Summary
El ensayo de adhesión a opsono es un método alternativo al ensayo de muerte opsonótico-fagocítico para evaluar las funciones opsónicas de los anticuerpos en el desarrollo de vacunas.
Abstract
El ensayo de opsono-adherencia es un ensayo funcional que enumera el apego de patógenos bacterianos a fagocitos profesionales. Debido a que la adherencia es necesaria para la fagocitosis y matar, el ensayo es un método alternativo a los ensayos de matanza opsono-fagocítico. Una ventaja del ensayo de opsono-adherencia es la opción de usar patógenos inactivados y líneas celulares de mamíferos, lo que permite la estandarización a través de múltiples experimentos. El uso de un patógeno inactivado en el ensayo también facilita el trabajo con agentes infecciosos de nivel 3 de bioseguridad y otros patógenos virulentos. En nuestro trabajo, el ensayo de adhesión al opsono se utilizó para evaluar la capacidad funcional de los anticuerpos, desde el sera de animales inmunizados con una vacuna a base de cápsulas de ántrax, para inducir la adherencia de Bacillus anthracis fijo a una línea celular de macrófago de ratón, RAW 264.7. La microscopía automatizada de fluorescencia se utilizó para capturar imágenes de bacilos adheridos a macrófagos. El aumento de la adherencia se correlacionó con la presencia de anticuerpos anti-cápsula en el suero. Los primates no humanos que presentaban altas concentraciones séricas de anticuerpos anti-cápsula estaban protegidos del desafío del ántrax. Por lo tanto, el ensayo de opsono-adherencia se puede utilizar para dilucidar las funciones biológicas de anticuerpos específicos de antígenos en sera, para evaluar la eficacia de los candidatos a la vacuna y otras terapias, y para servir como un posible correlato de inmunidad.
Introduction
El reconocimiento, la adherencia, la internalización y la degradación de un patógeno son parte integral de la fagocitosis1,una vía destacada en la respuesta inmune innata huésped descrita por primera vez por Ilya Metchnikoff en 18832,3. Los leucocitos fagocíticos, así como otras células del sistema inmunitario, son altamente discriminatorios en su selección de objetivos; son capaces de distinguir entre "yo infeccioso" y "yo no infeccioso" a través de patrones moleculares asociados a patógenos por su repertorio de receptores de reconocimiento de patrones (PRR)4,5. El reconocimiento del huésped de un patógeno también puede producirse con la unión de opsoninas huésped, como complemento y anticuerpos6. Este proceso, llamado opsonización, recubre el patógeno con estas moléculas, mejorando la internalización al unirse a los receptores opsónicos (por ejemplo, complemento y receptores Fc) en las células fagocíticas6. Para que un patógeno se adhiera a un fagocito, es necesaria la unión colectiva de múltiples receptores con sus ligandos de cognado. Sólo entonces la adherencia puede activar y sostener cascadas de señalización dentro de la celda host para iniciar la internalización6.
Debido a la importancia de la fagocitosis en el aclaramiento de patógenos y la prevención de infecciones, patógenos extracelulares han desarrollado numerosas maneras de subvertir este proceso para prolongar su supervivencia. Una estrategia de importancia es la producción de una cápsula polimérica aniónica (por ejemplo, polisacárido o poliaminoácido) que es anti-fagocítica en virtud de su carga, es poco inmunogénica, y protege moléculas en la envolvente bacteriana de los PRR6,7. Patógenos como Cryptococcus neoformans y Streptococcus pneumoniae tienen cápsulas compuestas de polímeros de sacárido, mientras que Staphylococcus epidermidis y algunas especies de Bacillus producen ácido poli-ɣ-glutámico (PGGA)7,8. Sin embargo, otros patógenos producen cápsulas que se asemejan al yo no infeccioso. Por ejemplo, Streptococcus pyogenes y una cepa patógena de B. cereus tienen una cápsula de ácido hialurónico que no sólo es anti-fagocítica, sino que también puede no ser reconocido como extraño por el sistema inmune9,10.
La conjugación de proteínas portadoras de cápsulas las convierte de antígenos pobres e independientes de T en antígenos altamente inmunogénicos dependientes de la T que pueden inducir títulos de anticuerpos anti-cápsula séricos altos11,12. Esta estrategia se emplea para vacunas autorizadas contra S. pneumoniae, Haemophilus influenzaey Neisseria meningitides11. Las actividades opsónicas de anticuerpos anti-cápsula han sido comúnmente evaluadas por ensayos de matanza opsono-fagocítica (OPKA)13,14,15,16. Estos ensayos prueban si los anticuerpos funcionales pueden desencadenar fagocitosis y matara 14. Sin embargo, el uso de OPKA con patógenos infecciosos, como agentes biológicos selectos de nivel 1 y toxinas (BSAT), incluido B. anthracis17,es peligroso y presenta riesgos para la seguridad; estos ensayos requieren un manejo exhaustivo de un agente selecto. El manejo de agentes seleccionados solo se puede realizar en laboratorios restringidos de bioseguridad nivel 3 (BSL-3); el trabajo en estas áreas exige procedimientos operativos prolongados debido a las numerosas precauciones de seguridad que deben seguirse. Los laboratorios BSL-3 tampoco suelen estar equipados con el equipo especializado utilizado para el trabajo opka, como microscopios y citómetros. Así, desarrollamos un ensayo alternativo basado en el uso de bacterias inactivadas18,19. Nos referimos a esto como un ensayo de opsono-adherencia (OAA) que no depende de la internalización y la eliminación de las salidas de ensayo; en su lugar, la adherencia de patógenos inactivados osonizados se utiliza como un índice de fagocitosis. Mecanicistamente, OAA es un sustituto adecuado porque la adherencia ocurre a priori y está íntimamente entrelazada con la internalización y la matanza intracelular. Desde una perspectiva de bioseguridad, OAA es preferible porque requiere un manejo mínimo de un agente infeccioso, es experimentalmente de menor duración que OPKA, y se puede realizar en laboratorios BSL-2 después de que se haya producido y transferido un stock del patógeno inactivado.
Demostramos la utilización de OAA para examinar la función opsónica de anticuerpos anti-cápsula que se encuentran en el sera de primates no humanos (NHP) vacunados con una cápsula conjugada [es decir, PGGA de B. anthracis conjugada al complejo proteico de membrana externa (OMPC) de Meningitidas Neisseria]20. Bacilos osonizados séricos fueron incubados con una línea celular de macrófago de ratón adherente, RAW 264.7. Después de la fijación, la monocapa celular y el bacilo adherente fueron imagenados por microscopía de fluorescencia. La adherencia bacteriana aumentó cuando los bacilos fueron incubados con suero de los NHP vacunados con la cápsula conjugada en comparación con el control sérico20. Adherencia correlacionada con la supervivencia del desafío de ántrax20,21. Por lo tanto, el uso de OAA caracterizó la función de los anticuerpos anti-cápsula y facilitó en gran medida las pruebas de nuestro candidato a la vacuna.
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Protocol
En cumplimiento de la Ley de Bienestar Animal, la política del Servicio de Salud Pública y otras leyes y regulaciones federales relativas a animales y experimentos que involucran animales, la investigación descrita aquí se llevó a cabo bajo un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. La instalación donde se llevó a cabo esta investigación está acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado De Los Animales de Laboratorio, Internacional y se adhiere a los principios indicados en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, Consejo Nacional de Investigación, 201124.
1. Cultura y mantenimiento de la línea celular, RAW 264.7
NOTA: Los siguientes procedimientos deben realizarse con técnicas asépticas.
- Caliente el suero bovino fetal (FBS) en un baño de agua de 56 °C durante 30 minutos para inactivar el complemento.
NOTA: El tiempo de inactivación de 30 min comienza cuando FBS alcanza los 56 °C. Para controlar la temperatura, caliente un volumen similar de agua en un vaso de precipitados en el mismo baño de agua. Una vez que el agua alcance los 56 °C, comience la cuenta atrás de 30 minutos para FBS. Alternativamente, FBS que ha sido desactivado por calor también está disponible comercialmente. - Preparar medio para células RAW 264.7 combinando 90% DMEM con glucosa alta y 10% FBS inactivado por calor (v/v). Añadir L-glutamina a una concentración final de 6 mM.
NOTA: DMEM con glucosa alta está formulado con 4 mM L-glutamina. Complementar L-glutamina a 6 mM promueve el crecimiento constante de las células. Se pueden añadir 100 penicilinas U/ml y 100 μg/ml de estreptomicina para evitar la contaminación. Otra línea celular murina común, J774A.1, también se puede utilizar y se cultiva en condiciones similares. - Descongelar un vial congelado de células en un baño de agua de 37 °C y retirar del baño tan pronto como se derrita. Añadir contenido asépticamente a 5 ml de medio completo en un tubo cónico. Invierta el tubo cónico dos veces y gire a 300 x g durante 5 minutos a las células de pellets.
- Aspirar medio usando un pipete pasteur estéril unido a un vacío para eliminar el agente de congelación. Pellet de celda resuspend en 5 ml de medio fresco.
- Transfiera la suspensión a un matraz o plato tratado con cultivo tisular. Agregue suficiente medio para cubrir completamente la parte inferior del matraz y arremolinarse para distribuir uniformemente las células. Indique el número de pasaje a partir de "1".
- Incubar células a 37 °C en presencia de 5% DE CO2 y humedad hasta alcanzar entre el 95% y el 100% de confluencia. Revise las células diariamente bajo el microscopio comenzando con el segundo día de incubación. No permita que las células alcancen >100% de confluencia, ya que esto hará que las células se levanten y mueran.
NOTA: El tiempo necesario para alcanzar la confluencia depende de cuántas células vivas fueron chapadas y el área de crecimiento del matraz. Por lo tanto, es prudente comprobar las células diariamente. - Células de subcultura raspando y diluyendo el caldo celular en medio fresco permitiendo al menos dos días de crecimiento entre raspados. Aumente el número de pasaje en 1 con cada subcultura.
NOTA: Pasar y raspar inmediatamente al día siguiente resultará en una pérdida más rápida de la adherencia general de la célula con el tiempo. Las células RAW 264.7 solo deben utilizarse hasta aproximadamente el paso 15. - Para chapar células RAW 264.7 para el ensayo OAA, reemplace con un medio fresco y utilice un raspador de células para raspar suavemente las células del matraz. Pipeta arriba y abajo para romper los grupos celulares para facilitar el recuento celular.
NOTA: El método tradicional para subcultar RAW 264.7 es raspado. En nuestra experiencia, el uso de trypsin hace que las células RAW 264.7 pierdan adherencia con el tiempo más rápido que con el raspado. - Para contar las células, diluya los volúmenes iguales de células y pruebe la solución azul. Cargue 10 μL en un hemociclo. Observe y cuente el número de células vivas que excluyen el tinte utilizando un microscopio compuesto invertido con una lente objetiva de 10x.
- Placa 1,4 x 104 células viables por pozo en una placa plana de vidrio de 96 pozos de 0,15 μm de espesor (placa #1). Permita que las células crezcan durante 3 días. Reemplace el medio gastado un día antes de realizar OAA.
NOTA: Después de 3 días de incubación, el número de células debe ser de aproximadamente 5 x 104/pozo.
2. Cultivo y preparados bacterianos
NOTA: La especie bacteriana utilizada en este protocolo es una cepa virulenta encapsulada, B. anthracis Ames. Todas las manipulaciones con esta especie requieren seguridad adecuada y autorizaciones de seguridad y deben realizarse en un armario de seguridad biológica clase II o clase III ubicado en un laboratorio BSL-3. Siga los procedimientos operativos institucionales para el trabajo de BSL-3 y para el uso de equipos de protección personal al manipular bacterias.
- Prepare el caldo de infusión cardíaca cerebral (BHI) disolviendo 37 g de polvo BHI en agua de 1 L y autoclavando a 121 °C durante 15 minutos. Almacene el caldo a temperatura ambiente.
- Prepare una solución de bicarbonato de sodio al 8% en agua y esterilizar con una jeringa filtrante de 0,20 μm. Almacene la solución a 4 °C y utilícenla en un plazo de 1 día.
- Mezcle 8 g de caldo nutritivo, 3 g de extracto de levadura y 15 g de agar en agua de 1 L para preparar placas de agar NBY. Autoclave a 121 °C durante 15 min. Vierta en placas de Petri y deje solidificar. Guarde las placas a 4 °C.
NOTA: Las placas de agar NBY se pueden hacer con o sin bicarbonato de sodio. La adición de bicarbonato de sodio a las placas de caldo y agar induce el crecimiento de colonias de mucoides que consisten en bacilo encapsulado. La concentración final de bicarbonato de sodio en medios líquidos y sólidos es del 0,8%. - Prepare el caldo de cultivo para B. anthracis mezclando caldo BHI autoclavado al 50%, 40% FBS y 10% solución de bicarbonato sódico (v/v).
NOTA: Este caldo está formulado para producir cadenas cortas de bacilo encapsulado. - Prepare una placa maestra de B. anthracis con rayas para su aislamiento en una placa de agar NBY de un stock de esporas un día antes de cultivar en caldo. Incuba a 37 °C.
- Inocula 30 ml de caldo de cultivo en un matraz de 250 ml ventilado con varias colonias de B. anthracis.
NOTA: Se necesita una relación volumen-superficie específica del caldo, como se especifica aquí, para producir bacilos encapsulados al máximo. - Agitar el cultivo del caldo a 125 rpm, 37 °C con 20% DE CO2 y humedad para 18-24 h.
NOTA: Crecer B. antrasis a temperaturas superiores a 37 °C puede inhibir la producción de cápsulas. - Utilice la tinción negativa con tinta india para garantizar una encapsulación suficiente y que los bacilos estén en cadenas cortas (1-5 bacilos/cadena) antes de la fijación (ver sección 3).
- Para determinar las unidades formadoras de colonias (CFU), diluya en serie 100 μL de cultivo 1:10 en solución de solución de fosfato y diluciones de cultivo de placas en placas de agar de sangre de oveja. Incubar de 12-18 h a 37 °C. Cuente las CFU y determine el número de bacterias por ml de cultivo.
NOTA: El conteo también se puede realizar utilizando un hemociclo dentro del microscopio una vez que las bacterias han sido reparadas. Sin embargo, esto no se recomienda porque los bacilos son difíciles de ver bajo bajo aumento. - Añadir 16% paraformaldehído (PF) a todo el volumen de cultivo bacteriano a una concentración final de 4% PF para fijar el bacilo. Agitar lentamente en una coctelera a temperatura ambiente durante 7 días.
NOTA: Siete días de incubación en 4% PF se basa en el procedimiento operativo estándar institucional USAMRIID para la fijación de bacilos vegetativos. - Para eliminar el fijador y la prueba de esterilidad, lave tres veces 4 ml (10% de volumen) de suspensión bacteriana fija en un tubo cónico de 50 ml por centrifugación a ≥3000 x g durante 45 minutos y usando un tubo cónico de 30 ml/lavado con PBS. Almacene la muestra restante en 4% PF a 4 °C.
NOTA: Después de la peletía, el pellet bacteriano es esponjoso debido a la presencia de la cápsula. No se cuide de no molestar el pellet durante el lavado. Es necesario eliminar todo fijador para que no interfiera con las pruebas de viabilidad. Si es necesario, aumente el número de lavados. - Para pruebas de viabilidad, inocular 40 ml de un medio de crecimiento bacteriano (por ejemplo, caldo BHI) con 4 ml de suspensión lavada (≤ 10% del volumen de caldo) e incubar a 37 °C durante 7 días. Compruebe la densidad óptica a 600 nm antes y después de 7 días para medir la turbidez.
- Después de 7 días de incubación en cultivo de caldo, placa ≥100 μL de caldo en una placa de agar e incubar durante otros 7 días. Si no se observa ningún aumento en la turbidez y no se observa ningún crecimiento en las placas, el cultivo original se considera estéril y puede transferirse a un laboratorio BSL-2.
NOTA: El Programa Federal de Agentes Seleccionados22 exige que B. anthracis inactivado solo se pueda transferir desde laboratorios BSL-3 después de demostrar la esterilidad completa de la muestra. Las pruebas de viabilidad para B. anthracis inactivadas consisten en cultivar el 10% de la muestra en caldo durante 7 días seguido de la culturing en medios sólidos durante otros 7 días22,23. Siga las directrices institucionales para recibir la aprobación de transferencia una vez establecida la esterilidad.
3. Tinción negativa y microscopía ligera para observar las cadenas de encapsulación y bacilo
- Mezcle 5 μL de suspensión bacteriana con 2 μL de tinta india en una diapositiva del microscopio. Coloque un vaso de cubierta de 1 o 1,5 μm de espesor encima de la suspensión sin crear burbujas.
NOTA: El esmalte de uñas se puede utilizar para sellar el vidrio de la cubierta en el tobogán. - Observe la suspensión bacteriana utilizando una lente objetivo de aceite de 40x a 100x en un microscopio ligero. Asegúrese de que el bacilo se encapsula observando una zona de aclaramiento (cápsula excluye la tinta india) que rodea cada bacteria y que las cadenas de bacilos son cortas.
4. Etiquetado fitc de bacterias
- Disolver el isotiocyanato de fluoresceína (FITC) en sulfóxido de dimetil a una concentración de 2 mg/ml.
- Mida el volumen del caldo bacteriano inactivado.
- Lave el caldo 3x en PBS para eliminar el fijador.
- Añadir solución FITC a una concentración final de 75 μg/ml. Agitar lentamente la mezcla durante 18-24 h a 4 °C.
- Lave tres veces las bacterias peletizando a ≥3000 x g, 45 min y usando 30 mL PBS/wash para eliminar el exceso de FITC. Asegúrese de que el pellet esponjoso no se moleste durante el lavado. Resuspend el bacilo en PBS en el mismo volumen inicial.
- Aliquot y almacenar el bacilo en microtubos a -20 °C hasta su uso. No congele/descongele bacilo varias veces, ya que el bacilo puede perder cápsula.
5. Opsonización bacteriana
- El calor inactiva un pequeño volumen de sera de prueba (de LOSP) a 56 °C durante 30 minutos en un bloque de calor.
- Descongelar y lavar bacterias etiquetadas con FITC con PBS 2x por peletización a 15000 x g durante 3-5 min. Resuspend en PBS en el mismo volumen inicial.
- En una placa inferior redonda de 96 pozos (placa #2), diluya en serie el sera de prueba en el medio celular. En otra placa inferior redonda de 96 (placa #3), agregue 10 μL de sera de prueba diluida en cada pozo.
NOTA: En cada plato, PBS y sera mono normal se incluyeron en lugar de sueros de prueba diluidos como controles negativos. También elegimos un suero de prueba como un control positivo para generar una curva estándar para normalizar todos los ensayos realizados en diferentes días. El suero de prueba de control positivo fue elegido arbitrariamente porque era abundante. - Para #3, agregue un complemento de conejo bebé recién reconstitutado de 10 μL.
NOTA: Una vez reconstituydo, deseche el complemento restante de conejo bebé; no se descongelen y se descongelen. - Para chapar #3, agregue el volumen adecuado de bacilos etiquetados con FITC para una multiplicidad de infección de 1:20. Por ejemplo, agregue el volumen que contiene 5 x 104 x 20 bacilos para 5 x 104 celdas. Remate cada pozo en placa #3 con el volumen adecuado de medio celular a total de 105 μL.
NOTA: La placa #1, que contiene células, recibe 100 μL de bacterias opsonizadas con los 5 μL restantes como volumen vacío. Probamos cada dilución de la prueba sera en duplicado. - Incubar placa #3 a 37 °C durante 30 min en presencia de 5% CO2 con humedad para opsonizar bacilos.
6. Ensayo de adherencia y etiquetado fluorescente de células de mamíferos
- Mantenga todos los reactivos a 37 °C antes de su uso.
- Coloque la placa #1, que contiene células adherentes, en un bloque de calor de 37 °C.
- Utilice un pipeteador multicanal para eliminar el medio gastado de los pozos y reemplazar rápidamente con 100 μL de bacterias opsonizadas de la placa #3. Asegúrese de que no se hayan generado burbujas en los pozos durante el pipeteo. La placa de incubación #1 a 37 °C con un 5% de CO2 y humedad durante 30 minutos para la adherencia.
- Lave cada pozo 5 veces con 150 μL PBS encima de un bloque de calor de 37 °C para eliminar bacilos no asociados.
NOTA: Se debe tener cuidado para garantizar que las células no se dispersen accidentalmente durante el lavado. - Diluir 16% PF con PBS 1:4 para hacer 4% PF. Fijar células con 4% PF para 1 h mediante la adición de 150 μL a cada pozo. Lave las células 2 veces con PBS.
- Mezcle 2 μL HCS (cribado de alto contenido) Mancha de células anaranjadas en PBS de 10 ml. Añadir 150 μL de esta solución de tinción a las células fijas e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
- Lave los pozos 2 veces con PBS.
- Conservar a 4 °C hasta la microscopía.
7. Microscopía
NOTA: En general, un microscopio automatizado de fluorescencia de alto rendimiento facilitará la toma de imágenes para la OAA. Si no hay un sistema automatizado disponible, las imágenes fluorescentes de bacilos adherentes se pueden tomar manualmente21. En este estudio20,bacilos adherentes y monocapas celulares fueron imagines usando el sistema de microscopía de escaneo láser Zeiss 700 con equipo especializado; nuestro sistema se componía del microscopio invertido Zeiss Axio Observer Z1 equipado con una etapa automatizada, el módulo Definite Focus, el objetivo 40 x NA 0.6, la cámara Axio Cam HRc y el software Zen 2012 (Blue Edition). Las imágenes adquiridas son imágenes de campo ancho, no imágenes confocales. El siguiente protocolo está pensado como una configuración básica de microscopio que es aplicable a una variedad de sistemas automatizados de microscopía.
- Incubar la placa #1 a temperatura ambiente durante 30 minutos. Encienda el microscopio y el equipo relacionado.
NOTA: La aclimatación a temperatura ambiente impide que la condensación se forme en la placa de vidrio durante la toma de imágenes. Además, evita el desenfoque debido al cambio de temperatura. - Coloque la placa en el escenario y concéntrese en las celdas utilizando el campo brillante o el contraste de fase.
- Seleccione el formato 96 bien como ajuste de placa. Seleccione configuración de canal.
NOTA: La excitación máxima de FITC y la longitud de onda de emisión son 495/519 nm; la mancha de células anaranjadas HCS es de 556 y 572 nm. Otros fluoróforos se pueden utilizar dependiendo de los filtros que están disponibles en el microscopio. - Seleccione configuración en modo mosaico. Indique el número de imágenes que se adquirirá.
NOTA: La función de ordenamiento en teselas permite la captura de varias ubicaciones en un pozo de muestra y se puede configurar para adquirir imagen en un mosaico o un formato aleatorio. Hemos captado 10 áreas aleatorias por pozo. - Cambie el modo de adquisición a "blanco y negro" o "monocromo" y binning ≥ 2x2.
NOTA: Establecer el binning de 1x1 a 2x2 o 4x4 aumentaría la velocidad de microscopía, pero también daría lugar a una menor resolución de la imagen. Para OAA, es suficiente utilizar estos ajustes, ya que el ensayo enumera tanto los macrófagos como las bacterias adherentes. - Active el módulo de enfoque automático o enfoque. Indique la frecuencia con la que se va a realizar la función de enfoque automático. Active la función de pila Z, si está disponible. Indique el número de pilas Z que capturarán el grosor de la monocapa celular y el bacilo adherente.
NOTA: El número de pilas Z elegidas aumentará el tiempo de microscopía, pero garantizará que se tome una imagen con el enfoque correcto en cada pila Z. - Designe una carpeta de archivos en la que guardar imágenes. Ejecute el programa de imágenes automatizadas.
8. Recopilación y análisis de datos
- Contar el número de bacilos adherentes y células de mamíferos por imagen. Cuente cada cadena de bacilos como una bacteria.
- Trace los bacilos/células del suero y el valor de prueba de control positivo (por ejemplo, la dilución de 1:10 es de 10 titeres) para generar una curva estándar en un programa de estadísticas adecuado.
- Analice el suero de prueba de control positivo utilizando un empalme de curva de regresión no lineal. A continuación, analice las muestras restantes utilizando la curva estándar del suero de prueba de control positivo para determinar las títulos correspondientes.
NOTA: Por lo general, es más preciso elegir las diluciones de la muestra cerca del centro de la curva estándar al determinar los títulos. - Calcule la media geométrica de las muestras de cada grupo vacunal. Calcule los valores P de los títulos transformados de registro por la diferencia menos significativa del análisis ANOVA.
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Representative Results
Esta sección muestra micrografos representativos recogidos durante un experimento de OAA junto con resultados que muestran que la OAA se puede utilizar para examinar la función biológica de los anticuerpos. Aquí, el ensayo se utilizó con éxito para evaluar la eficacia de un candidato a la vacuna contra el ántrax. Es fundamental verificar el estado de encapsulación en el bacilo, ya que la poca o ninguna encapsulación hace que se adhieran a las celdas del host, produciendo un fondo alto. La Figura 1 es una imagen de B. anthracis Ames manchada negativamente con tinta india para examinar la encapsulación. OAA requiere que se iluminen varios campos de vista adyacentes y si se utiliza microscopía confocal, varias pilas o secciones. Por lo tanto, es necesario verificar que los bacilos no son demasiado tenues ni foto-lejías demasiado rápido. La Figura 2 es una imagen del bacilo etiquetado con FITC. La Figura 3 muestra las imágenes de proyección máxima de B. anthracis Ames conectadas a las monocapas de celda. Estos son campos de visión representativos que fueron contados y puntuados para la OAA. El aumento en el apego de bacilos incubados con antídoto PGGA-OMPC se debe a la presencia de anticuerpos anti-cápsula que opsonizaron el bacilo. La Figura 4 muestra que los títulos séricos de los NHP vacunados con 10 y 50 μg PGGA-OMPC son significativamente más altos que los títulos solo para OMPC y PGGA.
Figura 1. Una imagen de tinta india de B. anthracis Ames fijo. Tenga en cuenta la zona de despeje que rodea el bacilo debido a la presencia de cápsula. Barra = 10 μm. La imagen fue tomada en el sistema de microscopía automatizada EVOS FL con lente objetivo de aceite de apertura numérica (NA) de 100 x 1,4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imágenes de FITC etiquetadas B. anthracis Ames fijas. (Izquierda) Imagen de contraste de interferencia diferencial; imagen fluorescente pseudocolor en verde (medio); combinado (derecha). Barra = 10 μm. Las imágenes confocales fueron tomadas en la Microscopía Confocal Zeiss 700 LSM con lente objetivo de aceite de 40 x 1.3 NA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Las imágenes fluorescentes de B. anthracis Ames se adhirieron a las monocapas celulares RAW 264.7. Los bacilos fueron osonizados con suero de prueba de LOSP vacunados e impulsados con (A) 10 μg PGGA-OMPC, (B) 50 μg PGGA-OMPC, (C) 50 μg solo PGGA, o (D) OMPC solamente. Verde = B. antrasis Ames, rojo = RAW 264.7 celdas. Barra = 20 μm. Se tomaron imágenes de campo anchas en el microscopio Zeiss Axio Observer Z1 con lente objetiva de 40 x 0,6 y la cámara Axio Cam HRc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Los títulos de opsono-adherencia de los NHP vacunados con 10 μg PGGA-OMPC, 50 μg PGGA-OMPC, 50 μg solo PGGA, o OMPC solo. Se grafican los medios geométricos de 5 animales por grupo. Las barras de error indican SEM. *p ≤ 0.001 en comparación con PGGA solamente. Los valores p se calcularon utilizando ANOVA con la prueba posthoc LSD. Los datos fueron publicados originalmente en Chabot, et al., 201620. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se ha demostrado que las vacunas basadas en cápsulas son eficaces contra numerosos patógenos bacterianos, y muchas tienen licencia para su uso en seres humanos25,26,27. Estas vacunas funcionan mediante la generación de anticuerpos dirigidos a la cápsula y muchos de estos estudios utilizan el OPKA para mostrar las funciones opsono-fagocíticas de los anticuerpos13,14,16,28,29. Debido a preocupaciones de bioseguridad y por facilidad de trabajo, desarrollamos una OAA para evaluar anticuerpos de animales vacunados con conjugados con cápsula B. anthracis. La presencia de cápsula en B. anthracis previene la adherencia y fagocitosis30,pero la osonización de bacilos con sera de animales vacunados induce apego a macrófagos20,21.
Para OAA, la actividad de adherencia, no la internalización y la matanza, se utiliza para cuantificar la actividad opsónica. Esto le dio a la OAA varias ventajas. Pudimos utilizar paraformaldehído muerto, etiquetado fluorescentemente bacilo encapsulado en lugar de organismos vivos. Los cambios en la superficie bacteriana por fijación de aldehído y etiquetado fluorescente no cambiaron la adherencia general de la bacteria a los macrófagos; bacilos fijos y etiquetados no eran más adherentes que los bacilos vivos (datos no mostrados). El grado de encapsulación puede variar de la cultura a la cultura y afectar la adherencia general a pesar de condiciones de crecimiento similares. Por lo tanto, el uso de un único stock bacteriano inactivado permite la estandarización a través de experimentos realizados en diferentes días y a través de diferentes conjuntos de experimentos. Esto fue valioso para comparar sera de los 20 NHP utilizados en este trabajo y sera que se generarán en nuestros próximos estudios. Por último, la mayoría de los macrófagos, incluidas las células RAW 264.7, son sensibles a la toxina letal de ántrax producida por el patógeno vivo31,haciendo que el uso de bacilos vivos sea inherentementeproblemático.
El uso de células RAW 264.7 también facilitó la estandarización. Inicialmente usamos una línea celular de uso común en células OPKA, HL-60. Sin embargo, encontramos dificultades para diferenciarlos a granulocitos con dimetil-formamida, como lo informan otros28,32. Las células RAW 264.7 tienen la ventaja de que no necesitan ser diferenciadas químicamente y son adherentes y, por lo tanto, más aptos para la OAA basada en microscopía. Esta línea celular se ha utilizado en numerosos estudios de fagocitosis con patógenos intracelulares33,34,así como B. anthracis31. El uso de células RAW 264.7, que se derivan del ratón, también es ventajoso porque los receptores fc del ratón son promiscuos en su especificidad de unión para IgG derivado de otras especies35. Esto nos permitió evaluar los anticuerpos anti-cápsula de los NHP con una línea celular murina.
El ántrax, aunque raro, es endémico en algunas regiones del mundo y estados Unidos. Una preocupación es que el FBS utilizado, procedente de los Estados Unidos, ya puede contener anticuerpos anti-cápsula como resultado de que el animal esté expuesto a esporas de B. anthracis u otros microbios productores de PGGA en el suelo. Para abordar este problema, el lote FBS que usamos fue probado previamente. Encontramos que la adición de FBS inactivado por calor aumentó la adherencia en comparación con dmem solo (datos no mostrados). Sin embargo, no aumentó la adherencia en comparación con el calor inactivado sera normal de cobaya, mono, ratón o humano (datos no mostrados). Por lo tanto, el lote FBS que utilizamos no contenía anticuerpos anti-cápsula como resultado de la exposición. Además, tampoco contendría anticuerpos anti-cápsula como resultado de que el animal fuera vacunado con el B. anthracis Sterne no comprimido, una cepa que carece del plásmido pXO2 necesario para la producción de cápsulas. El lote FBS probado se utilizó para todas las OAA posteriores.
Una limitación de la técnica es la tarea de contar bacilos y células por personal de laboratorio, lo que tomó una enorme cantidad de tiempo y esfuerzo. Esto se puede corregir con el uso de software que tiene este tipo de análisis; este software no estaba disponible para nosotros en ese momento. Sin embargo, debido a que el conteo manual era necesario, un paso crítico fue la eliminación o lavado de bacilos extraños y no separados para facilitar la tarea. También era necesario probar reactivos que condujeron a un menor ruido de fondo. OAA requiere una fuente de complemento porque mejora la opsonización36. Por lo tanto, probamos una variedad de fuentes complementarias, incluyendo conejillo de indias, complemento de conejo humano y bebé. Elegimos el complemento de conejo bebé para nuestro ensayo porque encontramos que no tiene actividades débiles y multi-específicas contra antígenos heterófilos, se utiliza comúnmente en los estudios OPKA14,15,37,y está disponible comercialmente.
Consideramos que la OAA es cuantitativa y altamente reproducible. Lo utilizamos para complementar estudios que involucran ensayos de unión de ligando como ELISAs, que sólo cuantifica los niveles totales de IgG, pero no distingue entre anticuerpos funcionales y no funcionales. OAA se puede utilizar para complementar otros ensayos funcionales (por ejemplo, la actividad bactericida sérica y los ensayos de neutralización de toxinas) para mostrar la diferente funcionalidad de los anticuerpos generados por la vacuna16,38. El desarrollo de OAA ha aumentado nuestro repertorio de estudios de inmunogenicidad para evaluar vacunas y terapias.
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Disclosures
Los autores no tienen una asociación comercial u otra que pueda plantear un conflicto de intereses.
Acknowledgments
J. Chua, D. Chabot y A. Friedlander diseñaron los procedimientos descritos en el manuscrito. J. Chua y T. Putmon-Taylor realizaron los experimentos. D. Chabot realizó análisis de datos. J. Chua escribió el manuscrito.
Los autores agradecen a Kyle J. Fitts por su excelente asistencia técnica.
El trabajo fue apoyado por la agencia de reducción de amenazas de defensa CBM. VAXBT.03.10.RD.015, número de plan 921175.
Opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las de los autores y no necesariamente están respaldadas por el Ejército de los Estados Unidos. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de Defensa, ni la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones implica el respaldo del Gobierno de los Estados Unidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
References
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M.
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144 (1883).
- Tauber, A. I.
- Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Candela, T., Fouet, A.
- Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
- Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
- Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
- Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
- Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
- Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
- Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
- Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
- Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
- List of Tier 1 BSAT. , Available from: www.selectagents.gov/ohp-app1.html (2017).
- Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
- Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
- Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
- Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
- Revised FSAP Policy Statement: Inactivated Bacillus anthracis and Bacillus cereus Biovar anthracis. , Available from: www.selectagents.gov/policystatement_bacillus.html (2017).
- Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, Suppl 1 1-9 (2013).
- Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
- Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
- Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
- Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400 (2019).
- Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250 (1999).
- Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J.
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
- Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
- Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
- Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
- Wolf, J. J. Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , Elsevier. 243-255 (2013).
