Summary
L'attuale protocollo stabilisce un metodo rigoroso e riproducibile per la quantificazione dei cambiamenti articolari morfologici che accompagnano l'osteoartrite. L'applicazione di questo protocollo può essere utile per monitorare la progressione della malattia e valutare gli interventi terapeutici nell'osteoartrite.
Abstract
Uno dei disturbi articolari più diffusi negli Stati Uniti, l'osteoartrite (OA) è caratterizzata da una progressiva degenerazione della cartilagine articolare, principalmente nelle articolazioni dell'anca e del ginocchio, che si traduce in impatti significativi sulla mobilità del paziente e sulla qualità della vita. Ad oggi, non esistono terapie curative esistenti per l'OA in grado di rallentare o inibire la degenerazione della cartilagine. Attualmente, c'è una vasta serie di ricerche in corso per comprendere la patologia OA e scoprire nuovi approcci terapeutici o agenti che possono rallentare in modo efficiente, fermare o addirittura invertire OA. Pertanto, è fondamentale avere un approccio quantitativo e riproducibile per valutare con precisione i cambiamenti patologici associati all'OA nella cartilagine articolare, nel sinovio e nell'osso subcondrale. Attualmente, la gravità e la progressione dell'OA sono valutate principalmente utilizzando l'Osteoarthritis Research Society International (OARSI) o i sistemi di punteggio Mankin. Nonostante l'importanza di questi sistemi di punteggio, sono semiquantitativi e possono essere influenzati dalla soggettività dell'utente. Ancora più importante, non riescono a valutare con precisione sottili, ma importanti, cambiamenti nella cartilagine durante gli stati della malattia precoce o le fasi di trattamento precoce. Il protocollo qui descritto utilizza un sistema software istomorfometrico computerizzato e semiautomatizzato per stabilire una metodologia quantitativa standardizzata, rigorosa e riproducibile per la valutazione dei cambiamenti congiunti nell'OA. Questo protocollo presenta una potente aggiunta ai sistemi esistenti e consente un rilevamento più efficiente dei cambiamenti patologici nel giunto.
Introduction
Uno dei disturbi articolari più diffusi negli Stati Uniti, OA è caratterizzato da una progressiva degenerazione della cartilagine articolare, principalmente nelle articolazioni dell'anca e del ginocchio, che si traduce in impatti significativi sulla mobilità del paziente e sulla qualità della vita1,2,3. La cartilagine articolare è il tessuto connettivo specializzato delle articolazioni diartrodiali progettato per ridurre al minimo l'attrito, facilitare il movimento e sopportare la compressione articolare4. La cartilagine articolare è composta da due componenti primari: condrociti e matrice extracellulare. I condrociti sono cellule specializzate, metabolicamente attive che svolgono un ruolo primario nello sviluppo, manutenzione, e riparazione della matrice extracellulare4. L'ipertrofia condromita (CH) è uno dei principali segni patologici dello sviluppo dell'OA. È caratterizzato da un aumento delle dimensioni del cellulare, diminuzione della produzione proteoglicana e aumento della produzione di enzimi che degradano la matrice della cartilagine che alla fine portano alla degenerazione della cartilagine5,6,7. Inoltre, i cambiamenti patologici nell'osso subcondrale e nel sinovio del giunto svolgono un ruolo importante nello sviluppo e nella progressionedell'OA 8,9,10,11,12. Ad oggi, non esistono terapie curative esistenti che inibiscono la degenerazione della cartilagine1,2,3,13,14. Così, c'è una vasta ricerca in corso che mira a capire la patologia OA e scoprire nuovi approcci terapeutici che sono in grado di rallentare o addirittura fermare OA. Di conseguenza, c'è una crescente necessità di un approccio quantitativo e riproducibile che consenta una valutazione accurata dei cambiamenti patologici associati all'OA nella cartilagine, nel sinovium e nell'osso subcondrale dell'articolazione.
Attualmente, la gravità e la progressione dell'OA vengono valutate principalmente utilizzando i sistemi di punteggio OARSI o Mankin15. Tuttavia, questi sistemi di punteggio sono solo semiquantitativi e possono essere influenzati dalla soggettività dell'utente. Ancora più importante, non riescono a valutare con precisione i cambiamenti sottili che si verificano nell'articolazione durante la malattia o in risposta alla manipolazione genetica o a un intervento terapeutico. Ci sono sporadiche relazioni nella letteratura che descrivono le analisi istomormetriche della cartilagine, del sinovio o dell'osso subcondrale16,17,18,19,2020,21. Tuttavia, manca ancora un protocollo dettagliato per l'analisi istomorfometrica rigorosa e riproducibile di tutti questi componenti articolari, creando un bisogno insoddisfatto nel campo.
Per studiare i cambiamenti patologici nell'OA utilizzando l'analisi istomorfometrica, abbiamo usato un modello di topo chirurgico OA per indurre l'OA attraverso la destabilizzazione del menisco mediale (DMM). Tra i modelli consolidati di murine OA, DMM è stato selezionato per il nostro studio perché coinvolge un meccanismo meno traumatico di lesione22,23,24,25,26. Rispetto agli interventi chirurgici a imumento meniscale-ligamentoso (MLI) o alle lesioni da legamento crociato anteriore (ACLI), DMM promuove una progressione più graduale dell'OA, simile allo sviluppo di OA negli esseri umani22,24,25,26. I topi sono stati eutanasia dodici settimane dopo l'intervento chirurgico DMM per valutare i cambiamenti nella cartilagine articolare, nell'osso subcondrale e nel sinovium.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un approccio standardizzato, rigoroso e quantitativo per valutare i cambiamenti congiunti che accompagnano l'OA.
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Protocol
I topi C57BL/6 di 12 settimane sono stati acquistati da Jax Labs. Tutti i topi erano alloggiati in gruppi di 3-5 topi per gabbia micro-isolatore in una stanza con un programma di 12 h luce /scuro. Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo la Guida del National Institute of Health (NIH) per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvate dall'Animal Care and Use Committee della Pennsylvania State University.
1. Modello chirurgico di osteoartrite post-traumatica (PTOA)
- Anestesizzare i topi utilizzando una combinazione di ketamina (100 mg/kg)/xylazina (10 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale, somministrazione di buprenorphine (1 mg/kg) tramite iniezione intraperitale per alleviare il dolore e radersi i capelli sul ginocchio. Verificare la mancanza di un riflesso pedale prima di iniziare l'intervento chirurgico.
- Eseguire la destabilizzazione della chirurgia del menisco mediale (DMM) come descritto in precedenza22,23.
NOTA: Si prega di fare riferimento a Glasson et al. e Singh et al. riferimenti per informazioni più dettagliate protocollo chirurgico22,23.- Fare un'incisione longitudinale di 3 mm dalla rotula distale all'altopiano tibiale prossimale dell'articolazione del ginocchio destro. Utilizzare una sutura per sposto il tendine rotuleo.
- Aprire la capsula articolare mediale al tendine e spostare il tampone di grasso infraptellare per visualizzare la regione intercondilar, il menisco mediale e il legamento meniscotibiale23.
- Trasmettere il legamento meniscotibiale mediale per completare il DMM e destabilizzare l'articolazione22,23. Chiudere il sito di incisione con graffette o suture.
- Eseguire interventi chirurgici fittizi seguendo una procedura simile, ma senza transezione del legamento meniscotibiale mediale.
NOTA: I topi sono stati randomizzati per ricevere un intervento chirurgico DMM o farsa. Secondo la letteratura pubblicata in precedenza, i topi sviluppano significativa PTOA 12 settimane dopo l'intervento chirurgico DMM22,23,24.
2. Eutanasia del topo e raccolta di campioni
- Eutanasia del topo
- Dodici settimane dopo il DMM, anestesizzare i topi utilizzando una combinazione di ketamina (100 mg/kg)/xylazina (10 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale.
- Fare un'incisione mediana attraverso la pelle lungo il torace e ritrarre la gabbia toracica per esporre il cuore per la fissazione perfusione27.
NOTA: Fare riferimento al riferimento Gage et al. per ulteriori informazioni sul protocollo per una corretta fissazione dei roditori, nonché la rappresentazione video dell'assemblaggio e delle procedure dell'apparecchiatura corretta27. - Impostare l'apparato perfusione secondo il protocollo del produttore.
- Eutanasia il topo perfondendo la salina eparinizzata attraverso il ventricolo sinistro fino a quando il sangue non viene eliminato e il fegato diventa pallido. Perfecone il mouse con il 10% di formalina neutra memorizzata nel buffer fino a raggiungere la fissazione completa del mouse.
NOTA: Un mouse perfuso con successo diventerà rigido. Il tempo medio di perfusione utilizzando il sistema di pompaggio automatico è di 5–7 min.
- Raccolta e preparazione dei campioni
- Isolare le ginocchia tagliando l'osso a metà femore e metà tibia e sezionare il tessuto muscolare circostante.
- Continuare la fissazione conservando le articolazioni del ginocchio in formali tamponati neutri del 10% a temperatura ambiente per 24 h, quindi a 4 gradi centigradi per 6 giorni.
- Decalcizzare l'osso conservando il campione nel buffer di decalcificazione EDTA per 1 settimana a temperatura ambiente con lieve agitazione28. Modificare la soluzione del buffer di decalcificazione ogni 3 giorni.
NOTA: il buffer di decalcificazione è stato preparato sciogliendo 140 g di tetrasodio EDTA ultrapuro in una soluzione di 850 mL di acqua distillata più 15 mL di acido acetico glaciale. Il buffer è stato equilibrato in pH a 7,6 mediante aggiunta goccia per sboccolare dell'acido acetico glaciale alla soluzione. Una volta raggiunto il pH 7,6, il tampone è stato portato a 1 l volume totale con acqua distillata. Buffer di decalcificazione è stato preparato fresco e utilizzato entro 1 settimana dalla preparazione. - Lavare le ginocchia con il 50% di etanolo, poi 70% etanolo per 15 min ciascuno, quindi elaborare per l'incorporamento.
NOTA: l'elaborazione del trasferimento dei fluidi è stata eseguita dal Molecular and Histopathology Core del Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Consultare il nucleo istologico dell'istituto per consigli sull'elaborazione ottimale dei campioni. - Incorporare le ginocchia del topo in paraffina con l'aspetto mediale dell'articolazione rivolta verso la superficie inferiore del blocco di paraffina. Applicare una leggera pressione sul lato tibiale dell'articolazione durante l'incorporamento per garantire che le superfici tibiali e femorali siano il più vicino possibile allo stesso piano.
3. Sezionamento microtome e selezione delle diapositive
- Sezionamento microtome
- Utilizzare le manopole di regolazione del piano sul supporto del blocco del microtoma per garantire una corretta facciata del blocco del campione.
- Affrontare il blocco di paraffina in modo che l'aspetto distale del femore, regione prossimale della tibia e corna anteriori e posteriori del menisco mediale appaiono nello stesso piano per la raccolta di sezioni (Figura supplementare 1A). Inizia a raccogliere sezioni sui vetrini quando le corna anteriori e posteriori del menisco mediale iniziano a separarsi l'una dall'altra.
- Assicurarsi che la tibia, il femore e il menisci appaiano sullo stesso piano confrontando le dimensioni della struttura. La tibia e il femore devono essere di dimensioni comparabili, con entrambe le corna meniscali simili per dimensioni e forma (Figura supplementare 1A). Se una struttura appare troppo grande rispetto alla sua controparte, ciò indica che è necessario un fronte aggiuntivo. È importante sottolineare che lo spazio articolare rimane intatto.
- Prendere le sezioni sagittali delle ginocchia del topo in paraffina attraverso il vano giunto mediale in sezioni da 5 m e raccogliere le sezioni sui vetrini. Raccogliere circa 30 sezioni per blocco di paraffina.
- Selezione diapositiva
- Selezionare tre sezioni rappresentative a 50 m di distanza per ogni campione a partire dalla quinta sezione (cioè diapositive 5, 15 e 25). Le diapositive selezionate verranno utilizzate per la successiva colorazione, il punteggio OARSI e l'analisi histomorfometrica.
NOTA: da un blocco con 30 sezioni totali, selezionare le diapositive dall'inizio (diapositive 5-10), al centro (diapositive 15–20) e alla fine (diapositive 25-30) del set per rappresentare chiaramente l'intero campione. Selezionare diapositive da livelli di profondità simili tra i campioni.
- Selezionare tre sezioni rappresentative a 50 m di distanza per ogni campione a partire dalla quinta sezione (cioè diapositive 5, 15 e 25). Le diapositive selezionate verranno utilizzate per la successiva colorazione, il punteggio OARSI e l'analisi histomorfometrica.
4. Colorazione ematossitale, Safranin Arancione e Verde veloce
- Deparaffina le diapositive selezionate con tre modifiche di xilene. Idratare i vetrini con due cambiamenti di etanolo al 100%, due cambi del 95% di etanolo e un cambio del 70% di etanolo.
- Macchiagli gli scivoli con ematossilina per 7 min poi lava con acqua corrente per 10 min.
- Sciacquare i vetrini in due cambi di acqua distillata e lasciare asciugare l'aria.
- Sgombrare le diapositive in tre cambi di xilene per 5 min ciascuno poi montare con supporti di montaggio basati su xilene e un coverslip.
NOTA: L'ematossia serve come macchia nucleare per identificare le aree del midollo osseo. Safranin-O è usato per macchiare cartilagine, proteoglicani, muchino e granuli di mastocio. Fast Green è usato come contromacchia per l'osso.
5. Immagini scorrevoli
- Immagine delle diapositive colorate Safranin-O e Fast Green utilizzando una telecamera disponibile collegata a un microscopio e software di imaging basato su computer.
- Aprire il software di imaging (vedere Tabella dei materiali) e disporre la regione di interesse dell'articolazione del ginocchio (ROI) al centro della finestra di imaging. Se si utilizza uno stadio di scorrimento del microscopio rotazionale, allineare la diapositiva in modo che la superficie tibiale si estenda per tutta la larghezza dell'asse orizzontale della regione di imaging.
- Impostare il bilanciamento del bianco della fotocamera prima di iniziare a visualizzare un insieme di campioni (Supplementary Figure 2). Immagine del raggruppamento del giunto con ingrandimento sia 4x che 10x, assicurando che sia la superficie articolare tibiale che quella articolare femorale e l'osso subcondrale tibiale siano inclusi all'interno di ciascuna delle ROI dell'immagine (Figura supplementare 1A, B). Salvare le immagini per ciascuno dei tre livelli selezionati da utilizzare per il punteggio OARSI.
NOTA: l'impostazione del bilanciamento del bianco della fotocamera dipenderà dal software e dai sistemi di fotocamera in uso. In genere, passare alla scheda Fotocamera o al menu Principale di imaging e scorrere verso il basso fino a Imposta bilanciamento bianco. Selezionare Imposta bilanciamento bianco per visualizzare un cursore o un'icona di piccole dimensioni (Figura supplementare 2A). Utilizzando il cursore, selezionare un'area all'interno dell'immagine/campione privo di macchie, ad esempio lo spazio del giunto, per impostare il bilanciamento del bianco.
6. Osteoartrite ricerca internazionale (OARSI) punteggio15
- Randomizzare le tre diapositive colorate Safranin-O e Fast Green selezionate da tutti i campioni.
- Esegui il punteggio OARSI in modo cieco con tre osservatori. In breve, visualizzare un'immagine alla volta in ordine casuale e consentire a tre osservatori di segnare ogni immagine, correlando a uno dei tre livelli selezionati per ogni campione.
NOTA: Si prega di fare riferimento alla tabella dei punteggi OARSI per una descrizione dettagliata della scala di classificazione15. - Calcola il punteggio medio per ogni sezione utilizzando i punteggi individuali di ogni osservatore. Determinare il punteggio medio per campione prendendo il punteggio medio delle tre sezioni rappresentative.
7. Analisi istomortrametrica
NOTA: le immagini dal vivo dell'articolazione del ginocchio vengono visualizzate su un monitor touchscreen utilizzando una fotocamera al microscopio e uno stilo viene utilizzato per tracciare manualmente i ROI. Gli algoritmi incorporati del software histomorfometria quantificano i parametri specificati (vedere Protocollo di seguito) nei ROI definiti. È importante sottolineare che le stesse sezioni colorate Safranin-O e Fast Green utilizzate nel punteggio OARSI vengono utilizzate per l'analisi istomorfometrica.
- Configurazione del software e preparazione della misurazione
- Attiva microscopio, fotocamera, computer e monitor touchscreen. Fare clic sull'icona del software per avviare il programma software. Posizionare il vetrino sullo stadio del microscopio per la visualizzazione.
- Centrare il campione all'interno della finestra di misurazione. Assicurarsi che la griglia di misurazione sia impostata sull'ingrandimento corretto in modo che corrisponda all'obiettivo utilizzato al microscopio (Figura supplementare 3).
- Passare alla scheda File nella parte superiore dello schermo e scorrere verso il basso fino a Leggi impostazioni. Aprire la finestra Impostazioni e selezionare il file di impostazioni appropriato per i parametri da misurare.
- Selezionare il parametro da misurare dall'elenco sul lato destro dello schermo (Supplementary Figure 3). Utilizzare lo stilo o il cursore del mouse per tracciare le immagini in base ai passaggi descritti di seguito per misurare specifici RO dei tessuti. Al termine di ogni misurazione, fare clic con il pulsante destro del mouse per terminare la misurazione e passare al parametro successivo.
NOTA: L'elenco dei parametri da misurare viene creato attraverso un file di preferenze distinto che viene impostato in consultazione con la società di software allo scopo di misurare i ROI descritti. Si prega di consultare la discussione per ulteriori dettagli sulla configurazione completa. - Completare tutte le misurazioni e passare alla scheda Dati di riepilogo nella parte inferiore della schermata del software ( Figurasupplementare 3). Fare clic sulla finestra dello schermo, premere il tasto Inserisci sulla tastiera o copiare e incollare i dati in un foglio di calcolo separato.
NOTA: Eseguire l'analisi istomorfometrica in modo randomizzato e accecato. Dopo aver completato tutte le misurazioni dei parametri per tutti i campioni, organizzare i dati e calcolare la media delle misurazioni delle tre diapositive di ogni campione.
- Misure delle aree cartilagini totali, calcificate e non calcolate
NOTA: utilizzare un software disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) per eseguire questi passaggi. Vedere Figura supplementare 1B,C per chiarimenti sulle regioni della cartilagine, le giunzioni e le regioni ossee subcondriali discusse in questa sezione.- Disegnare una linea attraverso il bordo superiore della superficie della cartilagine tibiale dove la cartilagine incontra lo spazio articolare. Disegnare una seconda linea in corrispondenza della giunzione condro-osseo dove la cartilagine calcificata incontra l'osso subcondrale (Figura 1B). Utilizzare la funzione Area software per ottenere automaticamente la misurazione dell'area cartilaginea totale.
- Disegnare una linea lungo il segno di marea, una linea naturale che separa le regioni calcificate e non calcificate della cartilagine. Disegnare una seconda linea in corrispondenza della giunzione condro-osseo dove la cartilagine calcificata incontra l'osso subcondrale (Figura 1B). Utilizzare la funzione Area software per ottenere automaticamente la misurazione dell'area della cartilagine calcificata.
- Calcolare l'area della cartilagine non calcolata sottraendo l'area della cartilagine calcificata dall'area totale della cartilagine (Figura 1B).
- Determinazione del numero di condrociti e del fenotipo
- Creare funzioni di conteggio separate all'interno delle impostazioni del software histomorphometry per distinguere la produzione di matrici e i condrociti non producibili a matrice (Figura 1B).
- Determinare il numero di matrici che producono o non producono condrociti utilizzando lo stilo per fare un piccolo punto su ogni condrocito che esprime il fenotipo specificato (Figura 1B).
NOTA: Contare le cellule in base al loro fenotipo come matrice che produce (cioè, forte colorazione Safranin-O) o matrice non producendo (cioè, molto debole o nessuna colorazione Safranin-O).
- Misurazione del perimetro della superficie articolare tibiale
- Misurare il perimetro assoluto della superficie articolare tibiale tracciando una linea attraverso la superficie della cartilagine tibiale, definendo attentamente le fibrillazioni individuali (Figura 1C).
- Disegnare una seconda linea lungo il tidemark per fungere da controllo interno per il piano di ogni sezione (Figura 1C).
- Calcolare l'indice di fibrillazione della superficie articolare tibiale dividendo il perimetro della superficie articolare tibiale per il perimetro del marchio di marea.
NOTA: i perimetri Tidemark sono generalmente uguali tra i campioni, quindi la differenza nei perimetri della superficie articolare tra finzione e DMM era generalmente piccola indipendentemente dal fatto che venisse utilizzato l'indice assoluto di perimetro o fibrillazione.
- Misurazione delle aree dello spazio subcondrale e del midollo
- Misurare l'area dello spazio del midollo subcondro utilizzando la funzione Area delineando le regioni nella regione subcondrale macchiate solo con ematossia (cioè negativo per Fast Green) per determinare l'area totale dello spazio del midollo all'interno dell'osso subcondrale. Disegnare linee intorno al perimetro di queste aree per determinare l'area totale di tutto lo spazio del midollo all'interno dell'osso subcondrale tibiale (Figura 2B).
- Misurare l'area subcondrale totale utilizzando la funzione area delineando la regione tra la giunzione condro-osseo e il bordo superiore della piastra di crescita, che si estende lateralmente alle regioni degli osteofiti anteriori e posteriori (Figura 2B).
- Calcolare l'area dell'osso subcondrale sottraendo l'area dello spazio del midollo osseo subdolo dall'area subcondrale totale (Figura 2B,C).
- Misurazione delle aree osteofite anteriori e posteriori
- Per misurare l'area osteofite, tracciare l'osteofite anteriore e posteriore della tibia prossimale utilizzando la funzione Area (Figura 2B,E,F).
NOTA: gli osteofiti sono proiezioni ossee che si formano tra la cartilagine articolare e la piastra di crescita, anteriore o posteriore alla regione subcondrale. Le aree osteofite sui lati anteriori e posteriori della tibia sono determinate tracciando l'area anteriore o posteriore all'osso subcondrale. La giunzione tra gli osteofiti e l'osso subcondrale è chiaramente delineata da una linea di celle che si estende dalla cartilagine articolare alla piastra di crescita. La giunzione tra osteofite e sinovio è definita da una transizione tra tessuto osseo e tessuto fibroso.
- Per misurare l'area osteofite, tracciare l'osteofite anteriore e posteriore della tibia prossimale utilizzando la funzione Area (Figura 2B,E,F).
- Misurazione dello spessore sinoviale
- Misurare lo spessore sinoviale femorale anteriore utilizzando la funzione Area disegnando una linea dal punto di inserimento interno del sinovio anteriore sul femore verso il suo punto di attacco sul menisco (Figura 3B).
- Disegnare una seconda linea dall'inserimento esterno del sinovio sul femore verso il suo attaccamento al menisco (Figura 3B).
- Calcolare lo spessore sinoviale dividendo l'area sinoviale totale per il perimetro sinoviale.
8. Analisi statistica
- Raccogliere i parametri misurati e calcolare la media dei risultati delle tre sezioni rappresentative per ogni campione. Analizzare i dati utilizzando un test t di Student non accoppiato per confrontare due gruppi o ANOVA unidirezionali per confrontare tre o più gruppi.
- Visualizzare i dati come media : errore standard di media.
NOTA: La rilevanza statistica è stata raggiunta a 0,05.
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Representative Results
L'OA indotta da DMM si traduce in degenerazione della cartilagine articolare e perdita di condrociti
L'OA indotto da DMM ha determinato un aumento del punteggio OARSI rispetto ai topi farsi, caratterizzati distintamente dall'erosione superficiale e dalla perdita della cartilagine (Figura 1A,D). Il protocollo histomorphometry qui descritto ha rilevato diverse modifiche associate all'OA, tra cui una diminuzione dell'area totale della cartilagine e nell'area della cartilagine non calcolata (Figura 1A,B,E,G); riduzione del numero totale di condrociti; e, soprattutto, la perdita di matrice che produce condrociti (Figura 1H,I). Le modifiche alla superficie articolare, indicative della gravità dell'erosione, sono state valutate utilizzando l'indice di fibrillazione della cartilagine. Nel complesso, l'indice di fibrillazione è aumentato nei topi DMM (Figura 1C,K,L). Tuttavia, è anche importante notare che l'indice di fibrillazione può diminuire nell'OA di fase finale a causa della completa erosione della superficie della cartilagine, come discusso nel protocollo. Un aumento dell'indice di fibrillazione significa degenerazione della superficie della cartilagine articolare durante lo sviluppo e la progressione dell'OA. Questi risultati evidenziano la capacità del programma di analisi istomorfometrica di rilevare e quantificare i cambiamenti della cartilagine patologica che caratterizzano la progressione OA.
Valutazione di altre modifiche congiunte nell'OA indotta da DMM
L'OA colpisce i tessuti articolari diversi dalla cartilagine, e i cambiamenti patologici in questi tessuti svolgono un ruolo cruciale nella progressione della malattia. Qui, il metodo di analisi istomorfometrica descritto ha rivelato un aumento della zona ossea subcondrale e una riduzione dell'area dello spazio del midollo osseo nei topi DMM (Figura 2A–D), che indica la sclerosi ossea subcondrale29,30. Anche le aree osteofite anteriori e posteriori sono aumentate nei topi DMM (Figura 2E,F), suggerendo un rimodellamento dell'osso subcondrale in corso che funge da meccanismo compensativo per gestire i cambiamenti nel carico articolare nel sito di lesione29,30.
L'analisi istomorfometrica del sinovioha ha mostrato un aumento dello spessore sinoviale nei topi DMM (Figura 3A–C), che è un tipico risultato dell'infiammazione sinoviale associata all'OA e la diffusione delle citochine infiammatorie nello spazio articolare11,12,31,32,33,34.
Analisi della variabilità interuser tra il punteggio OARSI e la istomorfometria
Figura 4A non mostra alcuna significativa variabilità interutente sia di un'analisi istomorfometrica dell'area della cartilagine non calcolata (Figura 4A) che del punteggio OARSI (Figura 4B). Tuttavia, l'analisi istomorfometrica ha mostrato una differenza media estremamente bassa tra gli osservatori che vanno da -0,0001179–0,00120, portando ad una quasi completa sovrapposizione dei risultati ottenuti dai tre osservatori, mentre la differenza media tra gli osservatori era più alta nel punteggio OARSI che andava dai valori -0,3–0,3 con una chiara deviazione dei valori O1 dai valori O2 e O3.
Figura 1: Istomorfometria della cartilagine articolare tibiale e dei fenotipi condriociti articolari da chirurgia fittizia e topi DMM. (A) Superficie articolare tibiale macchiata con Safranin-O/Fast Green. (B) L'analisi istomorfometrica è stata utilizzata per tracciare l'area totale della cartilagine e l'area della cartilagine calcificata (arancione). La cartilagine superiore all'area tidemark è stata calcolata come cartilagine non calcolata (verde). I condrociti che producono matrici (bianchi) e i condrociti non producenti a matrice (magenta) sono stati conteggiati all'interno dell'area della cartilagine non calcolificata. (C) Il perimetro della superficie articolare tibiale è stato misurato tracciando la superficie articolare (linea blu) seguita dal segno di marea (linea viola) per determinare l'indice di fibrillazione. (D) Il punteggio OARSI è aumentato nei topi DMM. (E–L) Rappresentazione grafica delle aree della cartilagine quantificate e dei conteggi condrociti da topori finti e DMM. Rispetto ai topi farsi, i topi DMM avevano diminuito l'area totale della cartilagine tibiale (E), l'area della cartilagine calcificata tibiale (F), la cartilagine tibiale non calcolata (G), il numero totale di condrociti tibiali (H), la matrice tibiale che produce la cronologia, (I) e i condrioti tibiali non producenti condrociti (J). Rispetto ai topi farsi, i topi DMM avevano aumentato il perimetro della superficie articolare tibiale (K) e l'indice di fibrillazione della superficie articolare tibiale (L). Le immagini sono state scattate utilizzando l'ingrandimento 10volte. P > 0.05 , "P < 0.01", "P "lt; 0,001" e "P < 0.0001" utilizzando il test t non accoppiato con la correzione di Welch, i valori sono espressi come media SEM; n - 5/gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Itomorfometria dell'area del midollo osseo subcondrale e dell'area ossea subcondrale da finzione e topi DMM. (A) Cartilagine articolare tibiale e osso subcondrale macchiato con Safranin-O/Fast Green. (B) Le aree del midollo osseo subcondrale (verde), l'area ossea subconddrale (magenta), l'area osteofita anteriore (giallo) e l'area osteofita posteriore (grigio) sono state tracciate con software di istomorfometria computeri. (C–F) Diagramma delle aree istomormormetriche tra la farsa e i topi DMM. Rispetto ai topi finti, i topi DMM avevano un aumento dell'area ossea subcondrale tibiale (C) e aree osteofite anteriori e posteriori (E–F), così come una diminuzione dell'area del midollo osseo tibiale rispetto ai topi finti (D). Le immagini sono state scattate utilizzando l'ingrandimento 4x. Utilizzando il test t non accoppiato < con la correzione di Welch, il test t non accoppiato è stato possibile utilizzare il test t non accoppiato. I valori sono espressi come media: SEM; n - 5/gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Istomorfometria del sinovio da finto intervento chirurgico e topi DMM. (A) Sinovio macchiato con Safranin-O/Fast Green. (B) Lo spessore sinoviale è stato misurato tracciando la membrana sinoviale meniscofemorale anteriore attraverso l'aspetto anteriore dell'articolazione tibiofemorale (verde). (C) Rappresentazione grafica delle misurazioni dello spessore sinoviale utilizzando un software di istomorfometria calcolato. I topi DMM avevano un aumento dello spessore sinoviale rispetto ai topi farsi. Le immagini sono state scattate all'ingrandimento 20x. P < 0.001 utilizzando il test t non accoppiato con la correzione di Welch, i valori sono espressi come media : SEM; n - 5/gruppo; S - sinovio; F - femore; e M - menisco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: variabilità interuser nel punteggio OARSI rispetto all'analisi istomorfometrica. (A) Misurazioni dell'area cartilagineo uncalcolificate ottenute utilizzando la istomorfometria da tre osservatori accecati (O1, O2, O3). (B) Punteggi OARSI per finti e topi DMM ottenuti dai tre osservatori accecati. Le linee tratteggiate indicano il valore medio per ogni gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare Figura 1: Analisi istologica delle sezioni articolari tibiofemorali del topo macchiate Safranina e Fast Green. (A) Un'immagine di ingrandimento 4x dell'articolazione tibiofemorale. Le aree di messa a fuoco sono etichettate. (B) Un'immagine di ingrandimento 10x del ROI articolare tibiofemorale. Vengono visualizzate le superfici tibiali e femorali e le corna meniscali anteriori e posteriori. I menisci hanno approssimativamente le stesse dimensioni e il ROI di imaging è centrato sul vano giunto. (C) Un'immagine di ingrandimento 40x della superficie tibiale prossimale. La linea del marchio di marea è etichettata come la linea tra le zone della cartilagine non calcolate e calcificate. La giunzione osteocondrale è etichettata tra la fine della cartilagine calcificata e l'inizio dell'osso subcondrale. Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare 2: Configurazione del sistema di istomorfometria e calibrazione del bilanciamento del bianco della fotocamera. (A) Giunto tibiofemorale del topo visualizzato con ingrandimento 4x nella finestra del software con bilanciamento del bianco non impostato. Prendere nota della scheda delle impostazioni della fotocamera nella parte superiore dello schermo e della selezione nel menu a discesa per impostare il bilanciamento del bianco. (B) Giunto tibiofemorale del topo all'ingrandimento 4x con set di bilanciamento del bianco. Si noti il cambiamento nella colorazione e colorazione del campione, aumentando la capacità dell'utente di distinguere alcune aree del giunto tibiofemorale durante l'esecuzione di misurazioni. Clicca qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare 3: Configurazione del software istomorfometrica prima delle misurazioni dell'analisi istomorfometrica. Screenshot rappresentativo della finestra del software histomorphometric. Si noti che la sezione del ginocchio del mouse macchiato è centrata nella regione di misurazione (griglia gialla) e la scala di ingrandimento corretta per la regione è selezionata in modo da corrispondere all'obiettivo utilizzato al microscopio (cerchiato in rosso nell'angolo in alto a destra dello schermo). L'elenco dei parametri viene visualizzato nella colonna a destra dell'area di imaging e misurazione. La selezione di un parametro evidenzierà il parametro, quindi la fibrillazione tibiale è attualmente selezionata per essere misurata. La scheda Dati di riepilogo nella parte inferiore della finestra è dove le misure per ogni parametro per ogni campione saranno organizzate e salvate per essere esportate dopo il completamento di ogni misurazione dei parametri per ogni sezione. Clicca qui per scaricare questa figura.
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Discussion
Recenti ricerche sull'osteoartrite hanno migliorato la nostra comprensione del crosstalk tra i diversi tessuti all'interno dell'articolazione e il ruolo di ogni tessuto nell'inizio o nella progressione della malattia8,9,10,3535,36. Di conseguenza, è diventato evidente che la valutazione dell'OA non dovrebbe limitarsi all'analisi della cartilagine, ma dovrebbe includere anche l'analisi dell'osso subcondrale e del sinovio. Nonostante ciò, la cartilagine articolare è stata l'obiettivo primario del punteggio semiquantitativo di OA15,37,38. Anche se la istomorfometria computerizzata è già stata applicata a varie aree della ricerca muscolo-scheletrica39,40,41,42,43,44, c'è una lacuna insoddisfatta nel descrivere un protocollo per analizzare con precisione e riproducibile modifiche discrete alla moltitudine di tessuti all'interno del compartimento giunto del ginocchio durante oA., L'applicazione di misurazioni dell'analisi istomorfometrica per quantificare i cambiamenti alla cartilagine, all'osso subcondrale e al sinovio fornisce una valutazione più olistica dei cambiamenti primari e secondari nelle articolazioni OA.
Qui, descriviamo per la prima volta un protocollo dettagliato che utilizza un software di analisi istomorfometrica computerizzato e semiautomatizzato per quantificare i cambiamenti patologici in diversi compartimenti articolari e valutare lo sviluppo, la progressione o la regressione di OA. Durante la preparazione del campione occorre prestare attenzione, poiché le macchie Safranin-O e Fast Green chiare sono essenziali per limitare l'ambiguità durante il tracciamento e l'assunzione di misurazioni con software istomorfometrico. Si consiglia di utilizzare nuove soluzioni di colorazione per ogni lotto di diapositive. Inoltre, la selezione delle diapositive per la colorazione deve avvenire a livelli coerenti tra i blocchi. Il primo scivolo deve essere prelevato ad un livello simile tra i campioni, idealmente non appena le corna meniscali anteriori e posteriori iniziano a separarsi.
Durante l'OA, la cartilagine totale e le aree cartilagini non calcolate diminuiscono a causa della fibrillazione della cartilagine e della degenerazione. In grave OA, può verificarsi anche una degenerazione completa della cartilagine calcificata. Il protocollo evidenzia il significato di determinare il fenotipo di condrociti come valutazione della progressione oA per la valutazione della segnalazione anabolica contro catabolica nella cartilagine. Il numero totale di condrociti e il numero di condrociti che producono matrice (anabolizzanti) sono ad alto contenuto nella cartilagine normale e basso nella cartilagine OA, dove la maggior parte dei condrociti esistenti nell'OA sono matrice non producendo (catabolica). È importante sottolineare che questo parametro essenziale nel campo della scoperta terapeutica OA non viene valutato dai sistemi di punteggio Di OARSI o Mankin. Alcuni interventi che non solo preservano l'area della cartilagine e il numero di condrociti, ma promuovono anche il fenotipo anabolizzante condrocito possono essere approcci terapeutici più efficaci.
Il protocollo qui descritto fornisce anche un metodo per misurare quantitativamente i sottili cambiamenti nelle fibrillazioni superficiali della cartilagine presenti nell'OA da lieve a moderato. Un maggior numero di fibrillazioni significa una maggiore misurazione perimetrale dovuta alla presenza di indentazioni nella superficie articolare. Pertanto, il perimetro tibiale della superficie articolare e l'indice di fibrillazione sono bassi nella cartilagine normale, intermedio in lieve OA a causa di alcune fibrillazioni, ad alto contenuto di OA moderato a causa di più fibrillazioni, ma di nuovo basso nel grave OA a causa della completa degenerazione della cartilagine e perdita.
Rimodellamento osseo subcondrale e sclerosi sono segni patologici caratteristici dell'OA, con conseguente riduzione dell'area dello spazio del midollo subcondro e aumento dell'area ossea subcondaria8,9,10,29,30. La quantificazione dei cambiamenti nell'area ossea subconddrale e nell'area spaziale del midollo subcondro descritta nel protocollo dimostra l'importanza di comprendere i cambiamenti multitessuto come componente trainante per la natura complessa dello sviluppo e della progressione della malattia di OA. La misurazione delle aree osteofite anteriori e posteriori fornisce importanti informazioni sulla scala del rimodellamento osseo che si verifica all'interno dell'articolazione. L'area osteofita è estremamente piccola nelle ginocchia omati ed è aumentata a causa della formazione di osteofiti in OA. La misurazione dell'area osteofita anteriore differiva leggermente dalla misurazione dell'area osteofita posteriore a causa della natura severa del rimodellamento osseo che si verificava nella regione mediale del ginocchio, vicino al sito di lesioni DMM.
Infine, questo protocollo delinea una valutazione quantificabile dei cambiamenti nella membrana sinoviale. Lo spessore sinoviale è basso nelle articolazioni fittizie e aumenta di OA. L'infiammazione nell'OA porta all'ispessimento della membrana sinoviale per aumentare la consegna di citochine infiammatorie e altri fattori allo spazio articolare10,11,1231,32. Pertanto, è essenziale valutare l'infiammazione articolare come fattore modulante della progressione della malattia di OA.
L'uso del software histomorfometria è limitato dalla disponibilità dell'hardware: monitor touchscreen o tablet con stilo sono assolutamente necessari data la quantità di ricalco manuale necessaria per l'acquisizione di misurazioni accurate. Il tentativo di misurare piccole aree con il software histomorfometria può anche essere limitante, in quanto la dimensione della penna è limitata a un diametro. Mentre questa incapacità di misurare piccole aree può essere scomoda, le aree articolari misurate sono facilmente definite con lo strumento area, e la bassa discriminazione del software fa una differenza trascurabile nella misurazione finale.
Va anche notato che la variabilità interindustriale è sempre un settore di preoccupazione per quanto riguarda l'attuazione di un protocollo quantitativo affidabile e riproducibile. Stabilire un protocollo di imerfometto efficace, riproducibile e rigoroso richiede la limitazione di potenziali variabili di composizione all'interno dell'analisi sperimentale, tra cui la riduzione della variabilità interuser. Tuttavia, a seguito di una breve sessione di formazione (circa 30 min) con il software, i membri del laboratorio sono stati in grado di generare misurazioni altamente coerenti e riproducibili, dove la distribuzione delle misurazioni tra gli utenti riflette più di una sovrapposizione diretta che rappresenta quasi nessuna variabilità interuser. È importante sottolineare che questo protocollo di istomorfometria dimostra un metodo efficiente per quantificare anche le differenze discrete tra campioni di finzione in modo altamente riproducibile.
Il sistema di punteggio OARSI è una misura di valutazione comunemente usata per i danni alla cartilagine nei pazienti affetti da OA e nei modelli di murinisperimentali 15. Il sistema di punteggio si basa su una scala di numeri interi concentrata principalmente sull'estensione delle fessure/erosione o della superficie articolare. Anche se non abbiamo trovato alcuna significativa variabilità interuser con i punteggi OARSI nel nostro esperimento, c'era ancora una differenza media più alta tra gli osservatori, rispetto a quasi nessuno nel protocollo di istomorfometria descritto. Pertanto, stabilire questo protocollo riproducibile per l'analisi istomorfometrica dei parametri definiti consente misurazioni altamente coerenti di ogni campione, anche tra più utenti, rimuovendo parte della natura soggettiva dell'analisi del campione.
Il sistema di punteggio standardizzato OSI è un punto di riferimento per la ricerca OA. Tuttavia, la natura limitata basata sul punteggio del sistema non consente la quantificazione dei cambiamenti sottili che si verificano all'interno dell'articolazione. La valutazione congiunta ampliata descritta in questo manoscritto utilizzando il software histomorfometria fornisce una caratterizzazione migliorata e meno soggettiva della gravità dell'OA. Questo protocollo è ottimizzato per i topi che hanno subito un'induzione chirurgica di OA. Le procedure e le tecniche possono tuttavia essere applicate per la valutazione dell'OA all'interno di altri modelli e ipotesi.
In sintesi, il protocollo qui descritto fornisce una guida chiara per un approccio quantitativo semiautomatico rigoroso e riproducibile per studiare la patologia OA o valutare gli interventi terapeutici.
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Disclosures
Nessuno
Acknowledgments
Vorremmo riconoscere l'assistenza del personale del Dipartimento di Medicina Comparata e del nucleo molecolare e istopatologia del Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Fonti di finanziamento: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
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