asit, 30 dakika aralıklı, mALA tedavileri ve kırmızı ışık ışınlaması arasındaki zaman aralığında cilde topikal olarak uygulanır).
3. Deride ROS tespiti
- Hidroetidin kullanılarak fotodinamik işlemden sonra kuyruk derisinde ROS üretiminin ex vivo değerlendirilmesi
NOT: Hidroetidin, floresan boya 2-hidroksietidyum (hET) üretmek için spesifik olarak ROS ile reaksiyona giren, floresan olmayan bir moleküldür.- Bölüm 1.3.3'te tarif edildiği gibi elde edilen bütün kuyruk derilerini, PBS çözeltisinde (kontrol numuneleri) 5 mM EDTA içinde 37 °C'de 3 saat inkübe edin veya ek olarak 2 mM mALA (fotodinamik işlem numuneleri) ekleyin.
- Her durumda, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 25 mg / mL'lik bir stoktan 3.2 μM'lik bir nihai konsantrasyona hidroetidin ekleyin ve RT'de karanlıkta 1 saat inkübe edin.
- Kuyruk derisi örneklerini parmak uçlarınızı kullanarak cam bir yüzey üzerinde gerin ve 10 J/cm2 akıcılıkta 636 nm kırmızı ışıkla ışınlayın.
- Epidermisi dermisten ayırmak ve epidermal tabakaları bölüm 1.3.3'te açıklandığı gibi sabitlemek için hemen devam edin.
- Yeşil heyecan verici ışık kullanarak bir floresan/konfokal mikroskop altında hET kırmızı emisyonunu değerlendirin, yüksek kaliteli görüntüler yakalayın ve daha fazla analize devam edin.
NOT: hET otoksidasyonu için negatif bir kontrol olarak fotodinamik tedavi yokluğunda doku örneklerinin hET boyamasını kullanın.
- Saç büyümesinin indüklenmesi ve yanık iyileşmesinin ardından fotodinamik tedaviden sonra arka deride ROS üretiminin in vivo tespiti
NOT: Bu adım, hücre içi esteraz enzimleri tarafından bölünmeden sonra, spesifik olarak 2',7'-diklorofloresein (DCF) floresan boyasını veren ROS ile reaksiyona giren, hücre kaynaklı floresan olmayan bir bileşik olan 2',7'-diklorodihidrofloresein diasetat (DHF-DA) kullanılarak gerçekleştirilir.- Saç büyümesinin indüksiyonu (bölüm 1.1) veya yanık iyileşmesi (bölüm 1.2) için hazırlanmış hayvanları kullanın. Topikal mALA krem uygulamalarından hemen önce (bkz. bölüm 2.1 ve 2.2), 100 μL 1 mg/mL'yi %50 etanol içinde DHF-DA tüm hedef kontrol/tedavi edilen cilt bölgelerine topikal olarak dağıtın, cildin materyali tamamen emmesine izin verin ve topikal mALA krem uygulamasına devam edin.
- Tedavi edilen hayvanları karanlıkta 4 saat inkübe edin, topikal mALA kremini PBS ile ciltten iyice yıkayın ve cilde ikinci bir doz 100 μL DHF-DA solüsyonu verin. Anestezi derinliğini doğrulamak için, tamamen iyileşene kadar hayvanları her 10 dakikada bir izleyin.
- Tedavi edilen hayvanları karanlıkta 50 dakika kuluçkaya yatırın, bir LED lamba kullanarak 636 nm kırmızı ışığın 2,5 ila 4 J/cm2'si arasında değişen bir akıcılıkla tüm sırt derisini uyuşturun ve ışınlayın.
- Işınlamadan hemen sonra, bir in vivo görüntüleme sistemi (Malzeme Tablosu) kullanarak ciltte üretilen ROS seviyelerini değerlendirin. Filtre kutusunu 445−490 nm uyarma ve 515−575 nm emisyon için ayarlayın, yüksek kaliteli görüntüler yakalayın ve daha fazla analize devam edin.
NOT: DHF-DA otoksidasyonu için negatif kontrol olarak fotodinamik tedavi yokluğunda doku örneklerinin DHF-DA boyamasını kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare sırt ve kuyruk derisinde mALA öncüsünün topikal uygulaması, bu bileşiğin mavi ışık (407 nm) uyarımı altında kırmızımsı-pembe floresansı ile gösterildiği gibi, tüm dokuda ve belirgin şekilde kıl folikülünde önemli bir PpIX birikimine neden olur (Şekil 2A, C). Tedavi edilen dokunun daha sonra kırmızı ışıkla (636 nm) 2.5−4 J /cm2'lik bir akıcılıkta ışınlanması, dokuda, özellikle saç folikülünün şişkin bölgesinde geçici ROS üretimini teşvik eder (Şekil 2B, D).
Fare derisinde in vivo ölümcül olmayan ROS üretiminin açılması, foto tedavilerden iki gün sonra saç folikülünün şişkin bölgesinde somatik kök hücreler olarak kategorize edilen LRC'lerin sayısında önemli bir artışı teşvik eder (Şekil 3, sol paneller). Özellikle, LRC sayısındaki artış geçicidir ve tedavilerden 6 gün sonra normal seviyelere geri döner (Şekil 3, sağ panel). Bu bölge fare derisindeki ana kök hücre nişlerinden biri olduğundan, bu bölgedeki hücre proliferasyonunun geçici bir indüksiyonu esas olarak şişkin nişin ve yerleşik kök hücre proliferasyon ve farklılaşma programlarının fonksiyonel aktivasyonunu yansıtır22,23.
Çıkıntılı kıl folikülü nişinin ROS'a bağlı aktivasyonu ayrıca ciltteki fizyolojik tepkilerle ilişkilidir. Bu nedenle, geçici ROS üretimi, 2. derece yanıktan sonra cildin iyileşme sürecini önemli ölçüde hızlandırır (Şekil 4A,B). Hasarlı/kabuklu cilt alanının kademeli olarak azalmasının ölçülmesi, dokuda PpIX'e bağlı geçici ROS üretiminin neden olduğu yara iyileşmesi hızlanma sürecinin sağlamlığını ve istatistiksel önemini göstermektedir (Şekil 4C). Aynı şekilde, ölümcül olmayan ROS seviyeleri, saç folikülünün büyüme uyaranlarına yanıt vermek için refrakter olduğu bir faz olan ikinci koordineli telojen sırasında tıraştan sonra saç büyümesini güçlü bir şekilde destekler22,23, saç büyümesini uyarmak için yeni bileşiklerin ve / veya süreçlerin potansiyelini değerlendirmek için yeterli bir yol oluşturur. Özellikle, askorbik asit (AA) gibi antioksidan bileşiklerin kullanımı, hızlandırılmış saç büyümesi gösteren hayvan sayısında istatistiksel olarak anlamlı bir azalmaya neden olur (Şekil 5B). Ek olarak, ciltteki DHF'nin floresan emisyonu ile ölçülen foto tedavilerden sonra ciltte ROS üretimi de antioksidan bileşikler tarafından önemli ölçüde azaltılır (Şekil 5C). Birlikte, bu sonuçlar, dokuda fizyolojik bir yanıt oluşturmak için PpIX bazlı fotoğraf tedavilerinden sonra ROS üretiminin kesinlikle gerekli olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Hem biyosentetik yolu kullanarak hücrelerde ve dokularda in situ ROS'un endojen fotodinamik üretiminin kontrollü olarak açılması için teorik arka plan. (A) Fotodinamik işlemler sırasında moleküler oksijen uyarımı ile sonuçlanan temel fotokimyasal reaksiyonların şematik gösterimi. Işığın uygun λ ile emilmesi üzerine, S0 temel durumundaki bir ışığa duyarlılaştırıcı molekül (PS), uyarılmış bir tekli durumS1'e geçiş yapar. Herhangi bir uyarılmış durum, enerjik olarak temel durumdan daha az tercih edildiğinden, molekül kısa bir süre sonra S0'a döner. Çoğu PS, S 1'den üçlü durum T1'e geçiş için yüksek bir kuantum verimliliğine sahiptir ve genellikle göreceli olarak uzun bir ömür ile karakterize edilir. Uyarılmış üçlü durumda aktive edilmiş PS, iki farklı yol aracılığıyla diğer moleküllerle reaksiyona girebilir. Tip I fotokimyasal reaksiyon, radikal türler oluşturmak için elektronların bitişik moleküllere aktarılmasıdır; bu radikallerin, süperoksit anyonu (•O2-), hidrojen peroksit (H2O2) ve hidroksil radikali (•OH) dahil olmak üzere ROS üretmek için moleküler oksijenle reaksiyona girmesi muhtemeldir. Tip II fotokimyasal reaksiyon, PDT'de kullanılan çoğu PS için baskın süreci temsil eder. Bu reaksiyon sırasında, enerjinin (elektronların değil) moleküler oksijene (temel durumdaki konfigürasyonu üçlü, 3O2 olan) transferi, radikal olmayan ancak oldukça reaktif singlet oksijenin (1O2) oluşumunu sağlar. Bu reaksiyonlar sırasında oluşan fotoürünler, sonunda hücre ölümüne neden olan veya potansiyel olarak hücre büyümesini uyarabilen oksidatif bir stresle sonuçlanan bir dizi biyokimyasal olayı tetikler. (B) 5-aminolevulinik asit (ALA), hem mitokondriyal hem de sitozolik hücresel bölmeleri içeren hem biyosentetik yolda doğal bir öncüdür. ALA sentaz enzim aktivitesi, bu yolun nihai ürünü olan serbest hemenin, glisin ve süksinil CoA'dan ALA sentezini inhibe ettiği bir negatif geri besleme kontrolü ile düzenlenir. Eksojen ALA veya türevi metil aminolevulinatın (mALA) uygulanması, düzenleyici geri bildirim sistemini atlar, böylece aşağı akış metabolitleri, özellikle protoporfirin IX (PpIX), hücrede ışığa duyarlılığa neden olan hücrede birikir. PpIX'e demir eklenmesinin katalizör enzimi olan ferroşelatazın hız sınırlayıcı özellikleri, bu endojen PS bileşiğinin birikimini teşvik eder. PBG = porfobilinojen. Bu rakam Carrasco ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: mALA ve kırmızı ışıkla fotodinamik tedavi, ciltte geçici ROS üretimini indükler. (A) Sırt derisinde mALA konu tedavisinden sonra endojen PpIX birikimi. Aynı hayvanda sol taraf kontrol olarak kullanıldı. (B) Sol panel: DHF-DA tarafından izlenen PpIX'e bağlı ROS (mALA+Light) üretimi. Sağ panel: sırt derisinde bağıl ROS üretiminin zaman seyri analizi; Her bir hayvanda mALA+Işığa karşı Işık bölgelerinin DHF-DA floresan emisyonunun nispi entegre yoğunluğu, ışınlamadan sonra farklı zamanlarda ölçüldü ve metodolojide açıklandığı gibi normalleştirildi. Ortalama ± SE temsil edildi (her zaman noktası için n = 4). (C) Kuyruk derisinde PpIX'in lokalizasyonu (floresan mikroskopi görüntüleri). (D) Saç folikülünün şişkin bölgesinde artmış ve sürekli bir birikim gösteren hET ile ortaya çıkan mALA + Işıktan sonra kuyruk derisinde ROS üretimi. Temsili konfokal mikroskopi görüntüleri (maksimum projeksiyonlar) gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakam Carrasco ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Deride in situ ROS üretiminin açılması, saç folikülü nişinin şişkin bölgesinde kök hücrelerin önemli ölçüde artmasını sağlar. Sol paneller: PpIX bazlı fototerapilerden 2 gün sonra fare kuyruğu derisi tüm yuvalarında BrdU etiket tutucu hücrelerin (LRC) lokalizasyonunu ve saç foliküllerinin şişkin bölgesinde LRC'nin belirgin artışını gösteren temsili konfokal mikroskopi görüntüleri (maksimum projeksiyonlar). Sağ panel: saç folikülü çıkıntı bölgesindeki LRC sayısının ölçülmesi. Ortalama + SE (n = 4) temsil edilir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam Carrasco ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Deride in situ ROS üretiminin açılması yanık iyileşmesini hızlandırır. (A) Kontrol numunelerine kıyasla tedavi edilen hayvanlarda yanık yaralı bölgelerde mALA tarafından indüklenen PpIX üretimi. (B) mALA+Işıkla tedavi edilen ve kontrol edilen hayvanlarda yanık iyileştirici evrimi. (C) mALA+Işıkla tedavi edilen hayvanlarda hızlandırılmış yanık iyileşmesini gösteren yanmış alanların (sol panel) zaman seyri ölçümü; iyileşmemiş alanın ortalama + SE (n = 4) temsil edilir. Her iki zaman seyri eğrisi arasındaki istatistiksel farklılıkları gösteren eğri altı alan analizi (sağ panel) (p ≤ 0.06). Bu rakam Carrasco ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Deride in situ ROS üretiminin açılması saç büyümesini uyarır. (A) Üst sıra: Işık kontrol bölgesi (sol taraf) ile karşılaştırıldığında refrakter telojen faz sırasında mALA+Light (dorsal derinin sağ tarafı) ile saç büyümesinin indüksiyonu. Alt sıra: Hem ciltte ROS üretimi hem de mALA+Light'ın neden olduğu saç büyümesinin hızlanması, askorbik asit (AA) antioksidan tedavisi ile inhibe edilir. (B) Antioksidan AA'nın yokluğunda veya varlığında kontrol bölgesine kıyasla mALA-PT'de hızlandırılmış saç büyümesi gösteren hayvanların yüzdesinin ölçülmesi (3 bağımsız deneyde n = 4). (C) MALA-PT (n = 4) sırasında AA tarafından indüklenen dorsal deride ROS üretim inhibisyonunun miktarının belirlenmesi. Her durumda, çubuklar ortalama + SE'yi temsil eder. Bu rakam Carrasco ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, fare derisinde fizyolojik etkilerle in vivo endojen ROS üretiminin geçici aktivasyonuna izin veren bir metodoloji sunuyoruz. Metodoloji, endojen ışığa duyarlılaştırıcı PpIX'in kontrollü ve lokal bir stimülasyonunu indüklemek için fotodinamik bir prosedüre dayanmaktadır (Şekil 1B). Bu deneysel yaklaşım, ROS biyolojisini in vivo deneysel sistemlerde incelemek için ilginç bir araçtır ve harici ROS kaynakları (genellikle hidrojen peroksit) kullanan metodolojiler üzerinde önemli bir ilerleme oluşturur ve dokuda/numunede kontrollü ve yerel ROS üretimine izin verir.
Aminolevulinat bazlı öncülerin, hücrelerin içinde PpIX birikimini teşvik etmek için fazla uygulandığı göz önüne alındığında, bu metodolojideki kritik bir adım, dokuda hasar eşiğinin altındaki ROS seviyelerinin geçici üretimini indüklemek için yeterli bir ışık dozunun oluşturulmasıdır, ancak güçlü bir uyarıcı etki gösterir. Şu anda, hücrelerde ve dokularda üretilen herhangi bir ROS tipinin tam miktarını doğrudan ölçmek için mevcut bir teknoloji yoktur. Metodolojimizde, belirli bir ışık dozu, üretilen ROS miktarı ve belirli bir biyolojik etki (örneğin, hücre ölümü veya hücre çoğalması) arasında doğrudan bir ilişki kurmak hala mümkün değildir. Bu nedenle, herhangi bir deneysel model için ışık dozu (akıcılık), her durum için tercih edilen nitel veya yarı nitel parametreler kullanılarak araştırmacı tarafından ampirik olarak belirlenmelidir. Fare derisi söz konusu olduğunda, hücre ölümü ve doku hasarı ile önemli ve geçici bir proliferatif dalganın indüksiyonu arasında kolayca ölçülebilir bir geçiş seçiyoruz.
Burada sunulan metodolojinin, yanık iyileşmesi ve saç folikülü büyümesi dahil olmak üzere farklı süreçlerde cilt yenilenmesinin iyileştirilmesinde çok etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu gözlemler, tesadüfi veya kronik yanıkların ve yaraların tedavisi veya farklı patolojiler için kliniklerde bu teknolojinin terapötik uygulamalarının uygulanmasının önünü açmaktadır: cilt ve özellikle kusurlu bir kök hücre işleyişini içeren saç folikülü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu çalışmada açıklanan prosedürlerin tüm ticari uygulamaları, EC, MIC ve JE tarafından yazılan ve ticari kullanım için Derma Innovate SL'ye lisanslanan bir CSIC-UAM patenti (EP2932967A1) ile korunmaktadır. JE ve JJM, Derma Innovate SL'de danışmanlık pozisyonuna sahiptir.
Acknowledgments
Bu çalışma, İspanya'dan Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1'den JE'ye) ve Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458'den JE'ye) tarafından verilen hibelerle desteklenmiştir. EC, Atracción de Talento Investigador hibesi 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid ve UAM) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-bromo-2'-deoxiuridine | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
| Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein | Roche | 11202693001 | |
| Depilatory cream (e.g., Veet) | Veet | ||
| Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
| Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
| Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp | Photocure ASA |
References
- Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biology. 13, 39-59 (2017).
- Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Bartosz, G. Reactive oxygen species: Destroyers or messengers. Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).
- Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Medical Weekly. 142, 13659 (2012).
- Speakman, J. R., Selman, C. The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan. BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).
- Fernandez, V., Videla, L. A. Biochemical aspects of cellular antioxidant systems. Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).
- Matés, J. M., Sánchez-Jiménez, F. Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes. Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
- Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).
- Hernández-García, D., Wood, C. D., Castro-Obregón, S., Covarrubias, L. Reactive oxygen species: A radical role in development. Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).
- Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregón, S. Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active. Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).
- Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses. Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).
- Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation. Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).
- Love, N. R., et al. Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration. Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).
- Le Belle, J. E., et al. Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
- Myant, K. B., et al. production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Hamanaka, R. B., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development. Science Signaling. 6 (261), 8 (2013).
- Carrasco, E., et al. Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).
- Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, Á, Espada, J. Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues. Methods. , 109 (2016).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hsu, Y. -C., Li, L., Fuchs, E. Emerging interactions between skin stem cells and their niches. Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).
- Plikus, M. V., et al. Epithelial stem cells and implications for wound repair. Seminars in Cell & Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).
