Optimering av renal organoid och organotypisk kultur för vascularization, utökad utveckling och förbättrad mikroskopi Imaging

Summary

Detta arbete beskriver två metoder för att studera organutveckling, en förbättrad xenotransplantation setup på chorioallantoic membran (CAM) från aviära embryon som möjliggör vascularization av odlade embryonala organ och organoider och en ny fast z-riktning organodlingsmetod med modifierade experimentella tillstånd som möjliggör högupplösning av time-lapse confocal imaging.

Abstract

Embryonala njurorganotypiska kulturer, och särskilt pluripotenta stamceller-härledda njurorganoider, är utmärkta verktyg för att följa utvecklingsprocesser och modellering njursjukdom. Modellerna begränsas dock av brist på vascularization och funktionalitet. För att ta itu med detta utvecklades ett förbättrat protokoll för metoden för xenografting celler och vävnader till chorioallantoic membranet (CAM) av en aviär embryo att få vascularization och restaurering av blodflödet utvecklats. Transplantaten är överlagrad med skräddarsydda minireservoirs som fixar proverna till CAM och förser dem med odlingsmedium som skyddar ympkvistarna från torkning. Den förbättrade odlingsmetoden gör att xenografts kan växa i upp till 9 dagar. Manuskriptet beskriver också hur man ger optimala förutsättningar för långsiktig konfokal avbildning av njurorganoider och organotypiska kulturer med hjälp av den tidigare publicerade Metoden Fixed Z-Direction (FiZD). Denna metod komprimerar försiktigt ett embryonalt organ eller organoid mellan ett glasöverdrag och membran i en stor mängd medium och ger utmärkta förutsättningar för avbildning i upp till 12 dagar. Tillsammans tillåter dessa metoder vascularization och blodflödet till njurorganoider och organotypiska njurkulturer med förbättrad confocal imaging. De metoder som beskrivs här är mycket fördelaktigt för att studera grundläggande och tillämpade funktioner i njurarna ex vivo. Båda metoderna är tillämpliga på olika typer av vävnader och organoider.

Introduction

Organotypic kultur av embryonala njurar blev en viktig modell för att studera nephrogenesis decennier sedan^1,2,3. Njurorganoider utgör ett avancerat modellsystem för att studera utveckling av friska och sjuka njurar⁴. Den största nackdelen för båda metoderna är dock att ingen metod rekapitulerar njurens huvudsakliga funktion: blodfiltrering. Nefroner och njurvaskulatur utvecklas i njurorganoider och organotypiska kulturer på samma sätt som tidig utveckling av in vivo; den glomeruli som bildas in vitro förblir dock avascular⁵. Vascularization av ex vivo embryonala njurar och njurmedicinska organoider har tidigare visats i transplantation experiment endast under in vivo villkor. Till exempel, transplantation av mänskliga pluripotenta stamceller-härledda njurorganoider under en mus njure kapsel möjliggör utveckling av nefroner i organoid till ett funktionellt stadium⁶.

En mellanliggande metod mellan rent in vitro-kulturer och in vivo transplantationsmetoder är xenotransplantation till CAM av fågelembryon. Vascularization av intakt mus njure primordia har visats tidigare med hjälp av detta system^7,8. Det visades dock också att den njurmedicinska vaskulaturen i den xenotransplanterade murinjuren härleddes från värdetotelet, inte transplantatet⁹. Denna observation minskade avsevärt potentialen hos chimär (avi-däggdjur) modeller av embryonala njurar för att studera utvecklingen av njurmedicinska vasculature, eftersom de experimentella villkoren var icke-vilseledande för överlevnaden av givaren-härledda endotelceller.

Presenteras i den första delen av detta protokoll är en förbättrad metod för odling av mus embryonala njurar på CAM av fågelägg, som kombinerar mikromiljöförhållanden organotypic kultur och xenotransplantation. Den största förbättringen av tidigare metoder är att istället för att placera musen embryonala njurar och njurorganoider direkt på CAM, implantation området är överlagrad med permeabla minireservoirs fyllda med odlingsmedium som levererar den transplanterade vävnaden med näringsämnen och skydda den från torkning. Försökens framgång ökar avsevärt och förutsättningarna för utveckling av givarens vaskulatur förbättras. Tillämpning av denna metod till xenotransplant kulturer resulterar i utvecklingen av glomerular vasculature består av endogena endotel celler från givaren njurar.

Detaljerad analys av cellulär morfogenesis är en annan viktig tillämpning av njurkultur modeller. Tidigare rapporterade metoder för time-lapse bild förvärv av njurkulturer är tillräckliga endast för analys av övergripande morfologi och mönster av embryonala njurar, men inte för att spåra enskilda celler¹⁰. Nyligen beskrevs en ny fast Z-Direction (FiZD) metod som syftar till hög upplösning confocal 3D time-lapse imaging av njurorganoider och organotypiska kulturer¹¹. I denna metod komprimeras organoiderna och embryonala organen försiktigt mellan ett glasskydd och ett genomsläppligt membran i ett transwellskär i en specialdesignad platta tills provets tjocklek når 70 μm, vilket ger optimala optiska förhållanden för avbildning. I den andra delen av metoderna beskrivs ett detaljerat protokoll för tillverkning av en specialdesignad platta och installationen av FiZD-experiment för långsiktig organoidavbildning.

Protocol

Djurvård och djurförsök var förenliga med den finska nationella lagstiftningen för användning av försöksdjur, Europeiska konventionen om skydd av ryggradsdjur som används för försök och andra vetenskapliga ändamål (ETS 123) och EU-direktiv 86/609/EEG.

1. Tillverkning av minireservoirs för odling av mus embryonala njurar och njurorganoider på kyckling CAM och inrättaxenotransplantation experiment

1. Använd transwell cellodling skär avsedda för 6 väl eller 12 väl plattor.
   OBS: Beroende på det specifika experimentet kan stora eller små minireservoirs användas. Det är bäst att använda små minireservoirs för xenografting upp till åtta embryonala njurar eller när flera minireservoirs kommer att placeras på samma kyckling embryo (t.ex. experimentera och kontrollera prover på samma kyckling CAM).
2. Skär ner sidorna av skären med hjälp av en roterande multiverktyg med ett cirkelsågblad eller en handsåg för att skapa en 2 mm hög plastring med ett genomsläppligt membran fäst vid den.
3. Polera kanterna på dessa minireservoirs med en skalpell eller en vass kniv.
4. Sterilisera minireservoirs i 70% etanol i minst 1 h.
5. Tvätta minireservoirs i autoklavererat dubbeldestillerat vatten och låt dem torka i en laminär huva.
6. Skölj minireservoirs i PBS och odlingsmedium (högglukos DMEM/10% FBS/1% penicillin-streptomycin).
7. Placera behållaren i en petriskål, ovanpå en droppe (600 μL/400 μL) odlingsmedium med membranet uppåt.
8. Ordna dissekerade ex vivo embryonala njurar eller njurorganoider jämnt på membranet med hjälp av en pipett eller ett glas kapillärrör. Undvik att lämna mycket vätska runt njurarna.
9. Låt proverna fästa vid membranet i en cellodlingskuvös vid 37 °C och 5 % CO_2.
   OBS: Upp till åtta E11.5 embryonala mus njurar eller njure organoider kan ordnas på den lilla insatsen. Det stora skäret rekommenderas om antingen större bitar av embryonal vävnad kommer att användas för xenotransplant eller en cell-hydrogel blandning på ett större område av CAM.
10. Ta 8-dagars gamla ex ovo odlade embryonala kycklingar beredda enligt tidigare publicerade metoder ur cellkulturen inkubator^12,13.
11. Överför minireservoirs till CAM så att ympkvistarna är vända mot CAM, och membranet överlägg dem. Placera minireservoirs i periferin av CAM, så att de inte täcker kyckling embryot.
    OBS: Vid användning av mindre minireservoirs tillverkade av transwellskär för 12 brunnsplattor kan upp till tre minireservoirs placeras på en CAM.
12. Tillsätt 500 μL (6 brunnsinsats) eller 300 μL (12 brunnsinsats) av odlingsmediet till minireservoirsna.
13. Odla proverna på kyckling CAM i högst 9 dagar. Byt ut odlingsmediet i minireservoirs dagligen.
    OBS: Vascularization av proverna kan observeras så snart som 24-48 h efter transplantation.

2. Tillverkning av specialdesignade plattor och inrätta FiZD kulturer

1. Borra hål med diametern 20 mm i botten av en 6-brunnsplatta.
   OBS: För FiZD-experiment, använd 6 brunnsplattor med ett 16 mm brunnsdjup (anges i tabell över material).
2. Polera kanterna på hålen (särskilt på ovansidan) med hjälp av en borrmaskin med en diskborre, en skalpell eller en vass kniv.
3. Sterilisera plattorna i 70% etanol i minst 1 h.
4. Tvätta plattorna i autoklavererat dubbeldestillerat vatten och låt dem torka i sterila förhållanden.
5. Tvätta 22 mm x 22 mm glasskydd med 70 % etanol eller rengör dem enligt det publicerade protokollet av Saarela et al.¹¹.
6. Limma täcken till den övre sidan av hålen i 6 brunnsplattor med ett giftfritt vävnadslim. Applicera lim runt hålet och placera försiktigt täcket för att täcka det. Låt limmet torka.
7. Inspektera plattorna under ett stereomikroskop och ta bort överflödigt torkat lim från täckens yta om det behövs.
   OBS: Kontrollera att det inte finns något lim ovanför täcket för att säkerställa jämn komprimering av proverna.
8. Blanda polystyren pärlor (70 μm partikelstorlek) med en lika stor volym hydrogel. En volym på 50–100 μl per brunn räcker.
   OBS: Förvara blandningen av hydrogel- och polystyrenpärkor på is.
9. Placera ett transwellskär under ett dissekerande mikroskop med membranet upp.
10. Ordna proverna (t.ex. ex vivo embryonala njurar eller njurorganoider) jämnt på membranet.
11. Tillsätt hydrogel/polystyren pärla blandningen bredvid proverna noggrant för att undvika skador på ömtåliga vävnader.
12. Vänd transwellinsatsen så att membranet med proverna monterade på den är vänd nedåt.
13. Placera försiktigt insatsen i en brunn av den modifierade 6-brunnsplattan och tryck försiktigt ner den så att proverna komprimeras till pärlornas nivå.
    OBS: Följ förloppet för komprimeringen med hjälp av ett mikroskop.
14. Håll insatsen något pressad till brunnen med en hand och fäst den på plattan genom att smälta plast med lödkolv på tre punkter i insatsens periferi.
15. När insatsen är fast på plattan, tillsätt 2 ml odlingsmedium (DMEM/10% FBS/1% penicillin-streptomycin) till brunnen och fortsätt montera de återstående brunnarna i plattan på samma sätt.
16. Överför den färdiga plattan till en inkubator på scenen av ett inverterat mikroskop för timelapse-avbildning.
17. Utför timelapse-avbildning av exemplen med lämpliga experimentella inställningar.
    OBS: Byte av odlingsmedium i plattans brunnar under tidsfördröjningsexperiment är inte nödvändigt, men kan enkelt göras genom hålen på skärets sidor.

Representative Results

Cam kultur protokoll presenteras här möjliggjorde mycket effektiv vascularization av njurorganoider och embryonala njurar som ett resultat av xenotransplantation på kyckling CAM (Figur 1, Film 1). Minireservoirs som innehåller odlingsmedium levererade näringsämnen till donatorvävnaden och skyddade den från torkning under den tidsperiod som föregick korrekt vaskularisering. Denna metod gav tillåtande villkor för givaren härledda endotelceller att växa. Njursvaskulatur i de transplanterade njurarna och organoiderna representerades därför mestadels, men inte uteslutande, av donatorspecifika celler (figur 2B,C,F). Mognare glomerular vasculature erhölls i njurar och njurorganoider transplanteras till CAM än i renal organotypic kulturer (Figur 2D,E).

FiZD-protokollet är en metod som utformats för långsiktig time-lapse imaging av ex vivo embryonala njurar och njurorganoider med hög upplösning confocal mikroskopi. I det klassiska organotypiska kulturprotokollet designat av Trowell¹⁴placeras ett prov på ett poröst filter, med stöd av ett metallgaller, och hålls vid luftvätskegränssnittet (figur 3A). Denna metod är inte optimal antingen för en upprätt eller inverterad typ av mikroskop. Den metod som presenteras här var speciellt utformad för att fungera med ett inverterat mikroskop för bildbehandling. Provet var immobiliserat mellan ett glasöverdrag underifrån och ett poröst membran av transwellinsats (se ovan) (figur 3B). Det optimala avståndet mellan membranet och täcket var ~70 μm. Polystyren pärlor användes som distanser för att ställa in tjockleken på preparatet i detta intervall (figur 3B).

Det finns inga kommersiellt tillgängliga 6 brunnsplattor där glasskyddsglaset ligger på den övre ytan av brunnens botten. Därför har ett protokoll utvecklats för tillverkning av specialdesignade plattor som har denna funktion (figur 3B). Figur 4 visar den representativa morfologin hos en embryonal njurkultur (figur 4A,D–F)och njurorganoider (figur 4B,C). Film 2 representerar resultaten av högupplöst time-lapse imaging av endotelceller i mus embryonala njure odlade i en FiZD setup. Den högra panelen i film 2 visar att både distribution och migrering av enskilda celler kunde observeras med den här metoden.

Figur 1: Murine embryonala njure xenotransplanteras till kyckling embryot CAM. Xenotransplantation av E11.5 embryonala mus njurar i 8-dagars gamla ex ovo kyckling embryo; en murine embryonala njure odlades i 7 dagar på CAM. Skala bar = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Film 1: Blodflödet i murine embryonala njure efter xenotransplantation till kyckling embryo CAM. En murine E11.5 embryonala njure var xenotransplanted till CAM av en 8-dagars gamla kyckling embryo och odlade i 7 dagar. Filmen visar kyckling blodflödet i xenograft på dag 7. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)

Figur 2: Murine embryonala njure xenotransplantation på kyckling embryo CAM. Murine E11.5 embryonala njurar (m) odlades som en organotypisk kultur (dvs. kontroll) eller xenotransplanterade till en 8-dagars gammal embryonal kyckling CAM (c) (dvs. experiment). Efter 5 dagars embryonal njurodling fixerades och färgades kontroll- och försöksproverna för den endotelmarkör cd31 (röd) (A–E) och kärnor (Hoechst; blå) (D, E). (C) Anastomoser mellan kyckling och rått blodkärl (pilspetsar). (D,E) Ett enda konfokalt segment från mitten av nefronen visas. F)Xenotransplantation av murine E11.5 embryonal njure till transgen GFP-kyckling CAM i 7 dagar, färgas för CD-31 (röd). Skalstänger = A–B 100 μm; C-E 20 μm; F 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Fast Z-riktningsodlingsmetod. (A)Traditionell odlingsmetod där provet växer på ett poröst membran som stöds av ett rutnät och håller explanten vid luftvätskegränssnittet. b) I den nya FiZD-installationen komprimerades provet försiktigt mellan glasskydden och ett transwell poröst membran. Polyesterpärlor kontrollerade provets tjocklek justerad i z-riktning. Denna siffra ändrades från Saarela m.fl.¹¹. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Embryonala njurar och njurorganoid utveckling i den nya FiZD kulturmetoden. Embryonala njurar (A, D-F) och njure organoider (B-C) odlades med hjälp av den nya FiZD setup. (A)Brightfield bild av en intakt embryonal mus njure på dag 7 av FiZD kulturen. (B)Brightfield bild av en mus njure organoid på dag 7 av FiZD kultur. (C)MtmG (röd) mus njure organoid odlades i 4 dagar med den nya FiZD setup. Ögonblicksbild av timelaps-bildstacken visar Wnt4Cre-aktiveratGFP-uttryck (grön) i de utvecklande nefronerna. (D)Mus embryonala njure odlades i 7 dagar med den nya FiZD setup. Six2 (grön) och Troma-1 (Krt8, röd) färgning visade nefron prekursorer och ureteric knopp (UB) bifurkationer, respektive. (E)Mus embryonala njur rudiment odlades i 12 dagar med den nya FiZD setup. Det var färgas med Troma-1 (röd) och Nephrin (grön), och visade UB bifurkationer och podocyter, respektive. (F)Samma prov som i(E)med hög effekt förstoring av Troma-1 + (röd) UB och Nephrin (grön) + podocyter. Denna siffra ändrades från Saarela m.fl.¹¹. Skalstänger = A-D, F 100 μm; E 1,000 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Film 2: Renal endotel celler märkta med GFP växa i den nya FiZD setup och kan observeras med hög upplösning confocal mikroskopi. Embryonala njurar från E11,5 mTmG; Tie1Cre möss dissekerades och odlas 6 dagar med den nya FiZD setup. Filmen visar Tie1Cre-induceradGFP-uttryck i endotelceller. En stapel med 20 z-lager togs med ett 10x/0.45 mål, med bilder som erhållits var 15:e minut. I filmen slås fem GFP z-lager och ett ljust fält focal plan samman. Panelen till höger visar en närbild av en utvecklande njure. Endotelceller migrerar in i vaskulär kluven av S-form skede nefroner kan ses. I panelen till höger slås GFP z-lager och ett ljust fältflagplan samman. De snabbt rörliga cellerna är troligen makrofager¹⁵. GFP-signalen uttrycktes också av vissa blodkroppar. Voxel storlek 0,69 μm x 0,69 μm x 4,13 μm. Denna film har ändrats från Saarela et al.¹¹. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)

Discussion

Två detaljerade protokoll presenteras som förfina den klassiska njurmedicinska organotypic kultur metod och möjliggöra vascularization, utökad utveckling och optimal 4D (dvs. 3D-bild och tid) bildframställning av ex vivo embryonala njurar och organoider. I det här avsnittet beskrivs de kritiska stegen i metoderna och felsökningen beskrivs.

Den betydande skillnaden mellan andra CAM kultur metoder och denna förbättrade kyckling CAM kultur metod är användningen av skräddarsydda minireservoirs i xenografting av embryonala njurar och njure organoider till CAM. Membranet botten av den modifierade transwell insatsen pressar proverna mot kyckling CAM och håller dem på plats. Skärets sidor fungerar som en reservoar för odlingsmedium som skyddar transplantatet från torkning. Xenografting till ex ovo odlade embryonala kyckling CAM rekommenderas starkt, eftersom denna metod exponerar ett större område av CAM där minireservoir kan placeras och gör det enkelt att visuellt följa vascularization processen^12,13.

En nackdel med kyckling CAM kulturmetoden är att tidsfönstret för att utföra xenotransplantation är begränsad till 8-9 dagar när CAM av kyckling embryot fungerar innan det börjar förnedra. Transplantat som behöver en längre tid att utveckla bör därför vaskulariseras genom xenotransplantation till en annan vävnad (t.ex. mus njure kapsel)⁶. Serial xenotransplantation av givaren vävnad kan vara en lösning på denna långa inkubationstiden problem. Metoden skulle kunna anpassas för time-lapse imaging av vascularization och utveckling av transplantatet, men först kravet på stabilisering av minireservoir och CAM för långsiktig avbildning måste åtgärdas. Den största fördelen med denna förbättrade njurlymfknutor xenotransplantation protokoll till kyckling CAM är att metoden ger förutsättningar för givaren-härledda endotelceller att frodas.

FiZD-protokollet beskriver en metod som utformats för långsiktig time-lapse imaging av ex vivo embryonala njurar och njurorganoider med hög upplösning confocal mikroskopi. För installationen är det viktigt att måtten på brunnen och infoga matchning. När ett täckslip limmas på botten av en 6-brunnsplatta och insatsen placeras på brunnen, bör skärets membran vidröra glaset. Sedan, när kulturen sätts upp, kommer distanspärlorna att bestämma membranets position och därmed tjockleken på det odlade organet eller organoiden. Av denna anledning är det viktigt att ta bort överflödigt lim och kontrollera att inget material begränsar insatsen från att röra täckglaset. Det är också viktigt att använda giftfritt vävnadslim för att fästa täckglaset. Observera att limmet inte fäster särskilt starkt, så det är viktigt att hantera plattorna noggrant. Plattorna kan återanvändas, och om täckglaset lossnar under tvättsteg, kan det limmas tillbaka på.

FiZD-avbildningsmetoden gör det möjligt att studera nephrogenesis på en cellnivå. Den höga kvaliteten på högupplösta time-lapse bilder gör det möjligt att tillämpa automatiserade cell segmentering för att studera cellulärt beteende i njurorganoider och njurkulturer. Flera prover som finns i olika brunnar av en 6 brunnsplatta kan studeras samtidigt under olika kulturförhållanden. Tekniken kan enkelt ändras för olika storlekar och typer av vävnad och organoider genom att ändra storleken på distanspärlorna; Detta visades med äggstockscellkulturer¹⁴. Som en ytterligare optimering av denna metod, kombinera FiZD setup med nyligen publicerade mikrofluidiska metoder¹⁶ kan vara mycket fördelaktigt för högupplöst mikroskopisk analys av cellulära morphogenesis i senare stadier av njure utveckling.

En fördel med FiZD-metoden är att det finns gott om odlingsmedium tillgängligt och det är inte nödvändigt att ändra den under 1 veckas bildbehandling. Ändå, om en media förändring behövs, kan mediet enkelt ändras från en öppning i väggen på insatsen. FiZD-metoden är också överlägsen andra organodlingsmetoder genom att den för exemplaret närmare mikroskopmålet. I andra allmänt använda odlingsmetoder finns ett membran eller filter och en glasplatta botten mellan det avbildade provet och målet, vilket förbjuder korrekt högupplöst avbildning¹⁷. Med FiZD-metoden är det möjligt att förvärva högupplösta bilder av levande vävnader.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Spade Drill Bit	Bosch	2609255277	For drilling 20 mm diameter holes
Automatic Egg Turner	OLBA B.V., Netherlands	AT-42	For incubation of eggs before ex ovo setup.
Cell Incubator	Panasonic	13090543	Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cell Incubator	SANYO	10070347	Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2
Cellstar 6-well Plate	Greiner	M9062	16 mm depth of wells to match with the inserts
Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool	Dremel	SC690
Confocal Microscope	Zeiss	LSM780
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts	Corning	10301031	For 6-well plates. 40 µm pore size
Countersink Drill Bit	Craftomat, Bauhaus	22377902	For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS)
Disposable Glass Capillary Tube	Blaubrand	7087 33
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0501
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Drilling Machine	Bosch	GSR 18 V-EC Professional
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D777	High glucose
Egg Incubator Compact S84	Grumbach, Germany	8012	For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60%
Ethanol (70%)	VWR
Fertilized Eggs	Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland		Hy-Line White and Nick Chick
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Forceps DUMONT #5	Dumont	#5SF
Glass Coverslips	Menzel-Gläser	Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##	22x22 mm
Histoacryl Glue	Braun	1050052
Matrigel	Corning	356230
On-stage Incubator	Okolab		Boldline, custom made
PBS -/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Biowest	X0520-500	Washing the mini reservoirs.
Penicillin and Streptomycin	Sigma	P4333
Polystyrene Beads	Corpuscular	1000263-10	70 µm in diameter
Rotary Multi Tool System	Dremel	4000
Soldering Iron	Weller	TCP S	Heated glass capillary can also be used
Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	665641
Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane	Greiner Bio-One	657610