Summary
Den opsono-tilslutning assay er en alternativ metode til opsono-fagocytiske drab analyse for at evaluere opsoniske funktioner antistoffer i vaccine udvikling.
Abstract
Den opsono-vedhængende analyse er en funktionel analyse, der opregner fastgørelse af bakterielle patogener til professionelle fagocytter. Fordi tilslutning er nødvendig for fagocytose og drab, analysen er en alternativ metode til opsono-fagocytiske drab assays. En fordel ved opsono-overholdelsesanalysen er muligheden for at bruge inaktiverede patogener og pattedyrscellelinjer, som muliggør standardisering på tværs af flere eksperimenter. Brugen af et inaktiveret patogen i analysen letter også arbejdet med biosikkerhedsniveau 3 infektiøse agenser og andre virulente patogener. I vores arbejde blev opsono-adherence assay brugt til at vurdere antistoffernes funktionelle evne, fra sera af dyr immuniseret med en miltbrand kapselbaseret vaccine, for at fremkalde overholdelse af fast Bacillus anthracis til en mus makrofagcellelinje, RAW 264.7. Automatiseret fluorescensmikroskopi blev brugt til at tage billeder af bacilli, der klæber til makrofager. Øget tilslutning blev korreleret med tilstedeværelsen af anti-kapsel antistoffer i serumet. Ikke-menneskelige primater, der udviste høje serum anti-kapsel antistof koncentrationer blev beskyttet mod miltbrand udfordring. Således kan opsono-vedhængende assay bruges til at belyse de biologiske funktioner antigen specifikke antistoffer i sera, til at evaluere effekten af vaccine kandidater og andre terapeutiske, og til at tjene som en mulig korrelere af immunitet.
Introduction
Anerkendelse, tilslutning, internalisering og nedbrydning af et patogen er integreret i phagocytose1, en fremtrædende vej i værten medfødt immunrespons, der først blev beskrevet af Ilya Metchnikoff i 18832,3. Phagocytiske leukocytter samt andre celler i immunsystemet er meget diskriminerende i deres valg af mål; de er i stand til at skelne mellem "infektiøs ikke-selv" og "ikke-infektiøst selv" gennem patogenrelaterede molekylære mønstre ved deres repertoire af mønstergenkendelsesreceptorer (PRR)4,5. Værtsgenkendelse af et patogen kan også forekomme ved binding af værtsoptisoniner, såsom komplement og antistoffer6. Denne proces, kaldet opsonisering, frakker patogenet med disse molekyler, hvilket forbedrer internaliseringen ved binding til opsoniske receptorer (f.eks. komplement og Fc-receptorer) på phagocytiske celler6. For at et patogen skal overholde en phagocyt, er kollektiv binding af flere receptorer med deres cognate ligands nødvendig. Først da kan tilslutning udløse og opretholde signalkaskader inde i værtscellen for at starte internalisering6.
På grund af betydningen af fagocytose i rydning af patogener og forebyggelse af infektion har ekstracellulære patogener udviklet mange måder at undergrave denne proces for at forlænge deres overlevelse. En strategi af betydning er produktionen af en anionisk polymer (f.eks polysaccharid eller polyaminosyre) kapsel, som er anti-fagocytisk i kraft af sin ladning, er dårligt immunogen, og skjolde molekyler på bakterielle kuvert fra PRR6,7. Patogener som Cryptococcus neoformans og Streptococcus pneumoniae har kapsler bestående af saccharid polymerer, mens Staphylococcus epidermidis og nogle Bacillus arter producerer poly-ɣ-glutamic syre (PGGA)7,8. Men andre patogener producerer kapsler, der ligner det ikke-smitsomme selv. For eksempel har Streptococcus pyogenes og en patogen stamme af B. cereus en hyaluronsyrekapsel, der ikke kun er anti-phagocytisk, men som heller ikke kan genkendes som fremmed af immunsystemet9,10.
Bøjning af kapsel til bæreproteiner omdanner dem fra fattige, T-uafhængige antigener til stærkt immunogene T-afhængige antigener, der kan fremkalde høje serum anti-kapsel antistoftitler11,12. Denne strategi er anvendt til godkendte vacciner mod S. pneumoniae, Hæmofili influenza ,og Neisseria meningitides11. De opsoniske aktiviteter anti-kapsel antistoffer er almindeligvis blevet evalueret af opsono-fagocytiske drab assays (OPKA)13,14,15,16. Disse assays tester, om funktionelle antistoffer kan udløse fagocytose og dræbe14. Anvendelsen af OPKA med infektiøse patogener, såsom biologiske udvalgte agenser i klasse 1 og toksiner (BSAT), herunder B. anthracis17,er imidlertid farlig og udgør en sikkerhedsrisiko. disse analysemetoder kræver omfattende håndtering af en udvalgt agent. Select agent håndtering kan kun ske i begrænset biosikkerhed niveau 3 (BSL-3) laboratorier; Arbejdet på disse områder kræver langvarige driftsprocedurer på grund af de mange sikkerhedsforanstaltninger, der skal følges. BSL-3 laboratorier er typisk heller ikke udstyret med det specialiserede udstyr, der anvendes til OPKA-arbejde, såsom mikroskoper og cytometre. Således har vi udviklet en alternativ analyse baseret på brugen af inaktiverede bakterier18,19. Vi henviser til dette som en opsono-overholdelse assay (OAA), der ikke er afhængig af internalisering og drab assay output; I stedet anvendes overholdelse af opsoniserede inaktiverede patogener som et indeks for fagocytose. Mekanistisk, OAA er en passende erstatning, fordi tilslutning sker a priori og er tæt sammenflettet med internalisering og intracellulære drab. Fra et biosikkerhedsperspektiv foretrækkes OAA, fordi det kræver minimal håndtering af et infektiøst middel, er eksperimentelt af kortere varighed end OPKA og kan udføres i BSL-2-laboratorier, efter at en bestand af det inaktiverede patogen er produceret og overført.
Vi demonstrerer brugen af OAA til at undersøge den opsoniske funktion af antikapselantistoffer, der findes i sera af ikke-menneskelige primater (NHPs), der er vaccineret med en kapselkonjugat [dvs. PGGA fra B. anthracis konjugeret til det ydre membranproteinkompleks (OMPC) af Neisseria meningitides]20. Serum opsoniseret bacilli blev inkuberet med en vedhængende mus makrofag celle linje, RAW 264,7. Efter fiksering blev cellemonomeren og den vedhængende bacilli afbildet af fluorescensmikroskopi. Bakteriel vedhæftning steg, når bacilli blev inkuberet med serum fra NHP'er vaccineret med kapselkonjugat sammenlignet med kontrolserum20. Tilslutning korreleret med overlevelse af miltbrand udfordring20,21. Således karakteriserede brugen af OAA funktionen af anti-kapselantistoffer og lettede i høj grad test af vores vaccinekandidat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I overensstemmelse med Animal Welfare Act, Public Health Service politik, og andre føderale vedtægter og forskrifter vedrørende dyr og forsøg med dyr, den forskning, der er beskrevet her blev udført under en institutionel Animal Care and Use Committee-godkendt protokol. Anlægget, hvor denne forskning blev udført, er akkrediteret af Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International og overholder principperne i vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr, National Research Council, 201124.
1. Kultur og vedligeholdelse af cellelinjen, RAW 264.7
BEMÆRK: Følgende procedurer skal udføres med aseptiske teknikker.
- Der opvarmes føtalt kvægserum (FBS) i et vandbad på 56 °C i 30 minutter for at inaktivere komplementet.
BEMÆRK: Inaktiveringstiden på 30 minutter begynder, når FBS når 56 °C. For at overvåge temperaturen opvarmes en lignende mængde vand i et bægerglas i samme vandbad. Når vandet når 56 °C, skal du starte nedtællingen på 30 minutter for FBS. Alternativt er FBS, der er blevet varmeinaktiveret, også kommercielt tilgængelig. - Forbered medium til RAW 264,7 celler ved at kombinere 90% DMEM med høj glukose og 10% varmeaktiveret FBS (v / v). L-glutamin tilsættes til en endelig koncentration på 6 mM.
BEMÆRK: DMEM med høj glukose er formuleret med 4 mM L-glutamin. At supplere L-glutamin til 6 mM fremmer konsekvent cellevækst. Der kan tilsættes 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin for at undgå kontaminering. En anden almindelig murincellelinje, J774A.1, kan også anvendes og dyrkes under lignende forhold. - Optø et frosset hætteglas med celler i et 37 °C vandbad, og fjern det fra badet, så snart det smelter. Indholdet tilsættes aseptisk til 5 mL komplet medium i et konisk rør. Inverter konisk rør to gange og spin på 300 x g i 5 minutter til pellet celler.
- Aspirat medium ved hjælp af en steril Pasteur pipet fastgjort til et vakuum for at fjerne frysemiddel. Resuspend celle pellet i 5 mL frisk medium.
- Suspension overføres til en vævskulturbehandlet kolbe eller skål. Tilsæt nok medium til helt at dække bunden af kolben og hvirvel til jævnt at distribuere celler. Angiv passagenummer, der starter med "1".
- Inkuber celler ved 37 °C i nærværelse af 5% CO2 og fugtighed, indtil 95% til 100% sammenløb er nået. Kontroller celler dagligt under mikroskopet begynder med den anden dag i inkubation. Lad ikke cellerne nå >100% sammenløb, da dette vil få cellerne til at løfte ud og dø.
BEMÆRK: Den tid, der er nødvendig for at opnå sammenløb, afhænger af, hvor mange levende celler der er belagt, og af kolbens vækstområde. Således er det klogt at kontrollere cellerne dagligt. - Subkulturceller ved at skrabe og fortynde cellemassen i frisk medium, hvilket giver mindst to dages vækst mellem skrabningerne. Forøg passagenummeret med 1 for hver subkultur.
BEMÆRK: Aflevering og øjeblikkelig skrabning den følgende dag vil resultere i hurtigere tab af generel celleophæftning over tid. RAW 264,7 celler bør kun anvendes op til ca. passage 15. - Til plade RAW 264,7 celler til OAA assay, erstatte med frisk medium og bruge en celle skraber til forsigtigt at skrabe celler fra kolben. Pipette op og ned for at bryde op cellen klumper for lettere celletælling.
BEMÆRK: Den traditionelle metode til subkultering af RAW 264.7 er ved skrabning. Det er vores erfaring, at brugen af trypsin får RAW 264.7 celler til at miste tilslutning over tid hurtigere end med skrabning. - Hvis du vil tælle celler, fortyndes lige store mængder celler og trypanblå opløsning. 10 μL på et hæmocytometer. Overhold og tæl antallet af levende celler, der udelukker farvestoffet ved hjælp af et omvendt sammensat mikroskop med en 10x objektiv linse.
- Plade 1,4 x 104 levedygtige celler pr. brønd i en 96 brønd 0,15 μm tyk glas flad bundplade (Plade #1). Lad cellerne vokse i 3 dage. Erstat brugt medium en dag før du udfører OAA.
BEMÆRK: Efter 3 dages inkubation skal antallet af celler være ca. 5 x 104/well.
2. Bakteriekultur og præparater
BEMÆRK: De bakteriearter, der anvendes i denne protokol, er en indkapslet virulent stamme, B. anthracis Ames. Alle manipulationer med denne art kræver passende biosikkerheds- og sikkerhedsgodkendelser og skal udføres i et biologisk sikkerhedsskab i klasse II eller iii, der er placeret i et BSL-3-laboratorium. Følg de institutionelle driftsprocedurer for BSL-3-arbejde og for brug af personlige værnemidler ved håndtering af bakterier.
- Forbered Brain Heart Infusion (BHI) bouillon ved at opløse 37 g BHI pulver i 1 L vand og autoklavering ved 121 °C i 15 min. Opbevar bouillon ved omgivelsestemperatur.
- Forbereder 8% natriumbicarbonatopløsning i vand og steriliseres ved hjælp af en 0,20 μm filtersprøjte. Opløsningen opbevares ved 4 °C og anvendes inden for 1 dag.
- Bland 8 g næringsstof bouillon, 3 g gær ekstrakt og 15 g agar i 1 L vand til at forberede NBY agar plader. Autoklave ved 121 °C i 15 min. Hæld i petriskåle og lad det størkne. Opbevar pladerne ved 4 °C.
BEMÆRK: NBY agarplader kan laves med eller uden natriumbicarbonat. Tilsætningen af natriumbicarbonat til bouillon og agarplader fremkalder væksten af mucoidkolonier bestående af indkapslet bacilli. Den endelige koncentration af natriumbicarbonat i både flydende og fast medie er 0,8%. - Forbered kultur bouillon til B. anthracis ved at blande 50% autoklaveret BHI bouillon, 40% FBS og 10% natriumbicarbonatopløsning (v/ v).
BEMÆRK: Denne bouillon er formuleret til at producere korte kæder af indkapslet bacilli. - Forbered en master plade af B. anthracis ved striber det til isolation på en NBY agar plade fra en spore lager en dag før dyrkning i bouillon. Inkuber ved 37 °C.
- Pod 30 mL kultur bouillon i en udluftet 250 mL kolbe med flere kolonier af B. anthracis.
BEMÆRK: Et specifikt volumen til overflade-forhold mellem bouillon, som angivet her, er nødvendigt for at producere maksimalt indkapslet bacilli. - Ryst bouillonkulturen ved 125 omdrejninger i minuttet, 37 °C med 20% CO2 og fugtighed i 18-24 timer.
BEMÆRK: Dyrkning B. anthracis ved temperaturer over 37 °C kan hæmme kapselproduktionen. - Brug negativ farvning med indisk blæk for at sikre tilstrækkelig indkapsling, og at bacilli er i korte kæder (1-5 bacilli/kæde) før fiksering (se afsnit 3).
- Til bestemmelse af kolonidannende enheder (CFU) fortyndes 100 μL kultur 1:10 i fosfat buffered saltvandsopløsning (PBS) og pladekulturfortyndinger på fåreblod agarplader. Inkuber i 12-18 timer ved 37 °C. Tæl CFU'er og bestemme antallet af bakterier pr. mL kultur.
BEMÆRK: Optælling kan også udføres ved hjælp af et hæmocytometer under mikroskopet, når bakterierne er blevet rettet. Dette anbefales dog ikke, fordi bacilli er vanskelige at se under lav forstørrelse. - Tilsæt 16% paraformaldehyd (PF) til hele mængden af bakteriekultur ved en endelig koncentration på 4% PF for at fastsætte bacilli. Omrør langsomt på en shaker ved omgivelsestemperatur i 7 dage.
BEMÆRK: Syv dages inkubation i 4% PF er baseret på USAMRIID institutionelle standard driftsprocedure for fastsættelse af vegetativ bacilli. - For at fjerne fikseringsmidlet og testen for sterilitet vaskes 4 mL (10% volumen) af fast bakteriel suspension i et 50 mL konisk rør ved centrifugering ved ≥3000 x g i 45 minutter og ved hjælp af en 30 mL /vask med PBS. Den resterende prøve opbevares i 4 % PF ved 4 °C.
BEMÆRK: Efter pelleting er bakteriel pellet fluffy på grund af tilstedeværelsen af kapsel. Pas på ikke at forstyrre pellet under vask. Det er nødvendigt at fjerne alle fikseringsmidler, så det ikke forstyrrer levedygtighedstesten. Hvis det er nødvendigt, øge antallet af vaske. - Til levedygtighedstest podes 40 mL af et bakterievækstmedium (f.eks. BHI-bouillon) med 4 mL vasket suspension (≤ 10% bouillonvolumen) og inkuberes ved 37 °C i 7 dage. Kontroller optisk massefylde ved 600 nm før og efter 7 dage for at måle uklarhed.
- Efter 7 dages inkubation i bouillonkulturen ≥ 100 μL bouillon på en agarplade og inkuberes i yderligere 7 dage. Hvis der ikke ses nogen stigning i uklarhed og ingen vækst på plader, betragtes den oprindelige kultur som steril og kan overføres til et BSL-2-laboratorium.
BEMÆRK: Federal Select Agent Program22 mandater, inaktiveret B. anthracis kan kun overføres fra BSL-3 laboratorier efter at have demonstreret fuldstændig sterilitet af prøven. Levedygtighedsprøvning for inaktiveret B. anthracis består i at dyrke 10% af prøven i bouillon i 7 dage efterfulgt af dyrkning på fast medium i yderligere 7 dage22,23. Følg de institutionelle retningslinjer for at modtage overførselsgodkendelse, når steriliteten er etableret.
3. Negativ farvning og let mikroskopi til at observere indkapsling og bacilli kæder
- 5 μL bakteriel affjedring blandes med 2 μL indisk blæk på et mikroskopdias. Placer et 1 eller 1,5 μm tykt dækglas oven på suspensionen uden at skabe bobler.
BEMÆRK: Neglelak kan bruges til at forsegle dækglasset på rutsjebanen. - Overhold bakteriel suspension ved hjælp af en 40x til 100x olie objektiv linse på et let mikroskop. Sørg for, at bacilli er indkapslet ved at observere en zone af clearance (kapsel udelukker Indien blæk) omkring hver bakterie, og at bacilli kæder er korte.
4. FITC-mærkning af bakterier
- Fluorescein isothiocyanat (FITC) opløses i dimethylsulfoxid ved en koncentration på 2 mg/mL.
- Måle mængden af inaktiveret bakteriel bestand.
- Vask bestanden 3x i PBS for at fjerne fikseringsmiddel.
- Der tilsættes FITC-opløsning ved en endelig koncentration på 75 μg/mL. Omrør langsomt blandingen i 18-24 timer ved 4 °C.
- Tre gange vaske bakterierne ved pelleting ved ≥3000 x g, 45 min og ved hjælp af 30 mL PBS / vask for at fjerne overskydende FITC. Sørg for, at den bløde pellet ikke forstyrres under vask. Resuspend bacilli i PBS i samme start volumen.
- Aliquot og opbevar bacilli i mikrorør ved -20 °C indtil brug. Der må ikke fryses/optøs bacilli flere gange, da bacillien kan miste kapslen.
5. Bakteriel opsonisering
- Varme inaktivere et lille volumen test sera (fra NHP' er) ved 56 °C i 30 minutter i en varmeblok.
- Tø og vask FITC-mærkede bakterier med PBS 2x ved pelleting ved 15000 x g i 3-5 min. Genbruges i PBS i samme startvolumen.
- I en 96 godt rund bundplade (plade #2), serielt fortyndet test sera i celle medium. I en anden 96 lang rund bundplade (plade #3) tilsættes 10 μL fortyndet testsera til hver brønd.
BEMÆRK: I hver plade blev PBS og normal abe sera inkluderet i stedet for fortyndet test sera som negativ kontrol. Vi valgte også et testserum som en positiv kontrol for at generere en standardkurve for at normalisere alle assays udført på forskellige dage. Den positive kontrol test serum blev vilkårligt valgt, fordi det var rigeligt. - For at plade #3 tilsættes 10 μL frisk rekonstitueret babykanin komplement.
BEMÆRK: Når det er rekonstitueret, skal du kassere de resterende babykanin supplere; må ikke fryses og optøes igen. - Til plade #3, tilsæt den passende mængde FITC-mærket bacilli for en mangfoldighed af infektion på 1:20. Tilføj f.eks. den diskenhed, der indeholder 5 x 104 x 20 bacilli for 5 x 104 celler. Top hver brønd i plade #3 med passende volumen af cellemedium til i alt 105 μL.
BEMÆRK: Plade #1, som indeholder celler, modtager 100 μL opsoniserede bakterier med de resterende 5 μL som tomrumsvolumen. Vi testede hver fortynding af testseraen i to eksemplarer. - Inkubatpladen #3 ved 37 °C i 30 min. i nærværelse af 5% CO2 med fugtighed for at opsonisere bacilli.
6. Overholdelse Assay og fluorescerende mærkning af pattedyrsceller
- Alle reagenser skal opbevares ved 37 °C inden brug.
- Placer plade #1, som indeholder vedhængende celler, på en 37 °C varmeblok.
- Brug en multikanalpipetor til at fjerne brugt medium fra brønde og hurtigt erstatte med 100 μL opsoniserede bakterier fra plade #3. Sørg for, at der ikke er genereret bobler i brøndene under pipering. Inkubatpladen #1 ved 37 °C med 5% CO2 og fugtighed i 30 minutter til tilslutning.
- Vask hver brønd 5x med 150 μL PBS oven på en 37 °C varmeblok for at fjerne ubundne bacilli.
BEMÆRK: Der skal drages omsorg for, at cellerne ikke spredes ved et uheld under vask. - Fortyndes 16% PF med PBS 1:4 for at lave 4% PF. Fastgør celler med 4% PF i 1 time ved at tilføje 150 μL til hver brønd. Vask celler 2x med PBS.
- 2 μL HCS (screening med højt indhold) Orange Cell Stain blandes i 10 mL PBS. Der tilsættes 150 μL af denne farvningsopløsning til faste celler og inkuberes i 30 minutter ved omgivelsestemperatur.
- Vask brønde 2x med PBS.
- Opbevares ved 4 °C indtil mikroskopi.
7. Mikroskopi
BEMÆRK: Generelt vil et automatiseret fluorescensmikroskop med høj gennemløb lette billeddannelsen for OAA. Hvis et automatiseret system ikke er tilgængeligt, kan fluorescerende billeder af vedhængende bacilli tages manuelt21. I denne undersøgelse20, vedhængende bacilli og celle monolayers blev afbildet ved hjælp af Zeiss 700 laserscanning mikroskopi system med specialiseret udstyr; vores system var sammensat af Zeiss Axio Observer Z1 omvendt mikroskop udstyret med en automatiseret fase, Definite Focus modul, 40 x NA 0,6 mål, Axio Cam HRc kamera og Zen 2012 (Blue Edition) software. De erhvervede billeder er widefield billeder, ikke konfokale billeder. Følgende protokol er tænkt som en grundlæggende mikroskopopsætning, der gælder for en række automatiserede mikroskopsystemer.
- Inkubatpladen #1 ved omgivelsestemperatur i 30 min. Tænd mikroskopet og det tilhørende udstyr.
BEMÆRK: Akklimatisering ved omgivelsestemperatur forhindrer kondens i at danne sig på glaspladen under billeddannelse. Derudover forhindrer det defokusering på grund af temperaturskift. - Placer pladen på scenen, og fokuser på cellerne ved hjælp af lyse felt- eller fasekontrast.
- Vælg 96 brøndformat som pladeindstilling. Vælg kanalindstillinger.
BEMÆRK: FITC's maksimale excitation og emission bølgelængde er 495/519 nm; HCS orange celle pletten er 556 og 572 nm. Andre fluorophorer kan anvendes afhængigt af de filtre, der er tilgængelige på mikroskopet. - Vælg indstilling til flisetilstand. Angiv antallet af billeder, der skal hentes.
BEMÆRK: Flisefunktionen gør det muligt at fange flere steder i en prøvebrønd og kan indstilles til at erhverve billede i et flise- eller tilfældigt format. Vi afbildede 10 tilfældige områder pr. brønd. - Skift anskaffelsestilstand til "sort/hvid" eller "monokrom" og binning ≥ 2x2.
BEMÆRK: Indstilling af binning fra 1x1 til 2x2 eller 4x4 ville øge mikroskopi hastighed, men vil også resultere i lavere opløsning af billedet. For OAA er det tilstrækkeligt at bruge disse indstillinger, da analysen opregner både makrofagerne og de vedhængende bakterier. - Slå autofokus- eller fokuseringsmodul til. Angiv, hvor ofte autofokuseringsfunktionen skal udføres. Slå Z-stakfunktion til, hvis den er tilgængelig. Angiv antallet af Z-stakke, der vil fange tykkelsen af cellens monolayer og vedhængende bacilli.
BEMÆRK: Antallet af valgte Z-stakke vil øge mikroskopitiden, men vil sikre, at der tages et billede med det rette fokus på hver Z-stak. - Angiv en filmappe, som billeder skal gemmes i. Kør det automatiserede billedprogram.
8. Dataindsamling og -analyse
- Tæl antallet af vedhængende bacilli- og pattedyrsceller pr. billede. Tæl hver kæde af bacilli som en bakterie.
- Tænk bacilli/cellerne i det positive kontroltestserum og -titer (f.eks. er 1:10 fortynding 10 titerenheder) for at generere en standardkurve i et passende statistikprogram.
- Analyser det positive kontroltestserum ved hjælp af ikke-lineær regressionskurvetilpasning. Analyser derefter de resterende prøver ved hjælp af standardkurven for det positive kontroltestserum for at bestemme tilsvarende titers.
BEMÆRK: Det er normalt mest præcist at vælge prøvefortyndingerne nær midten af standardkurven ved bestemmelse af titers. - Det geometriske gennemsnit af prøverne fra hver vaccinegruppe beregnes. Beregn P-værdierne for log transformerede titers ved mindst signifikant forskel ANOVA analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette afsnit viser repræsentative mikrografer indsamlet under et OAA-forsøg sammen med resultater, der viser, at OAA kan bruges til at undersøge antistoffernes biologiske funktion. Her blev analysen med succes brugt til at evaluere effekten af en miltbrandvaccinekandidat. Det er afgørende at kontrollere tilstanden af indkapsling på bacilli så lidt at ingen indkapsling får dem til at overholde værtsceller, der producerer en høj baggrund. Figur 1 er et billede af B. anthracis Ames negativt plettet med Indien blæk til at undersøge indkapsling. OAA kræver, at flere tilstødende synsfelter lyser, og hvis der anvendes konfokal mikroskopi, bruges flere stakke eller sektioner. Det er derfor nødvendigt at kontrollere, at bacilli hverken er for svagt eller fotoblegemiddel for hurtigt. Figur 2 er et billede af bacilli mærket med FITC. Figur 3 viser de maksimale projektionsbilleder af B. anthracis Ames, der er knyttet til cellens monolayers. Disse er repræsentative synsfelter, der blev talt og scoret for OAA. Stigningen i fastgørelse af bacilli inkuberet med PGGA-OMPC antiserum skyldes tilstedeværelsen af anti-kapsel antistoffer, der opsoniserede bacilli. Figur 4 viser, at serumtitlerne for NHP'er, der er vaccineret med 10 og 50 μg PGGA-OMPC, er betydeligt højere end titerne for OMPC og PGGA alene.
Figur 1. En Indien blæk billede af faste B. anthracis Ames. Bemærk frihøjden omkring bacilli på grund af tilstedeværelsen af kapsel. Bar = 10 μm. Billedet blev taget på EVOS FL automatiseret mikroskopi system med 100 x 1,4 numerisk blænde (NA) olie mållinse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Billeder af FITC mærket fast B. anthracis Ames. (Til venstre) Billede af differentialinterferenskontrastkontrast; fluorescerende billede pseudo-farvet i grøn (midten); flettet (højre). Bar = 10 μm. Confocal billeder blev taget på Zeiss 700 LSM Confocal Mikroskopi med 40 x 1,3 NA olie mållinse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Fluorescerende billeder af B. anthracis Ames overholdt RAW 264,7 celle monolayers. Bacilli blev opsoniseret med testserum fra NHP'er vaccineret og boostet med (A) 10 μg PGGA-OMPC, (B) 50 μg PGGA-OMPC, (C) 50 μg PGGA alene eller (D) OMPC alene. Grøn = B. anthracis Ames, rød = RAW 264,7 celler. Bar = 20 μm. Wide field billeder blev taget på Zeiss Axio Observer Z1 mikroskop med 40 x 0,6 objektive linse og Axio Cam HRc kamera. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Opsono-tilhængere af NHP'er vaccineret med 10 μg PGGA-OMPC, 50 μg PGGA-OMPC, 50 μg PGGA alene eller OMPC alene. De geometriske midler til 5 dyr pr. gruppe er graflagt. Fejllinjer angiver SEM. *p ≤ 0,001 sammenlignet med PGGA alene. P-værdierne blev beregnet ved hjælp af ANOVA med LSD posthoc-test. Dataene blev oprindeligt offentliggjort i Chabot, et al., 201620. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kapselbaserede vacciner har vist sig at være effektive mod talrige bakterielle patogener , og mange er licenseret til brug hos mennesker25,26,27. Disse vacciner virker ved at generere antistoffer rettet mod kapslen, og mange af disse undersøgelser bruger OPKA til at vise antistoffernes opsono-fagocytiske funktioner13,14,16,28,29. På grund af biosikkerhed bekymringer og for nem arbejde, udviklede vi en OAA til at evaluere antistoffer fra dyr vaccineret med B. anthracis kapsel konjugater. Tilstedeværelsen af kapsel på B. anthracis forhindrer overholdelse og fagocytose30, men opsonisering af bacilli med sera fra vaccinerede dyr fremkalder tilknytning til makrofager20,21.
For OAA bruges tilslutningsaktiviteten, ikke internalisering og drab, til at kvantificere opsonisk aktivitet. Dette gav OAA flere fordele. Vi var i stand til at udnytte paraformaldehyd dræbt, fluorescerende mærket indkapslet bacilli i stedet for levende organismer. Ændringer i bakterieoverfladen fra aldehydfiksering og fluorescerende mærkning ændrede ikke bakteriernes overordnede tilslutning til makrofagerne; fast og mærket bacilli var ikke mere vedhængende end levende bacilli (data ikke vist). Graden af indkapsling kan variere fra kultur til kultur og påvirke den overordnede tilslutning på trods af lignende vækstbetingelser. Således tillader brugen af en enkelt inaktiveret bakteriel bestand standardisering på tværs af eksperimenter udført på forskellige dage og på tværs af forskellige sæt eksperimenter. Dette var værdifuldt for at sammenligne sera fra de 20 NHPs, der anvendes i dette arbejde og sera, der vil blive genereret i vores kommende undersøgelser. Sidst, de fleste makrofager, herunder RAW 264.7 celler, er følsomme over for miltbrand dødelige toksin produceret af levende patogen31, gør brugen af levende bacilli i sagens natur problematisk.
Brugen af RAW 264.7 celler lettede også standardiseringen. Vi brugte oprindeligt en almindeligt anvendt cellelinje i OPKA, HL-60 celler. Vi fandt dog vanskeligheder med at differentiere dem til granulocytter med dimethyl-formamid, som rapporteret af andre28,32. RAW 264,7 celler har den fordel, at de ikke behøver at være kemisk differentieret og er vedhængende og dermed mere modtagelige for mikroskopi-baserede OAA. Denne cellelinje er blevet anvendt i talrige fagagocytoseundersøgelser med intracellulære patogener33,34, samt B. anthracis31. Brugen af RAW 264,7 celler, som er afledt af mus, er også fordelagtigt, fordi musen Fc receptorer er promiskuøs i deres bindende specificitet for IgG stammer fra andre arter35. Dette gav os mulighed for at evaluere anti-kapsel antistoffer fra NHPs med en murine celle linje.
Miltbrand, selv om sjældne, er endemisk i nogle regioner i verden og USA. En bekymring er, at de anvendte FBS, der stammer fra USA, allerede kan indeholde antikapselantistoffer som følge af, at dyret udsættes for B. anthracissporer eller andre PGGA-producerende mikrober i jorden. For at løse dette problem blev FBS-partiet, vi brugte, testet på forhånd. Vi konstaterede, at tilsætningen af varmeaktiverede FBS øgede tilslutningen sammenlignet med DMEM alene (data vises ikke). Det øgede dog ikke tilslutningen sammenlignet med varmeinaktiverede normale sera fra marsvin, abe, mus eller menneske (data vises ikke). Således indeholdt FBS-partiet, vi brugte, ikke antikapselantistoffer som følge af eksponering. Desuden ville det heller ikke indeholde antikapselantistoffer som følge af, at dyret blev vaccineret med det ikke-indkapslede B. anthracis Sterne, en stamme, der mangler den pXO2 plasmid, der er nødvendig for kapselproduktionen. Det testede FBS-parti blev brugt til alle efterfølgende OAA.
En begrænsning af teknikken er opgaven med at tælle bacilli og celler af laboratoriepersonale, hvilket tog en enorm mængde tid og kræfter. Dette kan afhjælpes ved hjælp af software, der har denne type analyse; denne software var ikke tilgængelig for os på det tidspunkt. Men fordi manuel optælling var nødvendig, var et kritisk skridt fjernelse eller vask af uvedkommende og ubundne bacilli for at lette opgaven. Det var også nødvendigt at teste reagenser, der førte til lavere baggrundsstøj. OAA kræver en kilde til komplement, fordi det forbedrer opsonisering36. Derfor testede vi en række komplementkilder, herunder marsvin, menneske- og babykanin komplement. Vi valgte baby kanin supplement til vores analyse, fordi vi fandt ud af, at det ikke har svage, multispecifikke aktiviteter mod heterofile antigener, det er almindeligt anvendt i OPKA-undersøgelser14,15,37, og det er let tilgængeligt kommercielt.
Vi finder OAA at være kvantitative og meget reproducerbare. Vi bruger det til at supplere undersøgelser, der involverer ligand bindende assays såsom ELISAs, som kun kvantificerer det samlede IgG-niveau, men skelner ikke mellem funktionelle og ikke-funktionelle antistoffer. OAA kan bruges til at supplere andre funktionelle assays (f.eks serumbaktericid aktivitet og toksinneutraliseringsanalyser) for at vise de forskellige funktionaliteter af vaccinegenererede antistoffer16,38. Udviklingen af OAA har øget vores repertoire af immunogenicitetsundersøgelser for at evaluere vacciner og terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke en kommerciel eller anden forening, der kan udgøre en interessekonflikt.
Acknowledgments
J. Chua, D. Chabot og A. Friedlander designede de procedurer, der er beskrevet i manuskriptet. J. Chua og T. Putmon-Taylor udførte eksperimenterne. D. Chabot udførte dataanalyse. J. Chua skrev manuskriptet.
Forfatterne takker Kyle J. Fitts for fremragende teknisk bistand.
Arbejdet blev støttet af Defense Threat Reduction Agency tilskud CBM. VAXBT.03.10.RD.015, plannummer 921175.
Udtalelser, fortolkninger, konklusioner og anbefalinger er forfatternes og er ikke nødvendigvis godkendt af den amerikanske hær. Indholdet af denne publikation afspejler ikke nødvendigvis forsvarsministeriets synspunkter eller politikker, og omtale af handelsnavne, kommercielle produkter eller organisationer indebærer heller ikke godkendelse fra den amerikanske regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
References
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M.
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144 (1883).
- Tauber, A. I.
- Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Candela, T., Fouet, A.
- Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
- Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
- Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
- Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
- Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
- Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
- Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
- Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
- Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
- List of Tier 1 BSAT. , Available from: www.selectagents.gov/ohp-app1.html (2017).
- Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
- Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
- Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
- Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
- Revised FSAP Policy Statement: Inactivated Bacillus anthracis and Bacillus cereus Biovar anthracis. , Available from: www.selectagents.gov/policystatement_bacillus.html (2017).
- Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, Suppl 1 1-9 (2013).
- Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
- Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
- Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
- Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400 (2019).
- Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250 (1999).
- Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J.
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
- Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
- Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
- Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
- Wolf, J. J. Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , Elsevier. 243-255 (2013).
