Summary
Этот протокол вводит метод микропаттернирования без литографии, который прост и доступен для тех, кто имеет ограниченный биоинженерный опыт. Этот метод использует индивидуальные лазерно-вырезанные трафареты для микропаттернвальных внеклеточных матричных белков в форме, представляющих интерес для модуляции морфологии клеток. Процедура микропаттернирования продемонстрирована с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитами.
Abstract
Методы микрошаблонирования широко использовались в клеточной биологии для изучения влияния контроля формы и размера клеток на определение судьбы клеток при разрешении одной клетки. Современные современные методы микропаттернирования одноклеточных элементов включают мягкую литографию и микроконтактную печать, которая является мощной технологией, но требует подготовленных инженерных навыков и определенной поддержки объектов в микрофабрикации. Эти ограничения требуют более доступной техники. Здесь мы описываем простой альтернативный метод, свободный от литографии: шаблон на основе трафаретов на основе одной ячейки. Мы предоставляем пошаговые процедуры, включая конструкцию трафарета, изготовление гидрогеля полиакриламидов, внеся белковое включение на основе трафаретов, а также клеточное покрытие и культуру. Этот простой метод можно использовать для шаблона массива до 2000 ячеек. Мы демонстрируем узор кардиомиоцитов, полученных из одного человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) с различными формами клеток, от 1:1 квадрата до 7:1 взрослых кардиомиоцитов, как прямоугольник. Этот трафаретный одноклеточный узор без литографии, технически прочный, удобный, недорогой и, самое главное, доступный для тех, кто имеет ограниченный биоинженерный опыт.
Introduction
Появление hiPSCs и последующее развитие протоколов для их направленной дифференциации на различные типы клеток позволили изучить развитие и болезни на молекулярном и пациент-специфическом уровне, в частности, с использованием кардиомиоцитов iPSC (iPSC-CMs) для моделирования кардиомиопатий1,2. Однако основным ограничением для изучения развития и физиологии с использованием системы iPSC и других моделей in vitro является отсутствие структурированной микросреды. На месте клетки подвергаются ограничениям внеклеточной матрицы (ECM), а также соседних клеток. Особый биохимический состав и жесткость этих микросред диктуют пространственное распределение клеток, а также факторы, доступные для участия в стеге клеточной печении. Это, в свою очередь, влияет на внутриклеточные сигнальные пути, экспрессию генов и определение судьбы клеток. Например, микропаттернированный iPSC-CM в взрослой форме стержня имеет значительно лучшую сократительную способность, кальцийпоток, митохондриальную организацию, электрофизиологию и поперечное образование3. Таким образом, свойства микросреды являются неотъемлемой частью регулирования клеточных функций.
Предыдущие методы микропаттернинга в значительной степени опирались на фотолитографию(рисунок 1A). В этом методе, слой фоточувствительного полимера, или photoresist, вращается на плоском субстрате из раствора, чтобы сформировать тонкую пленку толщиной около 1 мкм. Далее ультрафиолетовый (УФ) свет наносится на фотоустойчивость через маску, содержащую желаемый узор. Воздействие ультрафиолетового (УФ) света химически изменяет фотоустойчивость, изменяя его растворимость в соответствующем решении разработчика, перенося желаемый узор из маски на субстрат. Многие методы микропаттернов включают фотолитографию, поскольку она наделяет нанометр микрометровым контролем над конструкцией клеточных узоров. Тем не менее, спиннинг фоторезиста очень чувствителен к примесям, так как мельчайшие частицы пыли нарушит распространение раствора в тонкую пленку. Поэтому фотолитография должна осуществляться на незагрязненных объектах, которые являются дорогостоящими в обслуживании и требуют специальных знаний для использования. Кроме того, химические вещества, используемые в фотолитографии часто токсичны для клеток и могут денатурировать важные биомолекулы. Таким образом, фотолитография создает значительные препятствия для изготовления микрошаблонов для удобного биологического применения.
В 1994 году Whitesides и его коллеги4 преодолели некоторые проблемы, связанные с фотолитографией, впервые в ней собрал коллекцию методов, называемых мягкой литографией. В мягкой литографии, микроструктурированная поверхность сделанная с polydimethylsiloxane (PDMS), прозрачным, резиноподобным материалом, использована для того чтобы произвести картину протеинов ECM4. Общие мягкие литографические методы включают микроконтактную печать и микрофлюидный узор. В микроконтактной печати, в настоящее время наиболее популярным мягким литографическим методом, штамп PDMS, покрытый белками ECM, передает материал на поверхность в районах, с которыми контактирует марка(рисунок 1B). При микрофлюидном узоре микроструктуры проектируются на поверхности PDMS таким образом, что при нажатии на подтекст штамп создается сеть микроканалов, через которые жидкости могут доставляться в нужные области (рисунок 1С)5. Мягкая литография предлагает несколько преимуществ по сравнению с фотолитографией. После того, как мастер пластины microfabricated, PDMS марки могут быть легко воспроизведены без дальнейшего трудоустройства чистых помещений. Кроме того, отсутствие органических растворителей в процессе мягкой литографии позволяет использовать полимерные материалы, такие как полистирол, обычно используемые в клеточной культуре. Наконец, микропаттернирование с использованием мягких литографических методов не ограничивается плоскими поверхностями. Таким образом, мягкая литография повышает доступность и функциональность изготовления микрошаблона по сравнению с фотолитографией6. Однако мягкая литография имеет существенные недостатки. Например, начальный шаг травления, с помощью фотолитографии, по-прежнему требуется для микрофабриката марки. Кроме того, микропаттернирование с использованием штампа PDMS подвержено изменениям в качестве переноса белка на субстрат6. Избежание этих расхождений требует оптимизации и согласованности давления, применяемого к штампу PDMS во время переноса белка, в противном случае деформация и искажение размеров функций форм PDMS может произойти6. Существует также серьезная озабоченность неоднократно госиспользованием PDMS из-за поглощения малых молекул7.
Чтобы избежать использования мягкой фотолитографии и штампов PDMS, мы описываем метод микропатии на основе трафаретных элементов, свободных от литографических одноклеточных элементов, который преодолевает многие препятствия, связанные с фотолитографией и мягкой литографией. В этом методе, гидрогель полиакриламид используется в качестве субстрата для ввода белка eCM на основе трафаретов, что позволяет селективное покрытие одного hiPSC-CMs. Этот метод очень совместим с полимерными материалами, используемыми в классических условиях клеточной культуры. Кроме того, при надлежащей очистке и обслуживании трафареты многоразовые и устойчивы к деградации и поглощению белка в процессе микрофабрикации. Наконец, процесс шаблонирования является технически надежным, недорогим, настраиваемым и доступным для тех, кто не имеет специализированных навыков биоинженерии. Этот трафарет на основе микропаттернинга техника была широко использована в наших последних публикациях моделирования разнообразных кардиомиопатий8,9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление отрицательного шаблона полиимидных трафаретов
- Создайте шаблон(рисунок 2A) в формате .dxf с помощью программного обеспечения для проектирования с помощью компьютера (например, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator).
- Создайте круг (диаметр ю 22 мм) для разграничения границы трафарета.
- Нарисуйте твердую форму или желаемый узор.
- Включите хиральную букву (например, R), чтобы отметить переднюю сторону трафаретов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, массив квадратов и прямоугольников генерируется для шаблона iPSC-CMs на одноклеточных и клеточных парах. Файлы проектирования доступны (см. Дополнительные файлы). Предел разрешения микрофабрикации составляет 10 мкм.
- Отправить дизайн в микрофабрикации компании лазерной огранки полиимидной пленки и изготовлению трафаретов(рисунок 2B,C).
2. Подготовка аликов сульфо-САНПАХ
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол изменен от Фишера и др.11.
- Используйте влагостойкий картонный образец ящика для хранения (например, 100 скважин, 10 х 10 мест для центрифуговых трубок, габариты: 13,4 см х 13,4 см х 5,1 см). Пометьте его "имя/дата/сульфо-САНПАХ 40 Л/восстановлено с 1200 Л Л ПБС".
- Этикетка 50 микроцентрифуговых труб (полипропилен, 1,5 мл) с 'S' на крышке.
- Возьмите 4 мл ангидроуса, дополнительный сухой диметилсульксид (DMSO) и стерильный фильтр растворса с помощью мембранного фильтра (размер пор - 0,22 мкм) в стерильную коническую трубку площадью 15 мл.
- Приготовьте ванну с жидким азотом и накройте крышкой, чтобы свести к минимуму испарение жидкого азота.
- Растворите 50 мг сульфо-САНПАХ а в 2 мл фильтрофильтрованного DMSO.
- Вихрь хорошо полностью растворяется сульфо-САНПАХ в DMSO.
- Распределите 40 аликотов сульфо-SANPAH в стерильные трубки 1,5 мл.
- Перенесите трубки в коробку.
- Флэш-заморозить трубки в жидком азоте в течение 5 мин.
- Храните аликвоты при -80 градусах по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Aliquots можно использовать на up to 6 месяцев без умаленной эффективности. Концентрация сульфо-САНПАХ составляет 25 мг/мл или 50,77 м/м/ м/
3. Стерилизация инструментов
- Автоклав два щипца, 24 стеклянных крышки (22 х 22 мм, No 1 или No 1.5), одно лезвие бритвы, и три без ворса абсорбирующими салфетками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сделать 12 конструкций гидрогеля, 24 стеклянные крышки необходимы. На конструкцию должно быть два крышки. Целесообразно подготовить некоторые запасные крышки. - Поместите две части парафина пленки (4 х 4 дюйма) в этанол устойчивых пластиковых поле (например, 1000 л пипетки наконечник поле) и стерилизовать их в свежем 70% этанола, по крайней мере 15 минут.
4. Приготовление раствора прекурсора полиакриламидного гидрогеля
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол изменен от Ли и др.12.
- Растворите 125 мг аминоэтилметакрилата (АЕМ) в 36,25 мл деионизированной воды в 50 мл полипропиленовой центрифугной трубки путем вихря.
- Для подготовки 50 мл из 10 кПа полиакриламидового раствора прекурсора (8-0,15-15 мМ), смешайте 10 мл 40% раствора акриламида, 3,75 мл 2% раствора бис-акриламида и 36,25 мл раствора AEM, подготовленного в шаге 4,1 в новом 50 м полипропилуне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация раствора прекурсора составляет 8% акриламида, 0,15% бис-акриламид, и 15 мМ AEM, который был измерен, чтобы иметь жесткость 10 кПа атомной микроскопии силы. В соответствии с ткани приложений, представляющих интерес, жесткость гидрогеля может быть изменена путем изменения соотношения 40% акриламида на 2% бис-акриламид раствор. Например, 8% акриламида-0,08% бис-акриламид раствор дает 3 кПа гидрогелей; 8% акриламид-0,48% бис-акриламид раствор дает 38 кПа гидрогелей; 8% акриламид-0,48% бис-акриламид раствор дает 60 кПа гидрогелей. Рекомендуется подтвердить жесткость гидрогелей, изготовленных из растворов-прекурсоров с измененными соотношениями.
5. Подготовка решения для фотонинитиаторов
- Для 1 мл 5% раствора фотонитиатора сначала растворите 50 мг 2-гидрокси-4'-(2-гидроксиетхокси)-2-метилпрофифенона порошок в 700 л 100% этанола в 1,5 мл полипропиленовой центрифуговой трубки с крышкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: 2-Гидрокси-4'-(2-гидроксиец)-2-метилпропиофенон не растворим в воде. Убедитесь в том, чтобы полностью растворить порошок в этаноле путем вихря. - После полного растворения 2-гидрокси-4'-(2-гидроксиетхокси)-2-метилпропиофенон в этанол путем вихря, добавить 300 л фосфат-буферного солей (PBS) для окончательного объема 1 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация 2-гидрокси-4'-(2-гидроксиетхокси)-2-метилпропиофенон раствор составляет 5%. Неслопонный 5% раствор фотоинитиатора хорош в течение 4 недель при 4 градусах Цельсия.
6. Подготовка подвальной мембранной матрицы белкового раствора
ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица мембраны подвала (Таблица материалов) будет температур-чувствительным материалом. Убедитесь в том, чтобы работать на льду с охлажденной пипетки советы и трубки, а также ледяной растворов. Новый запас подвальной мембранной матрицы следует медленно размораживать на льду при 4 градусах Цельсия в одночасье.
- Подготовьте 200 л подвальной мембранной матримовой белковой раствора на конструкцию гидрогеля. Для 12 конструкций необходимо 2,4 мл раствора белка мембранной матрицы. Подготовьте 10% дополнительного раствора (например, 2,6 мл).
- Для каждой новой партии / много подвале мембраны матрицы белка раствор, оптимизировать коэффициент разбавления. Впервые, тест коэффициентов разбавления 1:10, 1:20, 1:40, чтобы найти коэффициент разбавления, который дает лучшие качества для клеточного шаблона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если подвальная мембранная матрица белковый раствор слишком вязкой, он будет образовывать гель на вершине трафарета, и это, скорее всего, отслаивается при удалении трафарета. Если белковый раствор слишком жидкий, он проникает через узорные отверстия трафаретов, что приведет к низкому качеству узорства. - Разбавлять подвальную мембранную матримальную белковую оболочку раствором на льду с измененным игловым исредним/питательным смешением F-12 (DMEM/F12) или 1x PBS к оптимизированному коэффициенту разбавления выше. Например, разбавить 120 л бульонного раствора в 2,4 мл средств DMEM/F12 (1:20) и держать на льду для последующего использования.
7. Изготовление гидрогеля
- Поместите лампу для УФ-скамейки (365 нм, 4 мВт/см2)в капюшон биологической безопасности.
- Поместите стерилизованные парафина пленки со ступени 3.2 и высушите полностью в стерильных условиях. Если парафиновые пленки не полностью сухие, используйте вакуумную систему аспирации, чтобы удалить любую остаточную жидкость. Поместите шесть автоматических крышки от шага 3.1 на каждом парафина пленки с помощью autoclaved щипц.
- Приготовьте УФ-перекрестный раствор прекурсора полиакриламидов, разбавив 5% раствор фотоинитиатора (шаг 5.2) раствором прекурсора полиакриламида (шаг 4.2) в 50 мл полипропиленовой центрифугной трубки. Для 5 мл УФ-кросслинкия раствора прекурсора полиакриламида добавьте 50 зл 5% раствора фотоинитиатора к 5 мл раствора-прекурсора полиакриламида.
- Фильтр решение прекурсора от шага 7.3 с помощью 50 мл фильтра единицы с 0,22 мкм размер пор для стерилизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда готовьте свежее решение-прекурсор. - Распределить 200 зл полиакриламидов решение прекурсора от шага 7,4 на каждом 22 х 22 мм стеклянная крышка скольжения в парафин ежефабина Петри блюдо и тщательно накрыть еще 22 х 22 мм стеклянной крышкой сверху, чтобы бутерброд решение между (Рисунок 3A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Параффин пленка используется, чтобы избежать разлива и ограничить решение прекурсора между крышками. - Поместите крышку содержащие Петри блюдо от шага 7.5 под ЛАМПой УФ скамейке и фотополимеризации полиакриламид гидрогели в течение 5 мин(рисунок 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если поверхность небелая, уф-абсорбция поверхности снижает эффективность фотокроссуликов. Покрытие белой бумаги на небелой поверхности важно, чтобы свести к минимуму потери интенсивности УФ- Для защиты от УФ-излучения накройте лампу алюминиевой фольгой и надевайте очки для защиты от УЛЬТРАВ. - Тщательно отсоедините одну крышку от другого с помощью лезвия бритвы с помощью рычагов действий(рисунок 3C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрогель, как правило, придерживаться верхней крышкой. Обратите особое внимание при отходе крышки от мягкого гидрогеля, потому что он, скорее всего, сломается. - Заполните одноразовый полипропиленовый резервуар PBS. Перенесите гидрогель-покрывало композиты в содержащий PBS резервуар для промывки гидрогелей в PBS в течение 5 мин. После промывки поместите конструкцию гидрогеля обратно на парафина пленку в чашке Петри.
8. Спряжение белка
- Подготовка ведро льда и precool PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для шести гидрогелей, 1200 Л холодного PBS необходимо. - Вынизить аликот сульфо-САНПАХ (1 флакон и 6 гелей).
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости, количество сульфо-SANPAH используется может быть уменьшена после оптимизации. - Добавьте 1200 л холодных PBS в флакон аликота сульфо-SANPAH и перемешайте, прокладывая вверх и вниз.
- Распределить 200 л сульфо-САНПАХ на парафина в чашке Петри и накрыть гидрогелем-покрывальным композитом с гидрогелем, контактируя сульфо-САНПАХ (Рисунок 3D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сульфо-САНПАХх очень восприимчив к воде из-за гидролизов. Свежая оттепель от -80 градусов по Цельсию прямо перед использованием. Не используйте и не замораживайте остатки. - Вывешить гидрогель в ультрафиолетовую лампу на 365 нм, 4 мВт/см2 в течение 5 мин для активации сульфо-САНПАХ.
ПРИМЕЧАНИЕ: После воздействия, сульфо-SANPAH будет меняться с оранжевого на коричневый(рисунок 3E). Если гидрогель становится коричневым, это указывает на успешную активацию фенилазидной группы сульфо-САНПАХ и включение сульфо-САНПАХ на гидрогель. Непосредственно продолжайте шаги 8.6-8.9 в пределах максимум 10 мин, потому что активность сульфо-САНПАХ будет снижаться. - Пополнить одноразовый полипропиленовый резервуар свежим и пБС. После активации сульфо-САНПАХ перенесите активированные гидрогели и быстро промойте гидрогели в резервуаре PBS для удаления несвязанного сульфо-САНПАХа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длительная стирка может привести к низкой эффективности спряжения белка. - После быстрого промыть, поместите гидрогель-прилагается крышки на парафина пленки в чашках Петри и тщательно мазок гидрогелей с стерильными салфетками без ворса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные PBS на вершине гидрогеля приведет к утечке подвала мембраны матрицы белка через трафарет, и сушка слишком широко приведет к разрыву гидрогеля при удалении трафарета из-за слишком высокой приверженности трафарет. - Поместите трафарет на верхней части гидрогеля и мазок с autoclaved ворса свободных салфетки для обеспечения плотного уплотнения между трафаретом и гидрогелем (Рисунок 3F).
- Тщательно распределите 200 л разбавленного мембранного матемного белкового раствора, подготовленного с шага 6.3(Рисунок 3G)сверху. Оставьте на ночь в инкубаторе (37 градусов по Цельсию).
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда трафарет-гидрогель контакт плотно и концентрация белка матрицы мембраны подвала эффективна, раствор протеина матрицы мембраны подвала будет sequestered и остает на верхней части трафарета(Рисунок 3H). При оптимизации время инкубации может быть сокращено. Теоретически, он может быть уменьшен до 30 мин-2 ч. - На следующий день, передать гидрогели на 6 хорошо пластины и полностью погрузить их в PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется снять трафарет с погружением PBS над крышкой, чтобы предотвратить разрыв и прилипание гидрогеля к трафарету. - Тщательно удалите трафарет с помощью автоматически хотетов без разрыва гидрогеля. Отдохните хорошо с DMEM, вернуть узорчатые гидрогели в инкубатор, и оставить их на ночь, чтобы проверить на любое загрязнение.
- Если средства массовой информации остаются ясными, гидрогели готовы к использованию для клеточного покрытия. Оптимизируйте плотность покрытия клеток и время инкубации, чтобы сделать сливку клеток для соответствующих атак.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для одноклеточного узора hiPSC-CMs, семян и инкубировать на ночь. Для посева рекомендуются следующие номера клеток: 30 000, 60 000 и 90 000 клеток/хорошо. Посев слишком много клеток приводит к более чем одной клетке на шаблон. Сотовый ситечко рекомендуется напрягать неодиночные клетки перед посевом клеток. - На следующий день, наблюдать привязанность клеток и распространение, и изменить средства массовой информации, чтобы избавиться от отдельных клеток.
9. Очистка использованных трафаретов
- Чтобы удалить остаточные матричные белки на используемых трафаретах, погрузите трафареты в ферментный раствор(Таблица Материалов) в течение 10 мин при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фермент должен быть выбран в зависимости от используемых матричных белков. Для раствора матричного белка, богатого коллагеном, используйте коллагенеза. Также рекомендуется ультразвуковая ультразвуковая а10-15 мин в ферментном растворе. - Аспирируй раствор и пополняй 10% отбеливателя. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Промыть 3x с PBS.
- Хранить в 70% этанола при 4 градусах Цельсия до использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Было продемонстрировано изготовление трафаретов, содержащих массив квадратов или прямоугольников(рисунок 4A). Следуя этому протоколу, мы получили узорчатые матричные протеиновые острова(рисунок 4B и рисунок 5A)и клетки(рисунок 4C). Концентрация субоптимального матричного белкового раствора привела к неоптимальному паттерну(рисунок 5В). Очень важно использовать переднюю сторону трафарета. При использовании задней стороны трафарета размер матричных белковых островов увеличивается за счет направления лазерной резки(рисунок 6A,B). В то время как ширина прямоугольных узоров существенно не изменилась(рисунок 6C),высота значительно увеличилась при использовании задней стороны трафарета, что привело к снижению предполагаемого соотношения сторон(рисунок 6D,E). Мы применили трафарет на основе узора кремниевых эластомерных субстратов(рисунок 7). Узорчатые кардиомиоциты на кремниевых эластомерных субстратах были визуализированы иммуноцитохимией сердечного тропонина Т при низком увеличении(рисунок 7А)и саркомерикического белка З-актинина при высоком увеличении(рисунок 7В). Трафаретнатное узор может также применяться к рисунку двух кардиомиоцитов бок о бок на гидрогелях с различной жесткостью. В качестве демонстрации мы показываем кардиомиоцитный узор на физиологически-соответствующей жесткости(рисунок 8А)и патологически-релевантной жесткости(рисунок 8B).
Рисунок 1: Схема трех стратегий микропаттернирования по золотому стандарту. (A) Фотолитография. (B) Микроконтактная печать. (C) Микрофлюидический узор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Рабочий процесс проектирования трафаретов. (A) Компьютерная конструкция трафарета. (B) Репрезентативная фотография лазерного триимида. (C) Репрезентативное микроскопическое изображение трафарета. В желтой области представляет собой трафарет полиамида, в то время как светло-голубая область представляет собой массив лазерной вырезать отверстия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Фотографии шагов по изготовлению гидрогеля. (A) Полиакриламид гидрогель изготовления путем сэндвич-раствор прекурсора между двумя крышками. (B) УФ-фото-кроссуливание гидрогелей полиакриламидов под лампой УФ-скамейки. УФ-лампа покрыта алюминиевой фольгой для защиты пользователя. (C) Фото-кросс-связанных гидрогель извлекается путем отсоединения coverslip с одной стороны. (D) Конструкция гидрогеля находится в контакте с раствором сульфо-SANPAH для изменения гидрогеля для ввоза белка ECM. Перед активацией УФ-излучения сульфо-САНПАХ оранжевый. (E) После активации УФ-излучения, сульфо-SANPAH становится коричневым, указывая, что он активирован и включен на поверхность гидрогеля. (F) После dabbing гидрогеля со стерильной ворса свободной салфетки, чтобы удалить избыток воды, трафарет помещается на гидрогель. (G) Подвальная мембранная матрима белковый раствор пипетки над трафарет-гидрогель конструкций. (H) Если трафарет-гидрогель контакт успешно жесткой, подвальная мембранная матрица белка раствор будет оставаться на вершине и не просачивается через. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Микропаттернирование белков мембранной матрицы подвала и индуцированных человеком плюрипотентных кардиомиоцитов стволовых клеток (hiPSC-CMs) с различными прямоугольными формами. (A) Микроскопические изображения трафаретов, содержащих прямоугольники лазерной огранки с различными соотношениями сторон (1:1, 4:1, 11:1). (B) Репрезентативные изображения иммуноокрашенных матричных белковых островов на гидрогелевных субстратах. (C) Представитель изображения hiPSC-CMs окрашенных для ядер (циан) и сердечного тропонина T (магента). Шкала бар 20 мкм для панелей B и C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Концентрация белка ECM играет важную роль в создании надлежащих моделей. (A) Репрезентативное изображение оптимальной концентрации с очень однородным распределением белков мембранной матрицы подвала в одиночных картинах. (B) Субоптимальные шаблоны матричных белков из-за низкой концентрации, что вызвало утечку матричного белка вне шаблонов и низкое количество матричных белков в рамках моделей, как это определено зародышей пшеницы агглютинин окрашивания. Шкала бар 20 мкм для панелей A и B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Stencil побочный эффект. (A) Подвал мембраны матрицы белков моделей, когда передняя сторона трафарета был использован. (B) Подвал мембраны матрицы белков моделей, когда задняя сторона трафарета был использован. Количественная оценка (C) ширина, (D) высота, (E) отношение аспекта прямоугольных островов матрицы мембраны подвала. График построен в среднем по sem. Статистика рассчитывается по неспаренному студенческому T-тесту. n.s. - не существенно. p qlt; 0.0001. Шкала бар 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: На основе стенов на кремниевом эластомерном субстрате. (A) Репрезентативное изображение одноклеточных узорчатых кардиомиоцитов на кремниевых эластомерах, окрашенных сердечным маркером, сердечным тропонином T (cTnT), при низком увеличении. Шкала бар 300 мкм. (B) Представитель одноклеточного узором кардиомиоцитов окрашенных саркомерикным белком-актинином при высоком увеличении. Шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Микропаттернирование hiPSC-CMs на гидрогелях полиакриламидов с различной жесткостью. (A) 10 кПа, (B) 60 кПа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Шаг | Наблюдаемая проблема | Возможная причина | Решение |
| 1.1 | Размер шаблона больше, чем ожидалось | Stencil переворачивается | Включите хиральную букву/форму в конструкцию трафарета, чтобы указать переднюю и заднюю сторону трафаретов |
| 8.1 | Гидрогельные переломы при пилинге трафаретов | Гидрогель прилипает к трафаретам | Очистка трафаретов |
| Не сушите гидрогель слишком много, прежде чем положить трафареты | |||
| 8.13 | Вложение ячеек является неоптимальным | Деградированный сульфо-САНПАХ | Использование нового сульфо-САНПАХ |
| Неэффективное включение белка | Подготовка нового белкового раствора ECM | ||
| Старый белковый раствор ECM | |||
| 8.13 | Узор клеток неоптимальн | Подвальная мембранная матрима белка решение разливается | Выполните иммуностоина с помощью фторофора-конъюгированных антитела IgG антимы или пшеницы зародышевой агглютинин для изучения распределения подвала мембраны матрицы белка раствора на гидрогеле |
| 8.13 | Более одной ячейки на одном слоте | Не в одноклеточной подвеске | Используйте 40-70 мкм-ситечко для одноклеточной подвески |
| Плотность посевов не является оптимальной | Оптимизация плотности посева от 30 k до 90 k per mL |
Таблица 1: Руководящие принципы устранения неполадок. Обсуждаются частые проблемы, возможные причины и потенциальные решения.
Дополнительные файлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить файлы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем метод микропаттернирования на основе литографии, который позволяет эффективно узорить клетки адептов. В этом протоколе мы демонстрируем узорство hiPSC-CMs в различных соотношений длины и ширины путем микропаттернинга подвальной мембранной матрицы белковых островов на гидрогелях полиакриламидов с физиологически- или патологически значимыми щипчинтами тканей или кремниевыми эластомерными субстратамами. Этот метод является относительно простым и очень доступным для любых исследователей, в том числе тех, кто имеет мало опыта в фотолитографии и микрофабрикации методов. Описанный метод обходит значительные проблемы, связанные с созданием марок с использованием мягкой литографии и передачей белков из штамповых форм в субстраты интереса, участвующие в технике микроконтактной печати. Этот протокол обеспечивает рабочий процесс для 1) создать специально разработанные трафареты с областью и формой интереса в экономически эффективным образом; 2) изготовить гидрогель субстрат с жесткостью интереса; и 3) эффективно спрягает белки ECM на гидрогелевом субстрате.
Традиционные методы мягкой литографии были использованы для узорства различных форм белков ECM, включая треугольники и звезды на субстратах различных материалов, таких как кремниевые материалы и стеклянные крышки13,14. В этом исследовании мы демонстрируем только прямоугольные закономерности, учитывая физиологически- и патологически соответствующую форму кардиомиоцитов. Мы считаем, что трафаретное узор других сложных форм может работать до тех пор, пока наименьшая особенность формы не выходит за рамки разрешения (10 мкм). Что касается субстрата материалов, мы демонстрируем трафарет на основе шаблона могут быть применены на гидрогеле(Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6 и Рисунок 8) или кремниевых основе эластомера субстрат(Рисунок 7). Представленный метод не работает на субстратах с минимальной клейкой к полиимид-материалам, таким как пластмассы культуры тканей и стеклянные крышки, потому что герметичное уплотнение между трафаретом на основе полиимидов и этими субстратами не достигается. Для обеспечения плотного герметизации требуется дальнейшая модификация поверхности. Наконец, мы показываем, что метод может быть использован для надежного производства клеточных парных моделей на гидрогелях с различной жесткостью (т.е. 10 кПа, 60 кПа)(рисунок 8).
В протоколе наиболее важным шагом является оптимизация концентрации белка ECM (протокол 6). Цель этого шага состоит в том, чтобы найти оптимальную концентрацию белка ECM, который является достаточно вязким, чтобы ингибировать белковый раствор просачиваться через отверстия трафарета, но не слишком концентрированный, чтобы избежать гелирования(рисунок 5). Этот метод на основе трафаретов не ограничивает тип белка ECM. Хотя вязкий раствор белка ECM, скорее всего, останется на вершине трафарета, менее вязкий белок также может быть использован. Одним из требований является обеспечение того, чтобы поверхности трафарета и гидрогеля PA были достаточно сухими, чтобы сформировать относительно стабильный гидрофобный интерфейс. В этой демонстрации, подвальная мембранная матрица белка была использована, потому что он вязкий и подходит для культивирования hiPSC-CMs. Однако, другие белки ECM, вероятно, могут быть использованы (например, фибронектин, желатин, коллаген, ламинин).
В дополнение к оптимизации раствора белка ECM для каждого данного применения, создание надлежащего уплотнения между трафаретом и поверхностью гидрогеля имеет решающее значение для получения точной картины с белком ECM. Поскольку чрезмерная сушка может привести к разрыву гидрогеля, важно не перекрыть трафарет. Эти шаги (т.е. размещение трафарета на гидрогеле, а также мягко pealing его покинуть потом) требуют некоторой практики. Создание оптимальной процедуры обработки для каждого данного состояния также позволит избежать гидрогеля придерживаться трафаретов. При такой оптимизации лазерные ожоги субмикронного масштаба, вызванные изъянов в лазерной резке, существенно не повлияют на технику в отношении повреждения гидрогеля.
Другим важным шагом является использование передней части трафарета при размещении трафарета на гидрогелевом подставке. Мы обнаружили, что использование каждой стороны влияет на субстрат, предположительно из-за лазерной резки(рисунок 6). Одной из рекомендаций, когда узорные клетки в определенном размере или форме в первый раз является создание трафарета оптимизации. Функции stencil-дизайна не обязательно соответствуют окончательным узорчатым размерам ячейки. Мы рекомендуем создать трафарет оптимизации, содержащий градиент размеров объектов. Мы подготовили таблицу с перечислением потенциальных проблем и возможных решений, чтобы помочь с устранением неполадок(таблица 1).
Не требуется использовать ту же компанию микрофабрикации, что и в этой рукописи. Ключи к точному поколению трафарета являются диаметр луча лазера и толщина трафаретной пленки, в нашем случае полиимида (50 мкм). Мы считаем, что лазерная лаборатория, оснащенная соответствующим лазером, может генерировать трафарет несколькими шагами, оптимизируя интенсивность лазера, выравнивание и другие переменные. Хотя мы работали только с одной компанией, Есть много доступных компаний, которые выполняют точность лазерной резки.
Ограничением для этого метода является разрешение. В то время как фотолитография может достичь наномасштабного разрешения, разрешение на основе трафаретов ограничивается разрешением лазерной резки полиимидных трафаретов, которые на сегодняшний день, как правило, в масштабе нескольких микрон (10 мкм). Тем не менее, учитывая, что средний размер ячейки составляет более 10 мкм, разрешение, как правило, применимо к любому одноклеточному шаблону.
Таким образом, этот метод предоставляет универсальные платформы для изучения взаимодействий клеток-ECM, изучения корреляции структуры и функций клеток и многих других приложений. Мы считаем, что этот протокол принесет пользу многим биомедицинским исследователям и будет способствовать одноклеточным исследованиям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана постдокторской стипендией от Стэнфордского научно-исследовательского института здоровья детей (CHRI) и Национального института здравоохранения (1F32HL142205-01) в S.L. NIH Офис Директора Pioneer Award (LM012179-03), Американская ассоциация сердца учрежденных следователя премии (17EIA33410923), Стэнфордский сердечно-сосудистый институт, Хоффманн и Шрёпфер Фонда, и Стэнфордский отдел сердечно-сосудистой медицины, Департамент медицины S.M.W , Награды От Национального института здравоохранения (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) и программа исследований заболеваний, связанных с табаком (TRDRP 27IR-0012) в J.C.W, Американская ассоциация сердца (AHA) Постдокторская стипендиальная премия (18POST3030106) в H.Y. Мы благодарим д-ра Эндрю Олсена из Стэнфордской службы микроскопии неврологии за поддержку конфокальной визуализации микрошаблона hiPSC-CM. Мы благодарим H.Y. за первый дизайн трафарета, изготовление, одноклеточный микропаттерн iPSC-CM на полиакриламидном гидрогеле с покрытием крышкой, а также предварительное конфоковое изображение саркомерной структуры одноклеточных микрошаблонов iPSC-CMs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
