Summary
Bu çalışma, organ gelişimini incelemek için iki yöntem, kültürlü embriyonik organ ve organoidlerin vaskülarizasyonuna olanak sağlayan kuş embriyolarından koryoallantoik membran (CAM) üzerine geliştirilmiş bir ksinotransplantasyon kurulumu ve yeni bir sabit z-yönü yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı konfokal görüntüleme sağlayan modifiye deneysel koşulları ile organ kültürü yöntemi.
Abstract
Embriyonik böbrek organotipik kültürler, ve özellikle pluripotent kök hücre kaynaklı böbrek organoidler, gelişimsel süreçleri takip etmek ve böbrek hastalığı modelleme için mükemmel araçlardır. Ancak, modeller vaskülarizasyon ve işlevsellik eksikliği ile sınırlıdır. Bunu gidermek için, bir kuş embriyosundaki koryoallantoik membrana (CAM) ksenogreftleme yöntemi için geliştirilmiş bir protokol geliştirilmiş bir protokol geliştirilmiş tir. Greftler, örnekleri CAM'a sabitleyen ve greftleri kurumaya karşı koruyan kültür ortamı sağlayan özel yapım minirezervuarlarla kaplanır. Geliştirilmiş kültür yöntemi ksenogreftlerin 9 güne kadar büyümesini sağlar. El yazması ayrıca, daha önce yayınlanmış Sabit Z-Yön (FiZD) yöntemini kullanarak renal organoidlerin ve organotipik kültürlerin uzun süreli konfokal görüntülemesi için en uygun koşulların nasıl sağlandığını da açıklamaktadır. Bu yöntem, embriyonik bir organı veya organoidi cam bir kapak kayması ile membran arasında büyük miktarda orta derecede sıkıştırır ve 12 güne kadar görüntüleme için mükemmel koşullar sağlar. Birlikte, bu yöntemler geliştirilmiş konfokal görüntüleme ile renal organoidler ve organotipik böbrek kültürleri vaskülarizasyon ve kan akışını sağlar. Burada açıklanan yöntemler böbreklerin temel ve uygulamalı fonksiyonlarını incelemek için son derece yararlıdır ex vivo. Her iki yöntem doku ve organoidler çeşitli uygulanabilir.
Introduction
Embriyonik böbreklerin organotipik kültür on yıllar önce nefrogenez çalışma için önemli bir model oldu1,2,3. Böbrek organoidleri sağlıklı ve hastalıklı böbreklerin gelişimini incelemek için gelişmiş bir model sistemi temsil4. Ancak her iki yöntemin de ana dezavantajı, her iki yöntemin de böbreğin ana işlevini yeniden özetlemesidir: kan filtrasyonu. Nefronlar ve renal vaskülatür renal organoidlerde ve organotipik kültürlerde gelişimin erken evresine benzer şekilde gelişir; ancak, in vitro oluşan glomeruli avaskülerkalır 5. Ex vivo embriyonik böbreklerin ve renal organoidlerin vaskülarizasyonu daha önce sadece in vivo koşullarda yapılan transplantasyon deneylerinde gösterilmiştir. Örneğin, bir fare böbrek kapsülü altında insan pluripotent kök hücre kaynaklı böbrek organoidlerinin nakli fonksiyonel bir evre6organoid nefron gelişimini sağlar.
Tamamen in vitro kültürler ile in vivo transplantasyon yöntemleri arasında ara yaklaşım, kuş embriyolarının CAM'ine ksenotransplantasyondur. Bozulmamış fare böbrek primordia vaskülarizasyonu daha önce bu sistem kullanılarak gösterilmiştir7,8. Bununla birlikte, ksenonakledilen murine böbrekteki renal vaskülatürin greft9'dandeğil, konak endotelden türetildiği gösterilmiştir. Bu gözlem, embriyonik böbrek modellerinin böbrek vaskülatürgelişimini inceleme potansiyelini önemli ölçüde azaltmıştır, çünkü deneysel koşullar donör kaynaklı endotel hücrelerinin hayatta kalması için müsamaha kariyetsizdir.
Bu protokolün ilk bölümünde sunulan kuş yumurtalarının CAM fare embriyonik böbreklerin ekimi için geliştirilmiş bir yöntemdir, organotipik kültür ve knenotransplantasyon mikroçevre koşulları birleştirerek. Önceki yöntemlerde en önemli gelişme, fare embriyonik böbrekleri ve böbrek organoidlerini doğrudan CAM'e yerleştirmek yerine, implantasyon alanının nakledilen dokuyu besleyen kültür ortamıyla dolu geçirilebilir minirezervuarlarla kaplanmasıdır. besinlerle kuruyup kurutularak korur. Deneylerin başarı oranı önemli ölçüde artar ve donör kaynaklı vaskülatür gelişimi için koşullar geliştirmek. Bu yöntemin ksenotransplant kültürlerine uygulanması, donör böbreklerden endojen endotel hücrelerinden oluşan glomerüler vaskülatür gelişimini ile sonuçlanmaktadır.
Hücresel morfogenezin detaylı analizi böbrek kültürü modellerinin bir diğer önemli uygulamasıdır. Böbrek kültürlerinin zaman atlamalı görüntü edinimi daha önce bildirilen yöntemler sadece genel morfolojisi ve embriyonik böbrek desenleme analizi için yeterlidir, ancak tek tek hücreleri izlemek için10. Son zamanlarda böbrek organoidlerinin ve organotipik kültürlerin yüksek çözünürlüklü konfokal 3D hızlandırılmış görüntülemesini amaçlayan yeni bir Sabit Z-Yön (FiZD) yöntemi tanımlanmıştır11. Bu yöntemde, organoidler ve embriyonik organlar, numunenin kalınlığı 70 μm'ye ulaşana kadar cam bir kapak kayması ile transwell insertin geçirilebilir bir zarı arasında hafifçe sıkıştırılır ve görüntüleme için en uygun optik koşulları sağlar. Yöntemlerin ikinci bölümünde, özel olarak tasarlanmış bir plakanın imalatı ve uzun süreli organoid görüntüleme için FiZD deneylerinin kurulumu için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan bakımı ve prosedürleri, laboratuvar hayvanlarının kullanımına ilişkin Finlandiya ulusal mevzuatı, deneysel ve diğer bilimsel amaçlarla kullanılan omurgalı hayvanları koruma için Avrupa Konvansiyonu (ETS 123) ve 86/609/EEC AB Direktifi'ne uygun olarak uygulanmıştır.
1. Tavuk CAM fare embriyonik böbrekler ve böbrek organoidler ekimi için minirezervuarlar imalatı ve ksenotransplantasyon deneyleri kurma
- 6 kuyu veya 12 kuyu plakası için tasarlanmış transwell hücre kültürü kesici uçlarını kullanın.
NOT: Belirli bir deneye bağlı olarak büyük veya küçük minirezervuarlar kullanılabilir. Sekiz embriyonik böbreklere kadar ksenogreftleme veya aynı tavuk embriyosuna birkaç minirezervuar yerleştirildiğinde (örneğin, aynı tavuk CAM'de deney ve kontrol örnekleri) küçük minirezervuarlar kullanmak en iyisidir. - Dairesel testere bıçağı veya el testeresi ile döner bir çok alet kullanarak kesici uçların kenarlarını kesilerek geçirilmeye bilen 2 mm yüksekliğinde plastik bir halka oluşturun.
- Bir neşter veya keskin bir bıçak ile bu minirezervuarların kenarları parlatmak.
- Minirezervuarları en az 1 saat boyunca %70 etanol ile sterilize edin.
- Minirezervuarları otoklavlı çift distile suda yıkayın ve laminar bir başlıkta kurutun.
- PBS ve kültür ortamındaki minirezervuarları durula (yüksek glikozlu DMEM/%10 FBS/1% penisilin-streptomisin).
- Rezervuarı petri kabına yerleştirin, bir damlanın üzerine (600 μL/400 μL) membran yukarı bakacak şekilde kültür ortamının üzerine yerleştirin.
- Bir pipet veya cam kapiller tüp yardımı ile membran üzerinde eşit olarak diseksiyon ex vivo embriyonik böbrekler veya böbrek organoidler düzenleyin. Böbreklerin etrafında çok fazla sıvı bırakmaktan kaçının.
- 37 °C ve %5 CO2'debir hücre kültürü kuluçka makinesinde numuneler 2-24 saat membrana bağlansın.
NOT: En fazla sekiz E11.5 embriyonik fare böbrekler veya böbrek organoidler küçük eklemek üzerinde düzenlenebilir. Büyük kesici uç, ksenotransplant için daha büyük embriyonik doku parçaları veya CAM'in daha geniş bir alanında bir hücre-hidrojel karışımı için kullanılacaksa önerilir. - Hücre kültürü kuluçka12,13daha önce yayınlanmış yöntemlere göre hazırlanan 8 günlük eski ovo kültürlü embriyonik tavuk alın.
- Minirezervuarları CAM'e aktarın, böylece greftler CAM'e bakacak ve membran onları büstü eder. Minirezervuarları CAM'in çevresine yerleştirin, böylece tavuk embriyosu üzerini örtmesinler.
NOT: Transwell uçlarından 12 kuyu plakası için imal edilen küçük minirezervuarlar kullanılarak, bir CAM'a en fazla üç minirezervuar yerleştirilebilir. - Minirezervuarlara 500°L (6 iyi kesici uç) veya 300°L (12 iyi kesici uç) ekleyin.
- En fazla 9 gün boyunca tavuk CAM üzerinde örnekleri yetiştirmek. Minirezervuarlarda günlük kültür ortamını değiştirin.
NOT: Örneklerin vaskülarizasyonu transplantasyon dan sonra 24-48 saat olarak görülebilir.
2. Özel tasarlanmış plakaların imalatı ve FiZD kültürleri kurulması
- 6 kuyu plakasının altında 20 mm çapında delikler delin.
NOT: FiZD deneyleri için, 16 mm derinlikte 6 kuyu plakası kullanın (Malzeme Tablosu'ndabelirtilmiştir). - Bir karşı lavabo matkap ucu, bir neşter veya keskin bir bıçak ile elektrikli bir matkap kullanarak deliklerin jantlar (özellikle üst tarafta) Lehçe.
- En az 1 saat boyunca% 70 etanol plakaları sterilize.
- Plakaları otoklavlı çift distile suda yıkayın ve steril koşullarda kurumasına izin verin.
- 22 mm x 22 mm cam kapakları %70 etanol ile iyice yıkayın veya Saarela ve ark.11tarafından yayınlanan protokole göre temizleyin.
- Bir toksik olmayan doku tutkal kullanarak 6 kuyu plakaları deliklerin üst tarafına kapakları tutkal. Deliğin etrafına tutkal uygulayın ve kapağını hafifçe örtmek için yerleştirin. Tutkal kurusun.
- Plakaları stereomikroskop altında inceleyin ve gerekirse fazla kurutulmuş tutkalları kapak kapaklarının yüzeyinden çıkarın.
NOT: Numunelerin eşit şekilde sıkıştırIlmesini sağlamak için kapak lının üzerinde tutkal olmadığından emin olun. - Polistiren boncukları (70 μm partikül boyutu) eşit hidrojel hacmiyle karıştırın. Kuyu başına 50-100 μL hacim yeterlidir.
NOT: Buz üzerinde hidrojel ve polistiren boncuk karışımı tutun. - Membran yukarı bir diseksiyon mikroskobu altında bir transwell eklemek yerleştirin.
- Örnekleri (örn. ex vivo embriyonik böbrekler veya böbrek organoidleri) membran üzerinde eşit olarak düzenleyin.
- Kırılgan dokuların zarar görmesini önlemek için numunelerin yanına hidrojel/polistiren boncuk karışımını dikkatlice ekleyin.
- Transwell kesici uç, üzerinde biraraya getirilen numuneler ile membranAşağı bakacak şekilde çevirin.
- Yavaşça değiştirilmiş 6 iyi plaka bir kuyu içine eklemek yerleştirin ve hafifçe aşağı bastırın böylece örnekler boncuk seviyesine sıkıştırılır.
NOT: Mikroskop kullanarak sıkıştırmanın ilerlemesini takip edin. - Bir elinizle kuyuya hafifçe bastırArak kesiciye basılı tutun ve kesici ucun çevresinde üç noktada lehimleme demiri ile plastik eriterek plakaya sabitle.
- Kesici uç tabağa sabitlendiğinde, kuyuya 2 mL kültür ortamı (DMEM/%10 FBS/1% penisilin-streptomisin) ekleyin ve kalan kuyuları aynı şekilde plakada biraraya getirin.
- Bitmiş plakayı hızlandırılmış görüntüleme için ters bir mikroskobun sahnedeki kuvöze aktarın.
- Uygun deneysel ayarları kullanarak numunelerin hızlandırılmış görüntülemesini gerçekleştirin.
NOT: Hızlandırılmış deneyler sırasında plaka kuyularında kültür ortamının değiştirilmesi gerekli değildir, ancak kesici uç taki yan larında ki deliklerden kolayca yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan CAM kültür protokolü, tavuk CAM'de knenotransplantasyon sonucu böbrek organoidlerinin ve embriyonik böbreklerin yüksek verimli vaskülariteleştirilmesini sağlamıştır (Şekil 1, Film 1). Kültür ortamı içeren minirezervuarlar donör dokuya besin sağlamakta ve uygun vaskülarizasyondan önceki zaman diliminde kurumasını korumuştur. Bu yöntem, donör kaynaklı endotel hücrelerinin büyümesi için izin koşulları sağladı. Bu nedenle, nakledilen böbreklerde ve organoidlerde renal vaskülatür çoğunlukla temsil edildi, sadece olmasa da, donöre özgü hücreler tarafından(Şekil 2B,C,F). CAM'e nakledilen böbrek ve renal organoidlerde renal organotipik kültürlere göre daha olgun glomerüler vaskülatür elde edilmiştir(Şekil 2D,E).
FiZD protokolü, yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile ex vivo embriyonik böbreklerin ve renal organoidlerin uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesi için tasarlanmış bir yöntemdir. Trowell14tarafından tasarlanan klasik organotipik kültür protokolünde, bir numune gözenekli bir filtreye yerleştirilir, metal bir ızgara tarafından desteklenir ve hava-sıvı arabiriminde tutulur(Şekil 3A). Bu yöntem, dik veya ters bir mikroskop türü için de en uygun yöntem değildir. Burada sunulan yöntem görüntüleme için ters bir mikroskop ile çalışacak şekilde özel olarak tasarlanmıştır. Örnek aşağıdan bir cam kapak ve transwell insert gözenekli bir membran arasında hareketsiz (yukarıya bakınız)(Şekil 3B). Membran ile kapak kaymaarasındaki en uygun mesafe ~70 μm idi.Figure 3B
Cam kapak kayma kuyunun alt üst yüzeyinde bulunan hiçbir ticari olarak kullanılabilir 6 kuyu plakaları vardır. Bu nedenle, bu özel tasarımplakaların imalatı için bir protokol geliştirilmiştir (Şekil 3B). Şekil 4 embriyonik böbrek kültürünün(Şekil 4A,D–F) ve renal organoidlerin(Şekil 4B,C)temsili morfolojisini göstermektedir. Film 2, FiZD kurulumunda kültürlenmiş fare embriyonik böbrekteki endotel hücrelerinin yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme sonuçlarını temsil eder. Movie 2'deki sağ panel, bu yöntemle tek tek hücrelerin hem dağılımının hem de geçişinin gözlemlenebildiğini göstermektedir.
Şekil 1: Murine embriyonik böbrek knenotransplanted tavuk embriyo CAM. 8 günlük eski ovo tavuk embriyosuna E11.5 embriyonik fare böbreklerinin xenotransplantasyonu; bir murine embriyonik böbrek CAM 7 gün boyunca ekili oldu. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Film 1: Tavuk embriyosu CAM knenotransplantasyonu sonrası murine embriyonik böbrekkan akımı. Bir murine E11.5 embriyonik böbrek 8 günlük bir tavuk embriyosu CAM xenotransplanted ve 7 gün boyunca kültürlü edildi. Film 7. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Şekil 2: Tavuk embriyosu CAM'de murine embriyonik böbrek ksenotransplantasyonu. Murine E11.5 embriyonik böbrekler (m) bir organotipik kültür (yani, kontrol) olarak yetiştirilen veya 8 günlük embriyonik tavuk CAM (c) (yani, deney) knenotransplanted edildi. Embriyonik böbrek ekimi 5 gün sonra, kontrol ve deneysel örnekler sabit ve endotel belirteci CD31 (kırmızı)(A-E)ve çekirdekleri (Hoechst; mavi) (D, Eiçin lekeli idi. (C) Tavuk ve fare kan damarları (ok başları) arasında anastomozlar. (D,E) Nefronun ortasından tek bir konfokal dilim gösterilir. (F) Murine E11.5 embriyonik böbrek xenotransplantasyonu transgenik GFP-tavuk CAM için 7 gün, CD-31 için lekeli (kırmızı). Ölçek çubukları = A–B 100 μm; C-E 20 μm; F 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sabit Z yönü kültür yöntemi. (A) Numunenin ızgara tarafından desteklenen gözenekli bir membran üzerinde büyüdüğü ve eksplantı hava-sıvı arabiriminde tuttuğu geleneksel kültür yöntemi. (B) Yeni FiZD kurulumunda, numune cam kapak lı ve transwell gözenekli membran arasına hafifçe sıkıştırıldı. Polyester boncuklar z yönünde ayarlanan numunenin kalınlığını kontrol etti. Bu rakam Saarela ve ark.11'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yeni FiZD kültür yönteminde embriyonik böbrekler ve böbrek organoid gelişimi. Embriyonik böbrekler(A, D–F) ve böbrek organoidleri(B–C)yeni FiZD kurulumu kullanılarak ekildi. (A) FiZD kültürünün 7. (B) FiZD kültürünün 7. (C) MtmG (kırmızı) fare böbrek organoidi yeni FiZD kurulumu kullanılarak 4 gün boyunca ekildi. Zaman atlamalı görüntü yığınının anlık görüntüsü, gelişmekte olan nefronlarda Wnt4Cretarafından etkinleştirilen GFP (yeşil) ifadesini gösterir. (D) Fare embriyonik böbrek yeni FiZD kurulumu kullanılarak 7 gün boyunca ekildi. Six2 (yeşil) ve Troma-1 (Krt8, kırmızı) boyama nefron öncüleri ve üreterik tomurcuk (UB) çatallanma gösterdi. (E) Fare embriyonik böbrek rudiment yeni FiZD kurulum kullanılarak 12 gün boyunca kültürlü oldu. Troma-1 (kırmızı) ve Nefrin (yeşil) ile boyanmış ve ub çatallanmaları ve podositler sırasıyla gösterdi. (F) Troma-1+ (kırmızı) UB ve Nefrin (yeşil) + podositlerin yüksek güç büyütmesiyle(E)ile aynı örnek. Bu rakam Saarela ve ark.11'dendeğiştirilmiştir. Ölçek çubukları = A-D, F 100 μm; E 1.000 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Film 2: GFP etiketli renal endotel hücreleri yeni FiZD kurulumunda büyür ve yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile görülebilir. E11.5 mTmG'den embriyonik böbrekler; Tie1Cre fareler yeni FiZD kurulumu kullanılarak 6 gün boyunca parçalara çıkarıldı ve büyütüldü. Film endotel hücrelerinde Tie1Creindüklenen GFP ifadesini gösterir. Her 15 dakikada bir elde edilen görüntülerle 10x/0.45 hedefi kullanılarak 20 z-katmanından oluşan bir yığın alınmıştır. Filmde, beş GFP z-katmanları ve bir parlak alan odak düzlemi birleştirilir. Sağdaki panel, gelişmekte olan bir böbreğin yakın çekimini gösteriyor. S-şekilli evre nefronların vasküler yarık içine göç eden endotel hücreleri görülebilir. Sağdaki panelde, GFP z-katmanı ve bir parlak alan odak düzlemi birleştirilir. Hızla hareket eden hücreler muhtemelen makrofajlar15. GFP sinyali de bazı kan hücreleri tarafından ifade edildi. Voxel boyutu 0.69 μm x 0.69 μm x 4.13m. Bu film Saarela ve ark.11değiştirilmiştir. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klasik renal organotipik kültür yöntemini hassaslaştıran, vaskülarizasyon, uzlaşı gelişimi ve ex vivo embriyonik böbreklerin ve organoidlerin optimal 4D (yani 3D görüntü ve zaman) görüntülemesini sağlayan iki ayrıntılı protokol sunulmuştur. Bu bölümde yöntemlerdeki kritik adımlar vurgulanır ve sorun giderme konuları anlatılmaktadır.
Diğer CAM kültür yöntemleri ve bu gelişmiş tavuk CAM kültür yöntemi arasındaki önemli fark CAM embriyonik böbrekler ve böbrek organoidlerin ksenografting özel yapılmış minirezervuarlar kullanımıdır. Modifiye transwell kesici kesici uçtaki membran alt kısmı numuneleri tavuk CAM'ine bastırır ve yerinde tutar. Kesici uç kenarları, grefti kurumaktan koruyan kültür ortamı için bir rezervuar görevi görehizmet eder. Ex ovo kültürlü embriyonik tavuk CAM Xenografting şiddetle tavsiye edilir, Bu yöntem minirezervuar yerleştirilebilir CAM daha büyük bir alanı ortaya çıkarır ve kolay vaskülarite işlemi takip etmek kolaylaştırır12,13.
Tavuk CAM kültür yönteminin bir dezavantajı ksenotransplantasyon gerçekleştirmek için zaman penceresi 8-9 gün zaman tavuk embriyosu CAM fonksiyonları zaman aşağılayıcı başlamadan önce sınırlı olmasıdır. Bu nedenle geliştirmek için daha uzun zamana ihtiyaç duyan greftler farklı bir dokuya ksenotransplantasyon la vaskülarize edilmelidir (örn. fare böbrek kapsülü)6. Donör dokunun seri knenotransplantasyonu bu uzun kuluçka süresi sorununa bir çözüm olabilir. Bu yöntem, greftin zaman atlamalı görüntülemesi ve gelişmesi için uyarlanabilir, ancak öncelikle uzun süreli görüntüleme için minirezervuar ve CAM stabilizasyonu gereksinimi ele alınmalıdır. Tavuk CAM için bu geliştirilmiş renal knenotransplantasyon protokolünün en büyük avantajı, yöntem donör kaynaklı endotel hücrelerinin gelişmek için koşullar sağlamasıdır.
FiZD protokolü, yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile ex vivo embriyonik böbreklerin ve böbrek organoidlerinin uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesi için tasarlanmış bir yöntemi tanımlar. Kurulum için, kuyu ve ekle boyutlarının eşleşmesi çok önemlidir. Bir coverslip 6 kuyu plaka altına yapıştırılmış ve eklemek kuyu üzerine yerleştirilir, kesici uç membran ı camı dokunmak gerekir. Daha sonra, kültür kurulduğunda, spacer boncukmembran konumunu ve dolayısıyla kültürlü organ veya organoid kalınlığı nı belirleyecektir. Bu nedenle, fazla tutkal kaldırmak ve hiçbir malzeme kapak cam dokunmadan eklemek kısıtlayan olup olmadığını kontrol etmek önemlidir. Ayrıca kapak cam takmak için toksik olmayan doku tutkal kullanmak önemlidir. Tutkal çok güçlü bir şekilde takılmaz, bu nedenle plakaları dikkatli bir şekilde işlemek çok önemlidir. Plakalar yeniden kullanılabilir ve kapak camı yıkama adımları sırasında ayrılırsa, tekrar yapıştırılabilir.
FiZD görüntüleme yöntemi nefrogenezin tek hücredüzeyinde incelenmesini sağlar. Yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntülerin yüksek kalitesi böbrek organoidleri ve böbrek kültürlerinde hücresel davranışı incelemek için otomatik hücre segmentasyonu uygulamasına olanak sağlar. 6 kuyu plakasının farklı kuyularında bulunan çeşitli numuneler farklı kültür koşullarında aynı anda incelenebilir. Bu teknik, spacer boncukların boyutunu değiştirerek doku ve organoidlerin farklı boyutları ve türleri için kolayca değiştirilebilir; bu yumurtalık hücre kültürleri ile gösterilmiştir14. Bu yöntemin daha iyi bir optimizasyonolarak, FiZD kurulumunu yakın zamanda yayınlanan mikroakışkan yaklaşımlar16 ile birleştirmek böbrek gelişiminin sonraki aşamalarında hücresel morfogenezin yüksek çözünürlüklü mikroskobik analizi için son derece yararlı olabilir.
FiZD yönteminin bir avantajı da bol miktarda kültür ortamının mevcut olması ve 1 haftalık görüntüleme sırasında bunu değiştirmeye gerek olmamasıdır. Yine de, bir ortam değişikliği gerekiyorsa, ortam kesici uç duvarındaki bir açıklıktan kolayca değiştirilebilir. FiZD yöntemi, numuneyi mikroskoba yaklaştırması açısından diğer organ kültürü yöntemlerinden de daha üstündür. Diğer yaygın olarak kullanılan kültür yöntemleri bir membran veya filtre ve görüntülenmiş örnek ve amaç arasında bir cam plaka alt, doğru yüksek çözünürlüklü görüntüleme yasaklayan17vardır. FiZD yöntemi ile canlı dokuların yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Suomen Akatemia (Finlandiya Akademisi) (206038, 121647, 250900, 260056) tarafından finansal olarak desteklenmiştir; Mükemmellik Merkezi hibe 2012-201314), Munuaissäätiö - Finlandiya Böbrek ve Karaciğer Derneği, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Finlandiya İsveç Kültür Vakfı, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Finlandiya Kanser Derneği), Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013; FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) ve H2020 Marie Sklodow-Curie Innovative Training Network "RENALTRACT" Project ID 642997. Yazarlar teknik yardım için Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias ve Hannele Härkman teşekkür ederiz.
Şekil 3, 4 ve Film 2 Geliştirmeizni ile yeniden yazdırılır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adjustable Spade Drill Bit | Bosch | 2609255277 | For drilling 20 mm diameter holes |
| Automatic Egg Turner | OLBA B.V., Netherlands | AT-42 | For incubation of eggs before ex ovo setup. |
| Cell Incubator | Panasonic | 13090543 | Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cell Incubator | SANYO | 10070347 | Chicken CAM-culture incubator. Temperature set at 37° C, 90% humidity, 5% CO2 |
| Cellstar 6-well Plate | Greiner | M9062 | 16 mm depth of wells to match with the inserts |
| Circular Saw Blade for Dremel Rotary Tool | Dremel | SC690 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polycarbonate Membrane Inserts | Corning | 10301031 | For 6-well plates. 40 µm pore size |
| Countersink Drill Bit | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | For polishing (20.5 mm, 1/4", HSS) |
| Disposable Glass Capillary Tube | Blaubrand | 7087 33 | |
| Disposable Scalpel | Swann-Morton | 0501 | |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Drilling Machine | Bosch | GSR 18 V-EC Professional | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High glucose |
| Egg Incubator Compact S84 | Grumbach, Germany | 8012 | For incubation of eggs before ex ovo setup. Temperature set at 38° C with relative humidity set above 60% |
| Ethanol (70%) | VWR | ||
| Fertilized Eggs | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland | Hy-Line White and Nick Chick | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Forceps DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glass Coverslips | Menzel-Gläser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-stage Incubator | Okolab | Boldline, custom made | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+ | Biowest | X0520-500 | Washing the mini reservoirs. |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrene Beads | Corpuscular | 1000263-10 | 70 µm in diameter |
| Rotary Multi Tool System | Dremel | 4000 | |
| Soldering Iron | Weller | TCP S | Heated glass capillary can also be used |
| Thincert 12-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-well Cell Culture Inserts With 0.4 µm-pore Polystyrene Membrane | Greiner Bio-One | 657610 |
References
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238 (2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L.
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154 (2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958 (2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
