Summary
هنا ، نعرض طريقة فعالة لتنقية oligodendrocytes وإنتاج وسيط oligodendrocyte مكيفة التي يمكن استخدامها لتجارب الثقافة المشتركة.
Abstract
في الجهاز العصبي المركزي ، تشتهر oligodendrocytes بدورها في الميالات المحورية ، التي تسرع من انتشار إمكانات العمل من خلال التوصيل الملحي. وعلاوة على ذلك، يشير عدد متزايد من التقارير إلى أن oligodendrocytes تتفاعل مع الخلايا العصبية وراء الميالين، لا سيما من خلال إفراز العوامل القابلة للذوبان. هنا ، نقدم بروتوكولًا مفصلًا يسمح بتنقية خلايا النسب oligodendroglial من ثقافات الخلايا الدبقية التي تحتوي أيضًا على الخلايا الفلكية والخلايا المجهرية. تعتمد الطريقة على الاهتزاز بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ، مما يسمح بانفصال انتقائي للخلايا الأولية المنفّذة والخلايا المجهرية ، والقضاء على microglia عن طريق الالتصاق التفاضلي. ثم نصف ثقافة oligodendrocytes وإنتاج وسيط oligodendrocyte مكيفة (OCM). ونحن نقدم أيضا حركية العلاج OCM أو oligodendrocytes بالإضافة إلى الخلايا العصبية قرنية النهر المنقى في تجارب الثقافة المشتركة, دراسة التفاعلات oligodendrocyte الخلايا العصبية.
Introduction
Oligodendrocytes (OLs) هي الخلايا الدبقية للجهاز العصبي المركزي (CNS) التي تولد التفاف المالين حول محاور عصبية. تنشأ OLs من الخلايا السلائف oligodendrocyte (OPCs) التي تتكاثر داخل المناطق البطينية من الجهاز العصبي المركزي الجنيني ثم تهاجر وتفرق إلى OLs ناضجة تماما (أي، الخلايا تشكيل المالين)1. OPCs وفيرة خلال التنمية المبكرة، ولكن أيضا تستمر في الدماغ الكبار حيث أنها تمثل عدد الخلايا التكاثرية الرئيسية2. واحد OL ensheathes محاور متعددة في أقسام غير منفعل (أي، internodes)، وحافة كل حلقة المالين تعلق على محور عصبي تشكيل المجال البارانودال الذي أمر بالغ الأهمية للخصائص العازلة من المائلين1،3. بين paranodes هي فجوات صغيرة unmyelinated تسمى العقد من رانفييه. هذه العقد غنية بقنوات الصوديوم ذات بوابات الجهد (Nav) ، مما يسمح بتجديد والانتشار السريع لإمكانات العمل من خلال التوصيل الملحي4. هذا التفاعل ضيق يتيح أيضا دعم الطاقة المحورية من خلال التمازى العصبية من اللاكتات من OLs5،6.
يتم تنظيم نضوج خلايا النسب oligodendroglial وعملية الميالين بإحكام من خلال تفاعلاتها مع الخلايا العصبية7. في الواقع، OLs وOPCs، واسمه أيضا خلايا NG2، والتعبير عن مجموعة من المستقبلات للناقلات العصبية، ويمكن أن تتلقى مدخلات من الخلايا العصبية مثير ومثبطة، مما يسمح لهم باستشعار النشاط العصبي الذي يمكن أن يؤدي انتشارها و / أو التمايز في الخلايا المائلة2. بدوره، OPCs / OLs تفرز microvesicles والبروتينات في الفضاء خارج الخلية التي وحدها أو التوسط بشكل تآزري وظائف التشكيل العصبي واعصاب8،9،10،11،12. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية التي تتحكم في طرق متعددة من التفاعلات بين خلايا النسب oligodendroglial والخلايا العصبية لم يتم فك شفرتها بالكامل.
وعلاوة على ذلك، في العديد من الحالات المرضية CNS، تتأثر OLs في المقام الأول، وبالتالي تعكير تفاعلها مع الخلايا العصبية. على سبيل المثال ، في التصلب المتعدد (MS) ، يحدث الخلل العصبي عن طريق إزالة الميالة البؤرية في الجهاز العصبي المركزي ، وهو ثانوي لفقدان OLs الذي يمكن أن يؤدي إلى تلف عصبي وتراكم الإعاقة ذات الصلة. يمكن أن يحدث Remyelination ، وإن كان غير كاف في معظم الحالات13. وقد أدى التقدم المحرز في العقد الماضي، بسبب تطور العلاجات المناعية، إلى خفض معدل الانتكاس، ولكن تعزيز إعادة التمالع لا يزال حتى الآن حاجة غير ملباة. على هذا النحو ، فإن فهم أفضل لدور OLs ووظائفه وتأثيراته له أهمية خاصة لتطوير علاجات جديدة لمجموعة واسعة من ظروف الجهاز العصبي المركزي.
هنا ، ونحن نصف أساليب تنقية OLs والثقافة. وهذا يتيح إجراء دراسة دقيقة للآليات الجوهرية التي تنظم تطورها وبيولوجيتها. وبالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه الثقافات OLs عالية التخصيب بإنتاج وسيط أوليغودندروسيتي مكيف (OCM)، والتي يمكن إضافتها إلى ثقافات الخلايا العصبية النقية للحصول على نظرة ثاقبة لتأثير العوامل التي تفرزها OLs على فسيولوجيا الخلايا العصبية والاتصال. وعلاوة على ذلك، فإننا نصف كيفية تنفيذ نظام الثقافة المشتركة في المختبر حيث يتم الجمع بين oligodendrocytes تنقية والخلايا العصبية معا، مما يسمح لمعالجة الآليات التي تنظم (إعادة) myelination.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتتوافق رعاية الفئران واستخدامها في هذه التجربة مع السياسات والمبادئ التوجيهية المؤسسية (UPMC وINSERM وتوجيهات مجلس الجماعة الأوروبية 86/609/EEC). تم إنشاء البروتوكول التالي لالقمامة القياسية من 12 الجراء.
1. إعداد القوارير (~ 5 دقيقة)
ملاحظة: تنفيذ الخطوات التالية في اليوم السابق تشريح في غطاء تدفق لامينار تحت ظروف معقمة.
- معطف 150 سم2 قوارير (T150) مع غطاء مرشح (1 قارورة ل2 الجراء) باستخدام 5 مل من polyethylenimine (جزيرة الأمير إدوارد, 100 ملغ / لتر, انظر البروتوكول في الملف التكميلي 1).
- تخزين القوارير في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- شطف القوارير المغلفة 3 مرات مع الماء المقطر المعقم في يوم تشريح.
2. إعداد وسائل الإعلام (~ 10 دقيقة)
ملاحظة: تنفيذ الخطوات في غطاء تدفق لامينار تحت ظروف معقمة.
- إعداد 500 مل من وسط الثقافة، والتي تتكون من متوسط النسر المعدلة Dulbecco (DMEM) تستكمل مع 10٪ من مصل ربلة الساق الجنين (FCS) والبنسلين-ستريبتومسين (100 وحدة دولية / مل).
- إعداد 20.6 مل من وسط هضم الإنزيم في أنبوب 50 مل، يتكون من 20 مل من DMEM، 200 ميكرولتر من DNase (50 ميكروغرام/مل)، 200 ميكرولتر من الباباين (30 U/mL) و 200 ميكرولتر من L-السيستين (0.24 ملغم/مل).
- تصفية تعقيم وسائل الإعلام باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
- الحفاظ على وسائل الإعلام في غطاء محرك السيارة تدفق لامينار في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى تشريح.
3. التحضير للتشريح (~ 10 دقيقة)
ملاحظة: تنفيذ الخطوات في غطاء تدفق لامينار تحت ظروف معقمة.
- إعداد 100 مل من الفوسفات العازلة المالحة دون الكالسيوم والمغنيسيوم (PBS; 1x). تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
- إعداد 50 مل من الجليد البارد ة 1x محلول PBS تستكمل مع 750 ميكرولتر من الجلوكوز 45٪. تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
- ملء طبق بيتري 100 ملم مع 1x PBS لتنظيف الأدوات وثلاثة أطباق بيتري 60 ملم مع الجليد الباردة PBS-الجلوكوز لحصاد الأنسجة. وضع أطباق بتري على الجليد حتى تشريح.
4- تشريح الأجزاء
ملاحظة: يتم إجراء تشريح من الذكور والإناث الجراء الفئران Wistar في يوم ما بعد الولادة (P) 2.
- من أجل توفير بيئة معقمة، تأكد من تنظيف مقاعد البدلاء مع الإيثانول 100٪. تعقيم جميع الأدوات الجراحية مع الإيثانول 100٪.
- رش بلطف رقبة الجرو مع الإيثانول 70٪.
- استخدام مقص جراحي كبير لقطع رأس الحيوان ووضع الرأس في طبق بيتري 100 ملم تحتوي على الجليد الباردة PBS-الجلوكوز.
- استخدام ملقط منحني للحفاظ على رأس الحيوان على مستوى العين. استخدام مقص جراحي صغير لإجراء شق صغير في قاعدة الجمجمة وقطع الجمجمة بعد خط وسط الدماغ.
- استخدام ملقط لتقشير بلطف قبالة جزأين من الجمجمة من خط الوسط.
- استخدم ملعقة جراحية صغيرة لإزالة الدماغ من تجويف الرأس. وضع الدماغ في طبق بيتري 60 ملم تحتوي على الجليد الباردة PBS-الجلوكوز على الجليد.
- عرض تحت steromicroscope، واستخدام ملقط غرامة لإزالة المخيخ، وجذع الدماغ والمصابيح الشمية من نصفي الكرة الأرضية الدماغي.
- استخدام ملقط غرامة لفصل نصفي الكرة الأرضية الدماغي اثنين. استخدام ملقط غرامة لتقشير قبالة meninges. ضع القشريات الدماغية في طبق 60 مم بتري على الثلج.
ملاحظة: الجليد الباردة PBS أمر بالغ الأهمية لإزالة السحات الصحيح.
5. تفكك الأنسجة
ملاحظة: تنفيذ الخطوات في غطاء تدفق لامينار تحت ظروف معقمة.
- استخدام مشرط حاد لتقطيع القشريات الدماغية ناعما. نقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب 50 مل تحتوي على إنزيم الهضم المتوسطة.
- احتضان لمدة 30 دقيقة في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
- استخدام p1000 ميكروبيبت لإزالة بلطف المتوسطة هضم الانزيم مع التأكد من أن الأنسجة القشرية لا يزال في الجزء السفلي من أنبوب 50 مل.
- استخدام p1000 micropipette لإضافة 1 مل من DMEM-10٪ FCS والمثلثات بلطف الأنسجة.
- استخدم فلتر 70 ميكرومتر ومكبس من حقنة 1 مل لتصفية الأنسجة القشرية في أنبوب 50 مل.
ملاحظة: يمكن للمرء شطف الأنسجة المتبقية على جدار الأنبوب الداخلي عدة مرات مع DMEM-10٪ FCS. - ملء أنبوب 50 مل مع DMEM-10٪ FCS. الطرد المركزي في 423 × ز لمدة 5 دقيقة في RT. بعناية إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية مع 2 مل من DMEM-10٪ FCS.
- بلطف خلية خلية بيليه مع p1000 micropipette ثم مع ميكروبيبت p200. تمييع تعليق الخلية مع الحجم المناسب من DMEM-10٪ FCS.
ملاحظة: عقلان = T150 = 5 مل من DMEM-10٪FCS. - لوحة 5 مل من تعليق الخلية على T150 بكثافة 1 × 105 خلايا / سم2. أضف 20 مل من DMEM-10٪ FCS الدافئة لكل T150. احتضان في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
- تجديد نصف الوسط الثقافة بعد 6 أيام في المختبر (DIV) مع DMEM-10٪ FCS الدافئة.
6. تهتز التحضير
- أداء تهتز التحضير في اليوم قبل أن تهتز في غطاء تدفق اللامي تحت ظروف معقمة.
- تجديد نصف متوسط الثقافة عن طريق إضافة الثقافة الدافئة الطازجة المتوسطة في قارورة واحتضان في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
7. تهتز
- معطف ثلاثة أطباق بيتري 100 ملم مع جزيرة الأمير إدوارد. تخزينها في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تغطية غطاء القوارير مع فيلم البارافين ووضع القوارير في كيس من البلاستيك. القوارير يهز تحتوي على الخلايا الدبقية بين عشية وضحاها في 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم تنفيذ الهز الأول في 8 DIV ويمكن للمرء أن يؤدي ما يصل إلى ثلاثة اهتزازات مختلفة (انظر الشكل 1 للتوقيت).
8. OL الخلايا النسب الحصاد والثقافة
ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوات في غطاء تدفق لامينار تحت ظروف معقمة.
- في اليوم التالي للاهتزاز، إعداد Bottenstein-Sato (BS) المتوسطة وفقا للجدول 1.
- شطف أطباق بيتري المغلفة 3 مرات مع الماء المقطر المعقم.
- حصاد قوارير 'supernatant تحتوي أساسا على خلايا النسب OL ولكن أيضا بعض الخلايا microglial ولوحة على أطباق بيتري غير المغلفة 100 ملم.
ملاحظة: تسمح هذه الخطوة بإزالة الخلايا المجهرية من خلال التصاق سريع تفاضلي على سطح الطبق. - احتضان أطباق بيتري لمدة 15 دقيقة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
- املأ كل قارورة T150 بـ 25 مل من وسط الثقافة الدافئة الطازجة واحتضانها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5% من ثاني أكسيد الكربونحتى الهزة الثانية.
- نقل supernatant من أطباق بيتري إلى أطباق جديدة غير مغلفة 100 ملم بيتري للسماح التصاق الخلايا الدقيقة المتبقية.
- احتضان أطباق بيتري لمدة 15 دقيقة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
- قم بإزالة الـ supernatant ، الذي يحتوي على خلايا نسب OL غير ملتصقة ، ونقلها إلى أنابيب 50 مل (supernatant من 2 أطباق بيتري لأنبوب 50 مل). تجاهل أطباق بيتري مطلية بالميكروجليا.
- الطرد المركزي supernatant لمدة 5 دقيقة في 423 × ز. إزالة بعناية supernatant وresuspend بيليه الخلية مع 1 مل من وسط BS. تجمع جميع الكريات في أنبوب مشترك 50 مل وضبط مستوى الصوت إلى 10 مل مع متوسط BS.
- تحديد كثافة الخلايا عد الخلايا تحت المجهر.
ملاحظة: يجب الحصول على كثافة خلية بين 3 × 105/ مل و 5 × 105/ مل. - أضف 20 مل من BS إذا كانت كثافة الخلايا أعلى من أو تساوي 4 × 105/mL للحصول على حجم نهائي قدره 30 مل، أو إضافة 10 مل فقط من BS إذا كانت كثافة الخلية أقل من 4 × 105/mL للحصول على حجم نهائي قدره 20 مل.
- لوحة اثنين أو ثلاثة أطباق بيتري مغلفة مسبقا 100 ملم مع 10 مل من تعليق الخلية. احتضان في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
- إزالة الحطام من أطباق بيتري عن طريق منعش كل من BS المتوسطة 2 ساعة في وقت لاحق.
ملاحظة: فحص الثقافة تحت المجهر قبل وبعد التطهير للتحقق من كثافة الخلايا وكفاءة إزالة الحطام. - احتضان لمدة 2 أيام في وسط BS في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
ملاحظة: فحص الثقافة تحت المجهر. يجب أن يكون التقاء 70٪ إلى 80٪.
9. OCM الإنتاج
ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوات في غطاء تدفق لامينار تحت ظروف معقمة.
- إعداد NB-B27low المتوسطة وفقا للجدول 2.
- تجديد الثقافة المتوسطة مع 10 مل من المتوسط NB-B27low الدافئة. احتضان لمدة 2 أيام في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
- حصاد OCM، أي، supernatant التي تحتوي على OL تفرز العوامل. تصفية تعقيم OCM باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
ملاحظة: تخزين OCM في 4 °C لمدة أقصاها 2 أشهر.
10. OCM إضافة
ملاحظة: ينبغي أن يتم تنفيذ الخطوات في غطاء تدفق التصفيق في ظل ظروف معقمة. OCM يمكن أن تضاف إلى الثقافات العصبية فرس النهر المنقى أعدت وفقا للبروتوكول التالي14,وحصلت عليها عن طريق إضافة, 24 ساعة بعد العزلة, وكلاء مضادة للmitotic uridine و 5- فلوروديوكسيوريدين (5 ميكرومتر) لمدة 36 ساعة.
- في 3 DIV, إزالة جميع الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة التي تحتوي على العوامل المضادة للmitotic وإضافة 500 ميكرولتر من OCM دافئة جديدة.
- تجديد نصف المتوسطة كل 3 أيام مع الطازجة المصنوعة من قبل NB-B27.
ملاحظة: يمكن الحفاظ على هذه الثقافات حتى 21 DIV.
11. إضافة OL إلى ثقافة الخلايا العصبية فرس النهر المنقى
ملاحظة: تنفيذ الخطوات التالية في غطاء تدفق لامينار تحت ظروف معقمة. يمكن إضافة OLs إلى ثقافات فرس النهر المنقى التي تم الحصول عليها بنفس الطريقة الموضحة أعلاه.
- إعداد وسيط الثقافة المشتركة وفقا للجدول 3.
- استرداد ثقافة OL في 70٪ إلى 80٪ التقاء. شطف مع 2 مل من 1x مقسم تلفزيوني دافئ.
- لفصل الخلايا، إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين إلى طبق بيتري 100 ملم.
- احتضان لمدة 5 دقيقة في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
- إضافة 2 مل من DMEM-10٪ FCS لمنع رد الفعل الأنزيمي. حصاد supernatant التي تحتوي على خلايا النسب OL.
- الطرد المركزي في 423 × ز لمدة 5 دقيقة في RT. إزالة بعناية supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في الثقافة المشتركة الدافئة المتوسطة للحصول على تركيز 1.25 × 105 خلايا / مل.
- إضافة OL إلى الخلايا العصبية منقى فرس النهر الثقافة عن طريق إزالة 200 ميكرولتر من الخلايا العصبية ثقافة المتوسطة وإضافة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر (2.5 × 104 خلايا / جيدا) من لوحة 24 جيدا.
- تحديث نصف المتوسطة الثقافة المشتركة كل 2-3 أيام.
ملاحظة: يمكن الحفاظ على الثقافات المشتركة حتى 24 DIV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذا البروتوكول ، يتم تنقية خلايا النسب OL من الثقافات الدبقية عن طريق التخلص من الخلايا الفلكية وmicroglia. يمكن تقييم النقاء والفحص الفينوتيبيك لثقافات OL عن طريق تلطيخ المناعة مع علامات الدبقية15. وأشار تحليل التعبير عن علامات مختلفة إلى أن ثقافات OL كانت في الغالب قبل OLs مع 90٪ ± 4٪ من O4+ الخلايا، 85٪ ± 7٪ NG2+ الخلايا، و 4.7٪ ± 2.1٪ من PLP+ الخلايا، في حين أن 7.2٪ ± 2.5٪ من الخلايا كانت GFAP+ الخلايا الفلكية (متوسط ± D.D.، n = 3؛ الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، 4.6 ٪ ± 0.7 ٪ من الخلايا كانت CD11b+ الخلايا microglial (متوسط ± S.D.، لم يظهر).
OCM المنتجة من هذه الثقافات يمكن أن تضاف في 3 DIV إلى الثقافات العصبية فرس النهر المنقى. هذا العلاج يعزز تجميع البروتينات اللعنية, تتكون من قنوات ناالخامس المرتبطة Neurofascin 186 وAnkyrin G على طول محور عصبي من الخلايا العصبية GABAergic فرس النهر قبل myelination, في 17 DIV(الشكل 3A, B). وتجدر الإشارة إلى أن التسجيلات الكهروفيزيولوجية كشفت أن هذه المجموعات ترتبط بزيادة التوصيل لإمكانات العمل14. وبالإضافة إلى ذلك، يتم زيادة التعبير عن بروتين خيوط وسيطة الفوسفورية H ملطخة Smi31 في الخلايا العصبية فرس النهر OCM المعالجة(الشكل 3A). وبذلك فإن العوامل المفرزة Oligodendroglial متورطة في النضج العصبي وعلم وظائف الأعضاء.
يمكن دراسة Myelination من الخلايا العصبية فرس النهر من خلال إضافة OL في 14 DIV. من 20 DIV إلى 24 DIV ، فإن التلطيخ المناعي لعلامات المالين ، مثل البروتين الأساسي للمالين (MBP) يسمح بتصور شرائح المالين(الشكل 4).
الشكل 1: الجدول الزمني بروتوكول عزل خلايا النسب OL وإنتاج OCM. بعد تشريح القشريات الدماغية من الفئران P2 Wistar (الخطوة 4) ، قم بتفكك الأنسجة إلى الخلايا الدبقية المستزرعة (الخطوة 5). في 8 و 12 و 15 DIV (أي قبل أيام من اهتزاز)، وتجديد نصف المتوسطة مع DMEM-10٪ FCS الدافئة (الخطوة 6). في اليوم التالي، يهز الثقافات الدبقية بين عشية وضحاها عند 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية (الخطوة 7.2). حصاد supernatant تحتوي على خلايا النسب OL وعدد قليل من الخلايا microglia ولوحة لمدة 15 دقيقة في حاضنة الترطيب في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 (الخطوات 8.3 إلى 8.7). الطرد المركزي supernatant لمدة 5 دقيقة في 423 × ز،إعادة تعليق بيليه الخلية مع BS واحتضان لمدة 2 أيام في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 (الخطوات 8.8 إلى 8.12). لإنتاج OCM، احتضان لمدة 2 أيام في NB-B27low (الخطوة 9). لعزل OLs لتجارب الثقافة المشتركة، فصل الخلية باستخدام التربسين (الخطوة 11.3). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: OL الخلايا النسب النمط الظاهري في الثقافات. تم الحصول على الصور باستخدام المجهر البؤري. يتم تقديم إسقاطات الحد الأقصى للكثافة. (أ)تحتوي ثقافات OL في الغالب على ما قبل OLs (أي التعبير عن NG2 فقط (أحمر)، أو كل من O4 (الأخضر) وNG2 (أحمر)؛ ويشار إلى الخلايا التي تعبر عن كل من علامات مع النجوم الصفراء)، ولكن أيضا بعض OLs غير ناضجة (أي، التعبير فقط O4 وليس NG2؛ النجوم البيضاء). (ب)تم العثور على عدد قليل من OLs ناضجة (أي PLP+; الأخضر) وعدد قليل من الخلايا الفلكية (GFAP+ الخلايا; الأحمر) في ثقافات الخلايا النسب OL. أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الطلبات التمثيلية. (A, B) الخلايا العصبية فرس النهر تعامل مع OCM في 3 DIV وثابتة في 17 DIV صريحة بروتين خيوط وسيطة الفوسفورية H (Smi31; الأخضر; لوحة A). GABAergic الخلايا العصبية, التي تم تحديدها من قبل الغلوتامات decarboxylase isoform من 67 كيلو دا (GAD67) التعبير (أبيض), تراكم العرض من قنوات Ankyrin G و Nav الصوديوم (الأحمر; لوحات A و B, على التوالي) في الجزء الأولي محور عصبي وتشكل Ankyrin G و Nav مجموعات على طول محاورهم (لوحات A و B, على التوالي). أشرطة المقياس = 25 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الطلبات التمثيلية. خلايا النسب OL المضافة إلى ثقافة الخلايا العصبية فرس النهر في 14 DIV myelinate بعض محاور فرس النهر, هنا ثابتة في 23 DIV (MBP كعلامة المالين; الأخضر). ويلاحظ العقد من رانفييه (ناضد؛ الأحمر) في ما بين شرائح المالين. مقياس شريط = 25 ميكرون. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| وسائل الإعلام Bottenstein-Sato (BS) | التركيز النهائي |
| دولبيكو تعديل النسر المتوسط | |
| البنسلين- ستريبتومسين | 100 وحدة دولية/مل |
| أبو-نقل الإنسان | 100 ميكروغرام/مل |
| بكالوريا (بومبل سومال بوملين) | 100 ميكروغرام/مل |
| الانسولين | 5 ميكروغرام/مل |
| PDGF | 10 نانوغرام/مل |
| البروجسترون | 62 نانوغرام/مل |
| بوترين ديهيدروكلوريد | 16 ميكروغرام/مل |
| سيلينيت الصوديوم | 40 نانوغرام/مل |
| T3 (3,3', 5-Triiodo-L-thyronine ملح الصوديوم) | 30 نانوغرام/مل |
| T4 (L-Thyroxin) | 40 نانوغرام/مل |
الجدول 1: إعداد وسائط البوتنشتاين - Sato (BS).
| NB-B27 وسائل الإعلام المنخفضة | التركيز النهائي |
| السبة العصبية | |
| ملحق B27 | 0.5x |
| إل غلوتامين | 0.5 متر متر |
| البنسلين- ستريبتومسين | 100 وحدة دولية/مل |
| NB-B27 وسائل الإعلام | التركيز النهائي |
| السبة العصبية | |
| ملحق B27 | 1x |
| إل غلوتامين | 0.5 متر متر |
| البنسلين- ستريبتومسين | 100 وحدة دولية/مل |
الجدول 2: إعداد وسائط NB-B27low وNB-B27.
| الإعلام الثقافي المشترك | التركيز النهائي |
| دولبيكو تعديل النسر المتوسط | 1 vol |
| السبة العصبية | 1 vol |
| ملحق B27 | 1x |
| البنسلين- ستريبتومسين | 100 وحدة دولية/مل |
| أبو-نقل الإنسان | 50 ميكروغرام/مل |
| البيوتين | 10 نانوغرام/مل |
| بكالوريا (بومبل سومال بوملين) | 50 ميكروغرام/مل |
| سيرولبلازمين | 100 نانوغرام/مل |
| الهيدروكورتيزون | 0.05 ميكرومتر |
| الانسولين | 5 ميكروغرام/مل |
| ن-أسيتيل-إل-سيستين | 5 ميكروغرام/مل |
| البروجسترون | 6.2 نانوغرام/مل |
| بوتريسين | 16 ميكروغرام/مل |
| المؤتلف CNTF الإنسان | 0.1 نانوغرام/مل |
| سيلينيت الصوديوم | 5 نانوغرام/مل |
| T3 (3,3', 5-Triiodo-L-thyronine ملح الصوديوم) | 40 نانوغرام/مل |
| فيتامين ب12 | 27.2 نانوغرام/مل |
الجدول 3: إعداد وسائط الإعلام ذات الثقافة المشتركة.
الملف التكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لعرض هذا الملف (انقر على اليمين للتحميل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، نقدم بروتوكولًا مفصلًا للحصول على ثقافات خلية النسب oligodendroglial عالية التخصيب من الثقافات الدبقية المختلطة ، المقتبسة من طريقة نشرت سابقًا16، والإنتاج اللاحق للوسط المكيف OL. هذه التقنية اهتزاز ليست مكلفة، ويمكن أن تتكرر ثلاث مرات، وهو الأمثل للحصول على كمية عالية من OLs المنقى، والخلايا المستزرعة في بوتينشتاين-Sato (BS) المتوسطة التي تحتوي على PDGFα تتكاثر. يتم إعداد الخلايا الدبقية باستخدام القشريات الدماغية للفئران Wistar في P2 ، وهي نقطة زمنية تكون فيها الغالبية العظمى من خلايا النسب oligodendroglial هي ما قبل oligodendrocytes التي تعبر عن NG2 و O415. تجدر الإشارة إلى أن نضوج النسب OL مشابه في P2 في الماوس والجرذ ، ويمكن أيضًا استخدام هذا البروتوكول لعزل الماوس قبل oligodendrocytes17.
بعد هز الثقافات المختلطة للخلايا الدبقية، تتكون الخلايا المنفصلة بشكل رئيسي من خلايا النسب التوليغودروجيلي، ولكن أيضًا بعض الخلايا المجهرية وعدد قليل من الخلايا الفلكية. تتم إزالة الخلايا المجهرية من خلال التصاق تفاضلي على أطباق بيتري غير المصقولة. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن تحسين كفاءة الإزالة عن طريق تنفيذ خطوة التصاق إضافية. ومع ذلك، لا يزال حوالي 5٪ من الخلايا المجهرية موجودة في ثقافات الخلايا الأولية المخصبة، وكذلك 5٪ إلى 9٪ من الخلايا الفلكية. من الممكن تقليل التلوث من الخلايا الفلكية إلى أقل من 5٪ عن طريق تنفيذ خطوة إضافية للغسل المناعي باستخدام أطباق بيتري المغلفة بالأجسام المضادة O4؛ للحصول على بروتوكول مفصل انظر المعلومات التكميلية في فريمان وآخرون14. إزالة الحطام 2 ساعة بعد طلاء خلايا oligodendroglial هو خطوة حاسمة، والتي تعتمد على قوة التدفق المطبق مع pipet. في هذه الخطوة ، من المهم دراسة الثقافة تحت المجهر قبل وبعد التطهير للتحقق من الكفاءة لأن وجود الكثير من الحطام قد يضعف قدرة الخلية على البقاء والنمو. تجدر الإشارة إلى أنه من المهم أيضًا استخدام وسيط BS حديث الصنع ، وإلا فإنه يمكن أن يغير بقاء oligodendrocytes. بالإضافة إلى ذلك ، تبقى الخلايا النقية على قيد الحياة لمدة تصل إلى 6 أيام فقط بعد الطلاء. في الواقع، من المعروف أن الخلايا الدبقية الأخرى والخلايا العصبية تعزيز البقاء على قيد الحياة OPC والانتشار أو التمايز من خلال عوامل تفرز أو اتصالات مباشرة2،18.
تسمح طرق أخرى عزل OLs مباشرة بعد انفصام الدماغ، وذلك باستخدام وضع العلامات المناعية مع الأجسام المضادة O4 تليها الفرز الخلايا الفلورية المنشطة عن طريق قياس التدفق الخلوي (FACS) أو فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيًا (MACS). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تنقية OPCs إيجابية GFP أو oligodendrocytes إيجابية GFP عن طريق فرز الخلايا الفلورية من PDGFαR: GFP أو PLP: فئران GFP ، على التوالي19،20. طرق الفرز هذه هي أكثر ملاءمة لدراسة الحالة الفسيولوجية للoligodendrocytes بالمقارنة مع الثقافات تعامل مع عوامل النمو التي يمكن أن تغير النمط الظاهري. وتجدر الإشارة إلى أن فرز الخلايا المنشط ة بالفلورسنت قد استخدم لنهج التنميط الجيني فيالحالة الفسيولوجية العادية وظروف إزالة الميالين21. كما يمكن تغيير بقاء الخلية عن طريق فرز الخلايا، فمن الأفضل لإجراء مقالات وظيفية مباشرة بعد الفرز.
لقد أظهرنا أن الثقافات OL يمكن فصلها وإضافتها إلى الثقافات العصبية فرس النهر المنقى في 14 DIV. مثل هذه الثقافة المشتركة OL العصبية يسمح دراسة الخطوات المبكرة من myelination الذي يبدأ خلال الأسبوع الأول من الثقافة المشتركة (دوبيس، النتائج غير المنشورة). وقد تحققت نماذج أخرى من OL-فرس النهر المائلية المائلية المائلة المائلة المايلي الثقافة المشتركة من خلال إضافة oligodendrocytes مباشرة بعد فرز22,23. وعلاوة على ذلك، أنتجنا OCM لزيادة تشريح التفاعلات OL الخلايا العصبية ومعالجة دور العوامل التي تفرزها OL على ثقافات الخلايا العصبية. باستخدام هذه التقنية، أظهرنا أن أنواع فرعية GABAergic فرس النهر الخلايا العصبية (أي، parvalbumin+ و / أو سوماتوساتين+) يمكن أن تشكل مجموعات من البروتينات النودالية على طول محور ها المحاور التي يتم الناجم عن OCM قبل myelination14،24. تحليل الطيف الكتلي لـ OCM قد كشف العديد من البروتينات المفرزة وأدى إلى تحديد oligodendroglial Contactin-1 أنه في التآزر مع البروتينات مصفوفة خارج الخلية يتوسط الخطوات المبكرة للتكتل العقدي24. الثقافات الأولية هي نماذج مفيدة تسمح بتقييم تمايز خلية النسب القلة والتفاعلات مع الخلايا العصبية. ومع ذلك ، تم تطوير نهج أخرى لتقييم وظائف OL وmyelination ، إزالة الميالات وremyelination من الثقافات السابقين فيالجسم الحي cerebellar شريحة25،26، وفي دراسات الجسم الحي ، لا سيما مع الحمار الوحشي ونماذج الشرغوف27 التي هناك حاجة في الخطوات النهائية للدراسات ما قبل السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يملك أي من أصحاب البلاغ مصالح متنافسة أو مصالح متضاربة.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا ريمي رونزانو على نصيحته الحكيمة في تحرير المخطوطات. تم تمويل هذا العمل من قبل ICM ، INSERM ، منحة مؤسسة ARSEP إلى NSF ، وسعر Bouvet-Labruyère.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
- Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
- Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
- Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
- Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
- Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
- Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
- Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
- Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
- Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).
