Summary
在该协议中，我们描述了一个小鼠模型，不完整的手术切除软组织肉瘤测试（新）辅助疗法。
Abstract
手术通常是许多实体肿瘤的第一次治疗。然而，局部复发经常发生在原发性肿瘤切除后，尽管辅助或新佐剂疗法。当手术边缘不足无肿瘤，导致残余癌细胞时，将发生这种情况。从生物学和免疫学的角度来看，手术不是一个空事件;伤口愈合环境已知能诱导亲肿瘤和抗肿瘤通路。因此，旨在预防局部复发的药物开发临床前模型在测试新的（新）辅助疗法时应纳入手术切除，以模拟接受手术治疗的患者的临床设置。
在这里，我们描述了一个小鼠模型不完全手术切除的 WEHI 164 软组织肉瘤，允许测试（新）辅助疗法在伤口愈合反应的设置。在此模型中，50% 或 75% 的肿瘤被切除，留下一些原位癌组织，在临床环境中模拟手术后的粗残病。此模型允许在手术环境中测试疗法，同时考虑伤口愈合反应，这可能会影响（新）辅助治疗的疗效。不完全的手术切除导致肿瘤在没有辅助治疗的情况下在所有小鼠中可重现。带检查点封锁的辅助治疗可减少肿瘤再生。因此，该模型适用于在脱毛手术及其相关的伤口愈合反应的背景下测试疗法，并可以扩展到其他类型的固体癌症。
Introduction
手术仍然是许多实体肿瘤1的主要治疗选择，包括软组织肉瘤2，3。2,尽管癌症手术技术有所改善，并结合（新）辅助疗法，在原发性肿瘤切除4，5,后癌症复发和转移的风险仍然很高。在软组织肉瘤中，复发特别多发，在手术现场，导致发病率和死亡率增加。在临床环境中，可能很难获得足够宽的边距（例如，由于解剖限制），导致不完全切除和随后的肿瘤复发6。手术压力和随后的伤口愈合过程已知创造一个免疫抑制肿瘤微环境有利于肿瘤复发7,7，8。因此，软组织肉瘤，特别是免疫疗法的新疗法的发现和发展，最好考虑手术伤口愈合反应。
大多数临床前研究佐剂疗法最初使用皮下合成或异种移植小鼠模型，没有纳入手术压力和伤口愈合反应9,9，10。因此，我们开发了一个合成皮下小鼠软组织肉瘤模型，结合了不完整的手术切除。WEHI 164纤维肉瘤细胞在皮下接种，一旦肿瘤建立，我们去除50-75%的肿瘤体积（图1A-E）。肿瘤不断从剩余的肿瘤重新生长。此模型允许测试辅助疗法，同时考虑手术压力和伤口愈合的效果。多个小组在多项研究中都使用了类似的手术模型，发现这些模型可重复有效，包括11、12、13。,12,13在这里，我们提供了此协议的详细说明。
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Protocol
这些实验中使用的动物是从动物资源中心（西澳大利亚州珀斯）获得的。在Har harryPerkins医学研究所生物资源北设施（西澳大利亚州珀斯）的条件下饲养动物。所有实验都是按照哈利·帕金斯医学研究所动物伦理委员会批准的议定书进行的。在这些实验中使用了8-12周大的BALB/c小鼠。WEHI 164 纤维瘤细胞系来自澳大利亚细胞银行（新南威尔士州韦斯特米德）。
1. 细胞接种
- 细胞和动物的制备
- 确保在推荐的介质中维护单元系。例如，在罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）保持 WEHI 164 细胞系（RPMI） 1640 中，辅以 2 mM L-谷氨酰胺、10% 胎儿牛血清、20 mM HEPES、0.05 mM 2-甲氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素。
注：从低温储存中去除后，通道细胞至少3次，最多5次。为了确保最佳的细胞生存能力，当细胞在70-80%的汇合之间时，应进行分裂。肿瘤细胞系应测试支原体，因为感染可以改变细胞生长，影响体内的免疫反应。 - 接种前一天，用剪子剃右下侧的小鼠。
注：本实验使用了正常体重（16-22克）的8-12周龄为8-12周的雌性BALB/c小鼠。 - 在接种当天，收获 WEHI 164 细胞时，70-80% 的汇合通过三脑子炎。
- 从组织培养瓶中吸出培养基，然后加入无菌磷酸盐缓冲溶液（1x PBS），去除胎儿牛血清（FBS）的剩余痕迹。
- 从组织培养瓶中吸出 PBS。加入 3 mL 的 0.05% trypsin （对于 T75 烧瓶）， 然后旋转烧瓶， 使带细胞的烧瓶的整个表面被 trypsin 覆盖。
- 在37°C下孵育烧瓶，5%CO2培养箱3分钟。通过敲击烧瓶的两侧，检查细胞是否脱落，定期检查细胞。
- 从细胞培养箱中取出烧瓶，并添加 5 mL 的介质，辅以 FBS，以中和尝试性。
注：不要将细胞留在尝试性中的时间超过必要的时间，因为这样会损害细胞并导致细胞活力低。 - 多次移液悬浮液，获得单个单元悬浮液。将电池悬浮液转移到锥形离心管。
- 在350 x g下旋转3分钟，使细胞产生颗粒。
- 在1x PBS中清洗细胞三次。
- 在50 mL的无菌1x PBS中重新悬浮细胞，通过移液细胞悬浮上下清洗细胞。在350 x g下旋转3分钟，使细胞产生颗粒。
- 在15 mL无菌1xPBS中吸升和再增殖细胞。通过移液细胞悬浮液上下冲洗细胞。在350 x g下旋转3分钟，使细胞产生颗粒。
- 在正好 10 mL 的无菌 1x PBS 中吸升和重新暂停的细胞。如步骤 1.1.4.2 中一样清洗细胞，将少量（约 100 μL）的细胞悬浮液转移到离心管进行计数。在350 x g下旋转3分钟，使细胞产生颗粒。
- 使用 Trypan 蓝色排除方法使用血细胞计或自动细胞计数器确定细胞号。在无菌1x PBS中以5 x 106 6细胞/mL的浓度重新发送细胞。将细胞悬浮在冰上。
注：肿瘤细胞的生存能力应等于或超过80%，以确保肿瘤生长可重复。
- 确保在推荐的介质中维护单元系。例如，在罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）保持 WEHI 164 细胞系（RPMI） 1640 中，辅以 2 mM L-谷氨酰胺、10% 胎儿牛血清、20 mM HEPES、0.05 mM 2-甲氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素。
- 皮下接种
- 将细胞悬浮液彻底混合，在无菌 1x PBS 中用 26 G 针头填充注射器，并填充 100 μL 的细胞悬浮液（5 x 105细胞）。在加载下一个注射器之前重复混合细胞。
注：在整个过程中保持细胞在冰上，以保持生存能力。 - 适当限制鼠标，确保进入右下侧。在剃光的右下侧侧下皮接种小鼠。
注：通过稍微抬起针头，确保接种不在佩罗酮中，针应在皮肤下可见。接种后，皮肤下应形成气泡状肿块。 - 根据适用的道德批准要求监测小鼠，当肿瘤长到约50 mm2时进行手术切除。
- 将细胞悬浮液彻底混合，在无菌 1x PBS 中用 26 G 针头填充注射器，并填充 100 μL 的细胞悬浮液（5 x 105细胞）。在加载下一个注射器之前重复混合细胞。
2. 肿瘤部分手术切除
注：此协议需要两名研究人员;一个用于外科手术（SURGEON），另一个用于小鼠监测（助手）。
- 手术设置
- 在接种后的第12天，当肿瘤达到约50毫米2的大小时，在手术前30分钟，在颈部擦伤时，用100μL（0.1毫克/千克）的丁丙诺啡s.c.给小鼠服用剂量。
- 设置手术区与热垫覆盖长凳外套，并设置一个鼻锥麻醉。使用前对手术工具进行消毒，并在每个动物之间使用热珠消毒器，使工具在使用前冷却。有以下手术设备清洁，触手可及：氯己丁，拭子，纱布，眼凝胶，两个弯曲的钳子，剪刀，夹子施用器，夹子去除剂，夹子填充（图2A，2B）。
- 将加热室加热至37°C，并设置另一个加热垫进行恢复（图2C）。将灭菌工具放在无菌表面上，如自洗垫。
- 麻醉
- 将鼠标放在感应室中，用 4% 异氟兰（100% 氧气中的 4%在 1 L/min 的流速下）麻醉小鼠，直到呼吸速率减慢到每分钟约 60 次呼吸（1 分钟）（这通常需要 <1 分钟）。
注：不要将鼠标留在室内太久，因为这可能导致窒息和死亡。一次只有一只老鼠麻醉。 - 将鼠标转移到手术台上的热垫上，将鼻子上的鼠标放在鼻锥中，在 0.5 L/min 的流量下，用 3-4% 异氟兰保持麻醉状态。监测呼吸速率，确保麻醉深度保持。
注：助手必须在整个手术过程中监测小鼠的呼吸，以确保保持正确的麻醉水平。如果呼吸太慢，降低麻醉浓度，如果麻醉深度太浅，就会增加麻醉浓度。如果鼠标开始喘气，请将鼠标从鼻锥中取出，降低麻醉浓度，并等待呼吸恢复正常，然后再放在鼻锥上。 - 执行"捏测试"和"角反射测试"14，以确保小鼠在开始手术前完全麻醉。
注：鼠标任何部分的移动表明鼠标未完全麻醉。动物应该立即通过增加麻醉浓度来给予额外的麻醉剂。 - 用少量的眼部凝胶盖住老鼠的眼睛，以避免眼睛干燥。
- 将鼠标放在感应室中，用 4% 异氟兰（100% 氧气中的 4%在 1 L/min 的流速下）麻醉小鼠，直到呼吸速率减慢到每分钟约 60 次呼吸（1 分钟）（这通常需要 <1 分钟）。
- 外科手术（SURGEON）
- 用酒精氯己丁擦拭手术区3次。使用钳子和一把剪刀，沿着后侧做一个1厘米的直切口，离肿瘤3毫米（图3A，3B）。
注：将每只小鼠的切口标准化为 1 厘米（使用标尺），可以甚至评估小鼠之间的伤口愈合。将切口定位在离肿瘤 3 mm 的地方，可以进行随后的肿瘤内辅助治疗，而不会从伤口中渗漏。 - 使用钳子，拉开肿瘤和内皮之间的筋膜和皮下脂肪组织。皮下肿瘤通常附着在皮肤侧。
- 打开伤口，用钳子轻轻握住肿瘤轴承侧的皮肤，并"反转"肿瘤，使肿瘤在肿瘤外可见（图3C，3D）。
注：要切除的肿瘤部分应最接近开口，有足够的皮肤来关闭伤口。切除肿瘤时，注意不要割皮。 - 用一把剪刀，从肿瘤胶囊的一半切开，从肿瘤底部最接近开口开始。
- 对于50%的脱布手术，切过肿瘤的中间。使用弯曲钳子，挖出要切除的肿瘤部分（50%）;从脱骨区域挖出任何残留物。
- 对于 75% 的脱布，执行 50% 的肿瘤脱布，如上文第 2.3.5 部分所示。然后切入剩余的50%的肿瘤的一半，并挖出25%的肿瘤，使用弯曲钳，如上所述。
- 用酒精氯己丁擦拭手术区3次。使用钳子和一把剪刀，沿着后侧做一个1厘米的直切口，离肿瘤3毫米（图3A，3B）。
- 关闭手术场
- 将剩余的肿瘤放回皮肤下方，并使用钳子，将皮肤皮瓣拉在一起，沿着伤口将皮肤拉上线。
- 将皮肤从伤口边缘握在一起 5 mm，并使用手术夹关闭伤口，从最接近钳子的一侧开始。根据需要应用尽可能多的夹子，以确保没有底层组织暴露。通常，应用三到四个夹子，夹子之间有 2 mm 的间隙。
注：如果任何剪辑应用不好，请使用剪辑移除器将其删除，然后替换为新剪辑。
- 小鼠的恢复（助手）
- 将小鼠放入加热（37°C）加热室，让小鼠恢复。
- 将鼠标的笼子放在热垫上。监测加热室中的小鼠，直到它们从麻醉剂中恢复（觉醒和行走），然后将小鼠放回笼子里。将笼子放在热垫上再放在10分钟，直到老鼠变得更活跃。
- 给老鼠湿和软的食物。手术后1小时监测小鼠进行恢复，并确保夹子保持到位。确保笼子在热垫上半开/半开，让动物在无人看管时自行调节温度。
- 剂量小鼠与0.1毫克/千克丁丙诺啡（100μL皮下在颈部擦伤），手术后6-8小时（在一天结束）。第二天一早监测小鼠，并再次用0.1毫克/千克丁丙诺啡（100μL皮下在颈部擦伤）对小鼠进行剂量。根据需要给予更多的湿食物。
- 接下来的七天每天监测老鼠。使用剪辑移除器七天后可能会移除剪辑。
- 佐剂或新辅助治疗
- 在任何给定时间用（新）辅助治疗治疗小鼠，具体取决于感兴趣的治疗。
- 例如，在接种后的第15天，或在接种后的第15天用100μg抗CTLA-4的一剂剂量治疗小鼠，或在接种后的第15天、第17天和19天用三剂200微克抗PD-1.p.。
- 实验控制
- 当使用此模型评估炎症/伤口愈合的影响时，请考虑使用以下对照组：1） 无手术控制（治疗仍然可以在肿瘤内进行）;2） 沙姆手术控制：在皮肤上进行手术切口;肿瘤纵和暴露，但没有切除肿瘤组织 ;伤口用夹子闭合。
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Representative Results
肿瘤生长到50 mm2的大小是部分脱虫的理想尺寸。50 mm2 肿瘤的不完全手术切除导致肿瘤在没有辅助免疫治疗的情况下 100% （n=5） 可再生（图 4A）。接下来，我们使用该模型测试辅助免疫疗法，使用抗体对检查点分子细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）和编程死亡受体1（PD-1）。对抗CTLA-4或抗PD-1小鼠的治疗，治愈率分别达到80%和25%（每组n=4-5）（图4B，4C）。抗PD-1的响应提供了一个机会来测试新颖的组合，以进一步提高响应率。
图1：肿瘤部分手术切除图。（A） BALB/c小鼠在右下侧接种5 x 105 WEHI-164细胞。（B） 当肿瘤达到50毫米2时，手术可以开始。（C） 肿瘤被部分切除（显示50%）。（D） 手术地点用夹子封闭。（E） 辅助治疗可以在伤口区域进行静脉注射、内腹管（显示）或肿瘤内。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：手术设置的代表性图像。（A） 手术的整体图像，显示手术工具（步骤2.1中列出）和麻醉机。（B） 手术台的快照图像，显示触手可及的所有材料。（C） 用于鼠标回收的加热室和加热垫.请单击此处查看此图的较大版本。
图3：部分肿瘤脱发技术代表性图片。（A） 手术前肿瘤大小为50 mm2的完全麻醉小鼠。（B） 切口部位离肿瘤3毫米远;1 厘米切口。（C-D）打开伤口，用钳子轻轻握住肿瘤轴承侧的皮肤，并"反转"肿瘤，使肿瘤在外可见。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：肿瘤再生后不完全肿瘤切除和免疫治疗。（A） 在没有辅助免疫治疗的情况下，部分切除的 WEHI-164 肿瘤的肿瘤再生曲线。（B-C）手术后肿瘤再生，用抗CTLA-4（B）或抗PD1（C）进行辅助治疗。B虚线表示手术当天。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
我们为软组织肉瘤的不完全手术切除小鼠模型提供一种方案，以测试术内疗法。我们还标准化了手术切口，以便评估治疗后小鼠之间的伤口愈合情况。
肿瘤放置是此协议的重要组成部分。我们选择了皮下肿瘤模型，以便于手术访问肿瘤位点，并管理局部疗法，同时对小鼠负担最小。同样重要的是，确保肿瘤生长在皮下空间，而不是在近膜内，这可能导致意外的发病率和死亡率。
当为该协议选择肿瘤细胞系时，我们建议在体内生长的细胞形成固体质量（例如，WEHI-164模型），而不是半固体质量（如B16模型），因为在技术上很难部分切除。此外，如果肿瘤开始通过皮肤生长（通常在大于100 mm2的肿瘤中看到），不建议脱泡，因为皮肤可能会变得坏死，手术后无法愈合。我们已经克服了这个问题，通过去免疫肿瘤，一旦他们达到50毫米2的大小。
由于我们的模型可用于评估伤口愈合对治疗的影响，我们建议一个控制/耻辱组作为比较。控制可能是不变的肿瘤，或假手术，将只有皮肤切口，暴露的肿瘤，伤口闭合没有部分肿瘤脱皮。当从部分脱发对治疗结果中辨别手术引起的炎症和伤口愈合时，可以使用这个虚假的对照组。
要成功进行部分脱骨手术，需要考虑一些技术要点。一个重要的方面是肿瘤的正确植入和生长。肿瘤需要植入右下侧，远离后腿。植入过于靠近后腿的肿瘤会干扰其行走能力，并可能导致夹子产生额外的力，导致它们松动。此外，肿瘤大小的一致性至关重要，以避免脱球相对百分比的变异性。我们选择对大小为50 mm2的肿瘤进行手术，使手术在技术上变得简单，尽管我们设想对较小的肿瘤进行部分切除是可行的。为了防止肿瘤大小不一致，使用细胞系需要遵循适当的标准细胞培养技术，研究人员需要适当训练适当的肿瘤接种技术。当将该协议扩展到其他皮下肿瘤模型时，肿瘤的物理特性非常重要。例如，我们发现，引起软性胶质肿瘤的细胞系（例如，M3-9-M rhabdomyosarcoma和B16黑色素瘤15）在技术上具有挑战性的脱毛。
在手术过程中也需要考虑一些技术要点。小鼠需要充分麻醉，以防止在手术过程中移动。除了麻醉不足的小鼠会忍受的冒名顶替外，小鼠在手术过程中的任何运动都可能导致手术切除变得困难，导致小鼠之间切除的肿瘤大小的变异性。此外，小鼠呼吸速率应在手术过程中仔细监测，应调整异氟兰浓度，以保持适当的麻醉深度。因此，在外科手术过程中，始终需要一名助手来监测手术期间的呼吸速率，并确保麻醉水平足够。切口的大小需要一致，以避免伤口愈合反应的变异性。我们发现，1-1.5厘米的切口足以使肿瘤脱光，伤口脱皮的机会最小。
我们的部分切除模型模拟了手术后剩余的疾病，如许多实体肿瘤的临床设置中所看到的，并考虑到手术伤口愈合的效果，比传统的合成小鼠模型具有优势。此外，现有的传统手术模型都使用了完整的肿瘤切除，这并不总是导致肿瘤复发16。其他研究人员已经成功地使用部分切除模型使用其他癌细胞系11，12，13，突出了这种方法的鲁棒性。11,12,13此外，已经证明，部分切除，但不是完全切除，导致保护性抗肿瘤免疫记忆时，给予辅助治疗12，这是归因于从残余肿瘤抗原的持久性。
该模型旨在研究炎症和伤口愈合对治疗的影响。我们的脱毛方法临床上类似于手术后留下严重残留疾病的临床情况（R2切除），而不是宏观上完成与显微残留疾病（R1切除）的切除。例如，当肿瘤位于神经、动脉或相邻器官等关键结构旁边时，侵入性软组织肉瘤的手术切除可产生正边缘，排除具有宽边距的完整切除 17。切除手术模型导致显微正差已发表13;我们的方案可用于研究伤口愈合反应对治疗的影响，当宏观残留疾病存在。
我们模型的一个限制是，它不会引起遥远的复发和微虫，这是常见的手术后，在实体肿瘤，如乳腺癌或胰腺癌。其他手术模型，如穆林乳腺癌模型4T1 18，19，20或穆林模型的德诺沃乳18,19,20腺癌转移21更适合研究局部切除后全身复发。另一个限制是，该协议是皮下模型，因此不允许评估组织特异性病理学。为此，正畸肿瘤小鼠模型是适当的7，22，23。,237,然而，正畸模型更具挑战性，通常涉及更大的冒名顶替小鼠，更费时和昂贵的22。皮下模型非常适合评估（新）辅助疗法，无论是系统或局部，对局部癌症复发的影响，在成本效益和相对较高的通量方式，以最小的冒名顶替动物。
本协议中概述的不完全部分切除有助于测试辅助疗法，同时将手术伤口愈合作为一个因素，这是一个经常被忽视的变量。
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Disclosures
不披露。
Acknowledgments
这项工作是由袜子它到萨科马的赠款支持！基金会、澳大利亚和新西兰肉毒病协会、儿童白血病和癌症研究基金会和永久慈善组织。W.J.L由西蒙·李奖学金和来自国家健康和医学研究理事会和西澳大利亚州癌症理事会的奖学金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 gauge 0.5 mL insulin syringe | Becton Dickinson, Australia | 326769 | None |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21985023 | None |
| Anaestetic gas machine | Darvall Vet, Australia | SKU: 2848 | None |
| Anti-CTLA-4 | BioXcell, USA | BE0164 | None |
| Anti-PD-1 | BioXcell, USA | BP0273 | None |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL | RB healthcare UK Limited, UK | 55175 | Prescription order |
| Chlorhexidine Surgical Scrub 4% | Perigo Australia, Australia | CHL01449F(scrub | None |
| Fetal Bovine serum | CellSera, Australia | AU-FBS-PG | None |
| Forceps Fine 10.5 cm | Surgical house, Western Australia | CC74110 | None |
| Forceps Fine 12 cm Serrated | Surgical house, Western Australia | CC74212 | None |
| Forceps Halsted 14 cm | Surgical house, Western Australia | CD01114 | None |
| Heating chamber | Datesand Ltd, UK | Mini-Thermacage | None |
| HEPES (1M) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15630080 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Australia | SKU: 29405 | Prescription order |
| Lubricating Eye Ointment | Alcon | n/a | None |
| Penicillin/streptomycin 1000X | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140122 | None |
| Phosphate Buffered Solution 10x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 70013-032 | None |
| Reflex 7mm Clips | Able scientific, Australia | AS59038 | None |
| Reflex 7mm Wound Clip Applicator | Able scientific, Australia | AS59036 | None |
| Reflex Wound Clip Remover | Able scientific, Australia | AS59037 | None |
| Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit | Darvall Vet, Australia | #7885 | None |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21870092 | None |
| Scissors Iris STR 11 cm | Surgical house, Western Australia | KF3211 | None |
| Scissors Iris STR 9 cm | Surgical house, Western Australia | JH4209 | None |
| Small Induction Chamber | Darvall Vet, Australia | SKU: 9630 | None |
| TrypLE express 1x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12604-021 | None |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific Inc., USA | 5-1460-DK |
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