Summary
אנו מתארים פרוטוקול להערכת מורפולוגיה לב ותפקוד של בוגרים בדגים באמצעות אקו בתדר גבוה. השיטה מאפשרת ויזואליזציה של הלב והקוונפיקציה הבאים של פרמטרים פונקציונליים, כגון קצב הלב (HR), פלט לב (CO), שינוי באזור החלקי (FAC), הוצאה לפליטה (EF), וזרימה ומהירויות זרימה.
Abstract
הדגים (danio rerio) הפך לאורגניזם מודל פופולרי מאוד במחקר לב וכלי דם, כולל מחלות לב האדם, בעיקר בשל השקיפות העובריות שלה, מעקב גנטי, ו הנועם כדי מהיר, תפוקה גבוהה לימודים. עם זאת, הפסד של שקיפות מגביל ניתוח תפקודי לב בשלב המבוגר, אשר מסבך את הדוגמנות של מצבי לב הקשורים לגיל. כדי להתגבר על מגבלות כאלה, אולטרסאונד בתדר גבוה האקו בדגים הוא מתגלה כאופציה מעשית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי להעריך את תפקוד הלב ב דג זברה מבוגרים על ידי האקו לא פולשנית באמצעות אולטרסאונד בתדר גבוה. השיטה מאפשרת הדמיה וניתוח של מימד לב הדגים וככמת של פרמטרים פונקציונליים חשובים, כולל קצב הלב, עוצמת שבץ, פלט לב, ושבריר פליטה. בשיטה זו, הדג מורדם ונשמר מתחת למים וניתן לשחזר לאחר ההליך. למרות שאולטרסאונד בתדר גבוה היא טכנולוגיה יקרה, אותה פלטפורמת הדמיה ניתן להשתמש עבור מינים שונים (למשל, מורצין ו zebrafish) על ידי התאמת התמרה שונים. האקו הוא שיטה איתנה עבור פנוטיפים לב, שימושי באימות ואפיון של דגמי מחלות, בעיקר מחלות מאוחרות; מסכי התרופות; ומחקרים של פציעת לב, החלמה ויכולת התחדשות.
Introduction
הדגים (danio rerio) הוא מודל בעלי חוליות מבוסס היטב למחקרים של תהליכים התפתחותיים ומחלות אדם1. Zebrafish יש דמיון גנטי גבוה לבני אדם (70%), היכולת הגנטית, פוריות גבוהה, ושקיפות אופטית במהלך פיתוח עובריים, אשר מאפשר ניתוח חזותי ישיר של איברים ורקמות, כולל הלב. למרות שיש רק אטריום אחד וחדר השינה אחד, לב דג זברה (איור 1) הוא דומה באופן מבחינה פיזיולוגית לבבות ארבעה הצ. חשוב מכך, קצב פעימות הלב, מורפולוגיה חשמלית וצורה פוטנציאלית לפעולה דומים לאלה של בני האדם יותר מאשר מיניםמורניים 2. תכונות אלה הפכו דג זברה מודל מצוין עבור מחקר לב וכלי דם סיפקו תובנות מרכזיות להתפתחות הלב3,4, התחדשות5, התנאים הפתולוגית1,3,4, כולל טרשת עורקים, cardiomyopathies, הפרעות בקצב הלב, מחלות לב מולדות, ו-עמילואיד שרשרת האור קרדיולוגית1,4,6. הערכה של תפקוד לב אפשרי במהלך השלב העובריים (1-ימים הפריה פוסט) באמצעות ניתוח וידאו ישירה באמצעות מיקרוסקופ וידאו במהירות גבוהה7,8. עם זאת, דגים מאבדים את השקיפות שלהם מעבר לשלב העובריים, הגבלת הערכות פונקציונליות של לבבות בוגרים נורמליים ומצבי לב התפרצות מאוחרת. כדי להתגבר על מגבלה זו, אקו קרדיוגרפיה מועסק בהצלחה כמו ברזולוציה גבוהה, בזמן אמת חלופה הדמיה לא פולשנית כדי להעריך את פונקציית הלב הבוגרת דג זברה9,10,11,12,13,14,15.
ב-zebrafish, הלב ממוקם ventrally בחלל החזה מיד אחורי הזימים עם האטריום ממוקם על החדר. האטריום אוספת דם ורידי מתוך venosus הסינוס ומעבירה אותו אל החדר שבו הוא נשאב עוד יותר בולבוס הריוסוס (איור 1). כאן, אנו מתארים פיסיולוגי, מתחת למים, פרוטוקול להערכת תפקוד לב בוגרים דג זברה על-ידי אקו שאינו פולשני באמצעות מערך ליניארי בדיקה אולטרסאונד עם תדר מרכז של 50 MHz עבור הדמיה במצב B ברזולוציה של 30 μm. מאז גלי אולטרסאונד יכול בקלות לנסוע דרך המים, שמירה על קירבה בין הדג ואת בדיקה סריקה מתחת למים מספק מספיק משטח מגע לאיתור לב ללא צורך ג'ל אולטרסאונד והוא הכולל פחות מלחיץ את הדג. למרות שמערכות האקו-לב החלופיות דווחו על-ידי מספר סופרים9,12,13, כאן אנו מציגים את ההתקנה הכללית והנפוצה ביותר החלה על אולטרסאונד בתדר גבוה בבעלי חיים.
השיטה מאפשרת דימות ברזולוציה גבוהה של לב דג זברה מבוגרים, מעקב אחר מבנים לב, ו כימות של מהירויות שיא מדידות זרימת דם דופלר. אנו מראים אמין בvivo פיקציה של הפרמטרים הסיסטולי החשוב הדיאסטולי, כגון שבריר הפליטה (EF), שינוי באזור החלקי (FAC), תזרים הזרימה החדרית ומהירויות זרימה, קצב הלב (HR), ופלט לב (CO). אנו תורמים להקמת מגוון אמין של רגיל מבוגר בריא הפרמטרים של לב פונקציונלי ומימדי לאפשר הערכה מדויקת יותר של מדינות הפתולוגית. בסך הכל, אנו מספקים שיטה איתנה כדי להעריך את תפקוד הלב ב-דג זברה, אשר הוכיחה שימושי מאוד בהקמת ואימות דג זברה מחלת לב מודלים6,16, פגיעה בהלב והתאוששות10,13, ו התחדשות11,12, וניתן להשתמש בנוסף כדי להעריך תרופות פוטנציאליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הכרוכים בדגים אושרו על ידי הוועדה המוסדית שלנו לטיפול בבעלי חיים ובהתאם לחוק הרווחה של משרד החקלאות.
1. הגדרת ניסיוני
-
הגדרת הפלטפורמה לרכישת תמונה
- באמצעות מספריים קטנים או אזמל לעשות חתך על ספוג בעמדה 12 השעה להחזיק את הדג במהלך הסריקה. מניחים את הספוג במיכל זכוכית (איור 2א).
הערה: המיקום של החתך צריך לאפשר מקום מספיק כדי להזיז מתמר וגם לשמור על הדג לשאוג את קו המים כאשר הפלטפורמה מוטה לסריקה (איור 2). החתך יכול להשתנות בהתאם לגודל הדג; עם זאת, עבור גודל ומשקל סטנדרטיים, החתך צריך להיות כ 2.5 ס"מ x 0.7 ס"מ x 0.5 ס"מ (אורך, רוחב, עומק, בהתאמה). מיכל הזכוכית צריך להיות לפחות 6 ס מ עמוק כדי למנוע דליפת מים בעת הדמיה הדג. - לצרף את תיבת הזכוכית המכילה את הספוג על פלטפורמת אולטרסאונד, למשל באמצעות קלטת דו צדדית. ודאו שתיבת הזכוכית נמצאת במרכז הרציף ומחוברת בחוזקה (איור 2ב').
- להטות את הפלטפורמה קדימה על 30 ° באמצעות כפתור בצד שמאל של מחזיק הפלטפורמה (איור 2B). ממלאים את ריבוע זכוכית עם 200-250 mL של מים מערכת דגים המכיל 0.2 mg/mL tricaine מתיונין (MS222).
הערה: Tricaine יכול להיות מוכן כמו 4 mg/mL פתרון המניה ב Tris 40 mM pH 7 ו מדולל עוד לריכוז הרצוי במים מערכת דגים; 0.2 mg/mL נמצא הריכוז הטוב ביותר16. הפתרון של מלאי mg/mL tricaine יכול להיות מאוחסן לתקופה ארוכה של זמן ב-20 ° c או ב -4 ° c לחודש אחד. - הכנס את המחתמר בתוך מחזיק המיקרומניפולציה בתחנת הרכבת הפועלת, והפנה את חריץ התמר לכיוון המפעיל. שמרו על המערך במקביל לקרקע עם האורך הצדדי הפועל ביחס לשלב (ראו איור 2ב). השאירו מספיק מקום (10 ס מ משני הצדדים) עבור מערכת הרכבת מתמר המחובר כעת לנוע לאורך צירי x ו-y.
- היכנס לתוכנת הבקרה ובחר בעכבר (קטן) כלי דם. צור מחקר חדש, כמו גם סדרה חדשה עבור כל חיה הכלולה במחקר. מצא את לחצן המחקר החדש הממוקם בצד השמאלי התחתון של המסך בדף הדפדפן (התצוגה מתחילה ב-מצב B).
- באמצעות מספריים קטנים או אזמל לעשות חתך על ספוג בעמדה 12 השעה להחזיק את הדג במהלך הסריקה. מניחים את הספוג במיכל זכוכית (איור 2א).
2. טיפול בדגים
הערה: Zebrafish השתמשו במחקר זה היו מבוגרים, 11 חודשים בן זכרים של זן סוג פראי AB/Tuebingen (AB/TU). דג zebrafish שמרו במערכת האקווריום של זרימה עצמאית ב -28 ° c במחזור אור קבוע שנקבע כ-14 שעות אור/10 h כהה. Zebrafish ניזונו פעמיים ביום עם שרימפס ממלח (ארטמיה זוחלים) ופתיתי מזון יבש.
- באמצעות רשת דגים, להעביר את הדג לתוך מיכל קטן המכיל מים מערכת עם 0.2 mg/mL tricaine. המתן עד שהדג מורדם לחלוטין (אין תנועה ואין תגובה למגע).
- באמצעות כפית פלסטיק, בעדינות ובמהירות להעביר את הדג לתוך תיבת זכוכית המכילה את הספוג לתוך החתך בעבר עשה עם הצד הגחוני של הדג פונה כלפי מעלה.
הערה: ודא שראשו של הדג מוצב כלפי המפעיל (אותו כיוון של המיתמר) וברמה גבוהה במקצת בהשוואה לשאר חלקי הגוף כדי להשיג הדמיית לב טובה יותר. - בעדינות להנמיך את מתמר (שמירה על המיקום המקורי שלו) באמצעות ידית על מערכת המעקה, הצבת אותו longitudinally וקרוב לצד הגחוני של הדג עם חריץ של התמר מול המפעיל. השאירו 2-3 מ"מ (לא יותר מאשר 1 ס מ) אישור מן הדג. כוונן את הפלטפורמה ביחס לתמר באמצעות המיקרומניפולציה בכל 3 הצירים עד שהלב הדג מדמיין ולאחר מכן התחל את רכישת התמונה. אין לשנות את זווית התמר במהלך רכישת התמונה כולה (איור 2ג).
הערה: כל עוד יש מספיק קירבה (עד 1 ס מ), המים על גבי הדג יספק משטח מגע דרך מתח משטח נוזלי המאפשר שידור של גלי אולטרסאונד בין המקדח לבין הדג. לכן, אין צורך לדחוף את התמר נגד הדג. נסה להשלים שלב זה ולסיים את הסריקה בתוך פחות מ 3 דקות כדי למנוע מוות דגים או ירידה של קצב הלב במהלך רכישת תמונה. במידת הצורך, השתמש בשעון עצר. את הלב ניתן למצוא בצד העליון של המסך לכיוון צד שמאל של העין, אשר ניתן לדמיין בקלות אם הזזת ציר ה-x כל הדרך ימינה. אם יש קושי המשך למצוא את הלב בעוד במצב ב-B, לעבור צבע דופלר מצב, אשר יאפשר לעקוב אחר זרימת הדם (אדום מציין דם זורם לעבר המפעיל) ואיתור הלב.
3. רכישת תמונה
הערה: ראו טבלת חומרים לתוכנה למערכות דימות ולניתוח תמונה.
- האורך והצג B-מצב
- לאחר לוקליזציה של הלב, לבחור או להישאר ב-B-Mode (נמצא בצד השמאלי התחתון של מסך המגע לאחר שיזם סדרה חדשה) ולהקטין את השדה כדי להתקרב ולהסתכל מקרוב על הלב לאיתור קל יותר במהלך הניתוח.
- כדי לקבל תצוגה מקרוב וברורה יותר של הלב ברכישת תמונה במצב B, להקטין את השדה על ידי התקרבות. השתמש במסך המגע כדי לצמצם ידנית את השדה בשני צירי ה-x ו-y.
- במקרה הצורך, שיפור האיכות/הניגודיות של התמונה על-ידי הגדרת הטווח הדינמי ל-45-50 dB. עבור אל הפקדים במצב B באפשרות ' פקדים נוספים ' ולאחר מכן שמור את השינוי בהגדרות קבועות מראש של מצב. הקש על ' הגדרות מוגדרות מראש של מצב ' כדי לבחור את ההגדרה המוטבת של רכישת תמונות בכל פעם לפני התחלת התמונה של סידרה חדשה.
- קח כמה תמונות שתרצה במישור הציר הארוך על-ידי בחירה באפשרות ' שמור תמונה'.
הערה: ניתן למצוא מידע מפורט יותר ומשאבי הדרכה ברכישת תמונות ב- https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab ו- https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
- האורך השקפה הדופק גל
- מעבר ל דופלר צבע לאיתור זרימת הדם (לבחור צבע לחצן) ורכישה (נמצא בצד השמאלי התחתון של מסך המגע לאחר שיזם סדרה חדשה).
- השימוש במסך המגע ממקם את הרביע על גבי שסתום הלוח הפנימי וממקם את הזרימה הנכנס, שתהיה מזוהה על-ידי אות הצבע האדום (איור 3א). הפחת את אזור הרביע ככל האפשר כדי להגדיל את קצב המסגרות.
הערה: הנמך את צבע הדופק-חזרה-תדר (צבע PRF) (טווח מהירות) כדי להבטיח צבע צהוב ניתן לראות פרופיל מהירות של התמונה דופלר צבע. זה יגדיל את טווח המהירויות שניתן לראות ויסייע ליצור פסיפס של צבע שיאפשר להמחיש באופן ברור יותר את המהירויות שיא. - הפעל את גל הדופק (בחר Pw) במצב דופלר כדי לדגום מהירות זרימה של דם חדרית. הצב את שער נפח המדגם במרכז השסתום הלוח (שבו אות הצבע האדום הופך צהבהב יותר) כדי לזהות את מהירות הזרימה המקסימלית. כוונן את זווית ה-PW על המסך באמצעות אצבעותיך, כך שהוא מיושר עם כיוון הזרימה של הדם. לחץ להתחיל או לעדכן כדי להתחיל לבדוק את המהירות של הדם הזורם לתוך החדר.
הערה: ודא שהקו הנכון של הזווית מקביל לזרימת הדם כדי לספק תוצאות עקביות ומקבילות. הצבת קו הזווית הנכונה כך שהוא תואם את כיוון זרימת הדם תבטיח כי המהירויות נלכדים במדויק. - חזור על השלב 3.2.3 כדי לקבוע את מהירות יוצאת הדרך על ידי הצבת הרביע דופלר צבע בצומת בין החדר לבין בולבוס (שסתום בורגול) ולהתאים את הזרימה, אשר יהיה מכובד על ידי אות צבע כחול (איור 3ב). הצב את שער נפח הדגימה ממש לפני צומת החדר-בולבוס וכוונן את קו תיקון הזווית כדי להתאים לכיוון זרימת הדם.
הערה: כפי שהוזכר קודם לכן, כדי להשיג ערכי מהירות מדויקים, ודא שזווית ה-PW מיושרת עם זרימת הדם. - כוונן את קו הבסיס (סרגל), מוריד או מעלה אותו בלוח מהירות הזרימה, כדי לאתר ולעקוב לחלוטין את פסגות האותות (איור 3ג, ד). זהה את הפסגות של הזרימה הנכנסת ברביע העליון/חיובי (האות הולך לכיוון הבדיקה) ואת הפסגות הזרימה ברביע הנמוך/שלילי (האות מתרחק מהמקדח).
4. התאוששות מדגים
- ברגע הרכישה התמונה הושלמה, באמצעות כפית, להעביר את הדג לתוך מים מערכת רגילה לשימוש חינם של tricaine ולתת את הדג להתאושש (בדרך כלל לוקח 30 s כדי 2 דקות כדי לחדש את התנועה גיל ושחייה).
- כדי לעזור להחלמה, להשפריץ מים שוב ושוב על הזימים באמצעות פיפטה העברה כדי לקדם את האוורור של המים והעברת החמצן.
5. ניתוח תמונה
- פתח את תוכנת ניתוח התמונה.
- בחרו תמונה ולחצו על סמל עיבוד התמונה (איור 4). באמצעות קנה המידה הזמין (איור 4), להתאים את הבהירות ואת הניגודיות של התמונה כדי לאפשר ויזואליזציה ברורה של קירות חדרית או דפוס זרימת הדם.
- באמצעות התמונה במצב B, פתח את הרשימה הנפתחת מתוך האפשרות PSLAX (ציר ארוך) בחבילת הלב/מדידות (איור 4). לבחור מעקב LV ולעקוב הקיר הפנימי חדרית ב סיסטולה ו דיאמאנס כדי להשיג את האזור החדרית (VA) ב סיסטולה (VAs) ו דיאמד (vad), סוף נפח דיאסטולי (edv), והקצה הסיסטולי האמצעי (esv) (איור 5A, B).
הערה: ערכי אמצעי האחסון מורכים מעקבות תמונה דו-ממדית ועלולים לסטות מהישות התלת-ממדית. עבור כל המדידות, ממוצע לפחות 3 מחזורי לב מייצגים לכל חיה. - שים לב לעוצמת הקו ולשבר הפליטה שיחושבו באופן אוטומטי ויוצג על-ידי התוכנה.
הערה: ניתן לחשב באופן ידני את עוצמת הקו ושבריר הפליטה באמצעות הנוסחאות
SV = EDV-ESV
EF = (EDV-ESV)/EDV
כאשר SV הוא נפח קו, EDV הוא סוף הנפח דיאסטולי, ESV הוא אמצעי אחסון סיסטולי הקצה, ו-EF הוא שבר הוצאה - חישוב שינוי אזור השבר באמצעות הנוסחה
FAC = (VAd-VAs)/VAd
כאשר FAC הוא שינוי אזור חלקי, VAd הוא אזור חדרית ב דיאמאנס, ו VAs הוא אזור חדרית ב systole. - חישוב תפוקת הלב באמצעות הנוסחה
CO = HR x-SV
כאשר CO הוא פלט לב, HR הוא קצב הלב, ו-SV הוא נפח קו - באמצעות התמונה במצב הדופלר פעמו גל, למדוד את מהירות הדם הנכנס על ידי בחירת אפשרות הזרמת MV תחת חבילת הלב (איור 4). בחר E או A לקבלת דיאמטוגרפיה מוקדמת ומאוחרת, בהתאמה, וקבע את מהירויות השיא בגרף (איור 3ג).
- למדוד את מהירות הדם היוצאת על ידי בחירת זרימת Aov ולקבוע את הפסגות על העקיבה (איור 3ד).
- למדוד את קצב הלב באמצעות 2 מתודולוגיות שונות להערכה אמינה יותר:
- כאשר הלב הוא מדמיין על המסך במהלך רכישת תמונה, לספור את פעימות בתוך 10 s ולהכפיל אותו על ידי 6.
- באמצעות תמונת דופלר גל הדופק על תוכנת Vevo LAB, בחר את לחצן קצב הלב ומרווחי המעקב בין 3 פסגות זרימת אבי העורקים ברציפות (איור 4 ואיור 6).
- כדי לייצא נתונים לגיליון אלקטרוני לאחר שאיתרת את ה-LV ואת הפסגות של זרימת הדם, לחץ על הדוח | ייצוא | שמור בתור | excel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול המתואר מאפשר מדידה של פרמטרים חשובים של לב מימדי ופונקציונלי, מקבילה לטכניקה המשמשת האקו אדם ובעלי חיים. התמונות במצב B לאפשר מעקב של הקיר הפנימי חדרית ב סיסטולה ו דיאמטים (איור 5) וקבלת נתונים ממדיים, כגון מידות קאמרית וקיר, ונתונים פונקציונליים, כגון קצב הלב, נפח שבץ, ופלט לב, כמו גם פרמטרים של תפקוד סיסטולי חדרית, כגון שינוי אזור השבר הוצאה (טבלה 1). מדידות ברמה של שסתום מלוח באמצעות צבע במצב דופלר תמונות גם לספק זרימה המוח ומהירויות דם של זרימה (מהירות שבה דם ממלא יציאות החדר, בהתאמה) (איור 3 ושולחן 1).
הפרמטרים שהושגו במחקר זה היו דומים עם אלה שדווחו במחקרים קודמים באמצעות תנאים ניסיוניים דומים6,16,17 (שולחן 1), עוד להפגין את השגות של השיטה. בסך הכל, אנו מראים כי באמצעות פרוטוקול זה מפורט אחד יכול ביעילות ובעקביות להעריך את פונקציית הלב דג זברה, אשר קריטי בעת השוואת פנוטיפים לב שונים במהלך מחקר.
איור 1: איור של לב של דג בוגר. זרימת הדם מיוצגת על ידי חיצים: הדם זורם מתוך venosus סינוס אל האטריום, והוא מועבר נוסף אל החדר, שם הוא נשאב הריוסוס בולבוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: חדר הדמיה של דגים. (א) להכין "חדר" לעיבוד דגים, ספוג עם חתך לקצה אחד בכיוון אנכי מוצב במיכל זכוכית. (ב) מיכל הזכוכית מודבק בחוזקה על פלטפורמת ההדמיה הנוטה. (ג) מתמר רכוב על מניפולטור ומוצב במקביל החתך עבור מיצוב הדמיה נכונה (חריץ מתמר מצביע לעבר המפעיל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מלוח הזרימה הנכנס (A) ו-זרימה (ב) במצב דופלר צבע והמקביל מתאים דופלר wave להעריך את המהירויות של פסגות של גלי הדיאסטולי המתאימים (C) ו-(ד) לבין חדרית (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח תמונה. לאחר עיבוד תמונה (כדי להשיג ניגודיות ובהירות רצויה של התמונה), ניתן לבצע מדידות במצב דופלר PW (משמאל) ו-B-mode (מימין) תמונות. כדי לעקוב אחר קיר LV בתמונה במצב B, בחר חבילת לב מהתפריט הנפתח, עבור pslax, ובחר LV מעקב. כדי למדוד את המהירויות שיא בתמונה במצב דופלר PW, בחר חבילת לב מהתפריט הנפתח. כדי למדוד את מהירות הזרימה החדרית של זרימת הדם, בחר את האפשרות הזרמת MV ובחר E או A עבור הדיאמגנבו מוקדם ומאוחר בהתאמה. לקביעת מהירות הדם היוצאת, בחר זרימת Aov ומהירות שיא AV. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תמונות במצב B. (A) התמונה ב-מצב של החדר (V) בתוך הדיאמטרים, מלא דם המגיע מאטריום (א). (ב) התמונה של מצב B של החדר בתוך systole, הוצאת דם דרך הריוסוס בולבוס (ב, מעקב ירוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: גל הדופק תמונת דופלר. ערך קצב הלב יכול להיווצר על ידי מעקב 3 פסגות העורקים ברציפות. את פסגות זרימת אבי העורקים ניתן להציג על ידי בחירת לחצן קצב הלב בכרטיסיה מדידות בתוכנת הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| פרמטרים, יחידות ± sd | מחקר זה | וונג, ל' ואח', 2017; לי, ל. ט אל, 2016 &Amp; מישרה, ס. ט. אל, 2019 | הערות/תיאור |
| קצב לב (HR), bpm | 133 ± 7 | 118 ± 14-162 ± 32 | פראי-סוג AB/ABTU זכרים ונקבות בין 3-12 חודשים מורדם בטריקיין 0.2 mg/mL |
| שינוי אזור חלקי (FAC) | 0.38 ± 0.03 | 0.29 ± 0.07-0.39 ± 0.05 | |
| שבר הוצאה (EF), [%] | 42 ± 7 | 34 ± 0.04-48 ± 0.03 | |
| נפח קו (SV), μL | 0.21 ± 0.01 | 0.18 ± 0.06-0.28 ± 0.08 | |
| פלט לב (CO), μL min-1 | 27.3 ± 1.69 | 19 ± 9.5-36.1 ± 7.8 | |
| מהירות שיא E (זרימה מוקדמת של המוח הפנימי), mm/s | 30 ± 6.8 | 25 ± 7-51 ± 16 | |
| מהירות שיא (תזרים מאוחר של המוח הפנימי), mm/s | 152 ± 32 | 144 ± 36-288 ± 54 | |
| זרימה בין חדרית, mm/s | 86.6 ± 19 | n/a |
שולחן 1: פרמטרים של אקוקרדיוגרפיות למבוגרים בלבד. ערכים שהתקבלו עבור הפרמטרים של תפקוד הלב העריכו במחקר הנוכחי עבור זכר בוגר או נקבה בגיל בין 3 ו 12 חודשים מורדם בתמיסה 0.2 mg/mL tricaine. מגוון הערכים שהושגו עבור אותם הפרמטרים במחקרים קודמים6,16,17 שבוצעו בתנאים דומים מוצגים לצורך אימות ומסייעים לתקנן את השיטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים שיטה שיטתית לדימות אקו-קרדיוגרפי והערכה של תפקוד לב בדגי מבוגרים. אקוקרדיוגרפיה היא השיטה היחידה שאינה פולשנית ואיתנה ביותר עבור הדמיה למבוגרים בלבד דגים לב וניתוח פונקציונלי, והוא הופך פופולרי יותר ויותר במחקר וכלי דם בדגים דג זברה. כמות הזמן הנדרשת היא קצרה ומאפשר לימודי תפוקה גבוהה ואורך. עם זאת, קיימת וריאציה ניכרת במתודולוגיה ובניתוח נתונים. סטנדרטיזציה של האקו דגים קשה מאוד כאשר משתנים רבים כל כך יכולים להשפיע על הפרמטרים outcoming אים. כאשר עורכים מחקרים ניסיוניים, יש לשקול תנאים שיכולים ליצור שינויים, כולל הרדמה, משקל גוף, גיל, מין ומתח רקע. וואנג, L ואח '16 העריכו את השונות שהוצגו על ידי גורמים אלה והידור את הנתונים הזמינים על תפקוד לב דג זברה כדי לעזור לתקנן את השיטה. המחקר שלהם הוא משאב שימושי מאוד כדי לתכנן מחקרים ניסיוניים הכרוכים בהערכת הדגים. בהתבסס על המידע המסופק על ידי וואנג, L ואח '16 והפניות בתוך והתצפיות שלנו6, אנו מספקים מיתאר של שלבים קריטיים ותנאים שחשבנו חשוב עבור אופטימיזציה הפרוטוקול והניתנות ליישום:
הבחירה של הדגימה: מחקרים קודמים מראים כי בעוד הפרמטרים הפונקציה סיסטולי (EF, FAC) אינם מושפעים באופן משמעותי על ידי הבדלים מין, הפונקציה דיאסטולי (כלומר שיא גל E/A יחס) יכול להיות נמוך במידה ניכרת נקבות יותר מאשר 6 חודשים. זה היה גם הבחין כי אזורים חדרית וכרכים להגדיל באופן משמעותי עם גיל הדגים (3 חודשים ומעלה) והם גבוהים במידה ניכרת אצל נקבות בשל משקל גופם גבוה יותר וגודלם. יצירת אינדקס של אמצעי אחסון דיאסטולי לאינדקס הגוף המוני (BMI) ופני שטח הגוף (BSA) יכול לעזור לבטל את ההבדלים בין נשים בהתאמה לגברים וזכרים, ויצירת אינדקס ל-BSA ומשקל יכול לעזור להתגבר על ההבדלים בגיל הקשורים הבדלים בנפח16. היו גם דיווחים של פונקציות שונות של דיאסטולי בין דגים עם זנים רקע שונים16. באופן כללי, בעת בחירת תכנון ניסיוני, מומלץ להשתמש בפקדים של גיל ולהתאמץ ולהימנע מערבוב המינים השונים. השימוש בזכרים מומלץ, כאשר איכות התמונה הייתה נמוכה יותר בנקבות הגראפי.
מיקום סריקה: בהתקנה זו שתי עמדות סריקה אפשריות: ציר האורך וציר קצר. מצאנו שבמצב של ציר קצר היה קשה מאוד לזהות את תאי הלב. לכן, השתמשנו רק ציר האורך וממליצים על האחרון לתיחום של תאי הלב במצב B ו הנגזרת של גודל ותפקוד חדרית.
הרדמה: הרדמה נאותה היא קריטית כדי למנוע האטה משמעותיים במהלך המדידה. קצב הלב ישפיע על המדידה התפקודית של הלב, ומסכן את הדיוק של המחקר. Tricaine הוא סוכן הרדמה הנפוץ ביותר ומנה של 0.2 mg/mL נמצא כדי לספק הרגעה נאותה. עם זאת, זמן המדידה הוא קריטי מאז קצב הלב מתחיל לרדת אחרי 3-4 דקות תחת הרגעה16. כדי להימנע מהצגת השונות, חשוב לשמור על המידות תחת 3 דקות.
פרמטרים קריטיים: קצב הלב יכול להיחשב כפרמטר קריטי כאשר הוא מכוון לעקביות ולדיוק. יש להשוות את קצב הלב בין קבוצות נסיוניות שנבדקו ובטווח הערכים שדווחו לתנאים שבשימוש. מצאנו כי מגוון של 118 ± 14 כדי 162 ± 32 bpm יכול לייצג את הערכים הנורמליים עבור סוג פראי דג זברה 3-12 חודשים מבוגרים ישנים מורדם עם 0.2 מ"ג/mL של tricaine עבור פחות מ 3 דקות.
דיוק התוצאה: כדי להבטיח דיוק, יש לנקוט מדידות למינימום של 3 מחזורי לב. כדי להשיג מדויק יותר ידני תמונה ידנית, ניתוח צריך להיעשות באופן עיוור.
מלבד בחירת התנאים המתאימים ביותר, מספר היבטים הם קריטיים כדי להבטיח מדידה מדויקת. באופן אידיאלי, התנאים צריכים להישמר קרוב למצב הפיזיולוגי של הדג הרגיל ככל האפשר. ביצוע הסריקה מתחת למים יש את היתרון של שמירה על הדגים בסביבתם הטבעית וקרוב לתנאים נורמליים להחלפת גז, הרכב מים, לחץ הידרוסטטי וטמפרטורה. אלה הם יתרונות ברורים על פני המחקרים הקודמים, שבו במהלך הדגים הסריקה ממוקמים ספוג רטוב חשוף לאוויר בחדר מוליכות מופעלת על ידי אולטרסאונד ג'ל במקום מים9,10. סריקה תת מימית גם מאפשר התאוששות של הדג לאחר ההליך, בתנאי כי הזמן בין הרדמה והתאוששות נשמר תחת 3 דקות והדגים מוחזרים למים התאוששות מיד לאחר המדידה. כדי להבטיח את ההליך מבוצע במהירות וביעילות ככל האפשר, כמות ניכרת של זמן המושקע בהכשרה מומלץ לפני ביצוע ניסויים.
אקוקרדיוגרפיה היא שיטה מבוססת היטב להערכת תפקוד הלב בפרקטיקה הקלינית, כמו גם ב מורלין (או מיונקים אחרים) בעלי חיים דוגמניות. עם זאת, להבדיל ממורין או אקו אנושי, ביצוע אולטרסאונד דגים מתחת למים אינו מאפשר חיבור של הדגימה לאלקטרודות. לכן, מדידה ישירה של מחירי הלב והנשימה אינה אפשרית. במקרה כזה, קצב הלב יכול להיות נמדד על ידי ספירת פעימות לכל מינימום ב 10 או 15 דקות מרווח או על ידי מעקב ידני 3 פסגות זרימת אבי העורקים ברציפות (איור 6). קצב הלב גם משפיע על הנחישות של פרמטרים אחרים, כגון פלט לב, כי יש לחשב באופן ידני פרמטרים כגון נפח הקו התקבלו באמצעות מעקב הקיר הפנימי חדרית. היבט נוסף שכדאי לשקול הוא שמבנה לב הדגים שונה לגמרי מיונקים. בבית הדו השני, לב הבית, מילוי המוח נקבע בעיקר על ידי כיווץ פרפור, ודגים בדרך כלל להציג נמוך הרבה יותר מוקדם ליחס חדרית מאוחר לעומת יונקים18. זה מסביר את הפרופיל השונה שהושג על ידי גל הדופק דופלר בפסגות A ו-E בין דגי דג ולבבות בריאים מהיונקים.
אקו-קרדיוגרפיה מאפשרת אפיון מעמיק של פרופיל לב הדג וכימות של פרמטרים פונקציונליים מרובים. הערכים שהתקבלו עבור שבר הפליטה, שינוי אזור השברים, תזרים הזרימה והמהירויות של תזרים הזרימה, קצב הלב ותפוקת הלב נמצאים בטווח המדווח על-ידי המחקרים הקודמים (טבלה 1), המדגיש את השינוי בשיטה. יחד, הנתונים שלנו מראים כי בתדר גבוה אולטרסאונד אקו הוא שיטה חזקה ומזיבת למדוד מורפולוגיה לב של דגים ותפקוד בעת הערכת דגמי מחלות או בדיקות סמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לתמיכתו הטכנית של פרד רוברטס ולעדכון כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container - 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).
- Genge, C. E., et al. Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. Nilius, B., et al. 171, Springer International Publishing. 99-136 (2016).
