Summary
हम उच्च आवृत्ति इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग करके दिल की आकृति विज्ञान और वयस्क ज़ेब्राफिश में कार्य का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। विधि हृदय के दृश्य और कार्यात्मक मापदंडों के बाद की मात्रा, जैसे हृदय गति (एचआर), हृदय उत्पादन (सीओ), आंशिक क्षेत्र परिवर्तन (एफएसी), रिजेक्शन अंश (ईएफ), और रक्त प्रवाह और बहिर्वाह वेग की अनुमति देती है।
Abstract
जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)हृदय अनुसंधान में एक बहुत लोकप्रिय मॉडल जीव बन गया है, जिसमें मानव हृदय रोग शामिल हैं, मुख्यतः इसकी भ्रूणीय पारदर्शिता, आनुवंशिक ट्रैक्टेबिलिटी और तेजी से, उच्च थ्रूपुट अध्ययनों के लिए सुविधा के कारण। हालांकि, पारदर्शिता का नुकसान वयस्क चरण में हृदय समारोह विश्लेषण को सीमित करता है, जो उम्र से संबंधित दिल की स्थितियों की मॉडलिंग को जटिल बनाता है। ऐसी सीमाओं को दूर करने के लिए, जेब्राफिश में उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड इकोकार्डियोग्राफी एक व्यवहार्य विकल्प के रूप में उभर रहा है। यहां, हम उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड का उपयोग करके गैर-इनवेसिव इकोकार्डियोग्राफी द्वारा वयस्क ज़ेब्राफिश में हृदय समारोह का आकलन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। विधि जेब्राफिश हृदय आयाम के दृश्य और विश्लेषण और हृदय गति, स्ट्रोक की मात्रा, हृदय उत्पादन और इंजेक्शन अंश सहित महत्वपूर्ण कार्यात्मक मापदंडों के परिमाणीकरण की अनुमति देती है। इस विधि में, मछली को एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है और पानी के नीचे रखा जाता है और प्रक्रिया के बाद ठीक किया जा सकता है। हालांकि उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड एक महंगी तकनीक है, एक ही इमेजिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग विभिन्न ट्रांसड्यूसर को ढालकर विभिन्न प्रजातियों (जैसे, murine और ज़ेब्राफिश) के लिए किया जा सकता है। जेब्राफिश इकोकार्डियोग्राफी कार्डियक फेनोटाइपिंग के लिए एक मजबूत तरीका है, जो रोग मॉडल, विशेष रूप से देर से शुरू होने वाली बीमारियों के सत्यापन और लक्षण वर्णन में उपयोगी है; दवा स्क्रीन; और दिल की चोट, वसूली, और पुनर्योजी क्षमता का अध्ययन।
Introduction
जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)विकास प्रक्रियाओं और मानव रोगों के अध्ययन के लिए एक सुस्थापित कशेरुकी मॉडलहै । जेब्राफिश में भ्रूण विकास के दौरान मनुष्यों (70%), आनुवंशिक ट्रैक्टेबिलिटी, उच्च फेक्चरिटी और ऑप्टिकल पारदर्शिता के लिए उच्च आनुवंशिक समानता होती है, जो हृदय सहित अंगों और ऊतकों के प्रत्यक्ष दृश्य विश्लेषण की अनुमति देता है। सिर्फ एक एट्रियम और एक वेंट्रिकल होने के बावजूद, जेब्राफिश हार्ट(चित्रा 1)शारीरिक रूप से स्तनधारी चार-कक्षवाले दिलों के समान है। महत्वपूर्ण बात, जेब्राफिश हृदय गति, इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम आकृति विज्ञान, और कार्रवाई संभावित आकार मनुष्यों के समान है जो मूत्र प्रजातियों से अधिक2। इन विशेषताओं ने जेब्राफिश को हृदय अनुसंधान के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाया है और हृदय विकास3,4,4उत्थान5और पैथोलॉजिकल स्थितियों1,,3,,4,आर्टेरियोस्क्लेरोसिस, कार्डियोमायोपैथी, अतालता, जन्मजात हृदय रोगों, और एमिलॉयड लाइट चेन कार्डियोटॉक्सिकिटी1,,4,,6में प्रमुख अंतर्दृष्टि प्रदान की है । हाई-स्पीड वीडियो माइक्रोस्कोपी7,,8का उपयोग करके प्रत्यक्ष वीडियो विश्लेषण के माध्यम से भ्रूणीय चरण (1 दिन के बाद निषेचन) के दौरान हृदय समारोह का आकलन संभव हो पाया है । हालांकि, जेब्राफिश भ्रूणीय चरण से परे अपनी पारदर्शिता खो देते हैं, सामान्य परिपक्व दिलों के कार्यात्मक मूल्यांकन ों और देर से शुरू होने वाली दिल की स्थिति को सीमित करते हैं। इस सीमा को दूर करने के लिए, इकोकार्डियोग्राफी को वयस्क जेब्राफिश हृदय,समारोह,9,,10,,,11,12,13,14,,15का मूल्यांकन करने के लिए एक उच्च संकल्प, वास्तविक समय, नॉनइनवेसिव इमेजिंग विकल्प के रूप में सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है।
जेब्राफिश में, दिल थोरेसिक गुहा में वेंरैली स्थित है तुरंत वेंट्रिकल के लिए पृष्ठीय स्थित एट्रियम के साथ गिल्स के पीछे। एट्रियम पापी नसस से विषैले रक्त एकत्र करता है और इसे वेंट्रिकल में स्थानांतरित कर देता है जहां इसे आगे बल्बस आर्टेरियोसस(चित्रा 1)में पंप किया जाता है। यहां, हम 30 माइक्रोन के संकल्प पर बी-मोड इमेजिंग के लिए 50 मेगाहर्ट्ज की केंद्र आवृत्ति के साथ रैखिक सरणी अल्ट्रासाउंड जांच का उपयोग करके गैर-इनवेसिव इकोकार्डियोग्राफी द्वारा वयस्क ज़ेब्राफिश में हृदय समारोह का आकलन करने के लिए एक शारीरिक, पानी के नीचे, प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। चूंकि अल्ट्रासाउंड तरंगें आसानी से पानी के माध्यम से यात्रा कर सकती हैं, मछली और स्कैनिंग जांच के बीच निकटता को ध्यान में रखते हुए अल्ट्रासाउंड जेल की कोई आवश्यकता नहीं है और मछली के लिए कुल मिलाकर कम तनावपूर्ण है। हालांकि वैकल्पिक ज़ेब्राफिश इकोकार्डियोग्राफी सिस्टम कई लेखकों9,,12,,13द्वारा सूचित किए गए थे, यहां हम सामान्य और सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले सेटअप पेश करते हैं जो जानवरों में उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड पर लागू होता है।
विधि वयस्क ज़ेब्राफिश हृदय की उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग, हृदय संरचनाओं का पता लगाने और डॉप्लर रक्त प्रवाह मापन से पीक-वेग की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देती है। हम महत्वपूर्ण सिस्टोलिक और डायस्टोलिक मापदंडों के वीवो क्वांटिफिकेशन में विश्वसनीय दिखाते हैं, जैसे रिजेक्शन अंश (ईएफ), आंशिक क्षेत्र परिवर्तन (एफएसी), वेंट्रिकुलर रक्त प्रवाह और बहिर्वाह वेग, हृदय गति (एचआर), और कार्डियक आउटपुट (सीओ)। हम पैथोलॉजिकल राज्यों के अधिक सटीक मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए सामान्य स्वस्थ वयस्क जेब्राफिश कार्डियक कार्यात्मक और आयामी मापदंडों की एक विश्वसनीय श्रृंखला स्थापित करने में योगदान देते हैं। कुल मिलाकर, हम जेब्राफिश में हृदय समारोह का आकलन करने के लिए एक मजबूत विधि प्रदान करते हैं, जो जेब्राफिश हृदय रोग मॉडल6,16,हृदय की चोट और वसूली10,13,और पुनर्जनन,11,,12की स्थापना और मान्य करने में अत्यंत उपयोगी साबित हुआ है, और इसका उपयोग संभावित दवाओं का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।,
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Protocol
जेब्राफिश से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को हमारी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और यूएसडीए पशु कल्याण अधिनियम के अनुपालन में हैं ।
1. प्रायोगिक सेट-अप
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छवि अधिग्रहण के लिए मंच की स्थापना
- छोटी कैंची या स्केलपेल का उपयोग स्कैनिंग के दौरान मछली को पकड़ने के लिए 12 बजे की स्थिति में स्पंज पर चीरा लगाते हैं। स्पंज को एक ग्लास कंटेनर(चित्रा 2ए)में रखें।
नोट: चीरा की स्थिति पर्याप्त कमरे ट्रांसड्यूसर स्थानांतरित करने के लिए और भी मछली पानी की लाइन बेलो रखने के लिए जब मंच स्कैनिंग के लिए झुका है(चित्रा 2)की अनुमति चाहिए । चीरा मछली के आकार के आधार पर भिन्न हो सकता है; हालांकि, मानक आकार और वजन के लिए, चीरा क्रमशः लगभग 2.5 सेमी x 0.7 सेमी x 0.5 सेमी (लंबाई, चौड़ाई और गहराई) होना चाहिए। मछली इमेजिंग करते समय पानी के रिसाव से बचने के लिए कांच के कंटेनर को कम से कम 6 सेमी गहरा होना चाहिए। - उदाहरण के लिए, अल्ट्रासाउंड प्लेटफॉर्म पर स्पंज युक्त ग्लास बॉक्स को प्रत्यय करें, उदाहरण के लिए दो तरफा टेप का उपयोग करके। सुनिश्चित करें कि ग्लास बॉक्स मंच के केंद्र में है और दृढ़ता से संलग्न है(चित्रा 2बी)।
- प्लेटफ़ॉर्म धारक(चित्रा 2बी)के बाईं ओर घुंडी का उपयोग करके मंच को लगभग 30 डिग्री तक आगे झुकाएं। मछली प्रणाली पानी के 200-250 मिलीग्राम के साथ ग्लास स्क्वायर भरें जिसमें 0.2 मिलीग्राम/एमएल ट्राइकेन मीथेनसल्फोनेट (MS222) हो।
नोट: Tricaine Tris ४० mM पीएच 7 में एक 4 मिलीग्राम/mL स्टॉक समाधान के रूप में तैयार किया जा सकता है और आगे मछली प्रणाली के पानी में वांछित एकाग्रता को पतला; 0.2 मिलीग्राम/मिलील सबसे अच्छी एकाग्रता16पाई गई . 4 एमजी/एमएल ट्राइकेन स्टॉक सॉल्यूशन को लंबे समय तक -20 डिग्री सेल्सियस या एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है। - काम कर रहे रेल स्टेशन पर माइक्रोजोड़क धारक के भीतर ट्रांसड्यूसर डालें, ऑपरेटर की ओर ट्रांसड्यूसर के पायदान बदल रहा है । मंच के संबंध में काम कर रहे पक्ष देशांतर के साथ जमीन के समानांतर सरणी रखें (चित्रा 2बीदेखें) । एक्स-और वाई-कुल्हाड़ियों के साथ जाने के लिए अब कनेक्टेड ट्रांसड्यूसर-रेल सिस्टम के लिए पर्याप्त कमरे (दोनों तरफ 10 सेमी) छोड़ दें।
- नियंत्रण सॉफ्टवेयर में लॉग इन करें और माउस (छोटे) संवहनीचुनें। अध्ययन में शामिल प्रत्येक जानवर के लिए एक नया अध्ययन के साथ-साथ एक नई श्रृंखला बनाएं। ब्राउज़र पेज पर स्क्रीन के नीचे बाईं ओर स्थित नए अध्ययन बटन का पता लगाएं (दृश्य बी-मोड में शुरू होता है)।
- छोटी कैंची या स्केलपेल का उपयोग स्कैनिंग के दौरान मछली को पकड़ने के लिए 12 बजे की स्थिति में स्पंज पर चीरा लगाते हैं। स्पंज को एक ग्लास कंटेनर(चित्रा 2ए)में रखें।
2. मछली को संभालना
नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल ज़ेब्राफिश वयस्क थे, जंगली प्रकार तनाव एबी/Tuebingen (AB/TU) के 11 महीने पुराने पुरुषों । जेब्राफिश को 14 घंटे लाइट/10 एच डार्क के रूप में सेट लगातार प्रकाश चक्र में 28 डिग्री सेल्सियस पर स्टैंड-अलोन फ्लो-थ्रू एक्वेरियम सिस्टम में बनाए रखा गया था । जेब्राफिश को रोजाना दो बार नमकीन झींगा(आर्टेमिया नौपलियाई)और ड्राई फूड फ्लेक्स खिलाया जाता था ।
- एक मछली के जाल का उपयोग करना, ०.२ मिलीग्राम/mL ट्राइकेन के साथ प्रणाली पानी युक्त एक छोटे से टैंक में मछली हस्तांतरण । मछली पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड (कोई आंदोलन और छूने के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं) तक इंतजार करें।
- एक प्लास्टिक चम्मच का उपयोग करना, धीरे और जल्दी से कांच के बॉक्स में मछली हस्तांतरण जिसमें स्पंज को पहले से बनाए गए चीरा में मछली के वेंट्रल पक्ष के साथ किया गया था।
नोट: सुनिश्चित करें कि मछली का सिर ऑपरेटर की ओर तैनात है (ट्रांसड्यूसर के पायदान के समान दिशा) और बेहतर हृदय दृश्य प्राप्त करने के लिए शरीर के बाकी हिस्सों की तुलना में थोड़ा उच्च स्तर पर। - रेल प्रणाली पर हैंडल का उपयोग करके ट्रांसड्यूसर (अपनी मूल स्थिति को ध्यान में रखते हुए) को धीरे से कम करें, इसे देशीयरूप से और ऑपरेटर का सामना करने वाले ट्रांसड्यूसर के पायदान के साथ मछली के वेंट्रल पक्ष के करीब रखें। मछली से 2-3 मिमी (1 सेमी से अधिक नहीं) निकासी छोड़ दें। सभी 3 कुल्हाड़ियों में माइक्रोजोड़क का उपयोग कर ट्रांसड्यूसर के संबंध में मंच को समायोजित करें जब तक कि मछली दिल की कल्पना न हो जाए और फिर छवि अधिग्रहण शुरू न हो जाए। ट्रांसड्यूसर के कोण को पूरे छवि अधिग्रहण(चित्र ा 2सी)के दौरान नहीं बदला जाना चाहिए।
नोट: जब तक पर्याप्त निकटता (1 सेमी तक) है, मछली के शीर्ष पर पानी तरल सतह तनाव के माध्यम से एक संपर्क सतह प्रदान करेगा जो जांच और मछली के बीच अल्ट्रासाउंड तरंगों के संचरण की अनुमति देता है। इसलिए, मछली के खिलाफ ट्रांसड्यूसर को धक्का देने की कोई आवश्यकता नहीं है। इस कदम को पूरा करने और मछली की मौत या छवि अधिग्रहण के दौरान हृदय गति की कमी को रोकने के लिए 3 मिनट से भी कम समय में स्कैन खत्म करने की कोशिश करें। जरूरत पड़ने पर टाइमर का इस्तेमाल करें। दिल आंख के बाईं ओर स्क्रीन के ऊपरी हिस्से पर पाया जा सकता है, जो आसानी से कल्पना की जा सकती है अगर एक्स-अक्ष सही करने के लिए सभी तरह से चलती है । यदि बी-मोड में रहते हुए दिल को खोजने में निरंतर कठिनाई होती है, तो रंग डॉप्लर मोड पर स्विच करें, जो रक्त प्रवाह को ट्रैक करने की अनुमति देगा (लाल ऑपरेटर की ओर बहने वाले रक्त को इंगित करता है) और दिल का पता लगाने।
3. छवि अधिग्रहण
नोट: इमेजिंग सिस्टम और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए सामग्री की तालिका देखें।
- देशीयंबिया देखें बी-मोड
- दिल को स्थानीयकृत करने के बाद, बी-मोड (एक नई श्रृंखला शुरू करने के बाद टचस्क्रीन के निचले बाईं ओर पाया गया) का चयन करें या रहने के बाद, और क्षेत्र को कम करने के लिए ज़ूम इन करने के लिए और विश्लेषण के दौरान आसान ट्रेसिंग के लिए दिल पर करीब से नज़र डालें।
- बी-मोड छवि अधिग्रहण में दिल के करीब और स्पष्ट दृश्य रखने के लिए, क्षेत्र को ज़ूम करके कम करें। एक्स और वाई-अक्षों दोनों पर क्षेत्र को मैन्युअल रूप से संकीर्ण करने के लिए टचस्क्रीन का उपयोग करें।
- यदि आवश्यक हो, तो गतिशील रेंज को 45-50 डीबी तक स्थापित करके छवि की गुणवत्ता/विपरीत बढ़ाएं । अधिक नियंत्रण विकल्प में बी-मोड नियंत्रण पर जाएं और बाद में मोड प्रीसेटमें परिवर्तन को बचाएं। नई श्रृंखला की छवि शुरू करने से पहले हर बार अनुकूलित छवि अधिग्रहण सेटिंग का चयन करने के लिए मोड प्रीसेट टैप करें।
- सेव इमेजका चयन करके लंबे अक्ष विमान में जितनी इच्छा हुई उतनी छवियां लें ।
नोट: छवि अधिग्रहण पर अधिक विस्तृत जानकारी और प्रशिक्षण संसाधन https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab और https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users में पाए जा सकते हैं
- देशीयंवर्जिनल व्यू पल्स वेव
- रक्त प्रवाह का पता लगाने (रंग बटन का चयन करें) और अधिग्रहण (एक नई श्रृंखला शुरू करने के बाद टचस्क्रीन के नीचे बाईं ओर पाया) के लिए रंग डॉप्लर पर स्विच करें।
- टच स्क्रीन स्थिति का उपयोग करना एट्रिवेनट्राइकुलर वाल्व के शीर्ष पर चक्रऔर प्रवाह को स्थानीयकृत करता है, जिसे रेड कलर सिग्नल(चित्रा 3ए)द्वारा प्रतिष्ठित किया जाएगा। फ्रेम दर बढ़ाने के लिए जितना संभव हो उतना चतुर्भुज क्षेत्र को कम करें।
नोट: रंग डॉप्लर छवि के वेग प्रोफ़ाइल में पीले रंग को सुनिश्चित करने के लिए रंग पल्स-पुनरावृत्ति-आवृत्ति (रंग पीआरएफ) (वेग रेंज) को कम करें। यह वेग की सीमा में वृद्धि करेगा जिसे देखा जा सकता है और रंग की पच्चीकारी बनाने में मदद करेगा जो अधिक स्पष्ट रूप से चोटी के वेग की कल्पना करने की अनुमति देगा। - वेंट्रिकुलर रक्त प्रवाह वेग का नमूना लेने के लिए पल्स वेव (पीडब्ल्यूका चयन करें) डॉप्लर मोड को सक्रिय करें। अधिकतम प्रवाह वेग का पता लगाने के लिए एट्रिवेनट्राइकुलर वाल्व (जहां लाल रंग का संकेत अधिक पीला हो जाता है) के केंद्र में नमूना वॉल्यूम गेट की स्थिति। अपनी उंगलियों का उपयोग कर स्क्रीन पर पीडब्ल्यू कोण समायोजित करें ताकि यह रक्त प्रवाह की दिशा के साथ संरेखित हो। वेंट्रिकल में बहने वाले रक्त के वेग का नमूना शुरू करने के लिए प्रारंभ या अपडेट करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि कोण सही लाइन रक्त प्रवाह के समानांतर है ताकि सुसंगत और प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान करने के लिए । कोण सही लाइन रखने से यह रक्त प्रवाह की दिशा से मेल खाता है कि वेग सही कब्जा कर लिया जाता है। - वेंट्रिकल और बल्बस (बल्बुवेंट्रिकुलर वाल्व) के बीच जंक्शन पर रंग डॉप्लर क्वाड्रेंट रखकर बहिर्वाह वेग निर्धारित करने के लिए चरण 3.2.3 दोहराएं और प्रवाह को स्थानीयकृत करें, जिसे नीले रंग के संकेत(चित्रा 3बी)द्वारा प्रतिष्ठित किया जाएगा। वेंट्रिकल-बल्बस जंक्शन से ठीक पहले नमूना वॉल्यूम गेट की स्थिति और रक्त प्रवाह की दिशा से मेल खाने के लिए कोण सुधार लाइन को समायोजित करें।
नोट: जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, सटीक वेग मूल्यों को प्राप्त करने के लिए, सुनिश्चित करें कि पीडब्ल्यू कोण रक्त प्रवाह के साथ गठबंधन है। - बेसलाइन (बार) को समायोजित करें, प्रवाह वेग पैनल में इसे कम या बढ़ाएं, ताकि सिग्नल चोटियों(चित्रा 3सी, डी)का पता लगाया जा सके और उसका पता लगाया जा सके। ऊपरी/सकारात्मक चतुर्भुज (जांच की ओर जाने वाला संकेत) और निचले/नकारात्मक चतुर्भुज (जांच से दूर जाने वाले संकेत) में बहिर्वाह चोटियों की पहचान करें ।
4. मछली वसूली
- जैसे ही छवि अधिग्रहण पूरा हो जाता है, एक चम्मच का उपयोग करके, मछली को नियमित प्रणाली में स्थानांतरित करें, मछली को ट्राइकेन से मुक्त पानी में स्थानांतरित करें और मछली को ठीक होने दें (आमतौर पर गिल आंदोलन और तैराकी को फिर से शुरू करने के लिए 30 एस से 2 मिन लेता है)।
- वसूली में मदद करने के लिए, पानी और ऑक्सीजन हस्तांतरण के वातारण को बढ़ावा देने के लिए एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर गिल पर बार-बार पानी धार ।
5. छवि विश्लेषण
- छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें।
- एक छवि का चयन करें और छवि प्रसंस्करण आइकन(चित्र 4)पर क्लिक करें । उपलब्ध पैमाने(चित्रा 4)का उपयोग करना, वेंट्रिकुलर दीवारों या रक्त प्रवाह पैटर्न के स्पष्ट दृश्य की अनुमति देने के लिए छवि की चमक और विपरीत को समायोजित करें।
- बी-मोड छवि का उपयोग करके, कार्डियक पैकेज/माप(चित्रा 4)पर पीएसएलएक्स (पैरास्टर्नल लांग एक्सिस) विकल्प से ड्रॉप-डाउन सूची खोलें। सिस्टोल (वीएएस) और डायस्टोल (वीएडी), एंड डायस्टोलिक वॉल्यूम (ईडीडीवी) और एंड सिस्टोलिक वॉल्यूम (ईएसवी)(चित्रा 5ए, बी)में वेंट्रिकुलर एरिया (वीए) प्राप्त करने के लिए सिल्स्टोल और डायस्टोल में वेंट्रिकुलर इनर वॉल का चयन करें और ट्रेस करें।
नोट: वॉल्यूम मान 2D इमेज ट्रेसिंग से एक्सपेरिमेंटेड होते हैं और 3डी एंटिटी से विचलित हो सकते हैं. सभी मापों के लिए, प्रति पशु औसत कम से कम 3 प्रतिनिधि हृदय चक्र। - स्ट्रोक की मात्रा और इंजेक्शन अंश पर ध्यान दें जो स्वचालित रूप से गणना और सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदर्शित किया जाएगा।
नोट: स्ट्रोक की मात्रा, और इंजेक्शन अंश भी मैन्युअल रूप से सूत्रों का उपयोग कर के गणना की जा सकती है
एसवी = ईदव-ईएसवी
EF = (EDV-ESV)/EDV
जहां एसवी स्ट्रोक वॉल्यूम है, EDV अंत डायस्टोलिक वॉल्यूम है, ईएसआईवी सिस्टोलिक वॉल्यूम को समाप्त करता है, और ईएफ इजेक्शन अंश है - सूत्र का उपयोग करके आंशिक क्षेत्र परिवर्तन की गणना करें
एफएसी = (VAd-VAs)/VAd
जहां एफएसी आंशिक क्षेत्र परिवर्तन है, वीएडी डायस्टोल में वेंट्रिकुलर क्षेत्र है, और वीएएस सिस्टोल में वेंट्रिकुलर क्षेत्र है। - सूत्र का उपयोग करकार्डिक आउटपुट की गणना करें
सीओ = एचआर एक्स एसवी
जहां सीओ हृदय उत्पादन है, मानव संसाधन हृदय गति है, और एसवी स्ट्रोक की मात्रा है - स्पंदित वेव डॉप्लर मोड छवि का उपयोग करके, कार्डियक पैकेज(चित्रा 4)के तहत एमवी फ्लो विकल्प का चयन करके प्रवाह रक्त वेग को मापें। क्रमशः शुरुआती डायस्टोल और लेट डायस्टोल के लिए ई या ए का चयन करें, और ग्राफ(चित्र ा 3सी)पर चोटी-वेग निर्धारित करें।
- एओवी फ्लो का चयन करके बहिर्वाह रक्त वेग को मापें और ट्रेसिंग(चित्रा 3डी)पर चोटियों का निर्धारण करें।
- अधिक विश्वसनीय मूल्यांकन के लिए 2 अलग-अलग तरीकों का उपयोग करके हृदय गति को मापें:
- जब छवि अधिग्रहण के दौरान स्क्रीन पर दिल की कल्पना की जाती है, तो 10 एस के भीतर धड़कों को गिनें और इसे 6 से गुणा करें।
- वेवो लैब सॉफ्टवेयर पर पल्स वेव डॉप्लर छवि का उपयोग करना, हृदय गति बटन चुनें और लगातार 3 महाधमनी प्रवाह चोटियों(चित्रा 4 और चित्रा 6)के बीच अंतराल का पता लगाएं।
- एलवी और रक्त प्रवाह की चोटियों का पता लगाने के बाद स्प्रेडशीट में डेटा निर्यात करने के लिए, रिपोर्ट पर क्लिक करें । निर्यात । एक्सेल के रूप में सहेजें।
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Representative Results
वर्णित प्रोटोकॉल मानव और पशु इकोकार्डियोग्राफी में उपयोग की जाने वाली तकनीक के अनुरूप महत्वपूर्ण हृदय आयामी और कार्यात्मक मापदंडों की माप के लिए अनुमति देता है। बी-मोड छवियां सिस्टोल और डायस्टोल(चित्र5)में वेंट्रिकुलर इनर वॉल का पता लगाने और कक्ष और दीवार आयामों जैसे आयामी डेटा प्राप्त करने और हृदय गति, स्ट्रोक की मात्रा और हृदय उत्पादन जैसे कार्यात्मक डेटा के साथ-साथ वेंट्रिकुलर सिस्टोलिक फ़ंक्शन के मापदंडों जैसे आंशिक क्षेत्र परिवर्तन और इंजेक्शन अंश(तालिका 1)का पता लगाने की अनुमति देती हैं। रंग डॉप्लर मोड छवियों का उपयोग करए एट्रिओवेंट्रिकुलर वाल्व के स्तर पर माप भी वेंट्रिकुलर इनफ्लो और बहिर्वाह रक्त वेग प्रदान करते हैं (वेग जिस पर रक्त क्रमशः वेंट्रिकल भरता है और बाहर निकलता है)(चित्रा 3 और तालिका 1)।
इस अध्ययन में प्राप्त मापदंडों की तुलना पिछले अध्ययनों में इसी तरह की प्रायोगिक स्थितियों6,,16,,17 (तालिका 1)का उपयोग करके की गई रिपोर्ट के साथ तुलना की गई थी, जो विधि की प्रजनन क्षमता का प्रदर्शन करते हैं। कुल मिलाकर, हम बताते हैं कि इस विस्तृत प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक प्रभावी रूप से और लगातार जेब्राफिश कार्डियक फ़ंक्शन का आकलन कर सकता है, जो अध्ययन के दौरान विभिन्न कार्डियक फेनोटाइप की तुलना करते समय महत्वपूर्ण है।
चित्रा 1: वयस्क ज़ेब्राफिश दिल का चित्रण। रक्त प्रवाह परिसंचरण का प्रतिनिधित्व तीरद्वारा किया जाता है: रक्त सिनोस नसस से एट्रियम में बहता है और आगे वेंट्रिकल में स्थानांतरित हो जाता है, जहां इसे बल्बस आर्टेरियोसस में पंप किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: मछली इमेजिंग चैंबर । (क)एक मछली-इमेजिंग "कक्ष" तैयार करने के लिए, एक ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास में एक छोर की ओर चीरा लगाने वाला स्पंज कांच के कंटेनर में रखा जाता है। (ख)कांच के कंटेनर को झुका हुआ इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर मजबूती से टेप किया जाता है । (ग)ट्रांसड्यूसर को जोड़तोड़ पर रखा जाता है और सही इमेजिंग पोजिशनिंग के लिए चीरा के समानांतर रखा जाता है (ट्रांसड्यूसर नॉच ऑपरेटर की ओर इशारा कर रहा है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: रंग डॉप्लर मोड में एट्रिवेवेंट्रिकुलर इनफ्लो (ए) और आउटफ्लो (बी) और संबंधित वेंट्रिकुलर डायस्टोलिक वेव चोटियों (सी) और वेंट्रिकुलर आउटफ्लो (डी) के वेग का आकलन करने के लिए इसी स्पंदित तरंग डॉप्लर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: छवि विश्लेषण। छवि प्रसंस्करण (छवि की वांछित विपरीत और चमक प्राप्त करने के लिए) के बाद, पीडब्ल्यू डॉप्लर मोड (बाएं) और बी-मोड (दाएं) छवियों में माप किया जा सकता है। बी-मोड छवि में एलवी दीवार का पता लगाने के लिए, ड्रॉप-डाउन मेनू से कार्डियक पैकेज का चयन करें, PSLAXमें जाएं, और एलवी ट्रेसका चयन करें। पीडब्ल्यू डॉप्लर मोड इमेज में पीक वेग को मापने के लिए, ड्रॉप-डाउन मेनू से कार्डियक पैकेज का चयन करें। वेंट्रिकुलर रक्त प्रवाह वेग को मापने के लिए, एमवी फ्लो विकल्प का चयन करें और क्रमशः जल्दी डायस्टोल और देर से डायस्टोल के लिए ई या ए का चयन करें। बहिर्वाह रक्त वेग के निर्धारण के लिए, एओवी फ्लो और एवी पीक वेगका चयन करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: बी-मोड छवियां। (ए)डायस्टोल में वेंट्रिकल (वी) की बी-मोड छवि, एट्रियम (ए) से आने वाले रक्त से भरी हुई है। (ख)सिस्टोल में वेंट्रिकल की बी-मोड छवि, बल्बस आर्टेरियोसस (बी, ग्रीन ट्रेसिंग) के माध्यम से रक्त को बाहर निकालना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6: पल्स वेव डॉप्लर छवि। लगातार 3 महाधमनी प्रवाह चोटियों का पता लगाने से हृदय गति मूल्य उत्पन्न किया जा सकता है। विश्लेषण सॉफ्टवेयर में माप टैब में हृदय गति बटन का चयन करके महाधमनी प्रवाह चोटियों को प्रदर्शित किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| पैरामीटर, इकाइयां ± एसडी | यह अध्ययन | वांग, एल एट अल,2017; ली, एल एट अल, 2016 और मिश्रा, एस एट अल,2019 | टिप्पणियां/विवरण |
| हृदय गति (एचआर), बीपीएम | 133 ± 7 | 118 ± 14 - 162 ± 32 | जंगली प्रकार एबी/ABTU पुरुषों और महिलाओं के बीच 3-12 महीने के बीच tricaine ०.२ मिलीग्राम/mL में एनेस्थेटाइज्ड |
| आंशिक क्षेत्र परिवर्तन (एफएसी) | 0.38 ± 0.03 | 0.29 ± 0.07 - 0.39 ± 0.05 | |
| रिजेक्शन अंश (ईएफ), [%] | 42 ± 7 | 34 ± 0.04 - 48 ± 0.03 | |
| स्ट्रोक की मात्रा (एसवी), μL | 0.21 ± 0.01 | 0.18 ± 0.06 - 0.28 ± 0.08 | |
| कार्डियक आउटपुट (सीओ), माइक्रोनमिन-1 | 27.3 ± 1.69 | 19 ± 9.5 - 36.1 ± 7.8 | |
| ई पीक वेग (जल्दी वेंट्रिकुलर इनफ्लो), मिमी/एस | 30 ± 6.8 | 25 ± 7 - 51 ± 16 | |
| एक चोटी का वेग (देर से वेंट्रिकुलर इनफ्लो), मिमी/एस | 152 ± 32 | 144 ± 36 - 288 ± 54 | |
| वेंट्रिकुलर आउटफ्लो, मिमी/एस | 86.6 ± 19 | n/a |
तालिका 1: वयस्क ज़ेब्राफिश में इकोकार्डियोग्राफिक पैरामीटर। 3 और 12 महीने के बीच वयस्क पुरुष या महिला जेब्राफिश के लिए वर्तमान अध्ययन में मूल्यांकन किए गए हृदय समारोह मापदंडों के लिए प्राप्त मूल्य0.2 मिलीग्राम/एमएल ट्राइकेन समाधान में एनेस्थेटाइज्ड। पिछले अध्ययनों में एक ही मापदंडों के6लिए प्राप्त मूल्यों की एक श्रृंखला6,16,,17 इसी तरह की स्थितियों में प्रदर्शन सत्यापन के लिए प्रस्तुत किया जाता है और विधि मानकीकरण में मदद करने के लिए ।
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Discussion
हम इकोकार्डियोग्राफिक इमेजिंग और वयस्क ज़ेब्राफिश में हृदय समारोह के मूल्यांकन के लिए एक व्यवस्थित विधि का वर्णन करते हैं। इकोकार्डियोग्राफी लाइव वयस्क मछली कार्डियक इमेजिंग और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एकमात्र उपलब्ध गैर-आक्रामक और सबसे मजबूत विधि है, और यह जेब्राफिश हृदय अनुसंधान में तेजी से लोकप्रिय होता जा रहा है। आवश्यक समय की मात्रा कम है और उच्च थ्रूपुट और देशीयंतक अध्ययनों के लिए अनुमति देती है। हालांकि, नियोजित कार्यप्रणाली और डेटा विश्लेषण में काफी भिन्नता है। जेब्राफिश इकोकार्डियोग्राफी का मानकीकरण बहुत मुश्किल है जब इतने सारे चर आउटकमिंग मापदंडों को प्रभावित कर सकते हैं। प्रायोगिक अध्ययन करते समय, किसी को उन स्थितियों पर विचार करना चाहिए जो संज्ञाहरण, शरीर के वजन, उम्र, लिंग और पृष्ठभूमि तनाव सहित परिवर्तनशीलता का उत्पादन कर सकती हैं। वांग, एल एट अल16 ने इन कारकों द्वारा शुरू की गई परिवर्तनशीलता का आकलन किया और विधि को मानकीकृत करने में मदद करने के लिए जेब्राफिश कार्डियक फ़ंक्शन पर उपलब्ध डेटा संकलित किया। उनका अध्ययन जेब्राफिश इकोकार्डियोग्राफिक मूल्यांकन से जुड़े प्रायोगिक अध्ययनों को डिजाइन करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी संसाधन है। वांग, एल एट अल16 और संदर्भों के भीतर और हमारी अपनी टिप्पणियों6द्वारा प्रदान की गई जानकारी के आधार पर, हम प्रोटोकॉल अनुकूलन और प्रजनन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण माने जाने वाले महत्वपूर्ण कदमों और शर्तों की रूपरेखा प्रदान करते हैं:
नमूना का विकल्प:पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि सिस्टोलिक फ़ंक्शन पैरामीटर (ईएफ, एफएसी) लिंग मतभेदों से काफी प्रभावित नहीं होते हैं, डायस्टोलिक फ़ंक्शन (अर्थात् पीक वेव ई/ए अनुपात) 6 महीने से अधिक उम्र की महिलाओं में काफी कम हो सकता है। यह भी देखा गया कि वेंट्रिकुलर क्षेत्रों और मात्रा में मछली की उम्र (3 महीने और पुराने) के साथ काफी वृद्धि होती है और उनके शरीर के उच्च वजन और आकार के कारण महिलाओं में काफी अधिक होते हैं। बॉडी-मास इंडेक्स (बीएमआई) और बॉडी सरफेस एरिया (बीएसए) के लिए डायस्टोलिक वॉल्यूम इंडेक्स करने से उम्र से मेल खाने वाली महिलाओं और पुरुषों के बीच मतभेदों को खत्म करने में मदद मिल सकती है, और बीएसए और वजन को अनुक्रमित करने से उम्र से संबंधित डायस्टोलिक वॉल्यूममतभेदों कोदूर करने में मदद मिल सकती है 16 । विभिन्न पृष्ठभूमि उपभेदों के साथ मछली के बीच विभिन्न डायस्टोलिक कार्यों की भी रिपोर्ट थी। कुल मिलाकर, प्रायोगिक डिजाइन चुनते समय, उम्र और तनाव से मेल खाने वाले नियंत्रणों का उपयोग करने और विभिन्न लिंगों को मिलाने से बचने की सलाह दी जाती है। पुरुषों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि ग्रेविड महिलाओं में छवि की गुणवत्ता कम थी।
स्कैनिंग स्थिति:इस सेटअप में दो स्कैनिंग स्थिति संभव हैं: देशांतिधुरी धुरी और छोटी धुरी। हमने पाया कि कम धुरी मोड में कार्डियक कक्षों की पहचान करना बहुत मुश्किल था। इसलिए, हमने केवल देशीयभाषा धुरी का उपयोग किया और बी-मोड में हृदय कक्षों के चित्रण और वेंट्रिकुलर आकार और कार्य के व्युत्पन्न के लिए उत्तरार्द्ध की सलाह देते हैं।
एनेस्थीसिया:माप के दौरान महत्वपूर्ण ब्रैडीकार्डिया से बचने के लिए पर्याप्त सेडेशन महत्वपूर्ण है। हृदय गति हृदय कार्यात्मक माप को प्रभावित करेगा, अध्ययन की सटीकता समझौता। ट्रिकेन सबसे आम संवेदनाकारएजेंट है और पर्याप्त सेडेशन प्रदान करने के लिए 02 मिलीग्राम/मिलीग्राम की खुराक पाई गई थी। हालांकि, माप समय महत्वपूर्ण है क्योंकि हृदय गति16के तहत 3-4 मिन के बाद कम होने लगती है। परिवर्तनशीलता शुरू करने से बचने के लिए, माप को 3 मिन के नीचे रखना महत्वपूर्ण है।
महत्वपूर्ण पैरामीटर:स्थिरता और सटीकता के लिए लक्ष्य करते समय हृदय गति को एक महत्वपूर्ण पैरामीटर माना जा सकता है। हृदय गति का परीक्षण किया गया प्रयोगात्मक समूहों और उपयोग की गई शर्तों के लिए सूचित मूल्यों की सीमा के भीतर तुलनीय होना चाहिए। हमने पाया कि 118 ± 14 से 162 ± 32 बीपीएम की एक सीमा जंगली प्रकार ज़ेब्राफिश 3-12 महीने पुराने वयस्कों के लिए सामान्य मूल्यों का प्रतिनिधित्व कर सकती है जो 3 मिन से कम समय के लिए 0.2 मिलीग्राम/एमएल ट्राइकेन के साथ एनेस्थेटाइज्ड है।
परिणाम सटीकता:सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, माप को न्यूनतम 3 हृदय चक्रों पर लिया जाना चाहिए। अधिक सटीक मैनुअल छवि ट्रेसिंग प्राप्त करने के लिए, विश्लेषण अंधा तरीके से किया जाना चाहिए।
सबसे उपयुक्त स्थितियों को चुनने के अलावा, सटीक माप सुनिश्चित करने के लिए कई पहलू महत्वपूर्ण हैं। आदर्श रूप से, शर्तों को यथासंभव सामान्य मछली शारीरिक स्थिति के करीब रखा जाना चाहिए। पानी के नीचे स्कैन करने से मछली को उनके प्राकृतिक वातावरण में रखने और गैस एक्सचेंज, पानी की संरचना, हाइड्रोस्टैटिक प्रेशर और तापमान के लिए सामान्य परिस्थितियों के करीब रहने का फायदा होता है। ये पिछले अध्ययनों में स्पष्ट फायदे हैं, जहां स्कैनिंग मछली के दौरान कमरे की हवा के संपर्क में एक गीले स्पंज में रखा जाता है और चालकता9,10पानीके बजाय अल्ट्रासाउंड जेल द्वारा सक्षम है। पानी के नीचे स्कैनिंग भी प्रक्रिया के बाद मछली की वसूली के लिए अनुमति देता है, बशर्ते कि संज्ञाहरण और वसूली के बीच समय 3 मिन के तहत रखा जाता है और मछली माप के तुरंत बाद वसूली पानी के लिए वापस आ जाता है । यह सुनिश्चित करने के लिए प्रक्रिया को यथाशीघ्र और प्रभावी ढंग से किया जाता है, प्रयोग करने से पहले प्रशिक्षण पर खर्च किए गए समय की काफी मात्रा की सलाह दी जाती है।
इकोकार्डियोग्राफी नैदानिक अभ्यास के साथ-साथ मूत्र (या अन्य स्तनधारियों) पशु मॉडल में हृदय समारोह का मूल्यांकन करने के लिए एक बहुत अच्छी तरह से स्थापित विधि है। हालांकि, मूत्र या मानव इकोकार्डियोग्राफी के विपरीत, मछली अल्ट्रासाउंड पानी के नीचे प्रदर्शन इलेक्ट्रोड के लिए नमूने के कनेक्शन की अनुमति नहीं देता है । इसलिए दिल और सांस की दरों का सीधा माप संभव नहीं है। उस मामले में, हृदय गति को 10 या 15 मिन के अंतराल में प्रति मिन धड़कता है या मैन्युअल रूप से लगातार 3 महाधमनी प्रवाह चोटियों(चित्रा 6)का पता लगाकर मापा जा सकता है। हृदय गति हृदय उत्पादन जैसे अन्य मापदंडों के निर्धारण को भी प्रभावित करती है, जिनकी गणना मैन्युअल रूप से की जानी चाहिए एक बार स्ट्रोक वॉल्यूम जैसे मापदंडों को वेंट्रिकुलर इनर वॉल ट्रेसिंग के माध्यम से प्राप्त किया गया है। विचार करने के लिए एक और पहलू यह है कि मछली दिल आकृति विज्ञान स्तनधारियों से काफी अलग है । दो कक्षों जेब्राफिश दिल में, वेंट्रिकुलर फिलिंग ज्यादातर अलिंद संकुचन द्वारा निर्धारित की जाती है, और मछली आमतौर पर स्तनधारियों18की तुलना में देर से वेंट्रिकुलर भरने के अनुपात में बहुत कम जल्दी मौजूद होती है। यह जेब्राफिश और स्वस्थ स्तनधारी दिलों के बीच ए और ई चोटियों में पल्स वेव डॉप्लर द्वारा प्राप्त विभिन्न प्रोफ़ाइल बताते हैं।
इकोकार्डियोग्राफी मछली हृदय प्रोफ़ाइल और कई कार्यात्मक मापदंडों के मात्राकरण के एक पूरी तरह से लक्षण वर्णन सक्षम बनाता है । रिजेक्शन अंश, आंशिक क्षेत्र परिवर्तन, रक्त प्रवाह और बहिर्वाह वेग, हृदय गति और हृदय उत्पादन के लिए प्राप्त मूल्य विधि की प्रजनन क्षमता को रेखांकित करते हुए पिछले अध्ययनों(तालिका 1)द्वारा रिपोर्ट की गई सीमा में हैं। एक साथ लिया, हमारे डेटा से पता चलता है कि उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड इकोकार्डियोग्राफी एक मजबूत और प्रजनन विधि जेब्राफिश हृदय आकृति विज्ञान और कार्य को मापने के लिए जब रोग मॉडल या दवा परीक्षण का मूल्यांकन है ।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम फ्रेड रॉबर्ट्स की तकनीकी सहायता और पांडुलिपि के संशोधन का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container - 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
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