Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Opsono-Adherence Assay для оценки функциональных антител в разработке вакцин против bacillus anthracis и других инкапсулированных патогенов

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/60873
Automatic Translation
*1, *1, 1,3, 2
1Bacteriology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 2Headquarters Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 3Bioqual
* These authors contributed equally

Summary

Анализ опсоно-приверженности является альтернативным методом анализа опсоно-фагоцитического убийства для оценки опсонических функций антител в разработке вакцины.

Abstract

Анализ опсо-приверженности является функциональным анализом, который перечисляет присоединение бактериальных патогенов к профессиональным фагоцитам. Поскольку присоединение является необходимым для фагоцитоза и убийства, анализ является альтернативным методом опсоно-фагоцитического убийства анализы. Преимуществом анализа opsono-присоединения является возможность использования инактивированных патогенов и линий клеток млекопитающих, что позволяет стандартизировать в ходе нескольких экспериментов. Использование инактивированного патогена в анализе также облегчает работу с биобезопасности уровня 3 инфекционных агентов и других опасных патогенов. В нашей работе, анализ соответствия opsono был использован для оценки функциональной способности антител, от серы животных, иммунизированных вакциной на основе капсулы сибирской язвы, чтобы вызвать присоединение фиксированной Bacillus anthracis к линии клеток макрофаг мыши, RAW 264.7. Автоматизированная микроскопия флуоресценции использовалась для захвата изображений бацилл, придерживающихся макрофагов. Повышенная приверженность коррелирует с наличием анти капсульных антител в сыворотке крови. Не-человеческие приматы, которые продемонстрировали высокие концентрации антител в сыворотке крови против капсулы, были защищены от борьбы с сибирской язвой. Таким образом, анализ соответствия опсоно может быть использован для выяснения биологических функций антигенных специфических антител в сыворотке, для оценки эффективности вакцины кандидатов и других терапевтических средств, а также служить в качестве возможного корреляции иммунитета.

Introduction

Признание, приверженность, интернализации и деградации патогена являются неотъемлемойчастью фагоцитоза 1, заметный путь в принимающей врожденный иммунный ответ впервые описан Илья Метчников в 18832,3. Фагоцитные лейкоциты, как и другие клетки иммунной системы, являются весьма дискриминационными в выборе целей; они способны различать "инфекционное не-я" и "неинфекционные самоуправления" через патогенные связанные молекулярные модели их репертуар рецепторов распознавания образов (PRRs)4,5. Распознавание хозяина патогена может также происходить с связыванием опсонинов хозяина, таких как дополнение и антитела6. Этот процесс, называемый опсонизацией, покрывает патоген этими молекулами, усиливая интернализации при связывании с опсоническими рецепторами (например, дополнять и Fc рецепторы) на фагоцитных клетках6. Для того, чтобы возбудитель придерживался фагоцита, необходимо коллективное связывание нескольких рецепторов с их лигандами cognate. Только тогда присоединение может вызвать и поддерживать сигнальные каскады внутри ячейки-хозяина, чтобы инициировать интернализацию6.

В связи с важностью фагоцитоза в очистке патогенных микроорганизмов и профилактике инфекции, внеклеточные патогены разработали множество способов подорвать этот процесс, чтобы продлить их выживание. Одной из стратегий важности является производство анионовой полимерной (например, полисахаридной или полиаминовой кислоты) капсулы, которая является антифагоцитной в силу своего заряда, плохо иммуногенной, и защищает молекулы на бактериальной оболочке от PRRs6,7. Патогенные микроорганизмы, такие как Cryptococcus neoformans и Streptococcus pneumoniae имеют капсулы, состоящие из сахаридных полимеров, в то время как стафилококк эпидермидис и некоторые виды Bacillus производят поли-ɣ-глутамовую кислоту (PGGA)7,8. Тем не менее, другие патогены производят капсулы, которые напоминают неинфекционные самоуправления. Например, стрептококк пиогены и патогенный штамм B. cereus имеют капсулу гиалуроновой кислоты, которая является не только антифагоцитной, но которые также не могут быть признаны иностраннымииммунной системой 9,10.

Спряжение капсулы для носителя белков преобразует их из бедных, T-независимых антигенов в высоко иммуногенных Т-зависимых антигенов, которые могут вызвать высокую сыворотку анти-капсулы антитела титеры11,12. Эта стратегия используется для лицензированных вакцин против S. pneumoniae, Haemophilus influenzae, и Neisseria meningitides11. Опсонные действия анти-капсулы антител, как правило, были оценены опсоно-фагоцитических анализов убийства (OPKA)13,14,15,16. Эти анализы тест ли функциональные антитела могут вызвать фагоцитоз и убийство14. Тем не менее, использование OPKA с инфекционными патогенами, такими как Tier 1 Биологические выберите агентов и токсинов (BSAT), в том числе B. anthracis17, является опасным и представляет угрозу безопасности; эти анализы требуют тщательного обращения с выбранным агентом. Обработка выбора агента может быть выполнена только в лабораториях ограниченного уровня биобезопасности 3 (BSL-3); работа в этих областях требует длительных оперативных процедур в связи с многочисленными мерами предосторожности и безопасности, которые необходимо соблюдать. Лаборатории BSL-3 также, как правило, не оснащены специализированным оборудованием, используемым для работы OPKA, таким как микроскопы и цитометры. Таким образом, мы разработали альтернативный анализ, основанный на использовании инактивированныхбактерий 18,19. Мы называем это анализом о приверженности опсоно (ОАА), который не зависит от интернализации и убийства в результате анализа; вместо этого, соблюдение опсонизированных инактивированных патогенов используется в качестве индекса фагоцитоза. Механистически, OAA является подходящей заменой, потому что соблюдение происходит априори и тесно переплетается с интернализации и внутриклеточного убийства. С точки зрения биобезопасности, ОАА является предпочтительным, поскольку она требует минимальной обработки инфекционного агента, экспериментально короче, чем OPKA, и может быть выполнена в лабораториях BSL-2 после того, как запас инактивированного патогена был произведен и передан.

Мы демонстрируем использование OAA для изучения опсонной функции анти-капсулы антител, найденных в сыворотке не-человеческих приматов (NHPs) вакцинированы с капсулой конъюгировать (т.е. PGGA от B. anthracis спрягается с внешней мембраны белкового комплекса (OMPC) neisseria менингитаNo 20. Сыворотка opsonized бациллы были инкубированы с приверженцем мыши макрофаг клеточной линии, RAW 264.7. После фиксации, монослой клеток и адепт бациллы были изображены с помощью микроскопии флуоресценции. Бактериальное присоединение увеличилось, когда бациллы были инкубированы сывороткой из NHPs вакцинированы капсулы конъюгировать по сравнению с контролемсыворотки 20. Соблюдение коррелирует с выживанием сибирской язвывызов 20,21. Таким образом, использование ОАА характеризовало функцию антител против капсулы и значительно облегчило тестирование нашего кандидата вакцины.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

В соответствии с Законом о защите животных, политикой Службы общественного здравоохранения и другими федеральными законами и положениями, касающимися животных и экспериментов с участием животных, исследования, описанные здесь, проводились в соответствии с утвержденным Комитетом по уходу за животными и использованию институциональных животных. Объект, где проводилось это исследование, аккредитован Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторного ухода за животными, Международный и придерживается принципов, заявленных в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных, Национальный исследовательский совет, 201124.

1. Культура и техническое обслуживание клеточной линии, RAW 264.7

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры должны быть выполнены с асептическими методами.

  1. Нагрейте сыворотку крупного рогатого скота плода (FBS) в водяной бане с температурой 56 градусов по Цельсию в течение 30 минут для инактивации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время инактивации 30 мин начинается, когда FBS достигает 56 градусов по Цельсию. Чтобы следить за температурой, нагревать аналогичный объем воды в стакане в той же водяной бане. Как только вода достигнет 56 градусов по Цельсию, начните отсчет 30 минут для FBS. Кроме того, FBS, который был тепло-инактивированных также коммерчески доступны.
  2. Подготовка среды для RAW 264.7 клеток путем объединения 90% DMEM с высоким содержанием глюкозы и 10% тепла инактивированных FBS (v/v). Добавьте L-глутамин в окончательную концентрацию 6 мМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: DMEM с высоким содержанием глюкозы сформулирован с 4 мМ Л-глутамин. Дополнение L-глутамина к 6 мМ способствует последовательному росту клеток. Для предотвращения загрязнения можно добавить 100 U/mL пенициллин и 100 мкг/мл стрептомицина. Другая распространенная линия клеток мурина, J774A.1, также может быть использована и выращивается в аналогичных условиях.
  3. Оттепель замороженный флакон клеток в 37 градусов по Цельсию водяной бане и удалить из ванны, как только она тает. Добавить содержимое асептически до 5 мл полной среды в конической трубке. Инвертировать коническую трубку дважды и спина на 300 х г в течение 5 мин гранулы клеток.
  4. Аспират среды с помощью стерильной трубы Пастера прилагается к вакууму для удаления замораживания агента. Resuspend клеточных гранул в 5 мл свежей среды.
  5. Передача суспензии в ткань культуры обработанной колбы или блюда. Добавьте достаточно среды, чтобы полностью покрыть дно колбы и вихрем равномерно распределить клетки. Укажите номер прохода, начиная с "1".
  6. Инкубационые клетки при 37 градусах Цельсия при наличии 5% CO2 и влажности до 95% до 100% слияния. Проверяйте клетки ежедневно под микроскопом, начиная со второго дня инкубации. Не позволяйте клеткам достичь 100% слияния, так как это приведет к тому, что клетки будут подниматься и умирать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для достижения слияния зависит от того, сколько живых клеток были поцарились и рост области колбы. Таким образом, разумно проверять клетки ежедневно.
  7. Субкультурные клетки, выскаблив и разбавляя клеточный запас в свежей среде, позволяя по крайней мере два дня роста между соскобами. Увеличьте число проходов на 1 с каждой субкультурой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прохождение и немедленная выскабливание на следующий день приведет к более быстрой потере общего присоединения клеток с течением времени. RAW 264.7 ячейки должны использоваться только до примерно прохода 15.
  8. Чтобы пластины RAW 264,7 клеток для анализа OAA, заменить свежей среде и использовать сотовый скребок, чтобы аккуратно соскребать клетки с колбы. Pipette вверх и вниз, чтобы разбить ячейки сгустки для облегчения подсчета клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Традиционный метод для субквалирования RAW 264.7 путем соскабливания. По нашему опыту, использование трипсина приводит к RAW 264.7 клетки теряют приверженность с течением времени быстрее, чем при соскабливании.
  9. Чтобы подсчитать клетки, разбавить равные объемы клеток и попробовать синий раствор. Загрузите 10 мкл на гемоцитометр. Наблюдайте и подсчитывайте количество живых клеток, исключающие краситель с помощью перевернутого соединения микроскопа с объективом 10x.
  10. Плита 1.4 x 104 жизнеспособных клеток на колодец в 96 хорошо 0,15 мкм толщиной стекла плоская нижняя пластина (плита #1). Разрешить клетки расти в течение 3 дней. Заменить провел средний один день перед выполнением OAA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После 3 дней инкубации, количество клеток должно быть примерно 5 х 104/ хорошо.

2. Бактериальная культура и подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальный вид, используемый в этом протоколе, является инкапсулированным вирулентным штаммом B. anthracis Ames. Все манипуляции с этим видом требуют соответствующей биобезопасности и допусков и должны выполняться в кабинете биологической безопасности II или III класса, расположенном в лаборатории BSL-3. Следуйте институциональным операционным процедурам для работы BSL-3 и для использования средства индивидуальной защиты при обращении с бактериями.

  1. Приготовьте бульон Brain Heart Infusion (BHI), растворив 37 г порошка BHI в 1 л воды и автоклав при 121 КК в течение 15 мин. Храните бульон при температуре окружающей среды.
  2. Приготовьте 8% раствор бикарбоната натрия в воде и стерилизовать с помощью фильтра 0,20 мкм шприца. Храните раствор при 4 градусов по Цельсию и используйте в течение 1 дня.
  3. Смешайте 8 г питательного бульона, 3 г дрожжевого экстракта и 15 г агара в 1 л воды для приготовления тарелок NBY agar. Автоклав при 121 градусе по Цельсию в течение 15 мин. Налейте в чашки Петри и дайте затвердеть. Храните тарелки при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: NBY агар пластины могут быть сделаны с или без бикарбоната натрия. Добавление бикарбоната натрия в бульон и агарные пластины вызывает рост слизистых колоний, состоящих из инкапсулированных бацилл. Окончательная концентрация бикарбоната натрия как в жидком, так и в твердом виде составляет 0,8%.
  4. Подготовка культурного бульона для B. anthracis путем смешивания 50% автоклавного бульона BHI, 40% FBS и 10% раствора бикарбоната натрия (v/v).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот бульон разработан для производства коротких цепей инкапсулированных бацилл.
  5. Подготовьте мастер тарелку B. anthracis, полоски его для изоляции на NBY агар пластины из споры фонда за день до культивирования в бульоне. Инкубационный при 37 градусов по Цельсию.
  6. Прививка 30 мл культурного бульона в вентилируемой колбе 250 мл с несколькими колониями B. anthracis.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения максимально инкапсулированных бацилл необходимо определенное соотношение объема к поверхности бульона, как указано здесь.
  7. Встряхните культуру бульона при 125 об/мин, 37 градусов по Цельсию с 20% CO2 и влажностью 18-24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выращивание B. anthracis при температурах, более 37 градусов по Цельсию, может препятствовать производству капсул.
  8. Используйте отрицательное окрашивание чернилами Индии для обеспечения достаточной инкапсуляции и что бациллы находятся в коротких цепях (1-5 бацилл/цепь) до фиксации (см. раздел 3).
  9. Для определения единиц формирования колонии (CFU) последовательно разбавляют 100 МКЛ культуры 1:10 в растворе фосфатного буферного солевого раствора (PBS) и разбавлении культуры пластин на агарных пластинах крови овец. Инкубационный для 12-18 ч при 37 градусов по Цельсию. Подсчитайте CFUs и определите количество бактерий на мл культуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчет также может быть выполнен с помощью гемоцитометра под микроскопом, как только бактерии были исправлены. Тем не менее, это не рекомендуется, потому что бациллы трудно увидеть при низком увеличении.
  10. Добавьте 16% параформальдегид (PF) к всему объему бактериальной культуры при конечной концентрации 4% ПФ, чтобы исправить бациллы. Медленно агитировать на шейкер при температуре окружающей среды в течение 7 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Семь дней инкубации в 4% PF основан на USAMRIID институциональной стандартной операционной процедуры для фиксации вегетативных бацилл.
  11. Чтобы удалить фиксатор и тест на бесплодие, трижды мыть 4 мл (10% объема) фиксированной бактериальной суспензии в 50 мл конической трубки центрифугации при ≥3000 х г в течение 45 мин и с помощью 30 мл / мыть с PBS. Храните оставшуюся выборку в 4% PF при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После гранулирования, бактериальные гранулы пушистые из-за присутствия капсулы. Позаботьтесь, чтобы не беспокоить гранулы во время стирки. Необходимо удалить все фиксаторы, чтобы это не мешало тестированию жизнеспособности. При необходимости увеличьте количество моет.
  12. Для тестирования жизнеспособности прививка 40 мл среды роста бактерий (например, бульон BHI) с 4 мл промытой суспензии (≤ 10% от объема бульона) и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 7 дней. Проверьте оптическую плотность на 600 нм до и после 7 дней, чтобы измерить мутность.
  13. После 7 дней инкубации в бульоне культуры, пластины ≥100 мкл бульона на агар пластины и инкубировать в течение еще 7 дней. Если не наблюдается увеличения мутности и роста на пластинах, то оригинальная культура считается стерильной и может быть передана в лабораторию BSL-2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Федеральная программа специальныхагентов 22 предписывает, что инактивированные B. anthracis могут быть переданы только из лабораторий BSL-3 после демонстрации полной стерильности образца. Тестирование жизнеспособности инактивированного B. anthracis состоит из культивирования 10% образца в бульоне в течение 7 дней с последующим культивированием на твердой среде в течение еще 7дней 22,23. Следуйте институциональным руководящим принципам, чтобы получить разрешение на передачу после того, как будет установлена бесплодие.

3. Отрицательное окрашивание и световая микроскопия для наблюдения за инкапсуляции и бацилл цепи

  1. Смешайте бактериальную суспензию 5 МКЛ с 2 чернилами Индии на слайде микроскопа. Поместите 1 или 1,5 мкм толщиной крышка стекла на верхней части подвески, не создавая пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лак для ногтей может быть использован для уплотнения крышки стекла на слайде.
  2. Наблюдайте бактериальную подвеску с помощью объектива 40x-100x oil objective на световом микроскопе. Убедитесь, что бациллы инкапсулированы, наблюдая зону зазора (капсула исключает чернила Индии), окружающие каждую бактерию, и что цепи бацилл короткие.

4. FitC-маркировка бактерий

  1. Растворите фторцеин изотиоцианат (ФИТК) в диметилфоксиде при концентрации 2 мг/мл.
  2. Измерьте объем инактивированного бактериального запаса.
  3. Вымойте запас 3x в PBS, чтобы удалить фиксатор.
  4. Добавьте раствор FITC при конечной концентрации 75 мкг/мл. Медленно агитировать смесь для 18-24 ч при 4 градусов по Цельсию.
  5. Трижды мыть бактерии путем гранулирования на ≥ х г, 45 мин и с помощью 30 мл PBS / мыть, чтобы удалить избыток FITC. Убедитесь, что пушистые гранулы не нарушается во время стирки. Resuspend бациллы в PBS в том же объеме запуска.
  6. Aliquot и хранить бациллы в микротрубочки при -20 градусов по Цельсию до использования. Не замораживайте / оттепели бациллы несколько раз, как бациллы могут потерять капсулу.

5. Бактериальная опсонизация

  1. Тепло инактивировать небольшой объем испытательной сыворотки (от NHPs) при температуре 56 градусов по Цельсию в течение 30 минут в тепловом блоке.
  2. Оттепель и мыть FITC помечены бактерии с PBS 2x путем гранулирования на 15000 х г в течение 3-5 мин. Resuspend в PBS в том же объеме старта.
  3. В 96 хорошо круглой нижней пластине (пластина #2), последовательно разбавляют тестовую серу в клеточной среде. В другой 96 хорошо круглой нижней пластины (пластина #3), добавить 10 йл разбавленного теста сера в каждой хорошо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В каждой тарелке, PBS и нормальная сера обезьяны были включены вместо разбавленной сыворотки испытания как отрицательные управления. Мы также выбрали одну тестовую сыворотку в качестве положительного контроля для создания стандартной кривой для нормализации всех анализов, данных в разные дни. Положительный контрольный тест сыворотки был произвольно выбран, потому что он был обильным.
  4. Чтобы пластины #3, добавить 10 йл свежепостиженный ребенок кролика дополнение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После восстановления, отказаться от оставшихся ребенка кролика дополнения; не замораживать и оттаивать.
  5. Чтобы #3, добавьте соответствующий объем bacilli с маркировкой FITC для множественности инфекции 1:20. Например, добавьте объем, содержащий 5 x 104 x 20 бацилл для 5 х 104 клеток. Доверху каждый колодец в #3 с соответствующим объемом клеточной среды до общей сложности 105 МКЛ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: #1, которая содержит клетки, получает 100 МКЛ опсонизированных бактерий с оставшимися 5 йЛ в качестве объема пустоты. Мы тестировали каждое разбавление тестовой сыворотки в дубликате.
  6. Инкубационная пластина #3 при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин при наличии 5% CO2 с влажностью, чтобы опсонизировать бациллы.

6. Соблюдение анализа и флуоресцентной маркировки клеток млекопитающих

  1. Поддерживайте все реагенты при 37 градусах Цельсия перед использованием.
  2. Поместите пластину #1, которая содержит клетки-адепты, на тепловой блок 37 градусов по Цельсию.
  3. Используйте многоканальный трубоубирай, чтобы удалить оттяготую среду из скважин и быстро заменить 100 МКЛ опсонизированных бактерий из #3. Убедитесь, что пузырьки не были созданы в скважинах во время трубопроводов. Инкубационая пластина #1 при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 и влажностью в течение 30 мин для присоединения.
  4. Вымойте каждый хорошо 5x с 150 йЛ PBS на вершине теплового блока 37 градусов по Цельсию, чтобы удалить незакрепленные бациллы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо позаботиться о том, чтобы клетки не были случайно рассеяны во время стирки.
  5. Разбавить 16% ПФ с PBS 1:4, чтобы сделать 4% PF. Исправить клетки с 4% ПФ на 1 ч, добавив 150 йл к каждой хорошо. Вымойте клетки 2x с PBS.
  6. Смешайте 2 Л HCS (скрининг высокого содержания) Оранжевый cell Stain в 10 мл PBS. Добавьте 150 МКЛ этого раствора окрашивания в фиксированные клетки и инкубировать в течение 30 минут при температуре окружающей среды.
  7. Вымойте скважины 2x с PBS.
  8. Хранить при 4 градусов по Цельсию до микроскопии.

7. Микроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, высокая пропускная способность автоматизированного флуоресцентного микроскопа облегчит визуализацию для OAA. Если автоматизированная система недоступна, флуоресцентные изображения адепта бациллы могут быть принятывручную 21. В этомисследовании 20, адепт бациллы и клетки монослой были изображены с помощью системы лазерного сканирования зейс 700 с помощью специализированного оборудования; наша система состояла из перевернутого микроскопа zeiss Axio Observer No1, оснащенного автоматизированной сценой, модулем Definite Focus, целью 40 x NA 0.6, камерой Axio Cam HRc и программным обеспечением Zen 2012 (Blue Edition). Полученные изображения являются широко полевыми изображениями, а не конфокальные изображения. Следующий протокол предназначен в качестве основной установки микроскопа, который применим к различным автоматизированным системам микроскопии.

  1. Инкубационая пластина #1 температуре в течение 30 мин. Включите микроскоп и связанное с ним оборудование.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Акклиматизация при температуре окружающей среды предотвращает образование конденсата на стеклянной пластине во время визуализации. Кроме того, он предотвращает дефокусирование из-за изменения температуры.
  2. Поместите пластину на сцену и сосредоточьтесь на клетках, используя яркое поле или фазовый контраст.
  3. Выберите формат 96 хорошо в качестве параметра пластины. Выберите настройки канала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пик возбуждения FITC и длины волны выбросов 495/519 нм; HCS оранжевые пятна клеток 556 и 572 нм. Другие фторфоры могут быть использованы в зависимости от фильтров, которые доступны на микроскопе.
  4. Выберите настройки в режим Tile. Укажите количество изображений, которые будут получены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Функция плитки позволяет захватывать несколько мест в образце хорошо и может быть установлена для получения изображения в плитке или случайном формате. Мы изумили 10 случайных областей на колодец.
  5. Измените режим приобретения на "черный и белый" или "монохромный" и binning ≥ 2x2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установка binning от 1x1 до 2x2 или 4x4 увеличит скорость микроскопии, но также приведет к более низкому разрешению изображения. Для OAA, достаточно использовать эти настройки, как анализ перечисляет как макрофаги и адепт бактерий.
  6. Включите автофокусировку или фокусировку модуля. Укажите, как часто выполняется функция автофокусирования. Включите функцию стека, если таковые имеются. Укажите количество стеков, которые будут захватывать толщину монослойной клетки и адепта бациллы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество выбранных стеков увеличит время микроскопии, но обеспечит изображение с правильным фокусом, сделанным в каждом стеке.
  7. Назначьте папку файлов для сохранения изображений. Запустите автоматизированную программу визуализации.

8. Сбор и анализ данных

  1. Подсчитайте количество адептов бацилл и клеток млекопитающих на изображение. Считайте каждую цепочку бацилл одной бактерией.
  2. Участок бациллы / клетки положительного контроля тест сыворотки и titer (например, 1:10 разбавления составляет 10 единиц titer) для создания стандартной кривой в соответствующей программе статистики.
  3. Проанализируйте сыворотку положительного контроля с помощью установки нелинейной кривой регрессии. Затем проанализируйте оставшиеся образцы, используя стандартную кривую сыворотки положительного контрольного теста для определения соответствующих титеров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это, как правило, наиболее точным, чтобы выбрать образец разбавления ближе к середине стандартной кривой при определении титеров.
  4. Рассчитайте геометрическое среднее количество образцов из каждой группы вакцин. Рассчитайте P- значения преобразованных титеров журнала по наименее существенной разнице анализа ANOVA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом разделе показаны репрезентативные микрографы, собранные в ходе эксперимента OAA, а также результаты, показывающие, что ОАА может быть использована для изучения биологической функции антител. Здесь анализ был успешно использован для оценки эффективности вакцины против сибирской язвы кандидата. Очень важно проверить состояние инкапсуляции на бациллы, как практически нет инкапсуляции заставляет их придерживаться принимающих клеток, производя высокий фон. Рисунок 1 является изображение B. anthracis Эймс отрицательно окрашенных чернилами Индии для изучения инкапсуляции. OAA требует, чтобы несколько смежных полей зрения были освещены, и если используется конфоканная микроскопия, несколько стеков или секций. Таким образом, необходимо проверить, что бациллы не слишком тусклый, ни фото-отбеливатели слишком быстро. Рисунок 2 является изображением бациллы помечены FITC. На рисунке 3 показаны максимальные проекционные изображения B. anthracis Ames, прикрепленные к монослойным ячейкам. Это репрезентативные поля зрения, которые были подсчитаны и забиты для OAA. Увеличение вложения бацилл инкубируется с PGGA-OMPC антисемейка связано с наличием анти-капсулы антител, которые оссонировали бациллы. На рисунке 4 показано, что сыворотки титеров NHPs вакцинированы с 10 и 50 мкг PGGA-OMPC значительно выше, чем титеры для OMPC и PGGA в одиночку.

Figure 1
Рисунок 1. Изображение чернил Индии фиксированной B. anthracis Эймс. Обратите внимание на зону зазора, окружающую бациллы из-за наличия капсулы. Бар 10 мкм. Снимок был сделан на автоматизированной системе микроскопии EVOS FL с объективом 100 х 1,4 численной диафрагмы (NA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2. Изображения FITC помечены фиксированной B. anthracis Эймс. (слева) Контрастное изображение дифференциальных помех; флуоресцентное изображение псевдо-окрашено в зеленый (средний); объединены (справа). Бар 10 мкм. Конфокальные изображения были сделаны на 700 LSM confocal Microscopy с 40 х 1,3 NA масляной объектив. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3. Флуоресцентные изображения B. anthracis Ames придерживались RAW 264.7 клеточных монослой. Бациллы были опсонизированы с тестовой сыворотки от NHPs вакцинированы и повышеныс( A ) 10 мкг PGGA-OMPC, (B) 50 мкг PGGA-OMPC, (C) 50 мкг PGGA в одиночку, или (D) OMPC в одиночку. Зеленый цвет - B. anthracis Ames, красный - RAW 264,7 ячейки. Бар 20 мкм. Широкие полевые снимки были сделаны на микроскопе zeiss Axio Observer No1 с объективом 40 x 0,6 и камерой Axio Cam HRc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4. Opsono-присоединения титеры NHPs вакцинированы с 10 μ гPGGA-OMPC, 50 мкг PGGA-OMPC, 50 μ г PGGA в одиночку, или OMPC в одиночку. Геометрические средства 5 животных на группу на графике. Бары ошибок указывают на SEM.p ≤ 0,001 по сравнению только с PGGA. Значения p были рассчитаны с помощью ANOVA с помощью теста LSD posthoc. Данные были первоначально опубликованы в Chabot, и др., 201620. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Капсула на основе вакцин было показано, что эффективно против многочисленных бактериальных патогенов, и многие из них лицензированы дляиспользования в организме человека 25,26,27. Эти вакцины работают путем генерации антител, направленных на капсулу, и многие из этих исследований используютOPKA,чтобы показать опсоно-фагоцитныефункции антител 13,14,16,28,29. Из-за проблем с биобезопасностью и простоты работы, мы разработали OAA для оценки антител от животных, вакцинированных конъюгирует капсулу B. anthracis. Наличие капсулы на B. anthracis предотвращает присоединение и фагоцитоз30, но оссонизация бацилл с сывороткой от вакцинированных животных вызывает привязанность к макрофагам20,21.

Для ОАА деятельность по присоединению, а не интернализация и убийства, используется для количественной оценки опсонной деятельности. Это предоставило ОАА ряд преимуществ. Мы смогли использовать параформальдегид убитый, флуоресцентно помечены инкапсулированные бациллы вместо живых организмов. Изменения в поверхности бактерий в результате фиксации альдегида и флуоресцентной маркировки не изменили общую приверженность бактерий макрофагам; фиксированные и помеченные бациллы были не более приверженцами, чем живые бациллы (данные не показаны). Степень инкапсуляции может варьироваться от культуры к культуре и влиять на общую приверженность, несмотря на аналогичные условия роста. Таким образом, использование одного инактивированного бактериального запаса позволяет стандартизировать эксперименты, выполняемые в разные дни и в различных наборах экспериментов. Это было ценно для сравнения сыворотки из 20 NHPs, используемых в этой работе и сера, которые будут созданы в наших предстоящих исследованиях. Наконец, большинство макрофагов, в том числе RAW 264,7 клеток, чувствительны к сибирской язвы смертельный токсин, вырабатываемыйживой патоген 31, что делает использование живых бацилл по своей сути проблематично.

Использование ячеек RAW 264.7 также способствовало стандартизации. Сначала мы использовали широко используемую линию клеток в клетках OPKA, HL-60. Тем не менее, мы обнаружили трудности в дифференциации их гранулоцитов с диметил-формамид, каксообщили другие 28,32. RAW 264.7 клетки имеют то преимущество, что они не должны быть химически дифференцированы и являются адептами и, следовательно, более подменяемыми для микроскопии на основе OAA. Эта клеточная линия была использована в многочисленных исследованиях фагоцитоза свнутриклеточными патогенами 33,34, а также B. anthracis31. Использование RAW 264.7 клеток, которые являются производными от мыши, также выгодно, потому что мыши Fc рецепторы беспорядочны в их связывающей специфичности для IgG, полученных из другихвидов 35. Это позволило нам оценить анти-капсулы антитела от NHPs с линией клеток мурина.

Сибирская язва, хотя и редко, является эндемическим в некоторых регионах мира и США. Одна из проблем заключается в том, что FBS используется, источников из США, уже может содержать анти-капсулы антител в результате животного подвергаются B. anthracis споры или другие PGGA производства микробов в почве. Для решения этой проблемы, FBS много мы использовали был предварительно протестирован. Мы обнаружили, что добавление тепла инактивированных FBS сделал увеличение приверженности по сравнению с DMEM только (данные не показаны). Тем не менее, это не увеличить соблюдение по сравнению с теплом инактивированных нормальных сера от морских свинок, обезьян, мышей или человека (данные не показаны). Таким образом, FBS много мы использовали не содержат анти-капсулы антител в результате воздействия. Кроме того, он также не будет содержать анти-капсулы антител в результате животных, вакцинированных с unencapsulated B. anthracis Sterne, штамм, который не хватает pXO2 плазмид, необходимых для производства капсулы. Испытанный лот FBS был использован для всех последующих OAA.

Ограничением методики является задача подсчета бацилл и клеток лабораторным персоналом, что заняло огромное количество времени и усилий. Это может быть исправлено с помощью программного обеспечения, которое имеет этот тип анализа; это программное обеспечение не было доступно для нас в то время. Однако, поскольку ручной подсчет был необходим, важным шагом было удаление или смывание посторонних и непривязанных бацилл для облегчения задачи. Необходимо было также протестировать реагенты, которые приводили к снижению фонового шума. OAA требует источника дополнения, поскольку он повышает opsonization36. Таким образом, мы протестировали различные источники дополнения, включая морских свинок, человека и ребенка кролика дополнения. Мы выбрали дополнение кролика ребенка для нашего анализа, потому что мы обнаружили, что он не имеет слабых, многоспецифических мероприятий против гетерофильных антигенов, он широко используется в исследованиях OPKA14,15,37, и он легко доступен на коммерческой основе.

Мы считаем, что ОАА является количественной и воспроизводимой. Мы используем его в дополнение к исследованиям, связанным с лигандом обязательных анализов, таких как ELISAs, который только количественно общего уровня IgG, но не проводит различия между функциональными и нефункциональными антителами. OAA может быть использован в дополнение к другим функциональным анализам (например, бактерицидная активность сыворотки и анализы нейтрализации токсинов), чтобы показать различные функциональные возможности вакцин, генерируемыхантителами 16,38. Развитие ОАА увеличило наш репертуар исследований иммуногенности для оценки вакцин и терапевтических средств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют коммерческой или иной ассоциации, которая могла бы создать конфликт интересов.

Acknowledgments

Д. Чуа, Д. Чабот и А. Фридландер разработали процедуры, описанные в рукописи. Эксперименты проводили Дж.Чуа и Т. Путмон-Тейлор. Д. Чабот провел анализ данных. Рукопись написалА Ч. Чуа.

Авторы благодарят Кайл j. Fitts за отличную техническую помощь.

Работа была поддержана агентством по уменьшению оборонной угрозы грантом CBM. VAXBT.03.10.RD.015, план No 921175.

Мнения, толкования, выводы и рекомендации являются мнениями авторов и не обязательно одобрены армией США. Содержание этой публикации не обязательно отражает мнения или политику министерства обороны, равно как и упоминание торговых наименований, коммерческих продуктов или организаций не подразумевает одобрения со стороны правительства США.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) Corning, Corning, NY 431222
10 mL syringe (Luer-Lok tip) BD, Franklin Lakes, NJ 302995
15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA P96-1-N
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Science, Hatfield, PA 15710
75 cm sq. tissue culture treated flask Corning, Corning, NY 430641
Agar (powder) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A1296
Baby Rabbit Complement Cedarlane Labs, Burlington, NC CL3441
Bacto Yeast Extract BD, Sparks, MD 288620
BBL Brain Heart Infusion (BHI) BD, Sparks, MD 211059
Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates Remel, Lenexa, KS R01198
Cell scraper Sarstedt, Newton, NC 83.183
Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) Corning, Corning, NY 3596
Cover glass Electron Microscopy Science, Hatfield, PA 72200-10
Difco Nutrient Broth BD, Sparks, MD 234000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 11965-092 contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red
EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA AMAFD1000
Fetal Bovine Serum Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT SH30071.03 not gamma irradiated, not heat inactivated
Fluorescein isothiocyanate Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA F143
HCS Cell Mask Orange Cell Stain Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA H32713
hemocytometer (Improved Neubauer) Hausser Scientific, Horsham, PA 3900
India Ink solution BD, Sparks, MD 261194
L- glutamine (200 mM) Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA 25030081 supplement medium with additional 2mM L-glutamine
Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) Nikon Instruments, Melville, NY TE2000
PBS without Calcium or Magnesium Lonza, Walkersville, MD 17-516F
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT SV30010
petri dishes (100 x 15 mm) Falcon, Corning, Durham, NC 351029 for agar plates
RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) ATCC, Manassas, VA ATCC TIB-71
Slides VWR, Radnor, PA 16004-422
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S5761
Trypan Blue Solution (0.4%) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T8154
Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY 4109001865956000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
  2. Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144 (1883).
  3. Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
  4. Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
  5. Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
  6. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).
  7. Candela, T., Fouet, A. Poly-gamma-glutamate in bacteria. Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).
  8. Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
  9. Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
  10. Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
  11. Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
  12. Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
  13. Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
  14. Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
  15. Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
  16. Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
  17. List of Tier 1 BSAT. , Available from: www.selectagents.gov/ohp-app1.html (2017).
  18. Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
  19. Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
  20. Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
  21. Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
  22. Revised FSAP Policy Statement: Inactivated Bacillus anthracis and Bacillus cereus Biovar anthracis. , Available from: www.selectagents.gov/policystatement_bacillus.html (2017).
  23. Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
  24. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
  25. Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, Suppl 1 1-9 (2013).
  26. Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
  27. Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
  28. Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
  29. Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400 (2019).
  30. Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250 (1999).
  31. Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. On the role of macrophages in anthrax. Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).
  32. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
  33. Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
  34. Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
  35. Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
  36. Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
  37. Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
  38. Wolf, J. J. Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , Elsevier. 243-255 (2013).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 159 Опсонизация присоединение антитела сыворотка макрофаги капсула разработка вакцины врожденный иммунитет не-человеческие приматы RAW 264.7 клетки автоматизированная флуоресценция микроскопии коррелят иммунитета
Opsono-Adherence Assay для оценки функциональных антител в разработке вакцин против <em>bacillus anthracis</em> и других инкапсулированных патогенов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chua, J., Chabot, D. J.,… More

Chua, J., Chabot, D. J., Putmon-Taylor, T., Friedlander, A. M. Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens. J. Vis. Exp. (159), e60873, doi:10.3791/60873 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter