Summary
En este protocolo, describimos procedimientos para analizar cualitativa y cuantitativamente fenotipos del desarrollo en ratones asociados con defectos cardíacos congénitos.
Abstract
Los defectos cardíacos congénitos (CHD) son el tipo más común de defecto congénito en los seres humanos, afectando hasta el 1% de todos los nacimientos vivos. Sin embargo, las causas subyacentes de la ENFERMEDAD de Haya todavía se entienden mal. El ratón en desarrollo constituye un modelo valioso para el estudio de la CHD, ya que los programas de desarrollo cardíaco entre ratones y humanos están altamente conservados. El protocolo describe en detalle cómo producir embriones de ratón de la etapa gestacional deseada, métodos para aislar y preservar el corazón para el procesamiento posterior, métodos cuantitativos para identificar tipos comunes de CHD por histología (por ejemplo, septal ventricular defectos, defectos interauriculares, conducto arterial patentado) y métodos cuantitativos de histomorfometría para medir fenotipos comunes de compactación muscular. Estos métodos articulan todos los pasos involucrados en la preparación, recolección y análisis de muestras, permitiendo a los científicos medir correctamente y reproduciblemente la CHD.
Introduction
Las CHD son el tipo más común de defecto de nacimiento en humanos y son la principal causa de muertes relacionadas con defectos de nacimiento1,2,3,4,5,6. Aunque alrededor del 90% de los niños recién nacidos sobreviven a la enfermedad coronaria, con frecuencia se asocia con una morbilidad significativa e intervenciones médicas a lo largo de los años, imponiendo una pesada carga sobre la vida de los pacientes y el sistema de salud7,8,9,10. Fuera de los factores puramente genéticos, las causas de la ENFERMEDAD se entienden mal4. Las causas no identificadas representan el 56-66% de todos los casos de CHD según la Asociación Americana del Corazón y otras fuentes2,3,4,11. Los factores bien conocidos incluyen mutaciones genéticas, CNVs, variantes de nucleótidos individuales de novo y aneuploidía. Se sospecha que los factores ambientales y dietéticos son también fuentes importantes que contribuyen a la enfermedad de Son obligatorias, como sugieren los estudios epidemiológicos que vinculan el estilo de vida materno2,12,la privación económica y la carrera13,y mediante la investigación en factores dietéticos como el ácido fólico11,14 y el ácido retinoico lipídico bioactivo15,16. Investigar los mecanismos y causas de la ENFERMEDAD y otros defectos cardiovasculares es importante desarrollar estrategias preventivas y nuevas opciones terapéuticas1,4,17,18,19.
El ratón en desarrollo es un modelo de piedra angular para el estudio de la CHD en mamíferos. Sin embargo, algunos de los métodos y análisis empleados, como las disecciones que preservan la morfología del corazón, el análisis de las etapas del desarrollo y la identificación de defectos asociados a la CHD, pueden ser desalentadores para los científicos que son nuevos en el análisis de los corazones murinos. El objetivo de los métodos descritos en este protocolo es ofrecer directrices cualitativas y cuantitativas para estos procesos. Así, en este protocolo explicamos cómo realizar aparejos cronometrados para producir embriones de la etapa gestacional deseada, diseccionar a las hembras embarazadas para la recuperación intacta del corazón (incluyendo los tejidos asociados como el tracto de salida), la fijación del corazón y la preparación para seccionamiento de criostatos, métodos de histología básica, análisis cuantitativos de defectos cardíacos comunes y análisis cualitativos de la compactación del músculo cardíaco, un fenotipo precursor común para algunos tipos de CHD.
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Protocol
Todos los animales utilizados en los experimentos a los que se hace referencia en este documento fueron tratados utilizando las directrices de cuidado animal del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan (IACUC).
1. Acoplamiento cronometrado de ratones C57BL6/J para la producción de embriones
- Una vez que los ratones hayan alcanzado la edad reproductiva (6-8 semanas), colóquelos en formato de cría de harem (es decir, dos hembras por cada macho). Plasíquelos para la cría en algún momento de la tarde o de la noche.
NOTA: Los ratones a menudo se reproducen dentro de 1 h después de que las luces se han apagado dentro de su instalación de alojamiento. Las hembras deben retirarse de la cría a los 6-8 meses y los machos deben utilizarse a más tardar 12 meses de edad. - Si se utiliza el método de pesaje para determinar la fertilización, criar ratones en grandes grupos, porque el método de pesaje hace que el acoplamiento cronometrado continúe a un ritmo más lento que los métodos en los que solo se supervisan los tapones de la ucoma.
- A la mañana siguiente, compruebe si hay enchufes de cópula en algún momento entre las 8 AM-12 PM. Asegúrese de que esto se hace en los momentos correctos. Si el ensayo del tapón se realiza antes de las 8 de la mañana, existe el riesgo de que el enchufe esté demasiado profundo en el canal vaginal para ser observado. Si el ensayo del enchufe se realiza más tarde de las 12 PM, existe el riesgo de que el enchufe se haya caído.
- Coge a la hembra por la base de la cola e investiga la abertura al canal vaginal con el uso de una punta de micropipeta. Un tapón de cópula se verá como una barrera mucosa(Figura 1A),que podría ser un poco difícil de ver en algunos casos. La costra también es una indicación de que un tapón de cópula está o estaba presente. Si no hay barrera mucosa(Figura 1B) entonces la hembra probablemente no se ha apareado o el tapón de la cópula podría haberse caído ya.
- Consulte la mañana de la cópula como e0.5.
NOTA: Con los ratones C57BL6/J, los tapones de cópula pueden ser difíciles de identificar. Por lo tanto, a veces los ratones se apareaban a pesar de que no se observó ningún enchufe. La cópula no siempre conduce a la concepción. Esto es a menudo más probable en ratones C57BL6/J. Por lo tanto, controlar la progresión del peso para confirmar el embarazo (ver paso 1.4). Los pesajes pueden ayudar a identificar a las hembras que están embarazadas y confirmar que los tapones condujeron a la concepción. Tenga cuidado al aparearse a las hembras durante noches consecutivas. Si se observa que un macho en particular es bueno en la producción de un tapón de cópula, se puede confiar en que ese macho se aparee durante noches consecutivas con la misma hembra. - Tenga en cuenta que las posibilidades de embarazo son más altas con ratones que son criadores probados, ya que han sido criados con éxito antes. Para aumentar las posibilidades de tener criadores probados, los machos utilizados no deben ser demasiado viejos.
- Después del ensayo del tapón, sopesar a las hembras. Este pesaje debe ser seguido 7-10 días después. Si el aumento de peso supera los 1,73 g, entonces el ratón es probable que esté embarazada20. Si el aumento de peso es inferior a 1,73 g, es probable que no esté relacionado con el embarazo y el ratón debe ser reintroducido a la población reproductora.
NOTA: Los ratones C57BL6/J producen camadas pequeñas (de cinco a seis embriones en promedio). Pesar en los métodos para determinar el embarazo son precisos para la mayoría. El uso de este método proporciona una tasa de falsos positivos del 12,8% y excluirá el 3% de las mujeres que están realmente embarazadas20. Si al investigador le preocupa que el tiempo gestacional deseado sea más tarde, proceda al paso 1.5 - Opcional: El día en que se va a llevar a cabo la disección, asegúrese de que el embarazo ha progresado mediante la inspección física. Coge a la hembra por la base de la cola y estira el cuerpo hacia fuera. Esto es más fácil de hacer colocando el ratón en la muñeca y tirando suavemente de la base de la cola. Si la hembra está embarazada, entonces es probable que haya aumento de peso específicamente en el torso inferior, y aparecerá como bultos pequeños.
NOTA: El embarazo puede ser palpable tan pronto como e12.5 y será palpable en e14.5 en la mayoría de los casos. Los ratones C57BL6/J tienen tamaños de camada pequeños, por lo tanto, la hembra podría estar embarazada incluso si no hay signos físicos.
2. Disección de hembras y embriones para la recuperación del corazón
- Antes del inicio de la disección, prepare las siguientes soluciones a temperatura ambiente.
- Disolver el ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) en solución salina tamponada de fosfato (PBS) a una concentración de 0,5 mM.
NOTA: Una vez preparada, es preferible mantener la solución sobre hielo y utilizarla únicamente a 4oC. Si la contaminación es una preocupación, debe ser autoclaveda antes de su uso. - Disolver paraformaldehydo (PFA) en PBS a una concentración de 4%.
NOTA: Una vez preparada, es preferible mantener la solución sobre hielo y utilizarla únicamente a 4oC. Conservar a 4oC o más frío para un almacenamiento a largo plazo. La concentración de la solución de PFA puede variar dependiendo de las aplicaciones posteriores de las muestras de tejido. Este porcentaje se utiliza para la tinción de hematoxilina y eosina, inmunohistoquímica y tinción inmunofluorescente.
- Disolver el ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) en solución salina tamponada de fosfato (PBS) a una concentración de 0,5 mM.
- Una vez que la hembra ha alcanzado la etapa gestacional deseada, el ratón debe ser eutanasiado a la hora correcta del día de acuerdo con las pautas aprobadas de uso animal. Si los tiempos están en el medio día (por ejemplo, e15.5) deben sacrificarse cerca de las 12 PM. Si los tiempos son en días enteros (por ejemplo, e15.0) deben ser sacrificados cerca de las 12 AM.
NOTA: Se supone que la concepción se produce cerca de la medianoche durante la noche en que los ratones están emparejados. Sin embargo, es difícil determinar la hora exacta de la concepción. Debido a esto, el tiempo se estima, no es exacto. - Después de fijar las cuatro extremidades hacia abajo, haga cuidadosamente una incisión en forma de I a lo largo del torso, comenzando alrededor de la uretra hacia el esternón.
- Es probable que el útero se encuentre justo encima de la región pélvica. El útero del ratón tiene forma de Y; por lo tanto, es probable que sea muy largo y envuelto alrededor del torso. Retírelo levantándolo suavemente. Haga esto usando los lados de fórceps finos en un movimiento de cuchara. Los tejidos superficiales del útero pueden ser capturados con mucho cuidado por las puntas de los fórceps finos cuando inicialmente tiran del útero hacia fuera. Use tijeras para cortar el útero del cuerpo.
NOTA: Teniendo en cuenta la forma Inusual de Y del útero, asegúrese de que se extirpa todo el útero. - Remoje el útero en PBS helada. Ancle un extremo del útero hacia abajo y estírelo en una sola línea.
- Cortar el útero en secciones, cada sección que contiene un embrión separado. Despega suavemente el embrión con fórceps finos. Esto es más fácil de hacer con un par de fórceps en cada mano. Una vez retirado, coloque el embrión inmediatamente en una nueva placa de Petri llena de solución PBS-EDTA a 4 oC.
NOTA: La solución de PBS normal también se puede utilizar, pero el EDTA evita la coagulación en las muestras. - Escenificar los embriones usando Theiler Staging21. Debido a que la estadificación puede variar entre embriones dentro de una sola camada, escenifique cada embrión individual.
NOTA: Esto también puede proporcionar previsión de los posibles defectos cardíacos congénitos en los embriones. Por lo general, los síntomas de un defecto cardíaco congénito se pueden observar en la morfología embrionaria. Otros defectos importantes a menudo asociados con ciertas afecciones cardíacas pueden estar presentes. - El corazón se puede extirpar de varias maneras dependiendo de la edad del embrión.
NOTA: Si no está claro si el tracto de salida permanecerá intacto durante la extracción, retire más tejidos que únicamente el corazón (manteniendo el tracto de salida intacto y minimizando el contacto directo entre el corazón y los fórceps) o analice todo el embrión.- Usando un alcance de disección y dos pares de fórceps finos, coloque el embrión en su espalda y estabilice el acceso al pecho. Esto se puede hacer fijando los brazos hacia abajo con los fórceps o quitando los brazos y sosteniendo el torso en posición.
- Utilice el punto afilado de un segundo par de fórceps finos para hacer una incisión a lo largo del esternón del embrión y extenderse entre las clavículas hasta el ombligo. Comience haciendo incisiones muy finas y superficiales mientras trabaja gradualmente hacia el interior de la cavidad torácica. El corazón apenas debería hacerse visible. No lo entre en contacto con los fórceps durante estas incisiones superficiales.
- Pelar la caja torácica abierta usando el primer par de fórceps para apretar suavemente el torso del embrión, ligeramente caudal a la caja torácica. El corazón debe salir o hacerse evidente. El corazón puede requerir un poco de persuadir suave para salir. Utilice el lado de los fórceps, asegurándose de que el punto de los fórceps nunca entre en contacto con el corazón. Para mantener limpio el espacio de trabajo y los fórceps, mantenga cerca una toallita sin pelusas.
- Agarre suavemente los vasos sanguíneos pulmonares con los lados de los fórceps, asegurándose de no cortar el tejido y sacar el corazón de la cavidad torácica. Entonces, limpia el corazón.
NOTA: Para embriones e13.5 y menores, el corazón está cubierto por el pericardio. Esto debe ser removido para llegar al corazón.
- Usando un estereoscopio, tome una fotografía del corazón para una referencia posterior.
- Enjuague los corazones en la solución PBS-EDTA durante 1-2 min, y luego colóquelos en una solución de PFA al 4% durante aproximadamente 45-60 minutos para arreglarlos. Si desea realizar análisis de todo el embrión, remoje durante la noche. El volumen de la solución de PFA debe ser 5-6 veces el volumen del tejido que se está fijando.
NOTA: Este tiempo de incubación puede variar dependiendo de los estudios posteriores. Este tiempo de incubación se utiliza para la tinción de hematoxilina y eosina, inmunohistoquímica y tinción inmunofluorescente. - Lavar 5-10 min con PBS-glicina 3x y volver a colocar en PBS. También se puede añadir azida sódica o penicilina/estreptomicina para minimizar el crecimiento bacteriano y preservar los tejidos intactos. Los corazones ahora se pueden almacenar a corto plazo a 4 oC.
3. Preparación de tejidos
NOTA: Los tejidos se pueden preparar utilizando OCT (temperatura de corte óptima) incrustación o incrustación de parafina. Hay ventajas y desventajas para cualquiera de los métodos y el objetivo del análisis debe tenerse en cuenta a la hora de decidir qué método de incrustación se debe utilizar.
- Incrustación de PTU
NOTA: Este método puede ser preferible a la incrustación de formalina/parafina porque las criosecciones preservan la reactividad del antígeno, todavía se pueden utilizar para la hematoxilina y la tinción de eosina, y producen rodajas más rápido.- Preparar una solución de sacarosa disuelta en PBS a una concentración del 30% (p/v).
- Transfiera los tejidos a un nuevo tubo cónico de 15 ml o a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga pbS-30% sacarosa. Inicialmente, el tejido flotará.
- Colóquelo a 4oC en la nevera. El tejido estará listo para la incrustación de PTU cuando se hunde en la parte inferior del tubo, por lo general en 24-40 h.
NOTA: Los tejidos musculares sufren significativamente durante los ciclos de congelación/descongelación y pierden su morfología nativa. La sacarosa es absorbida por el tejido y funciona como un agente crioconservador que permite una mejor preservación de la morfología. Asegúrese de que haya suficiente solución en el tubo para que la flotación de los tejidos sea suficientemente monitoreada. PBS-sucrose se contamina fácilmente con bacterias, así que compruebe la solución con frecuencia en busca de nubosidad, lo que indica un crecimiento excesivo de hongos o bacterias. Para minimizar el riesgo de contaminación, se puede añadir penicilina/estreptomicina o azida sódica a la solución PBS-sucrose. - Retire los corazones con una pipeta Pasteur, asegúrese de que la abertura de la pipeta sea lo suficientemente ancha como para no romper el tejido. Corte la pipeta con tijeras si es necesario. Si trabaja con embriones enteros, utilice fórceps para recuperar la muestra.
NOTA: Haga esto suavemente. Incluso si la abertura de la pipeta es lo suficientemente ancha como para recuperar los corazones, los bordes de la pipeta todavía pueden romper los tejidos. Los fórceps pueden sangrar muestras de tejido si se usan de manera demasiado agresiva. - Permita brevemente que el tejido se seque al aire en una toallita sin pelusas. Coloque la muestra en un molde OCT en la posición deseada para el corte (es decir, sagital, transversal, coronal). Agregue el compuesto OCT hasta que la muestra esté completamente sumergida, asegurándose de que no haya burbujas en contacto con el tejido.
- Coloque el molde a -20 oC durante la noche o varios días y luego mueva el molde a -80 oC. Después de 24 h el molde está listo para la criosección. Los tejidos en este formato se pueden almacenar a largo plazo.
- Incrustación de parafina
- Usando etanol, deshidratar los tejidos en esta sucesión: 50% etanol para 10 min, 70% etanol para 10 min, 80% etanol para 10 min, 95% etanol para 10 min, 100% etanol para 10 min (hacer esto 3x).
- Remoje los tejidos en una serie de soluciones de etanol/xileno en esta sucesión: solución de etanol/xileno 2:1 para 10-15 min, 1:1 solución de etanol/xileno para 10-15 min, 1:2 solución de etanol/xileno para 10-15 min, 100% xileno para 10-15 min (haga esto 3x).
- Para reemplazar el xileno con parafina, remojar los tejidos en un horno al vacío (establecido entre 54-58 oC) en esta sucesión: solución de 2:1 xileno/parafina para 30 min, 1:1 solución de xileno/parafina para 30 min, 1:2 solución de xileno/parafina para 30 min, 100% parafina para 1-2 h, 100% parala fina para 1-2 h o durante la noche.
NOTA: Calentar los tejidos más allá de 60 oC durante largos períodos de tiempo hará que los polímeros de parafina se degraden y el tejido se vuelva quebradizo. - Usando parafina fresca, incruste los tejidos en la posición deseada.
4. Seccionamiento de criostato para tejidos embebidos OCT
- En el criostato, coloque todas las muestras en el interior durante un mínimo de 1 h si las muestras se almacenaron previamente en el congelador de -80 oC. Deben permanecer allí hasta que se hayan recogido todas las secciones.
- Asegúrese de que el criostato esté ajustado en los ajustes de temperatura correctos. La temperatura ambiental dentro de la cámara de criostato debe estar a unos -20 oC y el brazo del criostato debe estar a unos -24 oC.
NOTA: Esta temperatura puede variar dependiendo de cómo responda el bloque al corte. Si el corte inconsistente es un problema, la temperatura del medio ambiente podría reducirse. - Retire el bloque OCT de su molde tirando de los bordes del lado abierto del molde para aflojarlo y luego pellizcar el bloque en el extremo cerrado, donde el molde se estrecha.
- Para montar el bloque OCT, coloque el OCT a temperatura ambiente en el portabrocas, comenzando desde el medio y trabajando hasta el borde. No es necesario cubrir todo el mandril.
- Coloque el bloque OCT (consulte el paso 3.1) en el molde. El borde del bloque que estaba contra el lado cerrado del molde debe estar mirando hacia arriba en el mandril. Deje que el OCT del mandril se congele hasta que esté blanco opaco, aproximadamente 5-10 min.
- Coloque el mandril en el brazo durante otros 5-10 minutos para que el bloque llegue a la temperatura del brazo. Para obtener un sector paralelo, ajuste el brazo hasta que el borde del bloque sea paralelo al escenario y haya una distancia par entre el escenario y el borde inferior del bloque es el mismo que el escenario y el borde superior del bloque.
- Inserte la hoja y ajuste la distancia del bloque de la hoja para tomar secciones.
- Tome rodajas a un espesor de 10 m. Mantenga el corte hasta que el punto de interés se alcance manualmente o utilizando la función de recorte.
- Para recoger rodajas, utilice un pequeño pincel plano y un pincel de detalle. Cuando el molde comience a cortarse, utilice el cepillo plano para tirar suavemente de la rebanada contra el soporte. Al cortar a través de la muestra, el movimiento debe ser continuo y sin pausa, aunque la velocidad puede depender de la firmeza de la muestra.
- Durante el corte, utilice el cepillo plano para guiar suavemente la rebanada a medida que se hace. La rebanada no necesita estar al ras con la etapa en este punto, así que deje que dule para no causar lágrimas o jalaciones y afectar a la histología.
NOTA: Al cortar embriones enteros, esta parte puede ser especialmente difícil, especialmente cuando se cambia el tipo de tejido. Asegúrese de que las rodajas se hacen sin pausas y el pincel no tira de las rebanadas demasiado agresivamente. Cuando los tipos de tejido cambian, la rebanada puede romperse, por lo que mantener la temperatura fría es clave. Si la rotura es un problema, disminuya la temperatura o aumente el grosor de la muestra. - Detenga el movimiento del bloque una vez que la muestra esté completamente cortada, pero la rebanada aún no está libre del bloque. Sin mover el pincel plano de la rebanada, usa el pincel de detalle para dar palmaditas en la rebanada hacia abajo para que sea plana y congelarla contra el escenario.
- Sostenga la rebanada allí durante 10 s antes de quitar el pincel de detalle y terminar la rebanada. Utilice los dos pinceles de pintura para aplanar suavemente la rebanada contra el escenario, evitar cualquier balanceo y mantenerla contra el escenario durante 20-30 s.
- Vuelva a voltear la rebanada y aplanar contra el escenario. Mueva una diapositiva cargada electrostáticamente lo suficientemente cerca como para que la rebanada sea atraída y adhiera a la diapositiva sin tener que tocar la diapositiva hasta el escenario. Etiqueta las diapositivas con un lápiz.
- Guarde las diapositivas en una caja hermética para proteger los tejidos de la acumulación de hielo durante el almacenamiento. Para el almacenamiento a corto plazo, las diapositivas deben almacenarse a -20 oC antes de la tinción. Para el almacenamiento a largo plazo mantenerlos a -80 oC.
5. Seccionamiento de microtome para tejidos incrustados de parafina
- Coloque los bloques sobre hielo antes de seccionarlos para enfriar las muestras. Cuando se enfría, la parafina se corta más fácilmente y puede producir rodajas más delgadas.
- Preparar un baño de agua de 40-45 oC con agua ultrapura.
- Coloque la cuchilla en el soporte dentro del microtome. Asegúrese de que esté seguro y, a continuación, ajuste el ángulo de separación. Asegúrese de que el ángulo de separación es correcto. Esto se puede comprobar siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Coloque el bloque de parafina en el microtome. Asegúrese de que esté correctamente orientado para que la hoja se corte directamente a través del bloque.
- Asegúrese de que la hoja esté orientada correctamente con el bloque haciendo un par de rodajas. Haga esto cuidadosamente para que se puedan realizar ajustes.
- Recortar el bloque hasta que se alcance el punto de interés.
- Haga rodajas con el grosor deseado. Tenga en cuenta que es probable que se descarten los primeros sectores.
- Recoge las secciones y muévelas al baño de agua usando fórceps. Esto debería hacer que las secciones se aplanen. Utilice los fórceps para ajustarlos según sea necesario.
- Mueva una diapositiva cargada electrostáticamente lo suficientemente cerca como para que la rebanada sea atraída y se adhiera a la diapositiva. Etiqueta las diapositivas con un lápiz.
- Coloque todas las diapositivas recogidas en un portaobjetos. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche a 37 oC.
6. Desparafinación de tejidos
- Lavar los portaobjetos en la siguiente secuencia: 3 min en xileno (2x), 3 min en una solución de 1:1 xileno/100% etanol, 3 min en 100% etanol (2x), 3 min en 95% etanol, 3 min en 70% etanol, 3 min en 50% etanol.
7. Tinción de hematoxilina y eosina
- Prepare las diapositivas para la tinción.
- Si utiliza tejidos preparados para PTU, remoje en agua destilada durante 4 minutos hasta que se disuelva la PTU y deje secar.
- Si se utilizan tejidos incrustados de parafina, deben desparasinizarse. Consulte el paso 6.1.
- Coloque el portaobjetos en hematoxilina filtrada al 0,1% durante 10 minutos.
- Coloque el portaobjetos en 0.5% de eosina durante 10 s o sumerja 12x. Sumerja el portaobjetos en agua destilada hasta que la eosina ya no se raye, alrededor de 2-3 inmersiones.
- Deshidratar el portaobjetos empapando en 50% etanol para 10 s, 75% etanol para 10 s, 95% etanol para 30 s, y 100% etanol durante 1 min. Sumergir en xileno hasta que el xileno salga suave, 5-7 inmersiones.
- Permita que el xileno se evapore y se monte con un medio de montaje de secado rápido que tenga un índice de refracción cercano al vidrio.
8. Análisis cualitativo de defectos cardíacos comunes
- Tome imágenes de todas las muestras utilizando un microscopio invertido o estéreo y su cámara respectiva. Tomar imágenes macroscópicas y microscópicas, dependiendo de los tipos de defectos que se analizan. Las imágenes macroscópicas se pueden tomar con cualquier aumento por debajo de 10x. Las imágenes microscópicas deben tomarse con un aumento de 40x o superior. Las fotos tomadas en este artículo fueron tomadas con un aumento de 5x usando un microscopio estéreo y un objetivo de aire 40x (lente N.A. de 0.55) usando un microscopio invertido.
NOTA: Las imágenes macroscópicas son un buen punto de partida porque proporcionan una vista a todo el corazón(Figura 3). A medida que se identifican los patrones, se pueden centrar e investigar áreas específicas. - Alinee todas las imágenes una al lado de la otra en la pantalla de un ordenador. Tener todas las imágenes de muestras de control en un lado de la pantalla y todas las imágenes de muestras experimentales en el otro lado de la pantalla. Es mejor analizar un grupo de tratamiento a la vez.
- Busque diferencias en los fenotipos entre los grupos de tratamiento, comenzando en áreas clave donde se presenten defectos cardíacos comunes. Esto variará dependiendo de si las imágenes son macroscópicas, que retratan la anatomía gruesa del corazón, o microscópicas, que retratan la anatomía microscópica del tejido cardíaco.
- Comience a buscar defectos cardíacos macroscópicos comunes, como defectos del tabique ventricular(Figura 2A),defectos interauriculares(Figura 2B)y conducto sorco arterial patentado(Figura 2C). Todos estos defectos se ven más fácilmente en la visión transversal del corazón.
- Para identificar defectos del tabique, considere mirar varias rebanadas, ya que podrían observarse en un plano del tejido y no en otro.
NOTA: A veces un defecto no es la falta de un tabique, sino un agujero en el tabique. Por lo tanto, preste atención a no confundir un desgarro con un defecto septal. La búsqueda de consistencias entre las rodajas cercanas en una región específica puede confirmar si en realidad se trata de un defecto o un desgarro por el corte. - Para identificar defectos en el tracto de salida, como el conducto arterial patentado, utilice varias rodajas para seguir los vasos sanguíneos principales a medida que salen del corazón. Crear una imagen de los vasos sanguíneos principales en relación entre sí. Un ejemplo se presenta en la Figura 2C.
NOTA: Algunas irregularidades pueden deberse a la etapa de desarrollo de un embrión (por ejemplo, el conducto arterial patentado se cierra postnatalmente, poco después del nacimiento; el tabique ventricular no se cierra por completo hasta el e14,5). Algunos otros defectos cardíacos macroscópicos comunes que no se incluyen en las figuras incluyen truncus atereriosus persistente, que se puede detectar más fácilmente en e16.5 y posterior; ventrículo derecho de doble salida (DORV), que se puede detectar en rodajas en las que el corazón entra en el tracto de salida; y una aorta dominante22. Un defecto cardíaco microscópico común incluye disminución de la compactación muscular(Figura 4).
9. Análisis cuantitativo de la compactación muscular cardíaca utilizando tejidos manchados de hematoxilina y eosina
- Utilizando la vista macroscópica de las muestras de tejido teñido(Figura 4A),identifique una región de interés para la imagen con un aumento de 40x(Figura 4B). Para este papel, se utilizó la pared del ventrículo izquierdo. Guarde la imagen en el formato deseado. Para este documento, las imágenes se guardaron como archivos .tif.
- Abra la imagen en el software ImageJ.
- Establezca la imagen en 8 bits. Esto permite que la imagen utilice la herramienta de umbral en el siguiente paso23,24. Para hacer esto, seleccione"Imagen " Tipo de la clase de texto (Type 8 bits".
- Establezca el umbral de la foto. El propósito de este paso es seleccionar solo los píxeles que representan el fondo, excluyendo los píxeles que representan los tejidos23,24.
NOTA: Esta superficie se restará más adelante. Un umbral correcto seleccionará los píxeles que el investigador desea excluir de la superficie del tejido muscular. Por lo tanto, el resultado final debe incluir el tejido en escala de grises y se seleccionará el fondo.- Haga clic en "ImageJ ? Imagen de la imagen de la imagen de Ajustar ? Umbral". Mueva la barra superior para realizar ajustes de umbral. Cierre la ventana de ajustes de umbral sin realizar ningún otro cambio una vez que se seleccionen las secciones deseadas21.
- Utilice la herramienta Selecciones de polígono para seleccionar el espacio que ocupa el tejido. Asegúrese cuidadosamente de que los contornos rastreen los bordes del tejido, porque los trazados sueltos proporcionarán mediciones falsas.
- Ajuste la configuración de medición en ImageJ para que el software solo mida el área de píxeles que se seleccionaron utilizando la herramienta de umbral en el paso 9.423. "ImageJ ? Analizar ? Ajuste de Medidas (Set Measurements) Area y Limit to Threshold". Seleccione solo Area y Limit to Threshold.
- Mida el área de los píxeles resaltados. "ImageJ ? Analizar ? Medir". Este valor representa el área del espacio negativo.
- Mida el área de toda la región de interés. Este es el área que se seleccionó con la herramienta Selecciones de polígono. "Imagen J ? Analizar ? Ajuste de Medidas (Set Measurements) Area". Seleccione solo Area y anule la selección de Limitar a umbral. A continuación, medir, seleccionando "Imagen J ? Analizar ? Medir".
- Calcular el área que el tejido muscular real está ocupando dentro de la región de interés. Restar el área del espacio negativo del área de toda la región de interés. Este valor es el área del tejido muscular.
- Calcular el índice de compactación muscular (MCI). Divida el área del tejido muscular por el área de la región de interés.
Cuanto mayor sea el valor de MCI, más compactado será el músculo. Estos valores de MCI se pueden utilizar para el análisis estadístico para probar cambios significativos en la compactación muscular entre los grupos de tratamiento(Figura 4C).
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Representative Results
El índice de compactación muscular se comparó entre corazones que se desarrollaron bajo dos ambientes diferentes, un control y un grupo experimental. Estos protocolos se utilizaron para analizar cuantitativamente la compactación del tejido muscular, lo que permitió el análisis estadístico. Se demostró que la compactación muscular se redujo significativamente en los corazones experimentales en relación con los embriones que se desarrollaron en condiciones no experimentales.
Los embriones fueron descartados si el tiempo de observación parecía inexacto. Aunque el crecimiento atrofiado de embriones podría ser el resultado del tratamiento del experimento, y hay un rango en el progreso del desarrollo, la reproducción se espació lo suficiente como para garantizar el momento del desarrollo embrionario. La puesta en escena de los embriones se realizó utilizando Theiler Staging21. Se consideró que las muestras estaban mal cortadas si las rodajas no reflejaban consistencia o si tenían lágrimas o pliegues obvios. La tinción proporcionaba suficiente contraste para distinguir los bordes del tejido, pero no era tan oscuro como para hacer que las características celulares fueran indistinguibles. Las diapositivas se crearon entonces con un microscopio invertido con un objetivo de 40x. Los valores de MCI se calcularon utilizando el software ImageJ y Microsoft Excel. Estos valores de MCI se analizaron utilizando una prueba T.
Figura 1: Resultados del ensayo de enchufe en ratones C57BL6/J. (A) Un ratón con un enchufe de cópula fácilmente identificable. (B) Un ratón sin enchufe de cópula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Defectos cardíacos comunes. Esquema de la verdadera morfología prevista de un defecto cardíaco congénito. (A) Vista transversal de un defecto septal ventricular. (B) Vista transversal de un defecto interauricular. (C) Patentado conducto arterial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mancha de hematoxilina y eosina de corazones e15.5. (A) Un corazón manchado que se desarrolló en condiciones normales. Barra de escala a 750 m. (B) Un corazón manchado que se desarrolló en condiciones experimentales. Barra de escala de 750 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis cuantitativo de la compactación muscular entre corazones que se desarrollaron bajo dietas maternas normales y corazones que se desarrollaron bajo dietas maternas deficientes de ácidos grasos esenciales. (A) Hematoxilina y eosina teñidas corazones en una vista macroscópica (5x). Barras de escala a 1.000 m. (B) Corazones manchados de hematoxilina y eosina a la vista microscópica (40x). Barras de escala a 75 m. (C) Los datos resultantes de las mediciones del índice de compactación muscular. Los valores se analizaron utilizando una prueba T (n 4 por grupo de tratamiento). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo explora las técnicas involucradas en el análisis del desarrollo cardíaco en corazones embrionarios. Algunas limitaciones de este método son la destreza física requerida para las técnicas preparatorias, que pueden requerir práctica, y habilidad con imágenes de microscopio. Si las rodajas obtenidas en el criostato son desordenadas, la tinción de hematoxilina y eosina no será clara, o si las imágenes tomadas en el microscopio tienen mala iluminación, entonces el método utilizado con ImageJ no funcionará. Una limitación de la característica de umbral del software ImageJ es que selecciona píxeles ubicados en un extremo de un umbral que depende del valor de píxel. Por lo tanto, los píxeles que existan en el lado incorrecto del umbral se incluirán o excluirán incorrectamente en el cálculo. En última instancia, la solución de problemas será necesaria para la adopción de los protocolos para su uso en un estudio.
En caso de que la extracción del corazón sea demasiado difícil, considere saltar al paso 2.8. Además, considera eliminar algo más que el corazón y los pulmones de la cavidad torácica. El objetivo entonces se vuelve más grande y más fácil de manipular, y el contacto directo entre el corazón y los fórceps finos se minimiza. En la sección criostato, las muestras experimentales siempre se compararán directamente con las muestras de control. Esto permite cierto margen de error del usuario siempre que el error sea coherente en todos los ejemplos. Para minimizar el error del usuario y evitar resultados falsos, asegúrese de que se obtienen secciones comparables de ambos grupos de tratamiento. Por ejemplo, si más de una persona está produciendo secciones, asegúrese de que una persona produce un número par de secciones para los controles y todos los grupos de tratamiento, y no solo un subgrupo. Por último, al umbral de imágenes en ImageJ, la herramienta de umbral se utiliza para permitir la máxima libertad en la selección de píxeles que representan tejido y píxeles que no lo hacen. Si es necesario, ajuste el contraste de las imágenes para intensificar aún más el valor de píxel del fondo a partir del valor de píxel del tejido. Aunque hay opciones de solución de problemas, las técnicas todavía requieren un alto grado de habilidad. Sin embargo, la realización de este protocolo proporciona acceso a datos que no se miden típicamente en otros estudios de investigación de desarrollo cardíaco. Por lo tanto, la utilización de características de este protocolo podría hacer una contribución significativa a una investigación científica.
La identificación de los impactos de los tratamientos experimentales en la investigación de cardiología a menudo se investiga a través de la evaluación morfológica. Este es especialmente el caso en la biología del desarrollo, en la que la placenta hace difícil que las características fisiológicas del desarrollo de corazones se midan. Por lo tanto, el análisis morfológico que permite la visión de la función del corazón cambia drásticamente la trayectoria de la investigación de la biología del desarrollo. Aunque la mayoría de los papeles analizan el grosor del músculo cardíaco para determinar la fuerza del corazón, la medición directa de la compactación muscular podría proporcionar una visión más detallada de la fisiología del corazón de mamífero en desarrollo25,26,27.
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Disclosures
Los autores no tienen revelaciones que reportar.
Acknowledgments
El Laboratorio Aguirre es apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio K01HL135464 y por la Asociación Americana del Corazón bajo el número de premio 19IPLOI34660342.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
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