Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolation og karakterisering af voksne hjertefibroblaster og Myofibroblaster

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60909
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2American Red Cross, National Headquarters

Summary

Opnåelse af en ren population af fibroblaster er afgørende for at studere deres rolle i sårreparation og fibrose. Beskrevet her er en detaljeret metode til at isolere fibroblaster og myofibroblaster fra uskadte og tilskadekomne musehjerter efterfulgt af karakterisering af deres renhed og funktionalitet ved immunfluorescens, RTPCR, fluorescens-assisteret cellesortering, og kollagen gel sammentrækning.

Abstract

Hjertefibrose som reaktion på skade er en fysiologisk reaktion på sårheling. Der er gjort en indsats for at studere og målrette fibroblast undertyper, der mindsker fibrose. Men, fibroblast forskning er blevet hindret på grund af manglen på universelt acceptable fibroblast markører til at identificere quiescent samt aktiveret fibroblaster. Fibroblaster er en heterogen cellepopulation, hvilket gør dem vanskelige at isolere og karakterisere. Den præsenterede protokol beskriver tre forskellige metoder til at berige fibroblaster og myofibroblaster fra uskadte og tilskadekomne musehjerter. Ved hjælp af en standard og pålidelig protokol til at isolere fibroblaster vil gøre det muligt at studere deres roller i homøostase samt fibrose graduering.

Introduction

Hjertefibroblaster, celler af mesenkymale oprindelse, spiller en væsentlig rolle i opretholdelsen af den elektriske ledning og mekaniske kræfter i hjertet ud over vedligeholdelse af hjertearkitektur under homøostase1. Efter skade aktiveres disse celler, udvides og producerer ekstracellulære matrixproteiner (ECM)2. Mange prækliniske undersøgelser har afsløret fibroblaster som kritiske cellulære regulatorer, der opretholder den strukturelle integritet af et skadet hjerte3 samt vigtigste effektorceller, der er ansvarlige for ukontrolleret produktion og aflejring af ECM-proteiner, hvilket resulterer i stiv ardannelse og hjertesvigt4. Fibroblaster er en heterogen gruppe af celler, hvilket gør det udfordrende at dissekere deres reparative funktion fra pro-fibrotiske maladaptive egenskaber. For nylig er den funktionelle heterogenitet af to forskellige fibroblast undertyper efter myokardieskade blevet defineret, hvilket indikerer muligheden for at isolere forskellige fibroblast undertyper og studere deres rolle i sårheling5.

Opnåelse af en ren fibroblast befolkning er afgørende i delineating deres funktionelle rolle i reparation og fibrose. Men tilstedeværelsen af flere fibroblast markører, der genkender andre celletyper gør det udfordrende at isolere en væsentligt ren fibroblast population6. Flere elegante undersøgelser har udtænkt smarte måder at isolere hjertefibroblaster fra uskadte og sårede myocardium. Den mest populære og veletablerede metode til berigelse af fibroblaster er gennem selektiv vedhæftning efter enzymatisk vævsfordøjelse7.

Derudover er fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) af fibroblaster baseret på celleoverfladeantigener blevet beskrevet med succes8. I undersøgelsen blev mesenkymale celler efter enzymatisk fordøjelse sorteret som afstamningsnegative (Lin: Ter119−CD45−CD31−) og gp38-positive (gp38+) fra musehjerter. Gp38+ve celler blev bekræftet at være fibroblaster baseret på deres co-udtryk af col1α1 og andre mesenkymale markører. Selv om de fleste væv fordøjelse er afsluttet efter dissekere ud ventrikel i en petriskål, en nylig undersøgelse har undersøgt brugen af en direkte nål enzym perfusion af venstre hjertekammer til at isolere myocytter og ikke-myocytter, som omfatter fibroblaster9. Fibroblaster blev derefter isoleret ved selektiv vedhæfte lse i dette tilfælde.

Denne protokol beskriver isolering og berigelse af fibroblaster ved hjælp af tre metoder. Den første er en allerede etableret metode, der involverer selektiv vedhæftning af fibroblaster efter enzymatisk fordøjelse. Den anden metode bruges til primært at isolere skade-induceret alpha glat muskel udtrykke myofibroblaster. Den tredje metode omfatter sekventiel, magnetisk udtynding af en enzymfordøjet hjertecellesuspension af hæmatopoietiske og endotelceller. Efter udtømning isoleres fibroblaster/myofibroblaster baseret på tilstedeværelsen af antigenet MEFSK4 ved hjælp af magnetiske perler. For nylig, MEFSK4 er blevet beskrevet som et antigen til stede på quiescent samt aktiveret fibroblaster, hvilket gør det til en passende markør for fibroblast identifikation og isolation. Naturligvis har alle de metoder, der er beskrevet her, unikke begrænsninger. Det anbefales derfor stærkt at kontrollere renheden af den isolerede cellepopulation ved flowanalyse, immunfarvning og semi-kvantitativ pcr i realtid. Men, disse metoder kan udvides på, og yderligere markører kan tilføjes for at udelukke andre forurenende populationer før udnytte fibroblast og myofibroblast populationer for afgørende eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse nøje fastholder anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr af National Institutes of Health. Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee godkendte protokollen (protokolnummer: M1600076-01).

1. Hjertedissektion

  1. Forberedelse af opløsning
    1. KHB buffer
      1. Ved hjælp af en omrøringbar opløses langsomt 9,4 g Krebs-Henseleit bufferpulver (KHB) i 900 ml DDI-vand.
        BEMÆRK: Bufferen vil bundfælde, hvis den omrøres for hurtigt eller for længe. KHB-bufferen skal være kold under fibroblast-isolation.
      2. Der tilsættes 2,9 mM CaCl2 og 24 mM NaHCO3. pH-værdien justeres til 7,2-7,3 og fortyndes til et volumen på 1 L med dH2O.
      3. Med et sterilt filter (0,22 μm) opbevares ved 4 °C i op til 4 uger. Opbevares på is eller ved 4 °C under isolation.
    2. Collagenase fordøjelse cocktail
      1. Forbered fordøjelsecocktail dagen for fibroblast isolation. Bestemme den passende mængde fordøjelsecocktail i henhold til antallet af hjerter; 5 ml cocktail pr. 1 hjerte.
      2. Forbered kollagen blanding (se Tabel af materialer)og DNase I i henhold til producentens anvisninger.
      3. For 20 ml total fordøjelsescocktail tilsættes 17,5 μL DNase I, 180 μL 1 M HEPES og 500 μL kollagen til et tomt konisk 50 ml rør.
      4. Der tilsættes en tilstrækkelig volumen af Hanks Balanced Salt-opløsning (HBSS) med Ca2+ og Mg2+ for at opnå et samlet volumen på 20 ml.
    3. Rød blodcelle (RBC) lysis buffer
      1. Bestem den samlede nødvendige volumen baseret på antallet af hjerter (5 ml/hjerte). 10x RBC lysis lagerbufferen fortyndes til 1x ved hjælp af dH2O.
    4. Fibroblast medier: 10% FBS i DMEM F-12
      1. Tilføj 10% FBS til DMEM-F12 med L-glutamin og HEPES. Der tilsættes 10 U/ml penicillin/streptomycin, 2,5 μg/ml anti-svampe og 2,5 μg/ml mycoplasma profylaktisk (se Materialetabel). Opbevares ved 4 °C.
  2. Hjertedissektion
    1. Forbered en 6 brøndplade på is med 2 ml kold KHB pr. brønd til at opbevare hjerter under dissektion. Udnyt autoclaved kirurgisk saks og pincet.
    2. Euthanize mus på 12 uger eller ældre af isofluran overdosis, og følg med cervikal dislokation.
    3. Alternativt, for aktiveret fibroblast isolation, fremkalde myokardieinfarkt i 12 uger gamle mus ved koronararterie ligation10. Afliv musene 8-10 dage efter skaden.
    4. Spray krop med 70% ethanol og orientere, så den ventrale side vender mod eksperimentatoren. Fastgør eller behold vedhæng for at forhindre interferens.
    5. Skær mavehuden og musklen åben, men undgå piercing leveren. Skær lodret mod brystbenet, og forsigtigt åbne brystkassen og samtidig undgå piercing af hjertet. Fortsæt med at skære gennem brystkassen for at eksponere hjertet.
    6. Brug pincet, forsigtigt løfte hjertet ud af brystet, skære væk enhver lunge eller overskydende væv knyttet til ydersiden af hjertet. Fjern ventrikel og sted i en brønd af 6 godt plade med kold KHB. Fortsæt med at dissekere hjerter på denne måde, indtil alle prøver er blevet isoleret.
  3. Enzymatisk dissociation af hjertet
    1. Brug pincet, gentagne gange klemme og ophidse hjertet i KHB at fjerne overskydende blod. Overfør hjertet til en ren steril 10 cm2 plade. Ved hjælp af en enkelt kant klinge, hurtigt hakke hjertet i små stykker.
    2. Tilsæt 1 ml kollagenfordøjelsescocktail og fortsæt hakken, indtil stykkerne er små nok til at overføre med en 1 ml mikropipette. Der overføres stykker til et konisk 50 ml rør med en 1 ml mikropipette. Vask plade 2x med 2 ml kollagen fordøjelsecocktail.
      BEMÆRK: Hvis du skærer en del af pipettespidsen af, kan det hjælpe med at samle større stykker hjerte, som ellers kan sidde fast i pipettespidsen.
    3. Inkuber konisk rør ved 37 °C i 30 minutter med rokkende eller omrøring. Sikkert rør efter behov. Resuspender 10x med en 5 ml pipet, indtil indholdet er homogent, og inkuber det koniske rør ved 37 °C i 15 minutter med rotation eller omrøring.
    4. Resuspend10x med en 10 ml pipet indtil homogen. Prime en 40 μm celle si ved at fugte filteret med 1-2 ml KHB buffer oven på en ny 50 ml konisk rør. Der tilsættes 25 ml KHB-buffer til fordøjelsessuspension, resuspendere og filtreres gennem en primet 40 μm cellesi. Skift filter efter behov.
      BEMÆRK: Efterhånden som filtreringen aftager, kan det let at tappe rør eller bruge en 1 ml mikropipette til at trække suspension fra undersiden af filteret hjælpe cellesuspensionen igennem en delvist blokeret 40 μm cellesi.
    5. Der centrifugeres ved 400 x g og 4 °C i 10 min. Supernatanten fjernes, og pelleten suspenderes igen i 1x RBC lysisbuffer (5 ml/hjerte). Inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur (RT).
    6. Der centrifugeres ved 400 x g og RT i 10 min. Fjern derefter supernatanten, og der vaskes ved at suspendere pellet i 1 ml KHB-buffer.
    7. 9 ml KHB-buffer ender, og der filtreres gennem primet 40 μm cellesi til et nyt konisk 50 ml-rør. Centrifugeved 400 x g og RT i 10 min.
    8. Fjern supernatanten, resuspender i 1 ml fibroblast medier eller PBS, og bestemme cellenummeret. Fibroblaster kan isoleres ved de tre forskellige metoder, der er beskrevet nedenfor.

2. Isolering af fibroblaster fra enkelt celle suspension

  1. Fibroblast isolation: differentialplating (Figur 1)
    1. Forbered en 6-brøndplade ved at tilføje 2 ml fibroblast medier pr brønd og hvirvlende pladen til at dække brøndbunden.
    2. Resuspender celler i 1 ml medier pr. hjerte. Plade 1 ml cellesuspension pr. brønd, således at et hjerte (teoretisk) er ved at blive belagt pr. brønd. For eksempel ville seks hjerter blive suspenderet i 6 ml medier, derefter belagt i seks brønde med 1 ml cellesuspension pr. brønd.
    3. Swirl plade til jævnt fordelt celler. Der tilsættes yderligere 1-2 ml-medier pr. brønd for et samlet volumen på op til 5 ml pr. brønd, og der indsaskes ved 37 °C i 4 timer.
    4. Fibroblaster vil blive adskilt af selektiv vedhæftning efter 4 h. Fjern løssatte og døde celler ved at fjerne medier. Vask vedlagte celler med 2 ml PBS og tilsæt 2-4 ml sterilt fibroblast-medie pr. brønd. Inkuber ved 37 °C indtil det sammenløb. Skift medie hver 2-4.
  2. Fibroblast Isolation: FACS ved hjælp af en GFP reporter mus model (Figur 1)
    1. FACS-buffer
      1. Der forekommer 15 ml 5% føtal kvægserum (FBS) i dPBS uden Ca2+ og Mg2+. Opbevares på is eller ved 4°C.
    2. FC-blokkerløsning
      1. Der fremstilles 0,5 μL FC-blokker (renset antimuse-CD16/CD32) i 25 μL FACS (1:50 fortynding). 25 μL FC-blokkeropløsning kræves pr. prøve. Opbevares på is eller ved 4 °C.
    3. Prøveforberedelse og antistoffarvning
      BEMÆRK: Antistoffortyndinger kan tilberedes på forhånd, men dette kan risikere lys- eller temperatureksponering.
      1. Forbered 7AAD eller Ghost farvestof violet 510, der er 2x den nødvendige fortynding i FACS buffer. Se tabel 1 for antistoffer og fortyndinger.
      2. Resuspender 500.000 nyisolerede celler i 25 μL FC-blokkeropløsning for at forhindre uspecifik binding af FC-antistofregionen til en FC-receptor. Inkuber i 5 minutter på RT.
      3. 7AAD eller Ghost farvestof violet 510 antistof til det endelige volumen på 25 μL cellesuspension. Inkuber i 30-60 minutter på is i mørke.
      4. Vask ved resuspension i 1 ml FACS buffer. Der centrifugeres ved 500 x g i 5 min ved 4°C.
      5. Resuspender pellet i anbefalet flow cytometriprøvevolumen af FACS buffer (300 μL) og overførsel til flow cytometrirør.
    4. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)
      BEMÆRK: GFP-αSMA reportermus var et bidrag fra Dr. Ivo Kalajzic11. Denne mus udtrykker GFP under alfasmooth muskelcelle (αSMA) promotor. αSMA er blevet brugt som markør for aktiverede fibroblaster (myofibroblaster)12.
      1. Ved aktiveret fibroblast (αSMA, der udtrykker myofibroblast) isolation, fremkaldes myokardieinfarkt i 12 uger gamle GFP-αSMA-mus ved koronararterieligation. Ofre musene 8-10 dage efter skade.
      2. Efter en enkelt celle suspension fra de sårede mus hjerter, sortere αSMA+ ve fibroblaster for grøn fluorescerende protein (GFP). Brug ufarvede ubeskadigede fibroblaster til at indstille baggrundssignalet i GFP-kanalen efter kompensation.
      3. Gate for levende GFP+ve celler ved gating for 7AAD-ve /GFP+ve celler eller Ghost farvestof violet 510-ve/GFP+ ve celler og sortere GFP udtrykke αSMA+ve myofibroblasts.-ve Saml cellerne i fibroblast medier.
  3. Fibroblast isolation: magnetisk perle-baseret isolering af fibroblaster (Figur 1)
    1. Stødpude til ækvilibrering
      BEMÆRK: Forbered altid frisk buffer til isolationer.
      1. Forbered 0,5% BSA og 2 mM EDTA i PBS. Afgasbufferen ved omrøring af opløsningen, mens der monteres et vakuum på beholderens låg.
        BEMÆRK: Omrøring fjerner overskydende gas fra opløsningen, som derefter fjernes gennem vakuum, således at bobler ikke tilstoppe separationskolonnen ved brug.
    2. Magnetisk mærkning: CD45+ hæmatopoietiske celler
      1. Der centrifugeres isolerede celler fra mushjerter ved 500 x g i 5 min, og fjern derefter supernatanten.
      2. Resuspender cellepelletsen i 1 ml ligevægtsbuffer. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
      3. Cellesuspensionen centrifugeres som ovenfor, og cellepellet resuspenderes i 90 μL ækvilibreringsbuffer pr. 1 x 107 celler i alt. Der tilsættes 10 μL CD45+ magnetiske perler pr. 1 x 107 celler i alt. Bland godt og inkuber i mindst 15 minutter ved 4°C.
      4. Cellerne indlægges ved tilsætning af 2 ml ækvilibreringsbuffer pr. 1 x 107 celler i alt, hvorefter der centrifugeres ved 500 x g i 10 min ved 4°C.
      5. Fjern supernatant, tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer og resuspender op til 1 x 107 i alt celler i 2 ml equilibration buffer. Hvis der er mere end 107 celler til stede, skal eres bufferen lineært. Cellerne føres gennem et filter på 40 μm for at forhindre cellesammenlægninger i at tilstoppe separationskolonnematrixen.
    3. Magnetisk adskillelse: CD45+ hæmatopoietiske celler
      1. Adskillelsessøjlen anbringes i magnetfeltet på en egnet separator og en ligevægtskolonne med mindst 3 ml PBS.
      2. Indsaml ikke-mærkede celler i flowthroughen (FT), og kolonne 3x vaskes med 3 ml ligevægtsbuffer. Indsaml vasker med FT. Fjern kolonnen fra separatoren. Kolonnen anbringes på et konisk rør på 15 ml.
      3. Skyl magnetisk mærkede CD45+ celler ud ved at pipettere 5 ml ligevægtsbuffer på kolonnen og kraftigt kaste cellerne med et stempel, der følger med kolonnen.
      4. Der centrifugeres eluent samt FT/vaskefraktioner ved 500 x g. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
    4. Magnetisk mærkning og separation: CD31+ endotelceller
      1. Gentag protokol for CD45+ magnetisk mærkning og separation (punkt 2.3.2-2.3.3), undtagen brug CD31+ magnetiske perler til at inkubere med FT og vaske dele fra CD45+ isolation.
    5. Magnetisk mærkning og separation: MEFSK4+ fibroblaster
      1. Gentag protokol for CD45+ magnetisk mærkning ved hjælp af MEFSK4 anti-feeder-APC antistof i stedet for magnetiske perler. FT og vask portionerne fra CD31+ isolation ved 500 × g i 5 min, og fjern derefter supernatanten. Resuspender cellepellet i 1 ml ligevægtsbuffer, og tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
      2. Der tilsættes 10 μL MEFSK4 anti-feeder-APC-antistof pr. 1 x 107 celler. Inkuber i mindst 15 minutter ved 4 °C.
      3. MEFSK4 antistofbundne celler vaskes ved tilsætning af 5 ml ligevægtsbuffer pr. 1 x 107 celler i alt, hvorefter cellerne centrifugeres ved 500 x g i 5 min.
      4. Fjern supernatant og resuspender i anti-APC perler, ved hjælp af samme volumen af MEFSK4 anti-feeder-APC antistof, der anvendes. Inkuber på is i 15 minutter ved 4 °C.
      5. Der centrifugeres ved 500 x g i 10 min. Supernatanten fjernes, istandtages i 2 ml ligevægtsbuffer pr. 1 x 107 celler i alt, og der fortsættes med magnetisk adskillelse som tidligere beskrevet (punkt 2.3.3). Magnetisk adskilt MEFSK4+ve/ CD45-ve/CD31-ve fibroblaster kan bruges til renhed analyser og andre downstream applikationer.-ve

3. Renhed og funktionalitet Analyse af isolerede fibroblast Population

  1. ANALYSE AF FACS-populationens renhed: αSMA-GFP-celleanalyse (Figur 2)
    1. Resuspender friskisolerede celler i 25 μL fc-blokkeropløsning for at forhindre uspecifik binding af antistoffer. Inkuber i 5 minutter på RT.
    2. Valgfrit: Der tilsættes 25 μL 7AAD eller Spøgelsesfarveviolet 510 til cellesuspension. Inkuber i 30-60 minutter på is i mørke.
    3. Vask ved resuspension i 1 ml FACS buffer. Centrifugeved 500 x g i 5 min.
    4. Resuspender pellet i 50 μL FACS buffer. Tilføj CD31-PE-, CD45-APC- og AN2/NG2-antistoffer direkte til cellesuspensionen. Inkuber i 15 minutter på is (Tabel 1).
    5. Vask ved resuspension i 1 ml FACS buffer. Centrifugeved 400 x g i 5 min.
    6. Tilføj æsel anti-rotte AlexaFluor 405 sekundært antistof til cellerne mærket med ukonjugerede primære antistof. Inkuber i 30 minutter på is.
    7. Vask ved resuspension i 1 ml FACS buffer. Centrifugeved 400 x g i 5 min.
    8. Resuspender pellet i anbefalet flow cytometriprøvevolumen af FACS buffer (300 μL) og overføres til et mærket flowcytometrirør til flowanalyse.
      BEMÆRK: FACS-analyse til karakter i mefsk4-antigenets udtryk ved isolerede fibroblaster er beskrevet i punkt 3.3.
  2. Fibroblast renhed analyse: immunofluorescens (Figur 3A)
    1. Frø 30.000 primære fibroblaster (P0-P1) pr godt på coverslips placeret i en 24 godt plade og kultur indtil 80% confluent. Eller koncentrat sorteret CD45+ og CD31+ celler (30.000 celler pr. brønd) på en coverslip ved cytospin ved 400 x× g (en metode, der anvendes til at deponere celler direkte og jævnt på en coverslip i en 24 brøndplade).
    2. Fastgør celler med kold acetone i 15 min. Vask 3x gange med PBS.
    3. Bloker lysbilleder i 10% gedeserum. Inkubere dias med primære antistoffer natten over (Tabel 2).
    4. Vask dias 3x i PBS. Inkubersekundære antistoffer i 2 timer (tabel 2).
    5. Counterstain slides, og monter med en dråbe DAPI i slow-fade monteringsmedier.
  3. ANALYSE AF FACS-populationens renhed: MEFSK4-sondering (Figur 3B)
    1. Resuspender friskisolerede celler i 25 μL FC-blokkeropløsning for at forhindre uspecifik binding af antistoffer. Inkuber i 5 minutter på RT.
    2. Valgfrit: Der tilsættes 25 μL 7AAD eller Spøgelsesfarveviolet 510 til cellesuspension. Inkuber i 30-60 minutter på is i mørke.
    3. Vask ved resuspension i 1 ml FACS buffer. Centrifugeved 500 x g i 5 min.
    4. Resuspender pellet i 50 μL FACS buffer. Add MEFSK4 antistof direkte til cellesuspension. Inkuber i 15 minutter på is (tabel 1).
    5. Vask ved resuspension i 1 ml FACS buffer. Centrifugeved 400 x g i 5 min.
    6. Føj rotte IgG-APC til cellerne (Tabel 1). Inkuber i 30 minutter på is.
    7. Vask ved resuspension i 1 ml FACS buffer. Centrifugeved 400 x g i 5 min.
    8. Resuspender pellet i anbefalet flow cytometriprøvevolumen af FACS buffer (300 μL) og overførsel til flow cytometrirør til flowanalyse.
  4. Fibroblast renhed analyse: semi-kvantitative real-time rtPCR (Figur 3C)
    1. RNA-isolation og semikvantitativ PCR i realtid
    2. Efter berigelse af fibroblaster skal RNA isoleres ved hjælp af et RNA-isolationssæt (se Materialetabel). Følg producentens anvisninger.
    3. Komplet første streng DNA syntese ved hjælp af en cDNA syntese kit (se Tabel over materialer), efter producentens anvisninger.
    4. Udfør semikvantitativ PCR5i realtid .
  5. Fibroblast funktionalitet analyse: kollagen gel kontraktilitet assay (Figur 4)
    1. Kollagen opløsning
      1. Forbered 20 mM HEPES og 44 mM NaHCO3 i DMEM. Der tilsættes 1,67 mg type 1 rottekollagen pr. 1 ml DMEM med HEPES og NaHCO3.
    2. TGFβ-suppleret DMEM
      1. Forbered 10% FBS i DMEM suppleret med antibiotika og anti-svampe. TGFβ tilsættes til en endelig koncentration på 1 ng/ml.
    3. Celle/kollagen blanding og plating
      1. Forbered cellesuspension (P3-P5) og bestemme nødvendige volumen for at opnå 3,3 x 105 celler.
      2. Tilføj suspension volumen med 3,3 x 105 celler til nok kollagen løsning til at opnå 1 ml samlede volumen.
        BEMÆRK: Rottekollagen type 1 koncentration bør nu være 1,5 mg /ml.
      3. I en 48 brøndplade blandes 300 μL cellekollagen per brønd (~1 x 105 celler/brønd). Inkuber ved 37 °C i 15-20 minutter, indtil geleret.
      4. Brug en 30 G nål til at hjælpe med at adskille gel fra brøndvæggene. Der tilsættes 600 μL TGFβ og FBS suppleret DMEM til hver brønd. Billedplader på en reflekterende scanner ved 24 timer og 48 timer.
        BEMÆRK: Alle Immunofluorescence-forsøg blev udført på en flowcytometrimaskine udstyret med tre lasere (405 nm, 488 nm og 640 nm). Data blev erhvervet ved hjælp af en flow data erhverve software (Table of Materials). Yderligere dataanalyse blev udført ved hjælp af flow data analyse software. AlexaFluor 405 og Ghost Dye Violet 510 var begejstrede med 405 nm laser og indsamlet ved hjælp af en 450/50 BP og 525/50 BP filter, henholdsvis. GFP og PE var begejstrede for 488 nm laser og indsamlet ved hjælp af 530/30 BP og 575/26 BP filtre, henholdsvis. Enten APC eller AlexaFluor 647 var begejstret af 640 nm laser og indsamlet ved hjælp af en 670/14 BP filter. Alle cellesorteringsforsøg blev udført på en flowcytometrimaskine (Materialebord) udstyret med fire lasere (405 nm, 488 nm, 561 nm og 640 nm). 7-AAD var begejstret ved hjælp af 561 nm laser og indsamlet med en 670/14 BP filter. GFP og Ghost Dye Violet 510 blev indsamlet ved hjælp af de samme laser/filter kombinationer som beskrevet ovenfor. Alle sorteringsforsøg udnyttede en 100 um dyse med en 17 psi trykkonfiguration for øget downstream levedygtighed af målcellerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flowgating-ordningen, der demonstrerer myofibroblastisolation ved hjælp af αSMA-GFP reportermus
Uskadte hjerter viste ingen påviselige GFP+ celler i αSMA-GFP reporter mus model; De blev derfor brugt til at etablere en port til baggrundssignalet fra Den GFP-kanal, der blev efterkompensation (figur 2). αSMA+ celler blev sorteret på grundlag af tilstedeværelsen af GFP-udtryk fra den skadede venstre ventrikel 10 dage efter MI. En lille procentdel af endotelceller (GFP+/CD31+ celler; SD = 3,8% ± 0,0164; n = 5) og hæmatopoietisk (GFP+/CD45+ celler; SD = 3,18% ± 0,0112; n = 5) celler også udtrykt GFP i de sårede αSMA-GFP musehjerter (Figur 2A). GFP+/CD31-/CD45-celler gav dog ikke AN2, en pericytmarkør.

Ikke-tilskadekomne (quiescent) og tilskadekomne (aktiverede, αSMA+GFP+) celler udtrykt fibroblast markører
GFP+ celler isoleret fra αSMA-GFP mus udtrykt αSMA, kollagen type 1 alpha-1 kæde (COL1α1), vimentin, og periostin, når analyseret af IF analyse. Ikke-skadede fibroblaster isoleret ved selektiv vedhæftning udtrykt vimentin, men viste ikke udtryk for de aktiverede fibroblastmarkører: αSMA, periostin og COL1α1 (Figur 3A). Både uskadte og aktiverede fibroblaster udtrykte MEFSK4-antigenet, når det analyseres ved flowanalyse (figur 3B). Magnetisk isolerede MEFSK4+ve celler fra uskadte mus hjerter udtrykt markører for fibroblaster: Col1a1, pdgfrα, og periostin. I modsætning hertil havde magnetisk isolerede CD45 og CD31 positive celler ubetydeligt udtryk for fibroblast markører.

Fibroblaster og myofibroblaster viste evnen til at indgå kollagen
I cellekultur på stiv plast, fibroblaster har vist sig at pådrage kollagen geler i overværelse af TGFβ, demonstrere deres funktionelle evne til sammentrækning13,14. Denne in vitro karakteristisk for fibroblaster er meget lig bindevæv sammentrækning, der sker under væv reparation samt andre biologiske processer. Både uskadte fibroblaster, isoleret ved selektiv vedhæftning, og myofibroblaster, isoleret og sorteret fra αSMA-GFP mus, viste en evne til at indgå kollagen (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Skematisk fibroblast isolation ved hjælp af tre forskellige tilgange. (A) differentialplettering, (B) GFP+ cellesortering af αSMA-positive celler og (C) magnetisk perlebaseret isolering af fibroblaster. Repræsentativt lyst felt af cellerne i kulturen efter differentialplettering. Skalabar = 50 μM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: FACS-analyse af enkelte celler, der er isoleret fra αSMA-GFP-mushjerter efter MI. (A) Repræsentativ FACS gating ordning, der viser GFP + celler co-udtrykke CD31, CD45, eller AN2 fra αSMA-GFP mus skadet hjerter 10 dage efter myokardieinfarkt (MI). bB) grafisk kvantificering af de fremlagte FACS-data for hjerter efter MI n = 5 forsøg blev udført uafhængigt (***p < 0,0001 som beregnet ved hjælp af envejs ANOVA med Tukey's multiple sammenligningstest). Dette tal er tilpasset fra Saraswati et al.10. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Renhedsanalyser af fibroblaster isoleret fra uskadte og tilskadekomne mus hjerter. (A) Immunofluorescensfarvning af cellepopulationer (P0) fra hjertet af uskadte eller tilskadekomne αSMA-GFP-mus sorteret efter FACS. Både uskadte og aktiverede celler udtrykker fibroblast (FB) markører, såsom COL1α1, og vimentin, men ikke hæmatopoietisk markør CD45 eller endotelmarkøren CD31. Celler isoleret fra tilskadekomne αSMA-GFP mus hjerte udtrykt aktiveret fibroblast markører, αSMA, og periostin, som ikke var til stede i cellerne isoleret fra uskadte mus hjerter. Kerner blev plettet med DAPI, n = 3 forsøg blev udført uafhængigt. Scale bar = 100 μm. (B) Repræsentant FACS overlay histogram af uskadte og aktiverede fibroblaster (P3-P5), der viser udtrykket af fibroblast markør MEF-SK4. For en negativ kontrol blev rotte IgG anvendt, n = 2 forsøg blev udført uafhængigt. (C) Relativ fold ændring af Col1α1, Pdgfrα, og Postn udskrifter i uskadtMEKSK4 + ve fibroblaster, n = 3 eksperimenter blev udført uafhængigt (* p < 0,05 som beregnet ved hjælp af to-vejs ANOVA med Tukey's multiple sammenligninger test). A) og B) tilpasses fra Saraswati et al.10. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Funktionel karakterisering af fibroblaster isoleret fra uskadte og tilskadekomne musehjerter. Repræsentativ figur af kollagen gel sammentrækning i nærvær af uskadte og tilskadekomne aktiveret αSMA+ fibroblaster (P3-P5). Grafen repræsenterer den procentvise ændring i det oprindelige gelområde efter 24 timer og 48 timers sammentrækning, når den er inkuberet med uskadet og skadet aktiveret αSMA+ fibroblaster, n = 2 forsøg blev udført uafhængigt. Dette tal er tilpasset fra Saraswati et al.10. Klik her for at se en større version af dette tal.

Antistof Cellemål Fortynding
7AAD Døde celler 1:1000
Ghost farvestof violet 510 Døde celler 1:1000
APC-CD45 Hæmatopoietiske celler 1:200
PE-CD31 Endotelceller 1:200
anti-AN2/NG2 Pericytter 1:11
Æsel anti-rotte alexa fluor 405 Sekundært antistof 1:100
Anti-feeder celler-APC (MEFSK4) Fibroblaster 1:100
Rotte IgG-APC Kontrolelement af isotype 1:100

Tabel 1: FACS-farvestoffer og antistoffer.

Primært antistof Fortynding
α-glat muskel actin (αSMA) 1:1000
Fibroblast specifikt protein 1 (FSP1)1:250 1:100
COL 1α1 1:1000
Periostin (Periostin) 1:100
Vimentin (Vimentin) 1:200
CD31 1:250
CD45 1:250
Sekundært antistof Fortynding
Ged anti-mus Alexa Fluor 488 1:200
Ged anti-kanin-FITC 1:200
Ged anti-kanin-Cy3 1:200
Ged anti-rotte Alexa Fluor 488 1:200
Ged anti-rotte Alexa Fluor 647 1:200

Tabel 2: Immunfluorescens primære og sekundære antistoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fibroblaster er en heterogen gruppe af celler, identificeret ved forskellige sæt markører. De proteinmarkører, der er blevet brugt til at identificere fibroblaster, er diskoidreceptoren 2 (DDR2), fibronectin, vimentin, kollagen I og III og Thy115,16,17,18,19,20. Mens vimentin er blevet brugt til at identificere uskadte quiescent hjertefibroblaster, har fibroblastspecifikt protein 1, αSMA og periostin vist sig at identificere skadesinducerede aktiverede fibroblaster, idet αSMA er den mest almindelige markør til påvisning af aktiverede fibroblaster6,12,21. Derudover har Tcf21 og MEFSK4 proteiner fået nylig anerkendelse i erkendelse af både quiescent fibroblaster findes i uskadt hjertevæv samt aktiverede fibroblaster herunder myofibroblaster fundet i sårede musehjerter21,22.

Denne protokol anvender tre forskellige tilgange til at isolere og berige fibroblaster og aktiverede fibroblaster, herunder myofibroblaster. Fibroblast evne til fortrinsvis overholde plast bruges i den første tilgang til isolation. Efter enzymatisk fordøjelse med liberase er enkeltcellesuspensionen af celler seedet på en plastikskål for at fortrinsvis klæbe. Den manglende evne til mange ikke-fibroblast celler til at overholde polystyren overfladen af petriskåle giver os mulighed for at fjerne alle medier fra fadet og forblive med en relativt ren population af fibroblaster. En advarsel om at bruge denne teknik er selv om fibroblaster vil fortrinsvis overholde polystyren skålen, nogle forurenende ikke-fibroblast celler kan også vedhæfte, forlader en ikke-homogen population af celler.

Den anden isolationsteknik anvender FACS til at adskille αSMA, der udtrykker myofibroblaster fra andre celler. I den transgene musemodel, der anvendes her, udtrykkes GFP udelukkende sammen med αSMA, så myofibroblaster indeholdende αSMA kan detekteres af en FACS-maskine gennem gfp'ens fluorescerende egenskaber. Denne isolationprocedure gør det muligt for os at opnå en population af celler, der er ca. 99% myofibroblast. Renhedsanalyserne af disse celler er udførligt beskrevet af Saraswati et al.10.

Den tredje isolationsteknik er en effektiv måde at isolere både uskadte og aktiverede fibroblaster ved magnetisk perlebaseret adskillelse af MEFSK4-eksprescelle. Ved at tillade en enkelt cellesuspension at binde sig til anti-CD45 og anti-CD31 magnetiske perler og blive immobiliseret i en matrix på grund af magnetfelt effekter, dette gjorde det muligt adskillelse af eventuelle hæmatopoietiske såvel som endotelceller, der kan have forurenet fibroblast isolation. Da MEFSK4 for nylig er blevet brugt som en pålidelig markør til at identificere fibroblaster, kan et antistof, der binder sig til MEFSK4- udtrykkende celler, anvendes. Efter at have binder en magnetisk perle til antistoffet, hvilket skaber et kompleks, der tillader isolering af fibroblaster, overføres det magnetiske perlecellekompleks gennem en matrix i et magnetfelt, og der opnås en højt beriget fibroblastpopulation. Renheden af den isolerede fibroblast population bør vurderes ved immunfarvning, RTPCR, og flow cytometri analyser.

Som med enhver anden teknik, er der begrænsninger med de teknikker, der er beskrevet i dette manuskript. Begrænsningen af den selektive vedhæftningprotokol og magnetisk perlebaseret isolation er, at disse metoder ikke skelner mellem quiescent og aktiverede fibroblaster. For at berige aktiverede fibroblaster skal isolationen udføres 8-10 dage efter myokardieinfarkt. Derudover er det vigtigt at kontrollere renheden af isolation med andre fibroblast markører. MEFSK4-positiv fibroblastrenhed er kun påvist af RTPCR, anbefales det at teste (ved immunfarvning og flowcytometrianalyse) med andre fibroblastmarkører og markører, der genkender forurenende celletyper, herunder hæmatopoietisk (CD45), endotel (CD31) og pericytter (AN2). Hvis det er muligt, andre fibroblast specifikke markører kunne bruges til yderligere at sortere eller magnetisk isolere fibroblast populationen.

Brug af αSMA-GFP-mus til at isolere og sortere myofibroblaster er en pålidelig teknik til at opnå en aktiveret fibroblastpopulation. Der er dog observeret en ubetydelig procentdel af hæmatopoietiske og endotelceller i flowanalysen. For at forbedre denne teknik bør CD45+ve/CD31+ve- og AN2+ve-celler udelukkes fra GFP+ve/αSMA+ve cellesorteringen. Da αSMA er en bredt accepteret markør for myofibroblaster, er αSMA-GFP reporter musemodellen et værdifuldt værktøj, der bør udnyttes til at studere myofibroblaster i forbindelse med myokardieskader.

Der er flere vigtige fejlfindingstrin, der skal tages i betragtning. Fordøjelsestiden kan reduceres, hvis cellens levedygtighed og udbytte påvirkes. En røre bar bør ikke anvendes til at røre fordøjelsen blandingen, da dette påvirker cellens levedygtighed. Røret skal fastgøres på en rocker eller i en rystende inkubator for at omrøre fordøjelsesblandingen forsigtigt. Resuspension af det fordøjede væv 10x med en 5 ml eller 10 ml pipette er afgørende for korrekt dissociation af celler.

Korrekt røde blodlegemer lysis af enkeltcellesuspensionen skal udnyttes, hvis cellerne skal sorteres eller analyseres ved flow cytometri. For magnetisk perleisolation er afgasning af bufferen afgørende for at forhindre, at der kommer luftbobler i kolonnen. Den kolonne, der anvendes til magnetisk perlecelleisolation, bør ikke genbruges mellem forskellige magnetiske perlekonjugerede celler. For eksempel bør en ny kolonne anvendes til at adskille CD45+ celler, som skal kasseres efter eluering af CD45+ celler, derefter en anden ny for CD31+ celle isolation. I vores hænder har vi ikke set forurening af pericytter i isolerede / sorterede fibroblaster. MefSK4 har imidlertid vist sig at genkende pericytter22. Det anbefales derfor at bruge et ekstra trin til at sortere ud /magnetisk nedbryder pericytter (AN2) fra de enkelte celler. Selvom denne protokol er valideret i 12 uger gamle mus, kan teknikken anvendes til yngre eller ældre mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Ivo Kalajzic for αSMA-GFP mus. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health (NIH) under Award Number R01GM118300 (SS), National Institute of Biomedical Imaging og Bioengineering af NIH under Award Number R21EB019509 (P.P.Y.) og Scientist Development Grant of the American Heart Association under Award Number 17SDG33630187 (S.S.). Flow cytometri analyser blev udført på VUMC Flow Cytometri Shared Resource, som understøttes af Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) og Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetone
Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone) Sigma Aldrich A9528
Bovine Serium Albumin (BSA) Sigma 9048-46-8
Calcium chloride
Citrate Buffer
Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH) Roche Applied Science
DAPI
DDI water
DI water
DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES Life technologies 11330057
Dnase I(20U/mL) BioRad 7326828
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+ Gibco 13190-144
70% Ethanol
FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161
Fetal Bovine Serum (FBS) Life technologies 16000044
10% goat serum
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+ Corning 21-023-CV
1M HEPES Corning 25-060-Ci
Krebs-Henseleit Buffer powder Sigma K3753
Mycoplasma prophylactic (Plasmocin) Invivogen ant-mpp
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)
10x Red Blood Cell Lysis Buffer Miltenyi 130-094-183
Slow-fade Mounting Media
Sodium azide
Sodium bicarbonate
TGFβ
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Type 1 Rat Collagen
Antibodies
7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO) Molecular Probes A1310 dilution = 1:1000; RRID =
CD45-APC BD Bioscience 559864 dilution = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PE BD Bioscience 553373 dilution = 1:200; RRID = AB_394819
CD31 BD Biosciences 553370 dilution = 1:250; RRID = AB_394816
CD45 BD Biosciences 553076 dilution = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α1 MD Bioproducts 203002 dilution = 1:1000; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO) Tonbo Biosciences 13-0870 dilution = 1:1000; RRID =
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11029 dilution = 1:200; RRID = AB_138404
Goat anti-rabbit-Cy3 Southern Biotech 4050-02 dilution = 1:200; RRID = AB_2795952
Goat anti-rabbit-FITC Jackson Immunoresearch Laboratories 711-165-152 dilution = 1:200; RRID = AB_2307443
Goat anti-rat Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 dilution = 1:200; RRID = AB_2534074
Goat anti-rat Alexa Fluor 647 Thermo-Fisher A21247 dilution = 1:200; RRID = AB_141778
Periostin Santa Cruz SC67233 dilution = 1:100; RRID = AB_2166650
Vimentin Sigma Aldrich V2258 dilution = 1:200; RRID = AB_261856
α-smooth muscle actin (αSMA) Sigma Aldrich A2547 dilution = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblast specific protein 1 (FSP1) Millipore 07-2274 07-2274 dilution = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Magnetic Beads Miltenyi Biotec 130-052-301
CD31 Magnetic Beads Miltenyi Biotec 130-087-418
Anti-feeder cells-APC (MEFSK4) Miltenyi Biotec 130-102-900 dilution = 1:100; RRID = AB_2660619
anti-APC Beads Miltenyi Biotec 130-090-855
Rat IgG-APC Miltenyi Biotec 130-103-034 dilution = 1:100; RRID = AB_2661598
Donkey anti-rat Alexa Fluor405 Abcam ab175670 dilution = 1:100
anti-AN2/NG2 Miltenyi Biotec 130-097-455 dilution = 1:11; RRID = AB_2651235
Other Materials
0.22 µm Filter Thermo Scientific 723-2520
10 cm2 Cell Culture Dish Corning 430167
10 mL Pipet Fisherbrand 13-678-11E
40 µm Cell Strainer Fisherbrand 22363547
5 mL Pipet Fisherbrand 13-678-11D
50 mL Conical Tube Falcon 352070
6-well Plate Corning 3506
Flow Cytometry Tubes Falcon 352058
Forceps
Rocker
Single Edge Blade PAL 62-0177
Surgical Scissors
GFP-αSMA Reporter Mice
MACS Separator Magnetic Field
MACS Separation Column
Coverslips
Qaigen Rneasy Mini Kit Qaigen 74104
Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit Ambion AM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit BioRad 1708891
48-well Plate
30G Needle
3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa) BD Biosciences
4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III) BD Biosciences
Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a) BD Biosciences
Flow Data Analysis Software (FlowJo Software) BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  2. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  3. Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
  4. Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
  5. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
  6. Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
  7. Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
  8. Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
  9. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  10. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
  11. Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
  12. Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
  13. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  14. Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
  15. Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
  16. Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
  17. Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
  18. Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
  19. Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
  20. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
  21. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  22. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).

Tags

Biologi isolation αSMA fluorescens aktiveret cellesortering fibroblaster myofibroblast kollagengel immunfluorescens MEFSK4
Isolation og karakterisering af voksne hjertefibroblaster og Myofibroblaster
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Melzer, M., Beier, D., Young, P. P., … More

Melzer, M., Beier, D., Young, P. P., Saraswati, S. Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts. J. Vis. Exp. (157), e60909, doi:10.3791/60909 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter