Summary
Действующий протокол устанавливает строгий и воспроизводимый метод количественной оценки морфологических изменений суставов, которые сопровождают остеоартрит. Применение этого протокола может быть полезным в мониторинге прогрессирования заболевания и оценке терапевтических вмешательств при остеоартрите.
Abstract
Один из наиболее распространенных заболеваний суставов в Соединенных Штатах, остеоартрит (ОА) характеризуется прогрессирующей дегенерации суставного хряща, в первую очередь в тазобедренных и коленных суставов, что приводит к значительному воздействию на мобильность пациента и качество жизни. На сегодняшний день, Есть нет существующих лечебных методов лечения ОА в состоянии замедлить или ингибировать дегенерацию хряща. В настоящее время существует обширный объем текущих исследований, чтобы понять патологию ОА и открыть новые терапевтические подходы или агенты, которые могут эффективно замедлить, остановить, или даже обратить вспять ОА. Таким образом, крайне важно иметь количественный и воспроизводимый подход для точной оценки Связанных СОвРом патологических изменений в суставном хряще, синовиуме и подхондрятельной кости. В настоящее время, ОА тяжести и прогрессии в первую очередь оцениваются с помощью остеоартрита научно-исследовательского общества International (OARSI) или Манкин скоринга систем. Несмотря на важность этих систем скоринга, они являются полуколичественными и могут зависеть от субъективности пользователя. Что еще более важно, они не в состоянии точно оценить тонкие, но важные, изменения в хряще в начале состояния болезни или ранних фаз лечения. В описанном здесь протоколе используется компьютеризированная и полуавтоматизированная гистоморфетричная система программного обеспечения для создания стандартизированной, строгой и воспроизводимой количественной методологии для оценки совместных изменений в ОА. Этот протокол представляет собой мощное дополнение к существующим системам и позволяет более эффективно обнаруживать патологические изменения в суставе.
Introduction
Один из наиболее распространенных заболеваний суставов в Соединенных Штатах, ОА характеризуется прогрессирующей дегенерации суставного хряща, в первую очередь в тазобедренных и коленных суставов, что приводит к значительному воздействию на мобильность пациента и качество жизни1,2,3. Суставной хрящ является специализированной соединительной ткани диартродиальных суставов, предназначенных для минимизации трения, облегчения движения, и терпеть совместное сжатие4. Суставной хрящ состоит из двух основных компонентов: хондроцитов и внеклеточной матрицы. Хондроциты являются специализированными, метаболически активными клетками, которые играют главную роль в развитии, поддержании и ремонте внеклеточной матрицы4. Гипертрофия хондроцитов (Ch) является одним из основных патологических признаков развития ОА. Он характеризуется увеличением клеточных размеров, снижением протеогликана производства, а также увеличением производства хряща матрицы деградации ферментов, которые в конечном итоге приводят к дегенерации хряща5,6,7. Далее, патологические изменения в подхнольной кости и синовиуме сустава играют важную роль в развитии ОА и прогрессии8,,9,,10,11,12. На сегодняшний день нет существующих лечебных методов лечения, которые подавляют дегенерацию хряща1,,2,,3,,13,,14. Таким образом, существует обширные текущие исследования, направленные на понимание патологии ОА и открыть новые терапевтические подходы, которые способны замедлить или даже остановить ОА. Соответственно, возрастает потребность в количественном и воспроизводимом подходе, который позволяет точно оценить связанные с ОА патологические изменения хряща, синовия и подхноровленной кости сустава.
В настоящее время, ОА тяжести и прогрессии в первую очередь оцениваются с помощью OARSI или Манкин скоринговых систем15. Однако эти системы скоринга являются лишь полуколичественными и могут зависеть от субъективности пользователей. Что еще более важно, они не в состоянии точно оценить тонкие изменения, которые происходят в суставе во время болезни или в ответ на генетические манипуляции или терапевтического вмешательства. Есть спорадические доклады в литературе, описывающие гистоморфометрический анализ хряща, синовия, или подхнольной кости16,17,18,19,20,21. Тем не менее, подробный протокол для строгого и воспроизводимого гистоморфометрического анализа всех этих совместных компонентов по-прежнему отсутствует, создавая неудовлетворенную потребность в этой области.
Для изучения патологических изменений в ОА с помощью гистоморфометрического анализа, мы использовали хирургическую модель мыши ОА, чтобы вызвать ОА через дестабилизацию медиальный мениск (DMM). Среди установленных моделей мурина ОА, DMM был выбран для нашего исследования, поскольку она включает в себя менее травматический механизм травмы22,23,24,25,26. По сравнению с менискаль-связкой травмы (MLI) или передней крестообразной связки травмы (ACLI) операции, DMM способствует более постепенное прогрессирование ОА, подобно развитию ОА у людей22,24,25,26. Мыши были усыплены двенадцать недель после операции DMM для оценки изменений в суставном хряще, подхноловой кости и синовиума.
Целью данного протокола является создание стандартизированного, строгого и количественного подхода к оценке совместных изменений, сопровождающих ОА.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Двенадцатинедельные мыши C57BL/6 были приобретены в Jax Labs. Все мыши были размещены в группах 3-5 мышей на микро-изолатор клетке в комнате с 12 ч свет / темное расписание. Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения (NIH) по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета штата Пенсильвания.
1. Посттравматический остеоартрит (PTOA) хирургическая модель
- Анестезия мышей с помощью кетамина (100 мг/кг)/ксилазин (10 мг/кг) комбинации с помощью интраперитонеальной инъекции, вводят бупренорфин (1 мг/кг) с помощью интраперитонеальной инъекции для облегчения боли, и брить волосы над коленом. Проверьте отсутствие педали рефлекс перед началом операции.
- Выполните дестабилизацию медиальной хирургии мениска (DMM), как ранее описано22,23.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к Глассон и др. и Сингх и др. ссылки для более подробной информации хирургического протокола22,23.- Сделайте 3 мм продольной разрез от дистальной коленной чашечки до проксимального косого плато правого коленного сустава. Используйте шов, чтобы вытеснить сухожилие patellar.
- Откройте совместную капсулу медиала к сухожилию и переместить инфрапателлар жира площадку для визуализации межкондилярной области, медиальный мениск, и менискотибиальной связки23.
- Трансектируйте медиальную менискотибиальную связку, чтобы завершить DMM и дестабилизировать сустав22,23. Закройте место разреза с помощью скобок или швов.
- Выполняйте фиктивные операции после аналогичной процедуры, но без перерезки медиальной менискотибиальной связки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши были рандомизированы, чтобы получить либо DMM или фиктивной хирургии. Согласно ранее опубликованной литературе, мыши развивают значительные PTOA 12 недель после операции DMM22,23,24.
2. Эвтаназия мышей и сбор образцов
- Маусная эвтаназия
- Двенадцать недель после DMM, анестезирует мышей с помощью кетамина (100 мг/кг)/ксилазин (10 мг/кг) комбинации через интраперитонеальной инъекции.
- Сделайте разрез средней линии через кожу вдоль грудной клетки и врежьте грудную клетку, чтобы разоблачить сердце для перфузионной фиксации27.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Gage et al. ссылка на дополнительную информацию о протоколе для надлежащей фиксации грызунов, а также видео изображение надлежащей сборки оборудования и процедур27. - Настройка перфузионного аппарата в соответствии с протоколом производителя.
- Эвтанизировать мышь, пронизовывая гепаринизированный солевой раствор через левый желудочек, пока кровь не очищается и печень становится бледной. Пронизьте мышь 10% нейтральным буферизированным формалином до полной фиксации мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Успешно проникнутая мышь станет жесткой. Среднее время перфузии с помощью автоматизированной насосной системы составляет 5-7 мин.
- Сбор и подготовка образцов
- Изолировать колени, разрезая кость в середине бедренной кости и середине голени и вскрыть окружающие мышечной ткани.
- Продолжить фиксацию путем хранения коленных суставов в 10% нейтральный буферный формалин при комнатной температуре в течение 24 ч, затем при температуре 4 градусов по Цельсию в течение 6 дней.
- Декальцифифицировать кости путем хранения образца в EDTA декальцинации буфера в течение 1 недели при комнатной температуре с мягкой встряхивания28. Изменяйте буферное решение декальцинации каждые 3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер декальцинации был подготовлен путем растворения 140 г ультрачистого тетрана дивероя EDTA в растворе 850 мл дистиллированной воды плюс 15 мл ледниковой уксусной кислоты. Буфер был pH equilibrated до 7.6 путем dropwise добавление ледниковой уксусной кислоты к раствору. По достижении рН 7,6, буфер был доведен до 1 л общего объема с дистиллированной водой. Буфер декальцинации был подготовлен свежим и использовался в течение 1 недели после приготовления. - Вымойте колени с 50% этанола, затем 70% этанола в течение 15 минут каждый, а затем процесс для встраивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка передачи жидкости была выполнена Молекулярной и Гистопатологией Core в пенсильванском государственном Милтон ехий медицинский центр. Проконсультируйтесь с гистологичным ядром учреждения для получения рекомендаций по оптимальной обработке образцов. - Встраивай мышь колени в парафин с медиальной аспект сустава перед нижней поверхности парафиновой блока. Принесите небольшое давление на косую сторону сустава во время встраивания, чтобы обеспечить косой и бедренной поверхности как можно ближе к той же плоскости, как это возможно.
3. Микротом секционирование и выбор слайдов
- Секция микротомов
- Используйте ручки регулировки плоскости на держателе блока микротома для того чтобы обеспечить правильную облицовку блока образца.
- Лицо парафиновый блок так, что дистальный аспект бедренной кости, проксимальной области голени, и передние и задние рога медиального мениска появляются в той же плоскости для сбора раздела (Дополнительная фигура 1A). Начните собирать разделы на слайдах, когда передние и задние рога медиального мениска начинают отделяться друг от друга.
- Убедитесь, что голени, бедренной кости и менисци появляются в одной плоскости, сравнивая размеры структуры. Голени и бедренной кости должны быть сопоставимого размера, как с менискальные рога похожи по размеру и форме(Дополнительная рисунок 1A). Если структура кажется слишком большой по сравнению с ее аналогом, это означает, что требуется дополнительная облицовка. Важно отметить, что совместное пространство остается нетронутым.
- Возьмите sagittal разделы парафин-встроенных коленях мыши через медиальной совместного отсека в 5 мкм разделов и собирать разделы на слайдах. Соберите около 30 секций на парафин блок.
- Выбор слайдов
- Выберите три репрезентативные разделы по 50 мкм друг от друга для каждого образца, начиная с пятого раздела (т.е. слайды 5, 15 и 25). Выбранные слайды будут использоваться для последующего окрашивания, оценки OARSI и гистоморфетрического анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из блока с 30 общими разделами выберите слайды от начала (слайды 5-10), среднего (слайды 15-20) и конец (слайды 25-30) набора, чтобы четко представить весь образец. Выберите слайды из аналогичных уровней глубины между образцами.
- Выберите три репрезентативные разделы по 50 мкм друг от друга для каждого образца, начиная с пятого раздела (т.е. слайды 5, 15 и 25). Выбранные слайды будут использоваться для последующего окрашивания, оценки OARSI и гистоморфетрического анализа.
4. Гематоксилин, Safranin оранжевый, и быстрое зеленое окрашивание
- Депарафинизировать выбранные слайды тремя изменениями ксилена. Гидрат слайды с двумя изменениями 100% этанола, два изменения 95% этанола, и одно изменение 70% этанола.
- Пятно слайды с гематаклином в течение 7 мин затем промыть проточной водой в течение 10 мин. Пятно с быстрой зеленой в течение 3 мин и промыть в 1,0% ледниковой уксусной кислоты в течение 10 с. Пятно с Safranin-O в течение 5 мин и быстро промыть путем погружения в 0,5% ледниковой уксусной кислоты.
- Промыть слайды в двух изменениях дистиллированной воды и дайте воздуху высохнуть.
- Очистить слайды в трех изменениях ксилена в течение 5 минут каждый затем монтировать с ксилена основе монтажа средств массовой информации и coverslip.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гематоксилин служит в качестве ядерного пятна для выявления областей костного мозга. Safranin-O используется для пятнистого хряща, протеогликанов, муцина и гранул из тучных клеток. Быстрый зеленый используется в качестве противоядного пятна для костей.
5. Слайд-изображение
- Изображение Safranin-O и Fast Green окрашенных слайдов с помощью доступной камеры, прикрепленной к микроскопу и компьютерного программного обеспечения для визуализации.
- Откройте программное обеспечение для визуализации (см. Таблица материалов)и организовать область колена сустава интерес (ROI) в центре окна изображения. При использовании вращательного микроскопа слайд этапе, выровнять слайд так, что голени поверхности охватывает ширину горизонтальной оси области изображения.
- Установите баланс белого камеры перед началом изображения набора образцов(Дополнительная диаграмма 2). Изображение совместного отсека на обоих 4x и 10x увеличение, гарантируя, что как голени и бедренной суставной поверхности и голени подхонная кость включены в каждом из изображения ROIs(Дополнительная рисунок 1A, B). Сохраняй изображения для каждого из трех выбранных уровней, которые будут использоваться для оценки OARSI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установка белого баланса камеры будет зависеть от используемого программного обеспечения и систем камеры. Как правило, перейдите к вкладке камеры или меню основной визуализации и прокрутите вниз, чтобы установить баланс белого. Выберите Set White Balance и должен появиться небольшой курсор или значок(Дополнительная диаграмма 2A). Используя курсор, выберите область внутри изображения/образца, которая свободна от пятен, например, совместное пространство, чтобы установить баланс белого.
6. Остеоартрит научно-исследовательское общество международного (OARSI) забил15
- Рандомизировать три выбранных Safranin-O и Fast Green окрашенные слайды из всех образцов.
- Выполните OARSI забил в ослепленной манере с тремя наблюдателями. Кратко отобразить одно изображение в рандомизированном порядке и позволить трем наблюдателям забить каждое изображение, соотнесе в один из трех уровней, выбранных для каждого образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к таблице оценки OARSI для подробных описаний шкалы классификации15. - Рассчитайте средний балл для каждого раздела, используя индивидуальные баллы от каждого наблюдателя. Определить средний балл за выборку, взяв средний балл из трех репрезентативных разделов.
7. Гистоморфометрический анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Живые изображения коленного сустава просматриваются на сенсорном мониторе с помощью микроскопа камеры, и стилус используется для ручного отслеживания ROIs. Встроенные алгоритмы программного обеспечения гистоморфометрии количественно определяют указанные параметры (см. Протокол ниже) в определенных ROIs. Важно отметить, что те же Safranin-O и Fast Green окрашенные секции, используемые в оценке OARSI, используются для гистоморфометрического анализа.
- Настройка программного обеспечения и подготовка измерений
- Включите микроскоп, камеру, компьютер и сенсорный монитор. Нажмите на значок программного обеспечения для запуска программного обеспечения. Поместите слайд на сцену микроскопа для просмотра.
- Центр образца в окне измерения. Убедитесь, что сетка измерения установлена на надлежащее увеличение, чтобы соответствовать цели, используемой на микроскопе(Дополнительный рисунок 3).
- Перейдите на вкладку Файл в верхней части экрана и прокрутите вниз, чтобы прочитать настройки. Откройте окно настроек и выберите соответствующий файл настроек для измерения параметров.
- Выберите параметр, который будет измеряться из списка на правой стороне экрана(Дополнительная рисунок 3). Используйте курсор стилуса или мыши для отслеживания изображений в соответствии с шагами, описанными ниже, чтобы измерить определенную рентабельность тканей. При завершении каждого измерения, право Нажмите, чтобы закончить измерение и продолжить к следующему параметру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Список параметров, которые будут измерены, создается с помощью файла с четкими предпочтениями, который устанавливается в консультации с компанией-разработчиком программного обеспечения с целью измерения описанной рентабельности инвестиций. Пожалуйста, смотрите обсуждение для более подробной информации о полной настройке. - Выполнить все измерения, а затем перейти к вкладке Резюме данных в нижней части экрана программного обеспечения(Дополнительная диаграмма 3). Нажмите на окно экрана, нажмите клавишу Insert на клавиатуре или скопировать и вставить данные в отдельную таблицу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните гистоморфометрический анализ рандомизированным и ослепленным способом. После завершения всех измерений параметров для всех образцов, организовать данные и усреднение измерений из трех слайдов из каждого образца.
- Измерения общего объема, кальцинированных и некальцифицированных областей хряща
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте коммерчески доступное программное обеспечение (см. Таблицу Материалов)для выполнения этих шагов. Пожалуйста, см Дополнительный рисунок 1B,C для уточнения по области хряща, узлов, и подхновных областей кости обсуждается в этом разделе.- Нарисуйте линию через верхний край поверхности хряща, где хрящ встречается с совместным пространством. Нарисуйте вторую линию на хондро-оссевом стыке, где кальцифицированный хрящ встречается с подхндровой костью(рисунок 1B). Используйте функцию области программного обеспечения для автоматического получения общего измерения области хряща.
- Нарисуйте линию вдоль tidemark, естественной линии, разделяющей кальцинированные и некальцифицированные области хряща. Нарисуйте вторую линию на хондро-оссевом стыке, где кальцифицированный хрящ встречается с подхндровой костью(рисунок 1B). Используйте функцию области программного обеспечения для автоматического получения измерения области кальцинированного хряща.
- Рассчитайте некальцифицированную область хряща, вычитая кальцинированную область хряща из общей площади хряща(рисунок 1B).
- Определение числа хондроцитов и фенотипа
- Создание отдельных функций подсчета в настройках в программном обеспечении гистоморфометрии, чтобы различать матрицу производства и матрицы непроизводящих хондроцитов(рисунок 1B).
- Определите количество матриц, производящих или не производящих хондроциты, используя стилус, чтобы сделать небольшую точку над каждым хондроцитом, выражающим указанный фенотип(рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитайте клетки в соответствии с их фенотипом как либо матричная, производящая (т.е. сильное окрашивание Safranin-O) или матрицы, непроизводящей (т.е. очень слабый или не safranin-O окрашивание).
- Измерение периметра поверхности суставов
- Измерьте абсолютный голени суставной поверхности периметра путем отслеживания линии по всей поверхности голени хряща, тщательно определяя отдельные фибрилляции (Рисунок 1C).
- Нарисуйте вторую линию вдоль tidemark, чтобы служить в качестве внутреннего контроля для плоскости каждого раздела(рисунок 1C).
- Рассчитайте индекс фибрилляции поверхности суставов, разделив по периметру приливной марки по периметру суставной поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Периметры Tidemark, как правило, равны между образцами, поэтому разница в периметрах суставной поверхности между обманом и DMM, как правило, была небольшой ли абсолютный периметр или индекс фибрилляции были использованы.
- Измерение областей подхондрии костей и костного мозга
- Измерьте область пространства подхондренного мозга, используя функцию Области, определив области в области подхнора, окрашенных гематоксилином только (т.е. отрицательным для быстрого зеленого цвета), чтобы определить общую область пространства костного мозга в пределах подхондровой кости. Нарисуйте линии по периметру этих областей, чтобы определить общую площадь всего пространства костного мозга в косточке подхонов(рисунок 2B).
- Измерьте общую область подхнора, используя функцию области, определив область между хондро-оссеозным соединением и верхней границей нарастающей пластины роста, простирающейся на боковой части к областям передней и заднего остеофитов(рисунок 2B).
- Рассчитайте посхонную область костей, вычитая область пространства подхнового мозга из общей области подсхожи(рисунок 2B,C).
- Измерение передней и задней областей остеофита
- Для измерения области остеофита, проследить передние и задние остеофиты проксимальной голени с помощью функции области (Рисунок 2B,E,F).
ПРИМЕЧАНИЕ: Остеофиты костлявые проекции, которые образуют сявлические хрящи и рост пластины, передней или задней в области субхондра. Остеофитные участки на передней и задней сторонах голени определяются путем отслеживания передней или задней области к подхондровой кости. Соединение между остеофитами и подхноловой костью четко очертано линией клеток, простирающихся от суставного хряща до пластины роста. Соединение остеофита и синовия определяется переходом между костной и волокнистой тканью.
- Для измерения области остеофита, проследить передние и задние остеофиты проксимальной голени с помощью функции области (Рисунок 2B,E,F).
- Измерение синовиальной толщины
- Измерьте переднюю бедренную синовиальную толщину с помощью функции Области, нарисовав линию из внутренней точки вставки передней синовия на бедренной кости к точке крепления на менискае(рисунок 3B).
- Нарисуйте вторую строку от внешней вставки синовиума на бедренной кости к его привязанности к мениска(рисунок 3B).
- Рассчитайте толщину синовиальной, разделив общую синовиальную область по синовиальному периметру.
8. Статистический анализ
- Соберите измеренные параметры и усреднейте результаты из трех репрезентативных разделов для каждой выборки. Проанализируйте данные с помощью t-теста непарного студента, чтобы сравнить две группы или одностороннюю ANOVA, чтобы сравнить три или более групп.
- Отображение данных в качестве средней и стандартной ошибки среднего значения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Статистическая значимость была достигнута на стр. 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DMM-индуцированной ОА приводит к дегенерации суставного хряща и потери хондроцитов
DMM-индуцированной ОА привело к увеличению OARSI оценка по сравнению с фиктивными мышами, четко характеризуется поверхностной эрозии и потери хряща(Рисунок 1A,D). В протоколе гистоморфометрии, описанном здесь, было обнаружено несколько связанных с ОА изменения, включая уменьшение общей площади хряща и в нескопенной области хряща(рисунок 1A,B,E,G); сокращение общего числа хондроцитов; и, что немаловажно, потеря матрицы, производящей хондроциты(рисунок 1H,I). Изменения на поверхности сустава, свидетельствующих о серьезности эрозии, были оценены с помощью индекса фибрилляции хряща. В целом, индекс фибрилляции увеличился у мышей DMM(рисунок 1C,K,L). Вместе с тем важно также отметить, что индекс фибрилляции может снизиться в конце этапа ОА в связи с полной эрозией поверхности хряща, о чем говорится в Протоколе. Увеличение индекса фибрилляции означает дегенерацию поверхности суставного хряща во время разработки и прогрессирования ОА. Эти результаты подчеркивают способность программы гистоморфетрического анализа обнаруживать и количественно оценивать патологические изменения хряща, которые характеризуют прогрессирование ОА.
Оценка других совместных изменений в ДММ-индуцированной ОА
ОА влияет на ткани суставов, кроме хряща, и патологические изменения в этих тканях играют решающую роль в прогрессировании заболевания. Здесь описанный метод гистоморфометрического анализа выявил увеличение площади подхонной кости и уменьшение площади костного мозга у мышей DMM(рисунок 2A-D),что указывает на подхнолонный костной склероз29,30. Оба передних и задних остеофитных областях также увеличилось в DMM мышей(Рисунок 2E,F), предлагая текущие подхнолая кость ремоделирования, которая выступает в качестве компенсационного механизма для обработки изменений в совместной нагрузки на месте травмы29,30.
Гистоморфометрический анализ синовия показал повышенную толщину синовиальной толщины у мышей DMM(рисунок 3A-C),что является типичным результатом ассоциированного синовиального воспаления ОА и диффузии воспалительных цитокинов в суставное пространство11,,12,,31,,32,33,34.
Анализ изменчивости интерпользователей между оценкой OARSI и гистоморфомометрией
Рисунок 4A не показывает существенной изменчивости как гистоморфометрического анализа некальцифицированной области хряща(рисунок 4A),так и оценки OARSI(рисунок 4B). Однако гистоморфометрический анализ показал крайне низкую среднее различие между наблюдателями в диапазоне от -0,0001179-0,00120, что привело к почти полному перекрытию результатов, полученных тремя наблюдателями, в то время как средняя разница между наблюдателями была выше в оценке OARSI в диапазоне от -0,3-0,3 с явным отклонением значений O1 от O1.
Рисунок 1: Гистоморфометрия голени суставного хряща и суставного хондроцита фенотипов от фиктивной хирургии и DMM мышей. (A) Tibial суставной поверхности окрашенных Safranin-O/Fast Green. (B) Гистоморфометрический анализ был использован для отслеживания общей площади хряща и кальцинированной области хряща (оранжевый). Хрящ, превосходящий область tidemark, был рассчитан как некальцифицированный хрящ (зеленый). Матрица, производящая хондроциты (белые) и матрицы, не производящие хондроциты (монагенты), были подсчитаны в некопированной области хряща. (C) по периметру поверхности суставов косых глаз был измерен путем отслеживания суставной поверхности (синяя линия), а затем tidemark (фиолетовая линия) для определения индекса фибрилляции. (D) Оценка OARSI увеличилась в DMM мышей. (E-L) Графическое представление количественных областей хряща и хондроцитов от обмана и DMM мышей. По сравнению с фиктивными мышами, DMM мышей сократилась общая площадь голозевого хряща (E), tibial кальцинированного хряща области (F), tibial uncalcified хряща (G), tibial общее число хондроцитов (H), косичная матрица производства хондроцитов, (I) и косить матрицы непроизводительных хондроцитов (J). По сравнению с фиктивными мышами, DMM мышей увеличилось голобы суставной поверхности периметра (K) и увеличение голени суставной поверхности фибрилляции индекс(L). Изображения были сделаны с использованием 10-x увеличения. Злт; 0,05, Злт; 0,01, ЗПЗ злт; 0,001, и »P йlt; 0.0001 с использованием непарного t-теста с Welch's, значения коррекции выражаются как среднее SEM; n 5 /группа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Гистоморфометрия области подхнондры костного мозга и подхнольной области костей от фиктивной хирургии и DMM мышей. (A) Tibial суставного хряща и подхнольной кости окрашенных Сафранин-O/Fast Green. (B) Подхнодровые области костного мозга (зеленый), подхондрал кости области (магента), передней области остеофита (желтый), и задней области остеофита (серый) были прослежены с помощью компьютерного программного обеспечения гистоморфометрии. (C-F) График гистоморфометрических областей между обманом и DMM мышей. По сравнению с фиктивными мышами, DMM мышей была повышенная область косточки голени subchondral(C) и голени передней и задней области остеофита (E-F), а также снижение голени субхондраль костного мозга области по сравнению с фиктивными мышей (D). Изображения были сделаны с использованием 4x увеличения. Злт; 0,05, Злт; 0,01 с помощью непарного t-теста с коррекцией Уэлча. Значения выражаются как средние значения - SEM; n 5 /группа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Гистоморфометрия синовиума от фиктивной хирургии и DMM мышей. (A) Synovium окрашенных Сафрон-O / Быстрый зеленый. (B) Синовиальная толщина была измерена путем отслеживания передней менискофеморальной синовиальной мембраны через передний аспект трибиофеморального сустава (зеленый). (C)Графическое представление измерений синовиальной толщины с использованием компьютерного программного обеспечения гистоморфометрии. У dMM мышей была повышенная синовиальная толщина по сравнению с фиктивными мышами. Изображения были сделаны при 20-х увеличениях. P qlt; 0.001 с использованием непарного t-теста с коррекцией Уэлча, значения выражаются как среднее значение SEM; n 5/группа; S и синовиум; F и бедренная каяние; и М й мениска. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Вариативность переногую в оценке OARSI по сравнению с гистоморфоретриеметрическим анализом. (A) Измерения области некальцинированных хрящевки, полученные с помощью гистоморфометрии тремя ослепленными наблюдателями (O1, O2, O3). (B) OARSI оценки для обмана и DMM мышей, полученных от трех ослепленных наблюдателей. Пунктирные линии обозначают среднее значение для каждой группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная фигура 1: Гистологический анализ Safranin-O и Fast Green окрашенных тибиофеморальных совместных секций. (A) 4x увеличение изображение tibiofemoral сустава. Области фокусировки помечены. (B) 10x увеличение изображение tibiofemoral совместных рентабельности инвестиций. Визуализированы косые и бедренные поверхности, а также передние и задние менискальные рога. Менисци примерно одного размера и рентабельность изображений сосредоточена на совместном отсеке. (C) 40x увеличение изображения проксимальной косой поверхности. Линия tidemark обозначена как линия между некальцифицированными и кальцифицированными зонами хряща. Остеохондральный узел обозначен между концом кальцинированного хряща и началом подхонной кости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная диаграмма 2: Установка системы гистоморфометрии и калибровка баланса белого цвета камеры. (A) Мышь tibiofemoral совместных визуализированы при 4x увеличение в окне программного обеспечения с белым балансом не установлен. Обратите внимание на вкладку настроек камеры в верхней части экрана и выбор в меню выпадения, чтобы установить баланс белого. (B) Мышь tibiofemoral совместных при 4x увеличение с белым балансом набора. Обратите внимание на изменение окраски и окрашивания образца, повышая способность пользователя различать определенные области трибиофеморального сустава при выполнении измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Дополнительная диаграмма 3: Настройка гистоморфетрического программного обеспечения до гистоморфеметрического анализа измерений. Представитель скриншот гистоморфетриметрического окна программного обеспечения. Обратите внимание, что окрашенные мыши колено раздел по центру в области измерения (желтая сетка) и правильной шкалы увеличения для региона выбран в соответствии с целью используется на микроскоп (обведенный красным в верхнем правом углу экрана). Список параметров отображается в столбце справа от области изображения и измерения. Выбор параметра будет подчеркивать параметр, следовательно, Тибиальная фибрилляция в настоящее время выбрандля для измерения. Вкладка Сводные данные в нижней части окна, где измерения для каждого параметра для каждого образца будут организованы и сохранены для экспорта после завершения каждого измерения параметра для каждого раздела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Недавние исследования остеоартрита улучшили наше понимание перекрестного разговора между различными тканями в суставе и роль каждой ткани играет в инициации болезни или прогрессирования8,9,10,35,36. Соответственно, стало очевидно, что оценка ОА не должна ограничиваться анализом хряща, а должна также включать анализ подхндровой кости и синовиума. Несмотря на это, суставной хрящ был основным направлением полуколичественного скоринга ОА15,37,38. Хотя вычисленные гистоморфометрии уже были применены к различным областям опорно-мостоносного исследования39,40,41,,42,,43,44, есть неудовлетворенный разрыв в описании протокола для точного и воспроизводимого анализа дискретных изменений в множество тканей в суставном коленном отсеке во время ОА.44 Применение измерений гистоморфетрического анализа для количественной оценки изменений в хряще, подхноловой кости и синовиуме обеспечивает более целостную оценку первичных и вторичных изменений в суставах ОА.
Здесь мы впервые описываем подробный протокол, в котором используется компьютеризированное и полуавтоматическое программное обеспечение гистоморфетрического анализа для количественной оценки патологических изменений в различных совместных отсеках и оценки разработки, прогрессии или регрессии ОА. Следует соблюдать осторожность во время подготовки к образу, так как четкие и последовательные пятна Safranin-O и Fast Green необходимы для ограничения двусмысленности при отслеживании и проведении измерений с помощью гистоморфоретрического программного обеспечения. Использование свежих решений для окрашивания для каждой партии слайдов является целесообразным. Кроме того, выделение слайдов для окрашивания должно происходить на согласованных уровнях между блоками. Первый слайд должен быть сделан на аналогичном уровне между образцами, в идеале, как только передние и задние менискальные рога начинают отделяться.
Во время ОА общий объем хряща и некальцифицированных областей хряща уменьшаются из-за фибрилляции хряща и дегенерации. В тяжелых ОА, полная дегенерация кальцилированного хряща также может произойти. Протокол подчеркивает значение определения фенотипа хондроцитов в качестве оценки прогрессии ОА для оценки анаболического и катаболического сигнализации в хрящевой. Общее количество хондроцитов и количество матрицы производства хондроцитов (анаболические) являются высокими в нормальном хрящевом и низким в Хрящевие ОА, где большинство существующих хондроцитов в ОА являются матрицы непроизводства (катаболические). Важно отметить, что этот важный параметр в области ОА терапевтического открытия не оценивается OARSI или манкин скоринговых систем. Некоторые вмешательства, которые не только сохранить область хряща и количество хондроцитов, но и способствовать хондроцитов анаболический фенотип может быть более эффективным терапевтическим подходов.
Протокол, описанный здесь, также предоставляет метод количественного измерения тонких изменений в фибрилляции поверхности хряща, присутствующих в легкой и умеренной ОА. Большее количество фибрилляций означает увеличение измерения периметра из-за присутствия отступов в суставной поверхности. Таким образом, мибический суставной периметр поверхности и индекс фибрилляции являются низкими в нормальном хряще, промежуточные в мягкой ОА из-за некоторых фибрилляций, высокий в умеренной ОА из-за более фибрилляции, но снова низкий в тяжелой ОА из-за полной дегенерации хряща и потери.
Подхнолонная ремоделирование костей и склероз являются характерными патологическими признаками ОА, что приводит к уменьшению площади подхондрительного мозга и увеличению области подхнонадной кости8,,9,,10,,29,30. Количественная оценка изменений в области подхондривой костной ткани и области пространства подхонного мозга, описанная в протоколе, свидетельствует о важности понимания многотканевых изменений в качестве движущей составляющей для сложного характера развития и прогрессирования заболеваний ОА. Измерение передней и задней области остеофита обеспечивает важное понимание масштаба костной ремоделирования, происходящих в суставе. Область остеофита очень мала в фиктивных коленях и увеличивается из-за образования остеофита в ОА. Измерение передней области остеофита немного отличалось от измерения задней области остеофита из-за сурового характера ремоделирования костей, происходящих в медиальной области колена, недалеко от места травмы ДММ.
Наконец, в этом протоколе излагается количественную оценку изменений в синовиальной мембране. Синовиальная толщина с низкой в фиктивных суставах и увеличивается в ОА. Воспаление в ОА приводит к утолщению синовиальной мембраны для увеличения доставки воспалительных цитокинов и других факторов в пространство сустава10,,11,,1231,32. Таким образом, важно оценить воспаление суставов как модуляционный фактор прогрессирования болезни ОА.
Использование программного обеспечения гистоморфометрии ограничено наличием аппаратного обеспечения: сенсорные мониторы или планшеты со стилусом абсолютно необходимы, учитывая количество ручного отслеживания, необходимое для проведения точных измерений. Попытка измерить небольшие участки с гистоморфомоматрии программного обеспечения также может быть ограничение, как размер пера ограничен до одного диаметра. Хотя эта неспособность измерить небольшие участки может быть неудобной, измеряемые совместные области легко определяются с помощью инструмента области, а низкая дискриминация программного обеспечения делает незначительное различие в окончательном измерении.
Следует также отметить, что изменчивость между универсалами всегда вызывает озабоченность в отношении осуществления надежного и воспроизводимого количественного протокола. Создание эффективного, воспроизводимого и строгого протокола гистоморфометрии требует ограничения потенциальных переменных составива в рамках экспериментального анализа, включая снижение изменчивости интерпользователей. Однако после короткой тренировки (около 30 минут) с программным обеспечением, члены лаборатории смогли генерировать высокосогласованные и воспроизводимые измерения, где распределение измерений между пользователями отражает больше прямой накладки, представляющие почти никакой изменчивости между узлами. Важно отметить, что этот протокол гистоморфометрии демонстрирует эффективный метод количественной оценки даже дискретных различий между фиктивными образцами в высоко воспроизводимым образом.
Система оценки OARSI является широко используемой мерой оценки повреждения хряща у пациентов ОА и экспериментальных моделей мурин15. Система скоринга основана на масштабе целого числа, в основном ориентированной на степень расщелина/эрозии или суставной поверхности. Хотя мы не нашли существенной изменчивости интерпользователей с оценками OARSI в нашем эксперименте, все еще была более высокая средняя разница между наблюдателями, по сравнению с почти ни одной в описанном протоколе гитоморфофометрии. Таким образом, установление этого воспроизводимого протокола для гистоморфометрического анализа определенных параметров позволяет проводить весьма последовательные измерения каждого образца, даже между несколькими пользователями, устраняя часть субъективного характера анализа выборки.
Стандартизированная система оценки OARSI является эталоном для исследований ОА. Однако ограниченный характер системы, основанный на оценках, не позволяет количественно определить тонкие изменения, происходящие в суставе. Расширенная совместная оценка, описанная в данной рукописи с использованием программного обеспечения гистоморфометрии, обеспечивает расширенную и менее субъективную характеристику серьезности ОА. Этот протокол оптимизирован для мышей, которые подверглись хирургической индукции ОА. Однако процедуры и методы могут применяться для оценки ОА в рамках других моделей и гипотез.
Таким образом, в протоколе, подробно описанном здесь, содержится четкое руководство для строгого и воспроизводимого полуавтоматизированного количественного подхода к изучению патологии ОА или оценке терапевтических вмешательств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один
Acknowledgments
Мы хотели бы отметить помощь сотрудников Департамента сравнительной медицины и молекулярной и гистопатологии ядро в штате Пенсильвания Милтон С. Херши медицинский центр. Источники финансирования: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
References
- Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
- Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
- Lorenz, J., Grässel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S., Coppola, V. 1194, Humana Press. New York, NY. 401-419 (2004).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
- Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
- Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654 (2011).
- Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
- Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632 (2016).
- Martel-Pelletier, J., et al.
- Goldring, M. B., Otero, M.
- Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625 (2010).
- Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
- Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
- Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
- O'Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
- Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
- Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
- Pastoureau, P., Chomel, A. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. 101, Humana Press. New York, NY. 79-91 (2004).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Singh, S. R., Coppola, V. Mouse Genetics: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2004).
- Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413 (2014).
- Culley, K. L., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. Westendorf, J., van Wijnen, A. 1226, Humana Press. New York, NY. 143-173 (2015).
- Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
- Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33 (2011).
- Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
- Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
- De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
- Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028 (2016).
- Lories, R. J., Luyten, F. P.
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
- Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
- Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175 (2018).
- Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
- Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037 (2016).
- Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
- Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).
