Summary
현재 프로토콜은 골관절염을 동반하는 형태학적 관절 변화를 정량화하기 위한 엄격하고 재현 가능한 방법을 확립합니다. 이 프로토콜의 적용은 질병 진행을 모니터링하고 골관절염의 치료 적 개입을 평가하는 데 유용 할 수 있습니다.
Abstract
미국에서 가장 널리 퍼진 관절 질환 중 하나, 골관절염 (OA) 관절 연골의 점진적 변성을 특징으로, 주로 엉덩이와 무릎 관절에, 이는 환자의 이동성과 삶의 질에 중요한 영향을 초래. 현재까지, 연골 변성을 늦추거나 억제 할 수있는 OA에 대한 기존의 치료 요법이 없습니다. 현재, OA 병리학을 이해하고 효율적으로 감속, 중지 또는 OA를 역전시킬 수 있는 새로운 치료 접근법 또는 에이전트를 발견하기 위한 광범위한 연구가 진행되고 있습니다. 따라서, 관절 연골, 수축기 및 골격 뼈에서 OA 관련 병리학 적 변화를 정확하게 평가하기 위해 정량적이고 재현 가능한 접근 법을 가지고하는 것이 중요합니다. 현재, OA 심각도 및 진행은 주로 골관절염 연구 학회 국제 (OARSI) 또는 만킨 채점 시스템을 사용하여 평가된다. 이러한 채점 시스템의 중요성에도 불구하고, 그들은 반정적이며 사용자 주관성에 의해 영향을받을 수 있습니다. 더 중요한 것은, 그들은 정확하게 초기 질병 상태 또는 초기 치료 단계 동안 연골의 미묘한, 아직 중요한 변화를 평가하는 데 실패. 여기서 설명하는 프로토콜은 전산화되고 반자동화된 조직체형 소프트웨어 시스템을 사용하여 OA의 공동 변경 평가를 위한 표준화되고 엄격하며 재현 가능한 정량적 방법론을 수립합니다. 이 프로토콜은 기존 시스템에 강력한 추가를 제시하고 관절의 병리학 적 변화를 보다 효율적으로 감지 할 수 있습니다.
Introduction
미국에서 가장 널리 퍼진 관절 질환 중 하나인 OA는 주로 엉덩이와 무릎 관절에서 관절 연골의 점진적 변성을 특징으로 하며, 이는 환자의 이동성 및 삶의질에중대한 영향을 미치며1,2,,3. 관절 연골은 마찰을 최소화하고, 운동을 용이하게하고, 관절 압축을 견딜 수 있도록 설계된 이단 관절의 특수 결합조직입니다 4. 관절 연골은 두 가지 주요 구성 요소로 구성되어 있습니다 : 연골 세포와 세포 외 매트릭스. 연골세포는 세포외 기매트릭스의 개발, 유지 및 수리에 1차적인 역할을4하는 전문화된 대사 활성 세포이다. 연골 세포 비대 (CH)는 OA 발달의 주요 병리학 적 징후 중 하나입니다. 그것은 증가 세포 크기, 감소 프로테오글리칸 생산, 결국 연골 변성으로 이어질 연골 매트릭스 분해 효소의 증가 생산을 특징으로5,,6,,7. 또한, 관절의 상골골과 경막의 병리학적 변화는 OA 발달 및진행에중요한 역할을 한다8,9,10,,11,,12.9 현재까지 연골 변성을 억제하는 기존 치료법은 없습니다1,2,23,,13,,14.3 따라서, OA 병리학을 이해하고 OA를 감속하거나 중지 할 수있는 새로운 치료 접근법을 발견하는 것을 목표로 하는 광범위한 지속적인 연구가 있습니다. 따라서, 관절의 연골, 수축기 및 아초골 골에서 OA 관련 병리학적 변화를 정확하게 평가할 수 있는 정량적 및 재현가능한 접근법에 대한 필요성이 증가하고 있다.
현재, OA 심각도 및 진행은 주로 OARSI 또는 Mankin 채점시스템(15)을사용하여 평가된다. 그러나 이러한 채점 시스템은 반정적일 뿐이며 사용자 주관성에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 더 중요한 것은, 그(것)들은 정확하게 질병 도중 또는 유전 조작 또는 치료 내정간섭에 응하여 합동에서 생기는 미묘한 변경을 평가하지 못합니다. 연골, 연골 또는 골격16,,17,,18,,19,,20,,21의조직 체형 분석을 설명하는 문헌에 산발적 인 보고서가 있습니다. 그러나 이러한 모든 관절 구성 요소의 엄격하고 재현 가능한 조직 체형 분석을 위한 상세한 프로토콜은 여전히 부족하여 현장에서 충족되지 않은 필요성을 야기합니다.
조직 형 분석을 사용하여 OA의 병리학 적 변화를 연구하기 위해, 우리는 내측 반월 상 연골 (DMM)의 불안정화를 통해 OA를 유도하기 위해 수술 OA 마우스 모델을 사용했다. murine OA의 확립 된 모델 중, DMM은 부상22,,23,,24,,25,,26의덜 외상성 메커니즘을 수반하기 때문에 우리의 연구를 위해 선택되었다. 반월 상 연골 인대 부상 (MLI) 또는 전방 십자 인대 부상 (ACLI) 수술에 비해, DMM은인간22,,24,,25,,26에서OA 발달과 유사한 OA의 보다 점진적인 진행을 촉진한다. 마우스는 관절 연골, 골격 및 경막의 변화를 평가하기 위해 DMM 수술 후 12주 동안 안락사시켰다.
이 프로토콜의 목표는 OA와 함께 제공되는 공동 변화를 평가하기 위해 표준화되고 엄격하며 정량적인 접근 방식을 수립하는 것입니다.
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Protocol
12 주 된 남성 C57BL/6 쥐 잭스 연구소에서 구입 했다. 모든 마우스는 12시간 의 밝은/어두운 스케줄을 가진 방에 있는 마이크로 이솔레이터 케이지 당 3-5 마우스의 단으로 수용되었다. 모든 동물 절차는 국립 보건원 (NIH) 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었으며 펜실베니아 주립 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 외상 후 골관절염 (PTOA) 수술 모델
- 케타민 (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) 복 강 주사를 통해 조합을 사용 하 여 마우스를 마 취, 관리 buprenorphine (1 mg/kg) 통증 완화를 위한 복 강 주사를 통해, 그리고 무릎 에 머리를 면도. 수술을 시작하기 전에 페달 반사의 부족을 확인합니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 내측 반월 상 연골 (DMM) 수술의 불안정을 수행22,,23.
참고 : 더 자세한 수술 프로토콜 정보22,,23에대한 참조 Glasson 외 및 싱 외 참조를 참조하십시오.- 오른쪽 무릎 관절의 근위 경골 고원에 말단 슬개골에서 3mm 의 세로 절개를합니다. 봉합사를 사용하여 슬개골 힘줄을 대체하십시오.
- 관절 캡슐 내측을 힘줄로 열고 내측반지방패드를 이동하여 인터콘딜라 부위, 내측 반월상 연골 및 수막인대(23)를가시화한다.
- 내측 수막 인대를 경질하여 DMM을 완료하고 관절22,,23을불안정하게 합니다. 스테이플또는 봉합사로 절개 부위를 닫습니다.
- 유사한 절차에 따라 가짜 수술을 수행하지만 내측 수막 인대의 경면없이 수행하십시오.
참고: 마우스는 DMM 또는 가짜 수술을 받기 위해 무작위로 하였다. 이전에 발표 된 문헌에 따르면, 마우스는 상당한 PTOA를 개발 12 DMM 수술 후 주22,,23,,24.
2. 마우스 안락사 및 샘플 수집
- 마우스 안락사
- DMM 후 12주 후, 피하 주사를 통해 케타민(100 mg/kg)/자일라진(10 mg/kg) 조합을 사용하여 마우스를 마취시다.
- 흉부 를 따라 피부를 통해 중간 선 절개를하고 관류 고정을위한 심장을 노출하는 흉곽을 철회27.
참고: 적절한 설치류 고정을 위한 프로토콜에 대한 추가 정보는 Gage 외 참조뿐만 아니라 적절한 장비 조립 및 절차의 비디오묘사(27)를참조하십시오. - 제조업체의 프로토콜에 따라 관류 장치를 설정합니다.
- 혈액이 밖으로 삭제되고 간이 창백해질 때까지 좌심실을 통해 헤파린화 한 식염수를 교전하여 마우스를 안락사. 완전한 마우스 고정이 이루어질 때까지 10% 중립 버퍼링된 포르말린으로 마우스를 관유하십시오.
참고: 성공적으로 퍼우신 마우스는 뻣뻣해집니다. 자동 펌프 시스템을 사용하는 평균 관류 시간은 5-7 분입니다.
- 샘플 수집 및 준비
- 대퇴골과 경골 중간경골에서 뼈를 절단하여 무릎을 분리하고 주변 근육 조직을 해부.
- 무릎 관절을 실온에서 24 시간 동안 10 % 중성 완충 포르말린에 저장한 다음 6 일 동안 4 °C에서 고정을 계속하십시오.
- EDTA 데칼화 버퍼에 샘플을 1주일 동안 저장하여 온화한흔들림(28)으로실온에서 뼈를 데칼화한다. 3일마다 탈석 버퍼 솔루션을 변경합니다.
참고: 디칼화 완충액은 증류수 850 mL와 빙하 아세트산 15 mL의 용액에 140 g의 초순수 EDTA 테트라나트륨을 용해시킴으로써 제조되었다. 완충액을 용액에 빙하 아세트산을 드롭바이브하여 7.6으로 평형화시켰다. pH =7.6에 도달하면, 완충액을 증류수로 총 부피 1L로 가져왔다. 탈석 버퍼를 신선하고 제조한 후 1주일 이내에 사용하였다. - 무릎을 50 % 에탄올로 씻은 다음 70 % 에탄올을 각각 15 분 동안 씻은 다음 임베딩을 처리하십시오.
참고 : 유체 전달 처리는 펜 스테이트 밀튼 S. 허쉬 의료 센터에서 분자 및 조직 병리학 코어에 의해 수행되었다. 최적의 시료 처리에 대한 권장 사항은 기관의 역사학 코어에 문의하십시오. - 파라핀 블록의 바닥면을 향하는 관절의 내측 측면과 함께 마우스 무릎을 파라핀에 포함시다. 경골 및 대퇴 표면이 가능한 한 동일한 평면에 가깝게 되도록 포함 하는 동안 관절의 경골 측에 약간의 압력을 적용 합니다.
3. 마이크로 토메 절편 및 슬라이드 선택
- 마이크로토메 단면화
- 마이크로톤의 블록 홀더에 있는 평면 조정 노브를 사용하여 샘플 블록을 적절하게 향하도록 합니다.
- 파라핀 블록을 직면하여 대퇴골의 말단 양상, 경골의 근위 영역, 및 내측 반월상 연골의 전방 및 후방 뿔이 섹션 컬렉션을 위해 동일한 평면에 나타나게한다(보충 도 1A). 내측 반월 상 연골의 전방 및 후방 뿔이 서로 분리되기 시작할 때 슬라이드에서 섹션을 수집하기 시작합니다.
- 구조 크기를 비교하여 경골, 대퇴골 및 반월 상 연골이 동일한 평면에 나타나는지 확인하십시오. 경골과 대퇴골은 비슷한 크기여야하며, 반월 상 연골 뿔은 크기와 모양이 비슷합니다(보충 그림 1A). 구조물이 구조물에 비해 너무 큰 것처럼 나타나면 추가 면이 필요하다는 것을 나타냅니다. 중요한 것은 조인트 공간이 그대로 유지되는지 확인합니다.
- 파라핀내장마우스무릎의 시상부분을 5 μm 섹션의 내측 관절 구획을 통해 취하고 슬라이드의 단면을 수집합니다. 파라핀 블록당 약 30개의 섹션을 수집합니다.
- 슬라이드 선택
- 다섯 번째 섹션(즉, 슬라이드 5, 15 및 25)부터 시작하는 각 샘플에 대해 50μm 간격으로 세 개의 대표 섹션을 선택합니다. 선택한 슬라이드는 후속 염색, OARSI 채점 및 조직 체형 분석에 사용됩니다.
참고: 총 섹션이 30개인 블록에서 전체 샘플을 명확하게 나타내기 위해 세트의 시작 부분(슬라이드 5-10), 중간(슬라이드 15-20) 및 끝(슬라이드 25-30)에서 슬라이드를 선택합니다. 샘플 간에 비슷한 깊이 수준에서 슬라이드를 선택합니다.
- 다섯 번째 섹션(즉, 슬라이드 5, 15 및 25)부터 시작하는 각 샘플에 대해 50μm 간격으로 세 개의 대표 섹션을 선택합니다. 선택한 슬라이드는 후속 염색, OARSI 채점 및 조직 체형 분석에 사용됩니다.
4. 헤마톡실린, 사프란 오렌지, 패스트 그린 스테인드
- 자일렌의 세 가지 변경으로 선택한 슬라이드를 분리합니다. 100% 에탄올, 95% 에탄올의 두 가지 변화, 70% 에탄올의 한 가지 변화로 슬라이드에 수분을 공급합니다.
- 헤마톡실린으로 슬라이드를 7분 간 염색한 다음, 10분 동안 흐르는 물로 씻어내고, 10초 동안 1.0% 빙하 아세트산으로 헹구고, 사프란닌-O를 5분 간 적어 0.5% 빙하 아세트산으로 빠르게 헹굽습니다.
- 증류수의 두 가지 변화로 슬라이드를 헹구고 공기를 건조시키십시오.
- 5분 동안 세 번의 실렌 교체로 슬라이드를 클리어한 다음 자일렌 기반 마운팅 미디어와 커버슬립으로 장착합니다.
참고: 헤마톡실린은 골수 의 영역을 식별하기위한 핵 얼룩 역할을합니다. Safranin-O는 연골, 프로테오글리칸, 뮤신 및 비만 세포 과립을 염색하는 데 사용됩니다. 빠른 녹색은 뼈의 카운터 스테인으로 사용됩니다.
5. 슬라이드 이미징
- 현미경 및 컴퓨터 기반 이미징 소프트웨어에 부착된 사용 가능한 카메라를 사용하여 Safranin-O 및 Fast Green 스테인드 슬라이드를 이미지화합니다.
- 이미징 소프트웨어를 열고(재료 표참조) 이미징 창 중앙에 무릎 관절 영역(ROI)을 정렬합니다. 회전 현미경 슬라이드 단계를 사용하는 경우, 경골 표면이 이미징 영역의 수평 축의 너비에 걸쳐 있도록 슬라이드를 정렬합니다.
- 샘플 집합을 이미지화하기 시작하기 전에 카메라의 화이트 밸런스를 설정합니다(추가그림 2). 4x 및 10x 배율모두에서 관절 구획을 이미지화하고, 경골 및 대퇴 관절 표면 및 경골 골격이 각각의 이미지 ROIs 내에 포함되도록한다(보조 도 1A, B). OARSI 점수 매기기에 사용할 세 가지 선택한 각 수준에 대한 이미지를 저장합니다.
참고: 카메라의 화이트 밸런스 설정은 사용 중인 소프트웨어 및 카메라 시스템에 따라 달라집니다. 일반적으로 카메라 탭 또는 기본 이미징 메뉴로 이동하여 아래로 스크롤하여 화이트 밸런스 설정. 화이트 밸런스 설정을 선택하면 작은 커서 또는 아이콘이 나타납니다(추가 그림2A). 커서를 사용하여 조인트 공간과 같이 얼룩이 없는 이미지/샘플 내의 영역을 선택하여 화이트 밸런스를 설정합니다.
6. 골관절염 연구 학회 국제 (OARSI) 점수15
- 모든 샘플에서 선택한 세 개의 Safranin-O 및 빠른 녹색 스테인드 슬라이드를 무작위로 지정합니다.
- 세 관찰자와 맹목적인 방식으로 OARSI 점수를 수행합니다. 간단히, 무작위로 한 번에 하나의 이미지를 표시하고 각 샘플에 대해 선택된 세 가지 수준 중 하나에 상관 관계, 각 이미지에 점수를 세 관찰자를 허용합니다.
참고: 채점 척도15에대한 자세한 설명은 OARSI 점수 표를 참조하십시오. - 각 관찰자의 개별 점수를 사용하여 각 섹션의 평균 점수를 계산합니다. 세 가지 대표 섹션의 평균 점수를 취하여 샘플당 평균 점수를 결정합니다.
7. 조직체학 분석
참고: 무릎 관절의 라이브 이미지는 현미경 카메라를 사용하여 터치 스크린 모니터에서 볼 수 있으며 스타일러스는 ROI를 수동으로 추적하는 데 사용됩니다. 히스토모퍼홈트립 소프트웨어의 기본 제공 알고리즘은 정의된 ROI에서 지정된 매개 변수(아래 프로토콜 참조)를 정량화합니다. 중요한 것은, OARSI 점수매기기에서 사용된 동일한 사프라닌-O 및 빠른 녹색 스테인드 섹션이 조직형 분석에 사용된다.
- 소프트웨어 설정 및 측정 준비
- 현미경, 카메라, 컴퓨터 및 터치스크린 모니터를 켭니다. 소프트웨어 아이콘을 클릭하여 소프트웨어 프로그램을 시작합니다. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓아 볼 수 있습니다.
- 측정 창 내에 샘플을 가운데에 두는 것입니다. 측정 그리드가 현미경에서 사용되는 목표에 맞게 적절한 배율로 설정되어 있는지확인합니다(보조 그림 3).
- 화면 상단의 파일 탭으로 이동하여 아래로 스크롤하여 설정 읽기를 클릭합니다. 설정 창을 열고 측정할 매개변수에 적합한 설정 파일을 선택합니다.
- 화면 오른쪽에 있는 목록에서 측정할 매개변수를 선택합니다(추가그림 3). 스타일러스 또는 마우스 커서를 사용하여 특정 조직 ROI를 측정하기 위해 아래에 설명된 단계에 따라 이미지를 추적합니다. 각 측정이 완료되면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 측정을 종료하고 다음 매개 변수로 계속합니다.
참고: 측정할 매개 변수 목록은 설명된 ROI를 측정하기 위해 소프트웨어 회사와 협의하여 설정된 고유한 기본 설정 파일을 통해 작성됩니다. 전체 설정에 대한 자세한 내용은 토론을 참조하십시오. - 모든 측정을 완료한 다음 소프트웨어 화면 하단의 요약 데이터 탭으로 이동합니다(추가그림 3). 화면 창을 클릭하고 키보드의 삽입 키를 누르거나 데이터를 복사하여 별도의 스프레드시트에 붙여넣습니다.
참고: 무작위 및 블라인드 방식으로 조직 체형 분석을 수행합니다. 모든 샘플에 대한 모든 파라미터 측정을 완료한 후 데이터를 구성하고 각 샘플의 세 슬라이드에서 측정값을 평균으로 합니다.
- 총, 석회화 및 석회화되지 않은 연골 영역의 측정
참고: 시판되는 소프트웨어(재료 표참조)를 사용하여 이러한 단계를 수행합니다. 이 섹션 전체에 걸쳐 논의된 연골 부위, 접합부 및 골격 부위에 대한 설명을 위해 보충 그림 1B,C를 참조하십시오.- 연골이 관절 공간을 만나는 경골 연골 표면의 우수한 가장자리를 가로 질러 선을 그립니다. 석회화된 연골이 연골골 뼈와 만나는 연골-골착 접합부에서 두 번째 선을그립니다(그림 1B). 소프트웨어 영역 기능을 사용하여 총 연골 면적 측정값을 자동으로 얻을 수 있습니다.
- 연골의 석회화 및 석회화되지 않은 영역을 분리하는 자연 발생 라인인 조수표시를 따라 선을 그립니다. 석회화된 연골이 연골골 뼈와 만나는 연골-골착 접합부에서 두 번째 선을그립니다(그림 1B). 소프트웨어 영역 기능을 사용하여 석회화된 연골 영역 측정을 자동으로 얻을 수 있습니다.
- 총 연골 영역에서 석회화 된 연골 면적을 빼서 비석연성 면적을 계산합니다(그림 1B).
- 연골 세포 수와 표현형의 결정
- 조직 체 소프트웨어의 설정 내에서 별도의 카운트 함수를 생성하여 매트릭스 생산 및 매트릭스 비생산 연골세포(그림 1B)를구별합니다.
- 스타일러스를 사용하여 연골세포생성 또는 연골세포 생성 여부를 결정하여 지정된 표현형을 발현하는 각 연골세포 위에 작은 점을만든다(도 1B).
참고 : 매트릭스 생산 (즉, 강한 Safranin-O 염색) 또는 매트릭스 비 생산 (즉, 매우 희미하거나 사프란노 얼룩 없음)으로 자신의 표현형에 따라 세포를 계산합니다.
- 경골 관절 표면 둘레의 측정
- 경골 연골의 표면을 가로 질러 선을 추적하여 절대 경골 관절 표면 둘레를 측정하여 개별 세동을 신중하게 정의합니다(그림 1C).
- 조도표시를 따라 두 번째 선을 그려 각 섹션의 평면에 대한 내부 제어 역할을합니다(그림 1C).
- 경골 관절 표면 둘레를 조수 경계로 나누어 경골 관절 표면 세동 지수를 계산합니다.
참고: Tidemark 둘레는 일반적으로 샘플 간에 동일하므로 sham과 DMM 사이의 관절 표면 둘레의 차이는 일반적으로 절대 둘레 또는 세동 인덱스가 사용되었는지 여부에 관계없이 작습니다.
- 연골 골수 및 골수 공간 영역의 측정
- 헤마톡실린으로 염색된 하부 연골 영역의 영역을 개략적으로 개략적으로 하여 영역 기능을 이용하여 아초골 골수 공간 영역을 측정하여(즉, 패스트 그린에 대해 음수) 골격 골격 내의 총 골수 공간 영역을 결정합니다. 경골 골격 내의 모든 골수 공간의 총 면적을 결정하기 위해 이들 영역의 둘레에 선을그립니다(도 2B).
- 콘드로-골지 접합부와 성장판의 우수한 경계 사이의 영역을 개략적으로 개략적으로 개략적으로 하여 영역 함수를 이용하여 전체 경골 영역을 측정하고, 전방 및 후방 골형성물의 영역으로 측면으로 연장한다(도2B).
- 총 연골 영역으로부터 골격 근구 공간을 빼서 연골골 골격 면적을 계산한다(도2B,C).
- 전방 및 후방 골형성 부위 의 측정
- 골형성 부위를 측정하기 위해, 근위 경골의 전방 및 후방 골형성을 영역 함수를 사용하여 추적한다(도2B,E,F).
참고: 골형성은 관절 연골과 성장판, 전방 또는 후방 사이의 골격 돌출부입니다. 경골의 전방 및 후방 측에 골형성 영역은 골격 뼈에 전방 또는 후방 영역을 추적하여 결정된다. 골연골과 골격 사이의 접합은 관절 연골에서 성장 판으로 이어지는 세포 선에 의해 명확하게 묘사됩니다. 골형성제와 사이노비움 사이의 접합은 뼈와 섬유조직 사이의 전이에 의해 정의된다.
- 골형성 부위를 측정하기 위해, 근위 경골의 전방 및 후방 골형성을 영역 함수를 사용하여 추적한다(도2B,E,F).
- 활액 두께 측정
- 대퇴골의 전방 활액 의 내부 삽입 지점에서 반월 상 연골에 부착 점을 향해 선을 그려 영역 함수를 사용하여 전방 대퇴 활활 활활 두께를 측정합니다(그림 3B).
- 대퇴골에 경골의 외부 삽입으로부터 반월 상 연골에 대한 부착쪽으로 두 번째 선을 그립니다(그림 3B).
- 총 활액 면적을 활액 둘레로 나누어 활액 두께를 계산합니다.
8. 통계분석
- 측정된 매개 변수를 수집하고 각 샘플에 대한 세 가지 대표 섹션에서 결과를 평균화합니다. 페어링되지 않은 학생의 t 검정을 사용하여 데이터를 분석하여 두 그룹 또는 단방향 ANOVA를 비교하여 세 개 이상의 그룹을 비교합니다.
- 데이터를 평균 ± 표준 오차로 표시합니다.
참고: 통계적 유의는 p ≤ 0.05에서 달성되었다.
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Representative Results
DMM 유도 OA 는 관절 연골 변성 및 연골 세포 손실의 결과
DMM-유도 OA는 샴 마우스에 비해 OARSI 점수가 증가하여, 표면 침식 및 연골 손실을 뚜렷하게 특징으로하였다(도 1A,D). 여기에 상세한 히스토모퍼홈트리 프로토콜은 총 연골 영역과 비석연골 영역의 감소를 포함하여 여러 OA 관련 변화를 검출했다(도1A,B,E,G); 총 연골 세포 수의 감소; 그리고, 중요한 것은, 연골 세포 를 생산하는 매트릭스의 손실(그림 1H,I). 침식의 중증도를 나타내는 관절 표면의 변화는 연골 세동 지수를 사용하여 평가하였다. 전반적으로, 세동 지수는 DMM 마우스에서 증가했다(도 1C,K,L). 그러나, 의정서에서 논의된 바와 같이, 연골 표면의 완전한 침식으로 인해 말기 OA에서 세동 지수가 감소할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 세동 지수의 증가는 OA 개발 및 진행 동안 관절 연골 표면의 변성을 의미합니다. 이러한 결과는 OA 진행을 특징짓는 병리학연골 변화를 감지하고 정량화하는 조직체분석 프로그램의 능력을 강조한다.
DMM 유도 OA에 있는 그밖 합동 변경의 평가
OA는 연골 이외의 관절 조직에 영향을 미치고, 이러한 조직의 병리학적 변화는 질병 진행에 중요한 역할을한다. 여기서, 기재된 조직형태 분석 방법은 DMM 마우스에서 골수 공간의 증가 및 골수 영역의 감소를 나타내었으며(도2A–D),골수 경화증29,,30을나타낸다. 전방 및 후방 골형성 부위 모두 DMM 마우스에서증가(도 2E,F),부상 부위에서 관절 하중의 변화를 처리하는 보상 메커니즘으로 작용하는 지속적인 골격 리모델링을시사하는 29,,30.
활액의 조직형태 분석은 DMM 마우스에서 활액 두께가 증가함을보였으며(도 3A–C),이는 OA 관련 활액 염증및 염증성 사이토카인의 융합을 관절 공간으로 확산시킨 전형적인 결과11,11,12,,31,,32,,33,,34.
OARSI 점수 대 히스토모이트 사이의 사용자 간 가변성 분석
도 4A는 비석연골영역(도 4A)과OARSI 점수(도4B)의조직체 분석 모두에서 유의한 사용자 간 가변성을 나타내지 않았다. 그러나, 조직체학 분석은 -0.0001179-0.00120에 이르는 관찰자 들 간의 평균 차이가 극히 낮은 것으로 나타났으며, 3명의 관찰자가 얻은 결과의 거의 완전한 중첩을 초래하는 반면, 관찰자 간의 평균 차이는 O1 값의 명확한 편차로 -0.3-0.3에 이르는 OARSI 점수에서 더 높았다.
그림 1: sham 수술 및 DMM 마우스로부터경골 관절 연골 및 관절 연골 세포 표현형의 이성모골. (A)사프린-O/패스트 그린으로 얼룩진 경골 관절 표면. (b)조직형 분석은 총 연골 면적 및 석회화된 연골 영역(주황색)을 추적하는 데 사용되었다. 조수영역보다 우수한 연골은 비석연골(녹색)으로 계산하였다. 연골세포(흰색) 및 매트릭스 비생산 연골세포(magenta)를 생산하는 매트릭스는 비석화 연골 영역 내에서 계수되었다. (C)경골 관절 표면 둘레를 추적하여 관절 표면(파란색 선)을 추적한 다음 조수(보라색 선)를 추적하여 세동 지수를 결정하였다. (D)DMM 마우스에서 OARSI 점수가 증가하였다. (E–L) 정량화된 연골 영역및 연골세포 수의 그래픽 표현은 샴 및 DMM 마우스로부터 의한 카운트이다. 샴 마우스에 비해, DMM 마우스는 총 경골 연골면적(E),경골 석회화 연골영역(F),경골 비석연골수(G),경골 총 연골세포수(H),경골 매트릭스 생산 연골세포,(I)및 경골 매트릭스 비생산 연골세포(J)를감소시켰다. sham 마우스에 비해, DMM 마우스는 경골 관절 표면 둘레(K)를증가시키고 경골 관절 표면 세동 지수(L)를증가시켰습니다. 이미지는 10배 배율을 사용하여 촬영되었습니다. * P < 0.lt; **P < 0.01, ***P < 0.001, 및 ****P < 0.0001 웰치의 보정과 짝이 없는 t 테스트를 사용하여, 값은 평균 ± SEM으로 표현된다; n = 5/그룹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 샴 수술 및 DMM 마우스로부터의 연골 골수 부위 및 연골 골영역의 조직. (A)사프라닌-O/패스트 그린으로 염색된 경골 관절 연골과 골격. (B)골수 부위(녹색), 연골골 부위(마젠타), 전방 골형성제 영역(노랑), 후방 골형성부위(회색)를 계산된 조직체모친 소프트웨어로 추적하였다. (C–F) 가짜 와 DMM 마우스 사이의 조직 체형 영역을 그래프화. 샴 마우스에 비해, DMM 마우스는 경골 골수부위(C)와경골 전방 및 후방 골형성 부위(E–F)를 증가시켰으며, 샴마우스에 비해 경골 골수 골수 영역이E감소하였다(D).FD 이미지는 4배 배율을 사용하여 촬영되었습니다. * P < 0.05, **P < 0.01 웰치의 보정과 짝이없는 t 테스트를 사용하여. 값은 평균 ± SEM으로 표현됩니다. n = 5/그룹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 가짜 수술 및 DMM 마우스로부터의 경골의 이스토모모이. (A)사프라닌-O/패스트 그린으로 염색된 시노비움. (b)활액 두께는 경골 관절(green)의 전방 측면을 가로질러 전방 반월상연경활액막을 추적하여 측정하였다. (C)계산된 조직학 소프트웨어를 사용하여 활액 두께 측정의 그래픽 표현. DMM 마우스는 샴 마우스에 비해 활액 두께가 증가하였다. 이미지는 20배 배율로 촬영되었습니다. P < 0.001 웰치의 보정과 짝이 없는 t 검정을 사용하여, 값은 평균 ±SEM으로 표현된다; n = 5/그룹; S = 시노비움; F = 대퇴골; M = 반월 상 연골. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: OARSI 점수대 조직형 분석의 사용자 간 변동성. (A)3명의 맹인 관찰자(O1, O2, O3)에 의해 이골을 사용하여 얻은 비석연성 영역 측정. (B)3명의 맹인 관찰자로부터 얻은 Sham 및 DMM 마우스에 대한 OARSI 점수. 점선은 각 그룹의 평균 값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 사프라닌-O및 빠른 녹색 스테인드 마우스 경골 관절 절의 조직학적 분석. (A)경골 관절의 4배 배율 이미지. 초점 영역에 레이블이 지정됩니다. (B)경골 관절 ROI의 10배 배율 이미지. 경골 및 대퇴 표면뿐만 아니라 전방 및 후방 반월 상 연골 뿔이 시각화됩니다. 반월 상 연공서류는 대략 같은 크기이고 화상 진찰 ROI는 합동 구획에 중심을 두고 있습니다. (C)근위 경골 표면의 40 배율 이미지. 조수 선은 석회화되지 않은 연골 영역 사이의 선으로 표시됩니다. 골연골 접합부는 석회화된 연골의 끝과 연골 뼈의 시작 사이에 표시되어 있습니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 그림 2: 히스토모퍼시스템 설정 및 카메라 화이트 밸런스 교정. (A)마우스 경골 관절은 화이트 밸런스가 설정되지 않은 소프트웨어 창에서 4 배 배율로 시각화. 화면 상단의 카메라 설정 탭과 드롭다운 메뉴의 선택 항목을 사용하여 화이트 밸런스를 설정합니다. (B)마우스 경골 관절에서 4 배 배율로 화이트 밸런스 세트. 측정을 수행할 때 경골 관절의 특정 영역을 구별하는 사용자의 능력을 증가, 샘플의 착색 및 염색의 변화를 유의하십시오. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 조직형 분석 측정 전에 조직형 소프트웨어의 설정. 조직형 소프트웨어 창의 대표 스크린샷입니다. 얼룩진 마우스 무릎 섹션은 측정 영역(노란색 그리드)에 중심을 두고 있으며, 이 영역에 대한 올바른 배율 척도는 현미경에서 사용되는 목적과 일치하도록 선택된다(화면의 오른쪽 상단 모서리에 빨간색으로 동그라미). 매개 변수 목록은 이미징 및 측정 영역 오른쪽의 열에 표시됩니다. 매개변수를 선택하면 매개 변수가 강조 표시되므로 현재 측정할 지편 세동이 선택됩니다. 창 하단의 요약 데이터 탭은 각 샘플에 대한 각 매개변수에 대한 측정값을 구성하고 저장하여 각 섹션에 대한 각 매개변수 측정이 완료된 후 내보낼 수 있도록 저장됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
최근 골관절염 연구는 관절 내의 다른 조직과 각 조직이 질병 개시 또는 진행에서 수행하는 역할 사이의 크로스토크에 대한 우리의 이해를 향상시켰으며88, 9,9,10,,35,,36. 따라서, OA의 평가는 연골의 분석에 국한되어서는 안되지만 또한 연골 뼈와 수축기의 분석을 포함해야한다는 것이 명백해졌다. 그럼에도 불구하고, 관절 연골은 OA15,,37,,38의반정적 채점의 주요 초점이되었습니다. 계산된 조직체는 이미 근골격계 연구39,,40,,41,,42,,43,,44의다양한 영역에 적용되었지만, OA 동안 무릎 관절 구획 내의 다수 조직에 대한 이산 변화를 정확하고 재현적으로 분석하기 위한 프로토콜을 설명하는 데 있어 충족되지 않은 차이가 있다. 연골, 골격 및 연골 뼈의 변화를 정량화하기 위한 조직체 분석 측정의 적용은 OA 관절의 1차 및 2차 변화에 대한 보다 전체적인 평가를 제공합니다.
여기에서는 처음으로 전산화되고 반자동 조직체분석 소프트웨어를 활용하여 서로 다른 관절 구획의 병리학적 변화를 정량화하고 OA 개발, 진행 또는 회귀를 평가하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 조직체측정 소프트웨어로 측정을 추적하고 측정할 때 모호성을 제한하기 위해서는 명확하고 일관된 Safranin-O 및 Fast Green 얼룩이 필수적이기 때문에 시료 준비 중에 주의를 기울여야 합니다. 슬라이드의 각 배치에 대한 신선한 염색 솔루션을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 염색을 위한 슬라이드 선택은 블록 들 사이의 일관된 수준에서 이루어져야 한다. 첫 번째 슬라이드는 시료 사이에 비슷한 수준에서 복용해야 하며, 이상적으로는 전방 및 후방 반월상 연골 뿔이 분리되기 시작합니다.
OA 동안, 총 연골 과 비석 연골 영역은 연골 세동 과 변성으로 인해 감소. 심한 OA에서, 석회화 연골의 완전한 변성도 발생할 수 있습니다. 프로토콜은 연골에서 이화 신호 대 근육의 평가를 위한 OA 진행의 평가로 연골세포 표현형을 결정하는 의의 중요성을 강조합니다. 연골 세포의 총 수와 연골 세포 생산 매트릭스의 수 (anabolic) 정상 연골에서 높고 OA 연골에서 낮은, OA에서 기존의 연골 세포의 대부분은 매트릭스 비 생산 (catabolic). 중요한 것은, OA 치료 발견의 필드에 있는 이 필수적인 매개변수는 OARSI 또는 Mankin의 득점 시스템에 의해 평가되지 않습니다. 연골 부위와 연골 세포의 수를 보존 할뿐만 아니라 연골 세포 근육 표현형을 촉진하는 특정 개입은 보다 효과적인 치료 접근법일 수 있습니다.
여기에 상세히 설명된 프로토콜은 또한 경증에서 중간 정도의 OA에 존재하는 연골 표면 세동에 대한 미묘한 변화를 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다. 세동 수가 많을수록 관절 표면에 들여쓰기가 존재하기 때문에 경계 측정이 증가합니다. 따라서, 경골 관절 표면 둘레 및 세동 지수는 정상 연골이 낮고, 일부 세동으로 인한 경미한 OA의 중간, 더 많은 세동으로 인해 중간 OA에서 높지만, 완전한 연골 변성 및 손실로 인해 다시 심한 OA에서 낮다.
골격 근막증은 OA의 특징적인 병리학적 징후로, 연골골 골수 공간 영역을 감소시키고 연골골 뼈 영역을 증가시켜8,9,10,9,29,,30을증가시다., 프로토콜에 기술된 상연골 골영역 및 아연골골 공간 영역의 변화를 정량화하는 것은 OA 질환의 복합적 성질을 위한 구동 성분으로서 다조직 변화를 이해하는 것의 중요성을 입증한다. 전방 및 후방 골형성 부위의 측정은 관절 내에서 발생하는 뼈 리모델링의 규모에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 골연산 부위는 샴 수술 무릎에서 매우 작고 OA의 골형성으로 인해 증가합니다. 전방 골형성제 영역의 측정은 DMM 손상 부위 근처의 무릎 내측 부위에서 발생하는 뼈 리모델링의 심각한 특성으로 인해 후방 골형성 부위의 측정과 약간 달랐다.
마지막으로, 이 프로토콜은 활막의 변화에 대한 정량적 평가를 간략하게 설명합니다. 활액 두께는 샴 조인트가 낮고 OA가 증가합니다. OA의 염증은 활막의 두꺼워지며 염증성 사이토카인 및 기타 인자의 관절 공간10,11, 12,1231,,32의전달을 증가시킵니다., 따라서, OA 질환 진행의 변조 인자로서 관절 염증을 평가하는 것이 필수적이다.
histomorphometry 소프트웨어의 사용은 하드웨어의 가용성에 의해 제한됩니다 : 스타일러스와 터치 스크린 모니터 또는 태블릿은 정확한 측정을 하는 데 필요한 수동 추적의 양을 감안할 때 절대적으로 필요하다. 히스토모피트리 소프트웨어로 작은 영역을 측정하려고 시도하는 것도 펜 크기가 하나의 직경으로 제한되기 때문에 제한될 수 있습니다. 작은 영역을 측정할 수 없는 것은 불편할 수 있지만 측정된 조인트 영역은 영역 도구로 쉽게 정의되며 소프트웨어의 낮은 차별은 최종 측정에서 무시할 수 있는 차이를 만듭니다.
또한 사용자 간 가변성은 항상 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량적 프로토콜의 구현과 관련된 관심 영역이라는 점에 유의해야 합니다. 효과적이고 재현 가능하며 엄격한 조직 분석 프로토콜을 구축하려면 사용자 간 가변성을 줄이는 것을 포함하여 실험 분석 내에서 잠재적인 복합 변수를 제한해야 합니다. 그러나 소프트웨어와 함께 짧은 교육 세션(약 30분)을 마친 후 실험실 구성원은 사용자 간 측정 분포가 사용자 간 가변성을 거의 나타내지 않는 직접 오버레이를 더 많이 반영하는 매우 일관되고 재현 가능한 측정을 생성할 수 있었습니다. 중요한 것은, 이 히스토모퍼홈트립 프로토콜은 매우 재현성이 높은 방식으로 sham 샘플 간의 이산 차이도 정량화하는 효율적인 방법을 보여줍니다.
OARSI 채점 시스템은 OA 환자 및 실험 용 뮤린모델(15)에서연골 손상에 대한 평가의 일반적으로 사용되는 척도이다. 채점 시스템은 주로 갈라진 부분/침식 또는 관절 표면의 정도에 초점을 맞춘 정수 척도를 기반으로 합니다. 우리는 우리의 실험에서 OARSI 점수와 유의한 사용자 간 가변성을 발견하지 못했지만, 설명된 히스토모피트리 프로토콜에서 거의 아무도 에 비해 관찰자 사이의 더 높은 평균 차이가 여전히 있었다. 따라서 정의된 파라미터의 조직체학 분석을 위해 이 재현 가능한 프로토콜을 설정하면 여러 사용자 간에도 각 샘플의 매우 일관된 측정을 통해 샘플 분석의 주관적인 특성중 일부를 제거할 수 있습니다.
OARSI 표준화 된 채점 시스템은 OA 연구의 벤치 마크입니다. 그러나, 시스템의 제한된 점수 기반 특성은 조인트 내에서 발생하는 미묘한 변화의 정량화를 허용하지 않는다. 이 원고에 설명된 확장된 공동 평가는 히스토퍼홈트리 소프트웨어를 사용하여 OA의 심각도의 향상되고 덜 주관적인 특성을 제공한다. 이 프로토콜은 OA의 외과 유도를 겪은 마우스를 위해 최적화됩니다. 절차 및 기술은 다른 모형 및 가설 내의 OA의 평가를 위해 적용될 수 있습니다, 그러나.
요약하자면, 여기에 상세한 프로토콜은 OA 병리학을 조사하거나 치료 적 개입을 평가하기 위해 엄격하고 재현 가능한 반자동화 양적 접근법에 대한 명확한 가이드를 제공합니다.
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Disclosures
없음
Acknowledgments
우리는 비교 의학 직원의 부 및 펜 스테이트 밀튼 S. 허쉬 메디컬 센터에서 분자 및 조직 병리학 코어의 지원을 인정하고 싶습니다. 자금 출처: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF 관절염 연구 보조금 (F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
References
- Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
- Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
- Lorenz, J., Grässel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S., Coppola, V. 1194, Humana Press. New York, NY. 401-419 (2004).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
- Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
- Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654 (2011).
- Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
- Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632 (2016).
- Martel-Pelletier, J., et al.
- Goldring, M. B., Otero, M.
- Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625 (2010).
- Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
- Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
- Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
- O'Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
- Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
- Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
- Pastoureau, P., Chomel, A. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. 101, Humana Press. New York, NY. 79-91 (2004).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Singh, S. R., Coppola, V. Mouse Genetics: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2004).
- Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413 (2014).
- Culley, K. L., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. Westendorf, J., van Wijnen, A. 1226, Humana Press. New York, NY. 143-173 (2015).
- Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
- Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33 (2011).
- Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
- Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
- De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
- Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028 (2016).
- Lories, R. J., Luyten, F. P.
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
- Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
- Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175 (2018).
- Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
- Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037 (2016).
- Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
- Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).
