Summary
В этом протоколе мы описываем процедуры качественного и количественного анализа фенотипов развития у мышей, связанных с врожденными пороками сердца.
Abstract
Врожденные пороки сердца (ИБС) являются наиболее распространенным типом врожденных дефектов у людей, затрагивающих до 1% всех живорождений. Тем не менее, основные причины ИКД по-прежнему плохо изучены. Развивающаяся мышь представляет собой ценную модель для изучения ИКД, потому что сердечные программы развития между мышами и людьми очень сохраняются. Протокол подробно описывает, как производить эмбрионы мыши желаемой гестационной стадии, методы изоляции и сохранения сердца для обработки ниже по течению, количественные методы выявления распространенных типов ИБС по гистологии (например, желудочковая перепдал дефекты, дефекты межпредсердной перегородки, патентный артериоз протока и количественные методы гистоморфометрии для измерения общих фенотипов мышечного уплотнения. Эти методы сформулировать все шаги, связанные с подготовкой образца, сбор омывании и анализа, что позволяет ученым правильно и воспроизводимо измерять ИБС.
Introduction
ИБС являются наиболее распространенным типом врожденных дефектов у людей и являются основной причиной смерти, связанной с врожденными дефектами1,2,3,4,5,6. Хотя около 90% новорожденных детей выживают ИБС, это часто связано со значительной заболеваемости и медицинских вмешательств на протяжении многих лет, налагая тяжелое бремя на жизнь пациентов и системы здравоохранения7,8,9,10. Вне чисто генетических факторов, причины ИКД плохо изучены4. Неизвестные причины составляют 56-66% всех случаев ИКД в соответствии с Американской ассоциацией сердца и других источников2,3,4,11. Известные факторы включают генетические мутации, CNV, de novo одиночным нуклеотидным вариантом и анеуплоидией. Он подозревается, что экологические и диетические факторы также являются важными источниками, способствующими ИБС, как это предлагается эпидемиологических исследований, связывающих материнский образ жизни2,12, экономические лишения, и расы13, а также исследования диетических факторов, таких как фолиевая кислота11,14 и биоактивных липидной ретиноиновой кислоты15,16. Изучение механизмов и причин ИБС и других сердечно-сосудистых дефектов важно разработать профилактические стратегии и новые терапевтические варианты1,4,17,18,19.
Развивающаяся мышь является краеугольной моделью для изучения ИКВ у млекопитающих. Тем не менее, некоторые из используемых методов и анализов, таких как вскрытие, сохраняющее морфологию сердца, анализ стадий развития и выявление связанных с ИБС дефектов, могут быть пугающими для ученых, которые являются новыми для анализа сердца мурина. Цель методов, описанных в данном протоколе, заключается в предоставлении качественных и количественных руководящих принципов для этих процессов. Таким образом, в этом протоколе мы объясняем, как выполнять приуроченные спаривания для получения эмбрионов желаемой гестационной стадии, вскрыть беременных женщин для нетронутого восстановления сердца (в том числе связанных тканей, таких как отток тракта), фиксации сердца и подготовки к криостат секции, основные методы гистологии, количественный анализ общих пороков сердца, и качественный анализ уплотнения мышц сердца, общий фенотип прекурсора для некоторых типов ИБС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные, используемые в экспериментах, упомянутых в настоящем документе, лечились с использованием руководящих принципов по уходу за животными Комитета по уходу и использованию животных Мичиганского государственного университета (IACUC).
1. Приуроченное спаривание мышей C57BL6/J для производства эмбрионов
- После того, как мыши достигли возраста размножения (6-8 недель), положить их вместе в формате разведения гарема (т.е. две женщины на одного мужчину). Установите их для разведения где-то во второй половине дня или вечером.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши часто размножаются в течение 1 ч после того, как огни были выключены в их жилищном учреждении. Самки должны быть выведены из размножения в возрасте около 6-8 месяцев и мужчины должны использоваться не позднее 12 месяцев. - При использовании метода взвешивания для определения оплодотворения, породы мышей в больших группах, потому что метод взвешивания вызывает приурочен спаривания продолжать в более медленном темпе, чем методы, в которых только совокупления пробки контролируются.
- На следующее утро, проверьте совокупления пробки где-то между 8 AM-12 PM. Убедитесь, что это делается в нужное время. Если анализ вилки выполняется раньше, чем 8 утра, есть риск, что вилка слишком глубоко в вагинальном канале, чтобы наблюдаться. Если ассса штепсельной вилки выполняется позже, чем в 12:00, существует риск выпадения вилки.
- Захватите самку у основания хвоста и исследовать открытие вагинального канала с использованием кончика micropipette. Коволяция вилка будет выглядеть как слизистой барьер(Рисунок 1A), который может быть немного трудно увидеть в некоторых случаях. Crustiness также является признаком того, что ковоуляция вилка есть или присутствовал. Если нет слизистой оболочки барьера(рисунок 1B),то самка, вероятно, не спаривается или совокупление вилка могла бы уже выпала.
- Ссылайтесь на утро совокупления как e0.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: С C57BL6/J мышей, совокупление пробки может быть трудно определить. Таким образом, иногда мышей спариваются, хотя не разъем не наблюдалось. Копирование не всегда приводит к зачатию. Это часто более вероятно в мышах C57BL6/J. Поэтому следите за прогрессированием веса, чтобы подтвердить беременность (см. шаг 1.4). Вес модули может помочь определить женщин, которые беременны и подтвердить, что пробки привели к зачатию. Будьте осторожны при спаривании женщин в течение последовательных ночей. Если конкретный мужчина наблюдается, чтобы быть хорошим в производстве совокупления плагин, что мужчины можно доверять спариваться в течение последовательных ночей с той же женщиной. - Имейте в виду, что шансы на беременность выше с мышами, которые доказали заводчиков, так как они успешно были выведены раньше. Для того чтобы увеличить шансы иметь доказанные заводчики, мужчины используемые не должны быть слишком стары.
- После асссе зажигания взвесьте самок. Это взвешивание должно быть продолжено 7-10 дней более поздно. Если прирост веса превышает 1,73 г, то мышь, скорее всего, беременна20. Если увеличение веса ниже 1,73 г, это, вероятно, не связано с беременностью и мышь должна быть вновь размножения населения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши C57BL6/J производят небольшие пометы (в среднем пять-шесть эмбрионов). Взвешивание в методах для определения беременности являются точными для большинства. Использование этого метода обеспечивает 12,8% ложноположительных ставок и исключит 3% женщин, которые на самом деле беременны20. Если исследователь обеспокоен тем, что желаемое время гестационного позже, приступайке к шагу 1.5 - Дополнительно: День, когда вскрытие будет иметь место, убедитесь, что беременность прогрессировала путем физического осмотра. Захватите самку у основания хвоста и вытяните тело. Это проще всего сделать, поставив мышь на запястье и осторожно потянув основание хвоста. Если самка беременна, то, скорее всего, будет увеличение веса именно в нижней части туловиска, и она появится в виде небольших комков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Беременность может быть ощутимой уже в e12.5 и будет ощутимо e14.5 в большинстве случаев. C57BL6/J мышей имеют небольшие размеры помета, поэтому самка может быть беременной, даже если Нет никаких физических признаков.
2. Рассечение самок и эмбрионов для восстановления сердца
- Перед началом вскрытия подготовьте следующие растворы при комнатной температуре.
- Растворите этиленедиаминететраацетическую кислоту (ЭДТА) в фосфат буферный солен (PBS) при концентрации 0,5 мМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: После подготовки, предпочтительнее держать раствор на льду и использовать его только при 4 градусах Цельсия. Если загрязнение является проблемой, она должна быть autoclaved до использования. - Растворите параформальдегид (PFA) в PBS при концентрации 4%.
ПРИМЕЧАНИЕ: После подготовки, предпочтительнее держать раствор на льду и использовать его только при 4 градусах Цельсия. Хранить при 4 градусах Цельсия или холоднее для длительного хранения. Концентрация раствора PFA может варьироваться в зависимости от применения образцов тканей ниже по течению. Этот процент используется для гематоксилина и эозина окрашивания, иммуногистохимии и иммунофлуоресцентного окрашивания.
- Растворите этиленедиаминететраацетическую кислоту (ЭДТА) в фосфат буферный солен (PBS) при концентрации 0,5 мМ.
- После того, как самка достигла желаемой гестационной стадии, мышь должна быть усыплена в нужное время суток в соответствии с утвержденными руководящими принципами использования животных. Если сроки на полдня (например, e15.5), они должны быть принесены в жертву ближе к 12 вечера. Если сроки в течение целых дней (например, e15.0) они должны быть принесены в жертву около 12 утра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зачатие предполагается произойти около полуночи в течение ночи мышей в паре. Однако трудно определить точное время зачатия. Из-за этого, сроки оценивается, а не точно. - После прижимая четыре конечности вниз, тщательно сделать I-образный разрез вдоль туловища, начиная со всего уретры до грудины.
- Матка, вероятно, будет расположен чуть выше тазовой области. Матка мыши Y-образная; поэтому, скорее всего, он будет очень длинным и обернутым вокруг туловиза. Удалите его, осторожно подняв его. Сделайте это, используя стороны тонкой щипчинки в черпая движения. Поверхностные ткани матки можно очень тщательно схватилкончий за кончики тонких щипц при первоначальном вытягивании матки. Используйте ножницы, чтобы вырезать матку из тела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Имея в виду необычные Y-образный матки, убедитесь, что вся матка удаляется. - Замочите матку в ледяной PBS. Прикрепите один конец матки вниз и растянуть его на одну линию.
- Разрежьте матку на секции, каждая секция которой содержит отдельный эмбрион. Аккуратно очистить эмбрион с тонкими щипками. Проще всего это сделать с парой щипц в каждой руке. После удаления, поместите эмбрион немедленно в новое блюдо Петри заполнены раствором PBS-EDTA при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальный раствор PBS также может быть использован, но EDTA предотвращает свертывание в образцах. - Этап эмбрионов с помощью Theiler Постановка21. Потому что постановка может варьироваться между эмбрионами в пределах одного помета, этап каждого отдельного эмбриона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это также может обеспечить дальновидность в возможных врожденных пороков сердца в эмбрионах. Как правило, симптомы врожденного порока сердца могут наблюдаться в эмбриональной морфологии. Другие серьезные дефекты часто связаны с определенными заболеваниями сердца могут присутствовать. - Сердце может быть удалено различными способами в зависимости от возраста эмбриона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если неясно, останется ли отток тракта нетронутымво во время удаления, либо удалить больше тканей, чем только сердце (сохранение оттока тракта нетронутыми и минимизации прямого контакта между сердцем и щипцы) или анализировать весь эмбрион.- Используя область вскрытия и две пары тонких щипц, посадите эмбрион на спину и стабилизируете доступ к груди. Это может быть сделано либо прижимая руки вниз с щипками или удаления оружия и проведение туловище в положении.
- Используйте острую точку второй пары тонких щипц, чтобы сделать разрез вдоль грудины эмбриона и простираться между ключиками к пупку. Начните с очень тонких и поверхностных разрезов, постепенно работая в направлении внутренней части грудной полости. Сердце должно едва ли стать видимым. Не контактировать с ним с щипками во время этих поверхностных разрезов.
- Очистите грудную клетку открытой, используя первую пару щипц, чтобы аккуратно сжать на туловище эмбриона, слегка caudal к грудной клетке. Сердце должно выскочить или стать очевидным. Сердце может потребовать некоторых нежных уговоров, чтобы выйти. Используйте сторону щипкетей, убедившись, что точка щипкает никогда не вступает в контакт с сердцем. Чтобы сохранить рабочее пространство и щипцвы в чистоте, держите поблизости без ворса.
- Аккуратно возьмите легочные кровеносные сосуды со стороны щипцы, убедившись, что не разорвать ткани, и вытащить сердце из грудной полости. Затем очистите сердце.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для эмбрионов e13.5 и моложе сердце покрывается перикардом. Это должно быть удалено для того, чтобы достичь сердца.
- Используя стереоскоп, сфотографируйте сердце для последующей ссылки.
- Промыть сердца в растворе PBS-EDTA в течение 1-2 мин, а затем поместить их в 4% PFA решение примерно 45-60 мин, чтобы исправить их. Если анализ всего эмбриона желательно, замочить на ночь. Объем раствора PFA должен быть 5-6x объем ткани фиксируется.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это время инкубации может варьироваться в зависимости от более поздних исследований. Это инкубационное время используется для гематоксилина и эозина окрашивания, иммуногистохимии и иммунофлуоресцентного окрашивания. - Вымойте 5-10 мин с PBS-глицин 3x и место обратно в PBS. Азид натрия или пенициллина / стрептомицина также могут быть добавлены, чтобы свести к минимуму рост бактерий и сохранить нетронутыми тканями. Сердца теперь могут храниться в краткосрочной перспективе при 4 градусах Цельсия.
3. Ткань подготовки
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани могут быть подготовлены с помощью OCT (оптимальная температура резки) встраивания или парафина встраивания. Есть преимущества и недостатки любого метода, и цель анализа должна быть рассмотрена при принятии решения о том, какой метод встраивания следует использовать.
- Oct встраивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод может быть предпочтительнее формалин / парафин встраивания, поскольку криосекции сохранить реактивность антигена, все еще может быть использован для гематоцилин и эозин окрашивания, и производить ломтики быстрее.- Подготовьте раствор сахарозы, растворенного в PBS при концентрации 30% (w/v).
- Перенесите ткани в новую коническую трубку 15 мл или микроцентрифугную трубку 1,5 мл, содержащую пБС-30% сахарозу. Первоначально ткань будет плавать.
- Поместите его при 4 градусах по Цельсию в холодильнике. Ткань будет готова к встраиванию OCT, когда она опускается на дно трубки, как правило, в 24-40 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышечные ткани значительно страдают во время циклов замораживания/оттепели и теряют родную морфологию. Сахароза поглощается тканью и работает как криоконсервационный агент, который позволяет улучшить сохранение морфологии. Убедитесь, что в трубке достаточно раствора для достаточного контроля за плаванием тканей. PBS-сахароза легко загрязнена бактериями, поэтому проверяйте раствор часто на облачность, что указывает либо на грибковые, либо бактериальные разрастание. Чтобы свести к минимуму риск заражения, в раствор PBS-сахарозы можно добавить пенициллин/стрептомицин, либо азид натрия. - Удалите сердца с пипеткой Pasteur, убедитесь, что отверстие пипетки достаточно широк, чтобы не рвать ткани. При необходимости нарежьте пипетку ножницами. При работе с целыми эмбрионами, используйте щипцы для получения образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Делайте это осторожно. Даже если отверстие пипетки достаточно широкое, чтобы получить сердца, края пипетки все равно могут разорвать ткани. Силы могут отступить образцы тканей, если использовать слишком агрессивно. - Кратко дайте ткани высохнуть на безворсковой салфетке. Поместите образец в форму OCT в нужном положении для резки (т.е. сагиттал, поперечный, корональный). Добавьте соединение OCT до тех пор, пока образец не будет полностью погружен в воду, убедившись, что в контакте с тканью нет пузырьков.
- Поместите форму на -20 градусов на ночь или несколько дней, а затем переместить плесень до -80 градусов по Цельсию. После 24 ч плесень готова для криосекции. Ткани в этом формате могут храниться в долгосрочной перспективе.
- Параффин встраивание
- Использование этанола, обезвоживают ткани в этой последовательности: 50% этанола в течение 10 мин, 70% этанола в течение 10 мин, 80% этанола в течение 10 мин, 95% этанола в течение 10 мин, 100% этанола в течение 10 мин (сделай это 3x).
- Замочите ткани в серии этанола / ксилена решений в этой последовательности: 2:1 этанол / ксилена раствор для 10-15 мин, 1:1 этанол / ксилена раствор для 10-15 мин, 1:2 этанол / ксилена решение для 10-15 мин, 100% ксилен для 10-15 мин (это докс 3).
- Чтобы заменить ксилен парафином, замочить ткани в вакуумной печи (набор между 54-58 C) в этой последовательности: 2:1 ксилена / парафин решение в течение 30 мин, 1:1 ксилена / парафина решение для 30 мин, 1:2 ксилена / парафин решение для 30 мин, 100% парафин для 1-2 ч, 100% параффин для 1-2.2
ПРИМЕЧАНИЕ: Нагревание тканей за пределами 60 градусов по Цельсию в течение длительных периодов времени приведет к деградации парафиновых полимеров и ткани становятся хрупкими. - Используя свежий парафин, встраивайте ткани в нужное положение.
4. Крайостат секции для OCT встроенных тканей
- На криостат, поместите все образцы внутри в течение как минимум 1 ч, если образцы ранее хранились в морозильной камере -80 градусов. Они должны оставаться там до тех пор, пока не будут собраны все разделы.
- Убедитесь, что криостат установлен при правильных настройках температуры. Температура окружающей среды внутри криостатной камеры должна быть около -20 градусов по Цельсию, а рука криостата должна быть около -24 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта температура может варьироваться в зависимости от того, как блок реагирует на нарезку. Если непоследовательная нарезка является проблемой, температура окружающей среды может быть снижена. - Удалите блок OCT из формы, потянув по краям открытой стороны формы, чтобы ослабить его, а затем щипать блок на закрытом конце, где плесень сужается.
- Чтобы смонтировать блок OCT, поместите комнатную температуру OCT на патрон, начиная от середины и работая до края. Весь патрон не должен быть покрыт.
- Поместите блок OCT (см. шаг 3.1) на форму. Край блока, который был против закрытой стороны формы должны быть лицом вверх на патрон. Разрешить OCT на патрон заморозить, пока он непрозрачный белый, около 5-10 мин.
- Поместите патрон на руку еще 5-10 минут для блока, чтобы прийти к температуре руки. Чтобы получить параллельный срез, отрегулируйте руку до тех пор, пока край блока не будет параллельным этапу и есть равное расстояние между этапом и нижним краем блока, таким же, как сцена и верхний край блока.
- Вставьте лезвие и отрегулируйте расстояние блока от лезвия, чтобы взять секции.
- Возьмите ломтики толщиной 10 мкм. Держите нарезки до точки интереса достигается либо вручную или с помощью функции отделки.
- Для сбора ломтиков используйте небольшую плоскую кисть и детальную кисть. Когда плесень начинает быть разрезаны, используйте плоскую кисть, чтобы осторожно тянуть ломтик против стенда. При прорезывании образца движение должно быть непрерывным и без паузы, хотя скорость может зависеть от твердости образца.
- Во время нарезки, используйте плоскую кисть, чтобы аккуратно направлять ломтик, как это сделано. Срез не нужно заподлицо со сценой в этот момент, так что позвольте ему вздыматься, чтобы не вызвать слезы или тянет и повлиять на гистологию.
ПРИМЕЧАНИЕ: При нарезке целых эмбрионов, эта часть может быть особенно трудно, особенно при изменении типов тканей. Убедитесь, что ломтики сделаны без пауз и кисть не тянет на ломтики слишком агрессивно. Когда типы тканей меняются, ломтик может сломаться, поэтому сохранение холода является ключевым фактором. Если нарушение является проблемой, снижение температуры или увеличение толщины образца. - Приостановите движение блока после того, как образец полностью прорезается, но срез еще не свободен от блока. Не перемещая плоскую кисть от ломтика, используйте детальную кисть, чтобы погладить срез вниз, чтобы сделать его плоским и заморозить против стадии.
- Держите ломтик там в течение 10 с, прежде чем удалить детальную кисть и закончить срез. Используйте две щетки краски, чтобы аккуратно сгладить ломтик против сцены, предотвратить любой прокат, и держать его на сцене в течение 20-30 с.
- Переверните срез и снова пригоняйте его на сцену. Переместите электростатически заряженный слайд достаточно близко для того, чтобы срез был привлечен и прилипните к слайду, не прикасаясь к слайду на сцену. Наклейте на этикетку слайды карандашом.
- Храните слайды в герметичной коробке для защиты тканей от накопления льда во время хранения. Для кратковременного хранения слайды должны храниться при -20 градусов по Цельсию перед окрашиванием. Для длительного хранения держать их на уровне -80 градусов по Цельсию.
5. Микротомсекция для парафина встроенных тканей
- Поместите блоки на лед до секции для того, чтобы охладить образцы. Когда прохладно, парафин ломтики легче и может производить более тонкие ломтики.
- Приготовьте водяную ванну 40-45 градусов с использованием ультрачистой воды.
- Положите лезвие в держатель в микротоме. Убедитесь, что он является безопасным, а затем установить угол зазора. Убедитесь, что угол зазора является правильным. Это может быть проверено по инструкции производителя.
- Поместите парафин блок в микротом. Убедитесь, что он правильно ориентирован так, что лезвие будет вырезать прямо через блок.
- Убедитесь, что лезвие правильно ориентировано с блоком, сделав пару ломтиков. Делайте это осторожно, чтобы можно было внести коррективы.
- Обрезать блок до тех пор, пока точка интереса не будет достигнута.
- Сделать ломтики на желаемой толщине. Примите во внимание, что первые несколько ломтиков, скорее всего, будут отброшены.
- Возьмите разделы и переместить их в водяную ванну с помощью щипки. Это должно сделать разделы сгладить. Используйте щиптем, чтобы настроить их по мере необходимости.
- Переместите электростатически заряженный слайд достаточно близко для того, чтобы срез был припривлект сяречку и привязайтесь к слайду. Наклейте на этикетку слайды карандашом.
- Поместите все собранные слайды в стеллаж. Разрешить слайды высохнуть на ночь при 37 градусов по Цельсию.
6. Депараффинация тканей
- Вымойте слайды в следующей последовательности: 3 мин в ксилене (2x), 3 мин в 1:1 ксилена/100% этанола, 3 мин в 100% этанола (2x), 3 мин в 95% этанола, 3 мин в 70% этанола, 3 мин в 50% этанола.
7. Гематоксилин и эозиновевая окрашивание
- Подготовьте слайды для окрашивания.
- При использовании OCT подготовленных тканей, замочите в дистиллированной воде в течение 4 мин до тех пор, пока OCT не растворится и дайте высохнуть.
- При использовании парафина встроенных тканей, они должны быть депараффинизированы. Смотрите шаг 6.1.
- Поместите горку в отфильтрованный 0,1% гематаксилина в течение 10 мин. Поместите горку в дистиллированную воду, меняя воду 1x немедленно, а затем снова после 3 мин.
- Поместите слайд в 0,5% эосин для 10 с или окунуться 12x. Dip слайд в дистиллированной воде, пока эозин больше не полосы, около 2-3 провалов.
- Обезвоживать слайд, замачивая в 50% этанола на 10 с, 75% этанола на 10 с, 95% этанола на 30 с, и 100% этанола в течение 1 мин. Dip в ксилена, пока ксилен выходит гладкой, 5-7 провалов.
- Разрешить ксилен испаряться и монтировать с быстрой сушки монтажа среды, которая имеет рефракционный индекс близко к стеклу.
8. Квалификационный анализ распространенных пороков сердца
- Возьмите изображения всех образцов с помощью перевернутого или стереомикроскопа и соответствующей камеры. Возьмите макроскопические и микроскопические изображения, в зависимости от типов анализируемых дефектов. Макроскопические изображения могут быть приняты с любым увеличением ниже 10x. Микроскопические изображения должны быть сделаны при 40-х увеличениях или выше. Фотографии, сделанные в этой работе, были сделаны с 5-x увеличением с помощью стерео микроскопа и 40x цели воздуха (объектив N.A. 0.55) с помощью перевернутого микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Макроскопические изображения являются хорошей отправной точкой, потому что они обеспечивают вид на все сердце (Рисунок 3). По мере выявления закономерностей конкретные области могут быть сосредоточены на и далее исследоваться. - Выстраивайте все изображения бок о бок на экране компьютера. Исните все изображения контрольных образцов на одной стороне экрана и все изображения экспериментальных образцов на другой стороне экрана. Лучше всего анализировать одну группу лечения за один раз.
- Ищите различия в фенотипах между группами лечения, начиная с ключевых областей, где происходят общие пороки сердца. Это будет варьироваться в зависимости от того, изображения макроскопические, которые изображают валовой анатомии сердца, или микроскопические, которые изображают микроскопические анатомии сердечной ткани.
- Начните поиск общих макроскопических пороков сердца, таких как дефекты желудочковой перегородки(рисунок 2A),дефекты перегородки предсердий(рисунок 2B),и артериоз патентного протока(рисунок 2C). Все эти дефекты наиболее легко увидеть в поперечном виде сердца.
- Чтобы выявить дефекты перегородки, подумайте о нескольких ломтиках, так как они могут наблюдаться в одной плоскости ткани, а не в другой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда дефект не отсутствие перегородки, но отверстие в перегородке. Поэтому обратите пристальное внимание, чтобы не ошибиться слезы за дефект перегородки. Поиск консистенции между близлежащими ломтиками в определенном регионе может подтвердить, если это на самом деле дефект или разрыв от нарезки. - Для выявления дефектов в тракте оттока, таких как патентный артериоз протока, используйте несколько ломтиков, чтобы следовать основные кровеносные сосуды, как они покидают сердце. Создайте изображение основных кровеносных сосудов относительно друг друга. Пример показан на рисунке 2C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые нарушения могут быть вызваны стадией развития эмбриона (например, патентный артериоз протока закрывается послеродового, вскоре после рождения; желудочковая перегородка не закрывается до 14,5 евро). Некоторые другие общие макроскопические пороки сердца, которые не включены в цифры включают стойкие truncus atereriosus, которые могут быть обнаружены наиболее легко на e16.5 и позже; двойной выход правого желудочка (DORV), который может быть обнаружен в ломтики, в которых сердце входит в отток тракта; и главной аорты22. Общий микроскопический порок сердца включает в себя снижение мышечной уплотнения(рисунок 4).
9. Количественный анализ уплотнения сердечной мышцы с использованием гематоксилина и эозина окрашенных тканей
- Используя макроскопический вид окрашенных образцов тканей(рисунок 4A), определить область, интересную для изображения на 40x увеличение (Рисунок 4B). Для этой бумаги использовалась стена левого желудочка. Сохранить изображение в нужном формате. Для этой статьи изображения были сохранены как файлы .tif.
- Откройте изображение в программном обеспечении ImageJ.
- Установите изображение на 8-разрядное. Это позволяет изображению использовать инструмент порога в следующем шаге23,24. Для этого выберите «Изображение» Тип (тип) 8-битный".
- Установите порог фотографии. Цель этого шага состоит в том, чтобы выбрать только пиксели, которые представляют фон, за исключением пикселей, которые представляют ткани23,24.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта площадь поверхности будет вычтена позже. Правильный порог выберет пиксели, которые исследователь хочет исключить из области поверхности мышечной ткани. Таким образом, в конечном итоге должна быть указана ткань в сером масштабе и будет выбран фон.- Нажмите на кнопку"ImageJ Изображение (ru) Отрегулируйте (англ.) Порог". Переместите верхнюю планку, чтобы внести коррективы порога. Закройте окно регулировок порога, не внося никаких других изменений после того, как выбранные разделы выбраны21.
- Используйте инструмент Polygon Selections, чтобы выбрать пространство, которое занимает ткань. Тщательно убедитесь, что контуры прослеживают границы тканей, потому что свободные трассировки обеспечат ложные измерения.
- Отрегулируйте настройки измерения на ImageJ так, чтобы программное обеспечение измерял только область пикселей, которые были выбраны с помощью инструмента порога в шаге 9.423. ImageJ Анализ (ru) Набор измерений Площадь и предел к порогу". Выберите только область и ограничение порога.
- Измерьте площадь выделенных пикселей. ImageJ Анализ (ru) Мера". Это значение представляет область отрицательного пространства.
- Измерьте площадь всего интересуемого региона. Это область, которая была выбрана с помощью инструмента Polygon Selections. "Изображение J Анализ (ru) Набор измерений Площадь". Выберите только область и спределите ограничение на пороговыйрежим. Затем измерьте, выбрав "Изображение J Анализ (ru) Мера".
- Рассчитайте область фактической мышечной ткани, занимающей в пределах интересующего региона. Вычесть область отрицательного пространства из области всего региона, представляющих интерес. Это значение является областью мышечной ткани.
- Рассчитайте индекс мышечной компиляции (MCI). Разделите область мышечной ткани по области интересующей.
Чем больше значение MCI, тем более уплотнена мышца. Эти значения MCI могут быть использованы для статистического анализа для проверки на значительные изменения в мышечной уплотнении между группами лечения(рисунок 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Индекс уплотнения мышц был сравнен между сердцами, развивающимися в двух различных средах, контрольной и экспериментальной группой. Эти протоколы использовались для количественного анализа уплотнения мышечной ткани, что позволяло статистический анализ. Было показано, что мышечное уплотнение значительно снижается в экспериментальных сердцах по сравнению с эмбрионами, которые развивались в неэкспериментальных условиях.
Эмбрионы были отброшены, если время наблюдения казалось неточным. Хотя замедление роста эмбрионов может быть результатом лечения эксперимента, и есть диапазон в развитии прогресса, разведение было расставлено достаточно, чтобы обеспечить сроки развития эмбриона. Постановка эмбрионов была сделана с помощью Theiler Staging21. Образцы считались плохо нарезанными, если ломтики не отражали последовательность или если у них были явные слезы или складки. Окрашивание при условии достаточно контраста, чтобы различать края ткани, но не было так темно, чтобы сделать черты клеток неразличимыми. Слайды были затем изображены с перевернутым микроскопом с 40x целью. Значения MCI были рассчитаны с помощью программного обеспечения ImageJ и Microsoft Excel. Эти значения MCI были проанализированы с помощью T-теста.
Рисунок 1: Подключите результаты опроса у мышей C57BL6/J. (A) Мышь с легко идентифицируемой вилкой совокупления. (B) Мышь без совокупления плагина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Общие пороки сердца. Схема истинного ожидаемого морфологии врожденного порока сердца. (A) Поперечный вид дефекта желудочковой перегородки. (B) Поперечный вид дефекта перегородки предсердий. (C) Патентный проток артериоз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Гематоксилин и эозиновые пятна e15.5 сердец. (A) Запятнанное сердце, которое развивалось в нормальных условиях. Шкала бар 750 мкм. (B) Окрашенные сердца, которые разработаны в экспериментальных условиях. Шкала бар 750 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Количественный анализ мышечного уплотнения между сердцами, которые развивались при нормальных материнских диетах и сердцах, которые развивались под незаменимыми жирными кислотами, неполноценными материнскими диетами. (A) Гематоксилин и эозин окрашенных сердца на макроскопический (5x) зрения. Шкала баров 1000 мкм. (B) Гематаксилин и эозин окрашенных сердец при микроскопическом виде (40x). Шкала баров - 75 мкм. (C) Полученные данные измерений индекса компиляции мышц. Значения были проанализированы с помощью Т-теста (n - 4 на группу лечения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол исследует методы, связанные с анализом сердечного развития в эмбриональных сердцах. Некоторые ограничения этого метода являются необходимой физической ловкости для подготовительных методов, которые могут потребовать практики, и мастерство с микроскопом изображения. Если ломтики, полученные на криостате, грязные, гематоксилин и эозиновые окрашивания не будет ясно, или если изображения, сделанные на микроскоп имеют плохое освещение, то метод, используемый с ImageJ не будет работать. Ограничение пороговой функции программного обеспечения Image J заключается в том, что он выбирает пиксели, расположенные на одном конце порога, зависящий от значения пикселей. Таким образом, любые пиксели, которые существуют на неправильной стороне порога, будут неправильно включены или исключены в расчет. В конечном счете, устранение неполадок будет необходимо для принятия протоколов для использования в исследовании.
В случае, если извлечение сердца слишком сложно, рассмотрите пропуск шага 2.8. Кроме того, рассмотреть вопрос об удалении больше, чем просто сердце и легкие из грудной полости. Цель становится больше и легче манипулировать, и прямой контакт между сердцем и тонкой щиптем сведена к минимуму. При сечении криостата экспериментальные образцы всегда будут напрямую сравниваться с контрольные образцы. Это позволяет некоторое пространство для ошибки пользователя до тех пор, пока ошибка соответствует во всех образцах. Чтобы свести к минимуму ошибки пользователя и избежать ложных результатов, убедитесь, что сопоставимые разделы получены из обеих групп лечения. Например, если более одного человека производит разделы, убедитесь, что один человек производит четное количество разделов для контроля и всех групп лечения, а не только одна подгруппа. Наконец, при пороговом значении изображений на ImageJ используется инструмент порога, позволяющий обеспечить максимальную свободу выбора пикселей, представляющих ткани и пиксели, которые этого не делают. При необходимости отрегулируйте контраст изображений, чтобы еще больше усилить значение пикселя фона от пиксельной стоимости ткани. Хотя есть варианты устранения неполадок, методы по-прежнему требуют высокой степени мастерства. Однако выполнение этого протокола обеспечивает доступ к данным, которые обычно не измеряются в других исследованиях сердечного развития. Таким образом, использование особенностей этого протокола может внести значительный вклад в научное исследование.
Выявление воздействия экспериментального лечения в кардиологических исследованиях часто исследуется с помощью морфологии оценки. Это особенно касается биологии развития, в которой плацента затрудняет измерение физиологических особенностей развивающихся сердец. Поэтому морфологический анализ, позволяющий понять функцию сердца, резко меняет траекторию исследований биологии развития. Хотя большинство работ анализировать толщину сердечной мышцы, чтобы определить силу сердца, прямое измерение мышечной уплотнения может обеспечить дальнейшее понимание физиологии развивающихся млекопитающих сердце25,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют раскрытия информации, чтобы сообщить.
Acknowledgments
Лаборатория Агирре поддерживается Национальным институтом сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения под номером премии K01HL135464 и Американской ассоциацией сердца под номером 19IPLOI34660342.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
- Kathiresan, S., Srivastava, D.
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
- Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
- Kenny, L. A., et al.
- Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
- De Leval, M. R., Deanfield, J. E.
- Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
- Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
- Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
- Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
- Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).
- Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
- Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
- Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- Baldock, R., Bard, J., Davidson, D. Stage Definition. , https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998).
- Newbern, J., et al. Mouse and human phenotypes indicate a critical conserved role for ERK2 signaling in neural crest development. , http://www.pnas.org/cgi/content/full (2008).
- Carleton College. Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center. , https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017).
- Reinking, L. Examples of Image Analysis Using ImageJ. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007).
- MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
- Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J.
- Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).
