Summary
Dit protocol introduceert een lithografievrije micropatroonmethode die eenvoudig en toegankelijk is voor mensen met een beperkte bio-engineeringachtergrond. Deze methode maakt gebruik van aangepaste laser-cut stencils om micropatroon extracellulaire matrix eiwitten in een vorm van belang voor het moduleren van cel morfologieën. De procedure voor micropatterning wordt aangetoond met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten.
Abstract
Micropatroon technieken zijn op grote schaal gebruikt in de celbiologie om de effecten van het beheersen van celvorm en grootte op cel lot bepaling bij een enkele cel resolutie te bestuderen. De huidige state-of-the-art single cell micropatterning technieken omvatten zachte lithografie en micro-contact afdrukken, dat is een krachtige technologie, maar vereist getrainde technische vaardigheden en bepaalde faciliteit ondersteuning in microfabricage. Deze beperkingen vereisen een meer toegankelijke techniek. Hier beschrijven we een eenvoudige alternatieve lithografievrije methode: stencil-gebaseerde eencellige patronen. Wij bieden stapsgewijze procedures, waaronder stencilontwerp, polyacrylamidehydrogelfabricage, eiwitopname op basis van stencil en celbeplating en -cultuur. Deze eenvoudige methode kan worden gebruikt om een array van maar liefst 2.000 cellen patroon. We tonen de patronen van cardiomyocyten afgeleid van enkele door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met verschillende celvormen, van een 1:1 vierkant tot een 7:1 volwassen cardiomyocyte-achtige rechthoek. Deze stencil-gebaseerde eencellige patroonis lithografie-vrij, technisch robuust, handig, goedkoop, en vooral toegankelijk voor mensen met een beperkte bio-engineering achtergrond.
Introduction
De komst van hiPSC's en de daaropvolgende ontwikkeling van protocollen voor hun gerichte differentiatie in verschillende celtypen hebben het mogelijk gemaakt om ontwikkeling en ziekte op moleculair en patiëntspecifiek niveau te bestuderen, met name met behulp van door patiënten afgeleide iPSC-cardiomyocyten (iPSC-CC's) om cardiomyopathmieten te modelleren1,2. Echter, een belangrijke beperking tot het bestuderen van ontwikkeling en fysiologie met behulp van het iPSC-systeem en andere in vitro modellen is de afwezigheid van een gestructureerde micro-omgeving. In situ worden cellen onderworpen aan de beperkingen van de extracellulaire matrix (ECM), evenals naburige cellen. De bijzondere biochemische samenstelling en stijfheid van deze micro-omgevingen dicteren de ruimtelijke verdeling van cellen en factoren die beschikbaar zijn voor het aangaan van celhechting. Dit, op zijn beurt, beïnvloedt intracellulaire signalering trajecten, genexpressie, en cel lot bepaling. Bijvoorbeeld, micropatroon iPSC-CM in een volwassen-achtige staaf vorm heeft een aanzienlijk betere contractiele vermogen, calcium stroom, mitochondriale organisatie, elektrofysiologie, en dwars-tubule vorming3. Zo zijn de eigenschappen van de micro-omgeving integraal in de regulatie van cellulaire functies.
Eerdere micropatroontechnieken waren sterk afhankelijk van fotolithografie(figuur 1A). In deze techniek wordt een laag fotogevoelig polymeer, of fotoresist, gesponnen op een plat substraat van oplossing tot een dunne film van ongeveer 1 μm dik. Vervolgens wordt ultraviolet (UV) licht op de fotoresist aangebracht door middel van een masker met het gewenste patroon. Blootstelling aan ultraviolet (UV) licht verandert de fotoresist chemisch door de oplosbaarheid ervan in de respectievelijke ontwikkelaarsoplossing aan te passen, waardoor het gewenste patroon van het masker op het substraat wordt overgebracht. Veel micropatroonmethoden bevatten fotolithografie, omdat het nanometer-aan micrometer-niveau controle over het ontwerp van de celpatronen verleent. Het spinnen van de fotoresist is echter zeer gevoelig voor onzuiverheden, omdat de kleinste stofdeeltjes de verspreiding van de oplossing in een dunne film zullen verstoren. Fotolithografie moet daarom worden uitgevoerd in niet-verontreinigde faciliteiten, die kostbaar zijn om te onderhouden en speciale expertise vereisen om te gebruiken. Bovendien zijn de chemische stoffen die in de fotolithografie worden gebruikt vaak giftig voor cellen en kunnen ze belangrijke biomoleculen denatureren. Fotolithografie vormt dus aanzienlijke obstakels voor de fabricage van micropatronen voor handige biologische toepassingen.
In 1994, Whitesides en collega's4 overwon een aantal van de uitdagingen in verband met fotolithografie door baanbrekende een verzameling van technieken genaamd zachte lithografie. In zachte lithografie wordt een microgestructureerd oppervlak gemaakt met polydimethylsiloxaan (PDMS), een transparant, rubberachtig materiaal, gebruikt om een patroon van ECM-eiwitten te genereren4. Veelvoorkomende zachte lithografische technieken omvatten microcontactafdrukken en microfluïdische patronen. Bij het printen van microcontact, momenteel de meest populaire zachte lithografische methode, brengt een PDMS-stempel bekleed met ECM-eiwitten het materiaal over op een oppervlak op de gebieden die door de stempel worden gecontacteerd (figuur 1B). In microfluïdische patronen worden microstructuren zodanig ontworpen op een PDMS-oppervlak, zodat wanneer de stempel op een substraat wordt gedrukt, een netwerk van microkanalen ontstaat, waardoor vloeistoffen aan gewenste gebieden kunnen worden geleverd , wordt gecreëerd (Figuur 1C)5. Zachte lithografie biedt verschillende voordelen ten opzichte van fotolithografie. Zodra een master wafer is gemicrofabriceerd, de PDMS stempels kunnen gemakkelijk worden gerepliceerd zonder verdere werkgelegenheid van clean-room faciliteiten. Bovendien maakt de afwezigheid van organische oplosmiddelen in het proces van zachte lithografie het gebruik van polymere materialen zoals polystyreen mogelijk, meestal gebruikt in de celkweek. Ten slotte is micropatroon met behulp van zachte lithografische methoden niet beperkt tot vlakke oppervlakken. Zo verhoogt zachte lithografie de toegankelijkheid en functionaliteit van micropatroonfabricage via fotolithografie6. Zachte lithografie heeft echter belangrijke nadelen. Een eerste etsstap, met behulp van fotolithografie, is bijvoorbeeld nog steeds nodig om de stempel te microfabriceren. Bovendien is micropatroon met behulp van een PDMS-stempel onderhevig aan variaties in de kwaliteit van eiwitoverdracht op het substraat6. Het vermijden van deze discrepanties vereist optimalisatie en consistentie in de druk die wordt uitgeoefend op de PDMS-stempel tijdens eiwitoverdracht, anders kunnen vervorming en vervorming van de functiegrootte van de PDMS-mallen optreden6. Er is ook een grote zorg van herhaaldelijk gebruik van de PDMS als gevolg van kleine molecuul absorptie7.
Om te voorkomen dat het gebruik van zachte fotolithografie en PDMS-stempels, beschrijven we een stencil-gebaseerde, lithografie-vrije single cell micropatterning methode die veel van de obstakels in verband met fotolithografie en zachte lithografie overwint. Bij deze methode wordt een polyacrylamidehydrogel gebruikt als substraat voor de integratie van ECM-eiwit op basis van stencil, waardoor selectieve beplating van enkele hiPSC-CC's mogelijk is. Deze techniek is zeer compatibel met polymere materialen die worden gebruikt in klassieke celkweekomstandigheden. Bovendien zijn de stencils met de juiste reiniging en onderhoud herbruikbaar en bestand tegen afbraak en eiwitabsorptie tijdens het microfabricageproces. Ten slotte is het patroonproces technisch robuust, goedkoop, aanpasbaar en toegankelijk voor mensen zonder gespecialiseerde bio-engineeringvaardigheden. Deze stencil-gebaseerde micropatterning techniek is breed gebruikt in onze recente publicaties modellering gevarieerde cardiomyopathies8,9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabricage van op negatief patroon polyimide gebaseerde stencils
- Een patroon genereren (figuur 2A) in .dxf-indeling met behulp van computerondersteunde ontwerpsoftware (bijvoorbeeld AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).
- Genereer een cirkel (diameter = 22 mm) om de rand van het stencil af te zetten.
- Teken een met vaste vulling gevulde vorm of het gewenste patroon.
- Voeg een chirale letter (bijvoorbeeld R) toe om de voorkant van de stencils te markeren.
OPMERKING: Als voorbeeld wordt een reeks vierkanten en rechthoeken gegenereerd tot iPSC-C's met patroon op eencellige en celpaarniveaus. De ontwerpbestanden zijn beschikbaar (zie Aanvullende bestanden). De limiet voor de microfabricageresolutie is ~10 μm.
- Stuur het ontwerp naar een microfabricagebedrijf om polyimidefilm te laseren en stencils te fabriceren (Figuur 2B,C).
2. Bereiding van sulfo-SANPAH aliquots
OPMERKING: Het protocol is gewijzigd van Fischer et al.11.
- Gebruik een vochtbestendige kartonnen monsteropbergdoos (bijvoorbeeld 100 put, 10 x 10 spaties voor centrifugebuizen, afmetingen: 13,4 cm x 13,4 cm x 5,1 cm). Label het "naam/datum/sulfo-SANPAH 40 μL/gereconstitueerd met 1.200 μL PBS".
- Label 50 microcentrifugebuizen (polypropyleen, 1,5 mL) met een 'S' op het deksel.
- Neem 4 mL watervrije, extra droge dimethylsulfoxide (DMSO) en steriel filter de oplossing met behulp van een membraanfiltereenheid (poriegrootte = 0,22 μm) in een steriele conische buis van 15 mL.
- Bereid een vloeibaar stikstofbad en dek af met het deksel om de verdamping van de vloeibare stikstof te minimaliseren.
- Los 50 mg sulfo-SANPAH op in 2 mL van de gefilterde DMSO.
- Vortex goed om de sulfo-SANPAH volledig op te lossen in de DMSO.
- Verdeel 40 μL aliquots van de sulfo-SANPAH-oplossing in steriele buizen van 1,5 mL.
- Breng de buizen in de doos.
- Flash-freeze de buizen in vloeibare stikstof voor 5 min.
- Bewaar de aliquots op -80 °C.
LET OP: De aliquots kunnen tot 6 maanden worden gebruikt zonder verminderde efficiëntie. De sulfo-SANPAH-concentratie bedraagt 25 mg/mL of 50,77 mM.
3. Sterilisatie van gereedschappen
- Autoclave twee tangen, 24 glazen coverslips (22 x 22 mm, nr. 1 of nr. 1.5), een scheermesje, en drie lint-vrij absorberende doekjes.
LET OP: Om 12 hydrogelconstructies te maken, zijn 24 glazen afdekkingen nodig. Er moeten twee coverslips per constructie zijn. Het is raadzaam om wat reservecovers voor te bereiden. - Plaats twee stukken paraffinefolie (4 x 4 inch) in een ethanolbestendige plastic doos (bijvoorbeeld een 1.000 μL pipetpuntdoos) en steriliseer ze in verse 70% ethanol gedurende ten minste 15 min.
4. Bereiding van polyacrylamidehydrogelprecursoroplossing
OPMERKING: Het protocol is gewijzigd van Lee et al.12.
- Los 125 mg aminoethylmethacrylaat (AEM) op in 36,25 mL gedeïoniseerd water in een 50 mL polypropyleen centrifugebuis door vortexing.
- Voor de bereiding van 50 mL van 10 kPa polyacrylamide precursoroplossing (8-0,15–15 mM), meng 10 mL van 40% acrylamideoplossing, 3,75 mL van 2% bis-acrylamideoplossing en 36,25 mL van de AEM-oplossing bereid in stap 4.1 in een nieuwe 50 mL centrifuge polypropyleenbuis.
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van precursoroplossing is 8% acrylamide, 0,15% bis-acrylamide en 15 mM AEM, die werd gemeten om ~ 10 kPa stijfheid door atomaire kracht microscopie hebben. Volgens de weefseltoepassingen van belang kan de stijfheid van de hydrogel worden gewijzigd door de verhouding van de 40% acrylamide te veranderen tot de 2% bis-acrylamideoplossing. Zo levert 8% acrylamide–0,08% bis-acrylamideoplossing 3 kPa hydrogels op; 8% acrylamide–0,48% bis-acrylamideoplossing levert 38 kPa hydrogels op; 8% acrylamide–0,48% bis-acrylamideoplossing levert 60 kPa hydrogels op. Het is raadzaam om de stijfheid van hydrogels gemaakt van de precursor oplossingen met veranderde verhoudingen te bevestigen.
5. Voorbereiding van de oplossing voor foto-initiatiefnemers
- Voor 1 mL van 5% fotoinitiator oplossing, eerst oplossen 50 mg 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiofenon poeder in 700 μL van 100% ethanol in een 1,5 mL polypropyleen centrifuge buis met deksel.
OPMERKING: 2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiofenon is niet oplosbaar in water. Zorg ervoor dat u het poeder volledig oplost in ethanol door vortexing. - Na het volledig oplossen van de 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiofenon in ethanol door vortexing, voeg 300 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe voor een eindvolume van 1 mL.
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon oplossing is 5%. De verijdelde 5% fotoinitiator oplossing is goed voor 4 weken bij 4 °C.
6. Bereiding van keldermembraanmatrix-eiwitoplossing
OPMERKING: Keldermembraanmatrix (Table of Materials) is een temperatuurgevoelig materiaal. Zorg ervoor dat u werkt op ijs met gekoelde pipet tips en buizen, evenals ijskoude oplossingen. Een nieuwe voorraad van kelder membraan matrix moet langzaam worden ontdooid op ijs bij 4 °C 's nachts.
- Bereid 200 μL keldermembraanmatrix-eiwitoplossing voor per hydrogelconstructie. Voor 12 constructies is 2,4 mL keldermembraanmatrix-eiwitoplossing nodig. Bereid 10% extra oplossing voor (bijv. 2,6 mL).
- Voor elke nieuwe partij / partij van kelder membraan matrix eiwit oplossing, optimaliseren van de verdunning ratio. Test voor het eerst verdunningsratio's van 1:10, 1:20, 1:40 om de verdunningsverhouding te vinden die de beste eigenschappen oplevert voor celpatronen.
OPMERKING: Als de kelder membraan matrix eiwit oplossing is te stroperig, zal het een gel vormen op de top van het stencil, en het is meer kans af te pellen bij het verwijderen van het stencil. Als de eiwitoplossing te vloeibaar is, dringt deze door de patroongaten van de stencils, wat zal resulteren in een slechte kwaliteit patrooning. - Verdun de matrixoplossing van de keldermembraan op ijs met ijskoude Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) media of 1x PBS naar de geoptimaliseerde verdunningsverhouding hierboven. Verdun bijvoorbeeld 120 μL van de voorraadoplossing in 2,4 mL DMEM/F12-media (1:20) en houd het ijs voor later gebruik.
7. Hydrogelfabricage
- Plaats een UV-banklamp (365 nm, 4 mW/cm2)in een biologische veiligheidskap.
- Plaats de gesteriliseerde paraffinefolies vanaf stap 3.2 en droog volledig onder steriele omstandigheden. Als de paraffinefolies niet volledig droog zijn, gebruik dan een vacuümasassysteem om eventuele resterende vloeistof te verwijderen. Plaats zes autoclaved coverslips van stap 3.1 op elke paraffinefilm met behulp van de autoclaved tangen.
- Bereid UV-crosslinkable polyacrylamide precursoroplossing voor door 5% fotoinitiatoroplossing (stap 5.2) te verdunnen met polyacrylamideprecursoroplossing (stap 4.2) in een 50 mL polypropyleen centrifugebuis. Voeg voor 5 mL UV-crosslinkable polyacrylamide-precursoroplossing 50 μL van 5% fotoinitiatoroplossing toe aan 5 mL polyacrylamideprecursoroplossing.
- Filtreer de voorloperoplossing uit stap 7.3 met een filterunit van 50 mL met een poriegrootte van 0,22 μm voor sterilisatie.
LET OP: Bereid altijd nieuwe precursoroplossing. - Afzien van 200 μL polyacrylamideprecursoroplossing vanaf stap 7.4 op elke 22 x 22 mm glazen afdekkingsslip in de paraffine gefilmdpetrischaal en bedek zorgvuldig met nog een glasafdekking van 22 x 22 mm bovenop de oplossing daartussen (figuur 3A).
OPMERKING: Paraffinefolie wordt gebruikt om morsen te voorkomen en om de precursoroplossing tussen de afdekkingen te beperken. - Plaats de afdekslagvormige petrischaal vanaf stap 7.5 onder de UV-banklamp en fotopolymerisatie de polyacrylamide hydrogels gedurende 5 min (figuur 3B).
OPMERKING: Als het oppervlak niet-wit is, vermindert de UV-absorptie van het oppervlak de efficiëntie van het crosslinking. De dekking van wit papier op het niet-witte oppervlak is belangrijk om het UV-intensiteitsverlies te minimaliseren. Om uv-straling te beschermen, bedek je de lamp met aluminiumfolie en draag je een UV-beveiligingsbril. - Maak voorzichtig los een cover slip off van de andere met behulp van een scheermesje door middel van hefboomwerking actie (Figuur 3C).
LET OP: De hydrogel zal meestal vasthouden aan de bovenste coverslip. Let extra op bij het losmaken van de afdekkingsslip van de zachte hydrogel, omdat het waarschijnlijk breekt. - Vul een wegwerp polypropyleen reservoir met PBS. Breng de hydrogel-coverslip composieten in een PBS-bevattend reservoir om de hydrogels in PBS gedurende 5 min te spoelen. Na het spoelen, plaats de hydrogel constructie terug op de paraffine film in de petrischaal.
8. Eiwitvervoeging
- Bereid een ijsemmer en precool PBS.
OPMERKING: Voor zes hydrogels is 1.200 μL koude PBS nodig. - Neem de sulfo-SANPAH aliquot (1 fles = 6 gels).
LET OP: Indien nodig kan de gebruikte hoeveelheid sulfo-SANPAH na optimalisatie worden verminderd. - Voeg 1.200 μL koude PBS toe aan een flesje sulfo-SANPAH aliquot en meng door op en neer te paien.
- Nu200 μL sulfo-SANPAH op de paraffinefolie in de petrischaal en bedek met de hydrogel-coverslip composiet met hydrogel contact sulfo-SANPAH (Figuur 3D).
LET OP: Sulfo-SANPAH is zeer gevoelig voor water als gevolg van hydrolyse. Vers ontdooien van -80 °C vlak voor gebruik. Gebruik of bevries geen restjes. - Stel de hydrogel bloot aan de UV-lamp bij 365 nm, 4 mW/cm2 gedurende 5 min om sulfo-SANPAH te activeren.
OPMERKING: Na blootstelling verandert de sulfo-SANPAH van oranje naar bruin (figuur 3E). Als de hydrogel bruin wordt, duidt het op een succesvolle activering van de fenylazidegroep van sulfo-SANPAH en integratie van sulfo-SANPAH op de hydrogel. Ga direct verder met stappen 8.6−8.9 binnen een maximum van 10 min, omdat de activiteit van sulfo-SANPAH zal afnemen. - Vul een wegwerp polypropyleenreservoir aan met verse PBS. Na de activering van sulfo-SANPAH moet u de geactiveerde hydrogels overbrengen en de hydrogels snel spoelen in een PBS-reservoir om niet-gebonden sulfo-SANPAH te verwijderen.
LET OP: Een lange wasbeurt kan resulteren in een lage eiwitvervoegingsefficiëntie. - Na een snelle spoeling, plaats de hydrogel-bevestigd coverslips op de paraffine film in de petrischaaltjes en zorgvuldig dep de hydrogels met steriele pluisjes-vrije doekjes.
OPMERKING: De resterende PBS op de top van de hydrogel zal resulteren in lekkage van de kelder membraan matrix eiwitoplossing door het stencil, en drogen te uitgebreid zal leiden tot breuk van de hydrogel bij verwijdering van het stencil als gevolg van een te hoge hechting aan het stencil. - Plaats het stencil op de hydrogels en dep met autoclaved lint-vrije doekjes om een strakke afdichting tussen het stencil en de hydrogel te garanderen (Figuur 3F).
- Destijd 200 μL van de verdunde keldermembraanmatrix-eiwitoplossing die vanaf stap 6.3 (Figuur 3G) bovenop wordt bereid. Laat 's nachts in de couveuse (37 °C).
OPMERKING: Wanneer het stencil-hydrogel contact strak is en de kelder membraan matrix eiwit oplossing concentratie is optimaal, de kelder membraan matrix eiwit oplossing zal worden afgezonderd en blijven op de top van het stencil (Figuur 3H). Incubatietijd kan worden verminderd bij optimalisatie. Theoretisch kan het worden teruggebracht tot 30 min-2 uur. - Breng de hydrogels de volgende dag over op een 6-putplaat en dompel ze volledig onder in PBS.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het stencil af te pellen met PBS-onderdompeling over het uitglijder om scheuren en het plakken van de hydrogel aan het stencil te voorkomen. - Verwijder het stencil voorzichtig met autoclaved pincet zonder de hydrogel te scheuren. Resuspend goed met DMEM, breng de patroonhydrogels terug naar de couveuse en laat ze 's nachts testen op eventuele verontreiniging.
- Als de media helder blijven, zijn de hydrogels klaar om te worden gebruikt voor het beplaten van cellen. Optimaliseer de dichtheid van de celbeplating en de incubatietijd om hechting van de cellen voor de respectieve toepassingen mogelijk te maken.
OPMERKING: Voor eencellige patronen van hiPSC-CMs, zaad en incuberen 's nachts. De volgende celnummers worden aanbevolen voor zaaien: 30.000, 60.000 en 90.000 cellen/put. Het zaaien van te veel cellen leidt tot meer dan één cel per patroon. Een celzeef wordt aanbevolen om niet-afzonderlijke cellen te belasten voordat cel zaaien. - De volgende dag, observeren celgehechtheid en verspreiding, en verander de media om zich te ontdoen van vrijstaande cellen.
9. Reiniging van de gebruikte stencils
- Als u restmatrixeiwitten op de gebruikte stencils wilt verwijderen, dompelt u de stencils gedurende 10 min bij 37 °C onder in enzymoplossing (Tabel van materialen).
OPMERKING: Het enzym moet worden geselecteerd, afhankelijk van de gebruikte matrixeiwitten. Voor collageen-rijke matrix eiwit oplossing, gebruik collagenase. Een 10-15 min ultrasoontie in enzymoplossing wordt ook aanbevolen. - Aangezogen de oplossing en aan te vullen met 10% bleekmiddel. Incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Spoel 3x af met PBS.
- Bewaar in 70% ethanol bij 4 °C tot gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fabricage van stencils die een array van vierkanten of rechthoeken bevatten , is aangetoond (figuur 4A). Volgens dit protocol hebben we matrix-eiwiteilanden met patroon verkregen (figuur 4B en figuur 5A) en cellen (figuur 4C). Suboptimale matrixeiwitoplossingsconcentratie leidde tot suboptimale patronen (Figuur 5B). Het is van cruciaal belang om de voorkant van het stencil te gebruiken. Als de achterkant van het stencil wordt gebruikt, neemt de grootte van de matrixeiwiteilanden toe als gevolg van de richting van het lasersnijden (Figuur 6A,B). Hoewel de breedte van de rechthoekige patronen niet significant veranderde (figuur 6C), nam de hoogte aanzienlijk toe bij het gebruik van de achterkant van het stencil, wat leidde tot een vermindering van de beoogde beeldverhouding (Figuur 6D,E). We pasten stencil-gebaseerde patronen op silicium elastomer substraten (Figuur 7). De gedesssineerde cardiomyocyten op silicium elastomersubstraten werden gevisualiseerd door immunocytochemie van cardiale troponine T bij lage vergroting(figuur 7A)en sarcomeric eiwit α-actinine bij hoge vergroting (Figuur 7B). De op stencil gebaseerde patronen kunnen ook worden toegepast op patroon twee cardiomyocyten naast elkaar op hydrogels met verschillende stijfheiden. Als demonstratie tonen we de cardiomyocytepatronen op fysiologisch relevante stijfheid (figuur 8A) en pathologisch relevante stijfheid (Figuur 8B).
Figuur 1: Schematisch van drie goud-standaard micropatroonstrategieën. (A) Fotolithografie. bB) Afdrukken via Microcontact. (C) Microfluïdische patronen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Werkstroom voor het ontwerpen van stencils. (A) Het computerondersteunde ontwerp van het stencil. (B) Een representatieve foto van een lasergesneden polyimide stencil. (C) Een representatieve microscopische afbeelding van een stencil. Het gele gebied vertegenwoordigt het polyimidestencil, terwijl het lichtblauwe gebied een reeks lasergesneden gaten vertegenwoordigt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Foto's van hydrogel fabricage stappen. (A) Polyacrylamide hydrogel fabricage door het ingeklemd van de precursor oplossing tussen twee coverslips. bB) UV-fotocrosslinking van polyacrylamidehydrogels onder de UV-banklamp. De UV-lamp is bedekt met aluminiumfolie voor gebruikersbescherming. (C) De foto-crosslinked hydrogel wordt opgehaald door het losmaken van een coverslip aan de ene kant. (D) De hydrogelconstructie is in contact met de sulfo-SANPAH-oplossing om de hydrogel voor ECM-eiwitopname te wijzigen. Vóór UV-activering is de sulfo-SANPAH oranje. (E) Na UV-activering wordt sulfo-SANPAH bruin, wat aangeeft dat het wordt geactiveerd en op het hydrogeloppervlak is verwerkt. (F) Na het deppen van de hydrogel met steriele pluisjes om overtollig water te verwijderen, wordt het stencil op de hydrogel geplaatst. (G) Kelder membraan matrix eiwit oplossing is gepipetiseerd over de stencil-hydrogel constructies. (H) Als het stencil-hydrogel contact is met succes strak, de kelder membraan matrix eiwit oplossing zal blijven op de top en zal niet sijpelen door. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Micropatterning van keldermembraanmatrix-eiwitten en door de mens geïnduceerde pluripotente cardiomyocyten (hiPSC-CMs) met verschillende rechthoekige vormen. (A) Microscopische afbeeldingen van stencils die lasergesneden rechthoeken met verschillende aspectverhoudingen bevatten (1:1, 4:1, 11:1). BB) Representatieve afbeeldingen van immunostained matrix-eiwiteilanden op hydrogelsubstraten. (C) Representatieve afbeeldingen van hiPSC-CMs gekleurd voor kernen (cyaan) en cardiale troponine T (magenta). Schaalbalk = 20 μm voor panelen B en C. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: De ECM-eiwitconcentratie speelt een essentiële rol bij het genereren van goede patronen. (A) Representatief beeld van een optimale concentratie met een zeer homogene verdeling van keldermembraanmatrixeiwitten in de afzonderlijke patronen. (B) Suboptimale matrix eiwitpatronen als gevolg van lage concentratie, die lekkage van matrix eiwit buiten de patronen en lage hoeveelheden matrix eiwitten in de patronen, zoals bepaald door tarwe kiem agglutinine vlekken veroorzaakt. Schaalbalk = 20 μm voor panelen A en B. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Stencil bijwerking. (A) Kelder membraan matrix eiwitpatronen wanneer de voorkant van het stencil werd gebruikt. (B) Kelder membraan matrix eiwitpatronen wanneer de achterkant van het stencil werd gebruikt. Kwantificering van (C) breedte, (D) hoogte, (E) aspect ratio van rechthoekige kelder membraan matrix eiwiteilanden. Grafiek is uitgezet gemiddelde ± SEM. Statistieken worden berekend door ongepaarde student T-toets. n.s. = niet significant. = p < 0,0001. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Stencil-gebaseerde patronen op silicium eastomeer substraat. (A) Een representatief beeld van cardiomyocyten met een enkelcelpatroon op silicium-elastomersubstraten die zijn gekleurd door de cardiale marker, cardiale troponine T (cTnT), bij lage vergroting. Schaalreep = 300 μm. (B) Een representatieve cardiomyocyte met een enkelcellige patroon die is gekleurd door sarcomisch eiwit α-actinine bij hoge vergroting. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Micropatterning van hiPSC-CMs op polyacrylamidehydrogels met verschillende stijfheiden. aA) 10 kPa,b) 60 kPa. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Stap | Probleem waargenomen | Mogelijke reden | Oplossing |
| 1.1 | De patroongrootte is groter dan verwacht | Stencil wordt omgedraaid | Neem een chirale letter/vorm op in het stencilontwerp om de voor- en achterkant van stencils aan te geven |
| 8.1 | Hydrogelbreuken bij het schillen van stencils | Hydrogel plakt aan stencils | Reiniging van stencils |
| Droog hydrogel niet te veel voordat u stencils plaatst | |||
| 8.13 | Celbijlage is suboptimaal | Gedegradeerde sulfo-SANPAH | Gebruik nieuwe sulfo-SANPAH |
| Inefficiënte eiwitintegratie | Nieuwe ECM-eiwitoplossing voorbereiden | ||
| Oude ECM eiwitoplossing | |||
| 8.13 | Celpatronen is suboptimaal | Kelder membraan matrix eiwit oplossing morst over | Immunostaining uitvoeren met behulp van fluorophore-geconjugeerde anti-muis IgG antilichaam of Tarwe kiem agglutinine om de verdeling van kelder membraan matrix eiwit oplossing op hydrogel te onderzoeken |
| 8.13 | Meer dan één cel op één sleuf | Niet in eencellige suspensie | Gebruik 40−70 μm celzeef om eencellige suspensie te hebben |
| Zaaidichtheid niet optimaal | Optimaliseer de zaaidichtheid van 30 k tot 90 k per mL |
Tabel 1: Richtlijnen voor het oplossen van problemen. Frequente problemen, mogelijke redenen en mogelijke oplossingen worden besproken.
Aanvullende bestanden. Klik hier om bestanden te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een lithografievrije op stencil gebaseerde micropatroonmethode die effectieve patronen van aanhangende cellen mogelijk maakt. In dit protocol tonen we patronen van hiPSC-CMs in verschillende lengte-breedte verhoudingen door micropatterning kelder membraan matrix eiwiteilanden op polyacrylamide hydrogels met fysiologisch- of pathologisch relevante weefselstijfheid of siliciumgebaseerde elastomeersubstraten. Deze methode is relatief eenvoudig en zeer toegankelijk voor alle onderzoekers, met inbegrip van degenen die weinig achtergrond in fotolithografie en microfabricage technieken. De beschreven methode omzeilt belangrijke uitdagingen in verband met het genereren van postzegels met behulp van zachte lithografie en het overbrengen van eiwitten van stempelmallen naar substraten die betrokken zijn bij de microcontactdruktechniek. Dit protocol biedt een workflow aan 1) maak op maat ontworpen stencils met een gebied en vorm van belang op een kosteneffectieve manier; 2) fabriceren een hydrogel substraat met de stijfheid van belang; en 3) ecm-eiwitten op het hydrogelsubstraat efficiënt vervoegen.
Traditionele zachte lithografiemethoden zijn gebruikt voor het patronen van verschillende vormen van ECM-eiwitten, waaronder driehoeken en sterren op substraten van verschillende materialen, zoals materialen op basis van silicium en glazen coverslips13,14. In deze studie tonen we alleen rechthoekige patronen aan gezien de fysiologisch- en pathologisch relevante vorm van cardiomyocyten. Wij geloven dat stencil-gebaseerde patronen van andere complexe vormen kunnen werken zolang het kleinste kenmerk van de vorm niet verder gaat dan de resolutie (~ 10 μm). Met betrekking tot substraatmaterialen tonen we aan dat de op stencilgebaseerde patronen kunnen worden toegepast op hydrogel (figuur 2, figuur 3, figuur 5, figuur 6 en figuur 8) of op silicium gebaseerd elastomersubstraat ( figuur7). De gepresenteerde methode werkt niet op substraten met minimale kleefkracht aan polyimide-materialen zoals weefselkweekkunststoffen en glazen afdekkingen omdat de strakke afdichting tussen het op polyimide gebaseerde stencil en deze substraten niet wordt bereikt. Om een strakke afdichting mogelijk te maken, is verdere oppervlaktemodificatie nodig. Tot slot tonen we aan dat de methode kan worden gebruikt om op betrouwbare wijze celpaarpatronen te produceren op hydrogels met verschillende stijfheiden (d.w.z. 10 kPa, 60 kPa) (Figuur 8).
In het protocol is de meest kritieke stap optimalisatie van ecm-eiwitconcentratie (protocolsectie 6). Het doel van deze stap is het vinden van de optimale concentratie van ECM-eiwit dat stroperig genoeg is om de eiwitoplossing te remmen om door de gaten van het stencil te sijpelen, maar niet te geconcentreerd, om gelatie te voorkomen (Figuur 5). Deze op stencil gebaseerde methode beperkt het type ECM-eiwit niet. Hoewel de viskeuze ECM-eiwitoplossing eerder op de top van het stencil blijft, kan ook een minder viskeuze eiwit worden gebruikt. Een vereiste is ervoor te zorgen dat de oppervlakken van het stencil en DE HYDROGEL droog genoeg zijn om een relatief stabiele hydrofobe interface te vormen. In deze demonstratie werd keldermembraanmatrix-eiwit gebruikt omdat het stroperig en geschikt is voor het kweken van hiPSC-CMs. Echter, andere ECM eiwitten kunnen waarschijnlijk worden gebruikt (bijvoorbeeld fibronectine, gelatine, collageen, laminine).
Naast optimalisatie van de ECM-eiwitoplossing voor elke toepassing, is het genereren van een goede afdichting tussen het stencil en het hydrogeloppervlak cruciaal om een nauwkeurig patroon met het ECM-eiwit te verkrijgen. Omdat overmatig drogen kan leiden tot scheuren van de hydrogel, is het essentieel om het stencil niet te veel te drogen. Deze stappen (d.w.z., het plaatsen van het stencil op de hydrogel evenals zacht pealing het weg daarna) vereisen wat oefening. Het vaststellen van een optimale behandelingsprocedure voor elke gegeven toestand zal ook voorkomen dat de hydrogel aan de stencils. Met deze optimalisatie, submicron schaal laser brandwonden veroorzaakt door gebreken in de laser snijden zal niet wezenlijk van invloed op de techniek met betrekking tot hydrogel schade.
Een andere belangrijke stap is het gebruik van de voorkant van het stencil bij het plaatsen van het stencil op het hydrogelsubstraat. We vonden dat het gebruik van elke kant heeft een effect op het substraat, vermoedelijk als gevolg van laser snijden (Figuur 6). Een aanbeveling bij het patroon cellen in specifieke grootte of vorm voor de eerste keer is het genereren van een optimalisatie stencil. Stencil-ontwerp functies komen niet noodzakelijkerwijs overeen met de uiteindelijke patroon celmaten. We raden u aan een optimalisatiestencil te genereren dat een verloop van functiegroottes bevat. We hebben een tabel opgesteld met mogelijke problemen en mogelijke oplossingen om te helpen bij het oplossen van problemen(tabel 1).
Het is niet verplicht om hetzelfde microfabricagebedrijf te gebruiken dat in dit manuscript wordt genoemd. De sleutels tot nauwkeurige generatie van het stencil zijn de straaldiameter van de laser en de dikte van de stencilfilm, in ons geval, polyimide (50 μm). Wij geloven dat een laserlab uitgerust met een geschikte laser het stencil met een paar stappen kan genereren, waardoor de laserintensiteit, uitlijning en andere variabelen worden geoptimaliseerd. Hoewel we slechts met één bedrijf hebben gewerkt, zijn er veel bedrijven beschikbaar die precisielasersnijden uitvoeren.
Een beperking van deze methode is resolutie. Hoewel fotolithografie nanoschaalresolutie kan bereiken, is de op stencil gebaseerde patroonresolutie beperkt tot de resolutie van het lasersnijden van de polyimidestencils, die tot op heden meestal op de schaal van een paar microns (~ 10 μm) is. Aangezien de gemiddelde celgrootte meer dan 10 μm bedraagt, is de resolutie echter algemeen van toepassing op een eencellige patronen.
Samengevat biedt deze methode veelzijdige platforms voor het bestuderen van cel-ECM-interacties, het onderzoeken van celstructuur-functiecorrelatie en vele andere toepassingen. Wij geloven dat dit protocol veel biomedische onderzoekers ten goede zal komen en eencellige studies zal vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door postdoctorale fellowship van Stanford Child Health Research Institute (CHRI) en het National Institute of Health (1F32HL142205-01) aan S.L. de NIH Office of Director's Pioneer Award (LM012179-03), de American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), het Stanford Cardiovascular Institute, de Hoffmannroep en Schfer Foundation, en de Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine aan S.M.W , awards van het National Institute of Health (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) en Tobacco-related Disease Research Program (TRDRP 27IR-0012) aan J.C.W, de American Heart Association (AHA Postdoctoral) Fellowship Award (18POST34030106) aan H.Y. We danken Dr Andrew Olsen van Stanford Neuroscience Microscopy Service op de ondersteuning van confocale beeldvorming van de micropatroon hiPSC-CM. Wij danken H.Y. voor het eerste stencilontwerp, de fabricage, de micropatterning van iPSC-CM op de polyacrylamidehydrogel gecoate coverslip, en voorlopige confocale beeldvorming van de sarcomerestructuur van enkelcellige micropatroon iPSC-CMs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
