Summary
在这里，我们描述了一个详细和可重复的流细胞学方案，利用穆林骨关节炎的既定手术模型，使用细胞外和细胞内染色测定，确定单细胞/巨噬细胞和T细胞子集。
Abstract
骨关节炎 （OA） 是最常见的肌肉骨骼疾病之一，影响患者遭受疼痛和身体限制。最近的证据表明，该病的潜在炎症成分，T细胞和单核细胞/巨噬细胞可能与OA的发病机制有关。进一步的研究假设了炎症细胞系子集（如Th1、Th2、Th17和T-调节淋巴细胞）以及M1、M2和合成组织驻留巨噬细胞的重要作用。然而，局部突触和全身炎症细胞反应与关节结构变化之间的相互作用尚不得而知。为了充分了解T细胞和单细胞/巨噬细胞如何对OA的贡献，重要的是能够在突触组织、继发淋巴器官和系统（脾脏和骨髓）中同时大量识别这些细胞及其子集。如今，不同的炎症细胞子集可以通过细胞表面标记的组合来识别，使多色流细胞仪成为研究这些细胞过程的有力技术。在该协议中，我们描述了有关合成组织和继发淋巴器官的收获以及单细胞悬浮液的生成的详细步骤。此外，我们同时提供细胞外染色测定，以识别单细胞/巨噬细胞及其子集，以及一个细胞外染色和细胞内染色检测，以识别T细胞及其子集内的骨髓脾脏，骨髓，淋巴结和合成组织。该协议的每一步都经过优化和测试，结果可以进行高度可重复的检测，可用于其他手术和非手术 OA 小鼠模型。
Introduction
骨关节炎（OA）是一种使人衰弱和痛苦的疾病，涉及与关节1相关的所有组织的各种病理。OA是最常见的肌肉骨骼疾病之一，到2020年成为全球第四大残疾病因。创伤后OA发生在关节损伤后，在易感关节（如膝关节4、5）中，至少占所有OA的12%和OA的25%。此外，关节损伤使OA的终生风险增加5倍以上。并非所有明显类似的伤害都会继续发展OA，因此，驱动长期OA风险的决定性因素仍然具有挑战性。为了开发预防和治疗创伤后OA的有效治疗方法，调查和更好地定义容易患OA 1的损伤特异性病理学、病因和机制，这一点至关重要。
OA及其定义软骨破坏以前完全归因于机械应力，因此，OA被认为是一种非炎症性疾病2。然而，最近的研究表明，与健康对联2相比，OA患者的突触膜的炎症渗透和炎症细胞的增加，使炎症成分成为OA的潜在驱动力。2进一步的研究表明，CD4+和CD8+T细胞型的异常以及先天免疫系统的单核细胞/巨噬细胞都可能导致OA2，7的发病机制。详细调查这些异常发现各种T细胞子集2的相关作用，如Th1 8，Th29，Th178和T调控（特雷格）群体910，11。10,11尽管有这种令人信服的证据，T细胞反应的改变与OA的发展与进展之间的因果关系仍然不为人知。
除了在OA中发挥作用的特定T细胞外，最近的研究表明，分化的极化/激活的巨噬细胞可能与OA12的发病机制有关。特别是，来自血液单核细胞的巨噬细胞在合成中积累并极化成经典激活的巨噬细胞（M1）或OA发育期间的替代激活巨噬细胞（M2），这意味着单细胞衍生巨噬细胞和OA13之间的相关性。相比之下，某些巨噬细胞的子集在发育早期填充器官，并在单核细胞独立物质14中自我维持其数量。最近，这些突触组织-居民巨噬细胞（STRMs）14显示由紧密结阻屏障调解的关节保护功能。这些发现表明，异常，特别是巨噬细胞子集，可能在OA的发育过程中发挥关键作用。然而，这种炎症性细胞反应和创伤后关节的结构变化之间的相互作用是未知的。
从历史上看，通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法15，16，对突触组织中免疫细胞的分析仅限于免疫组织化学（IHC）或mRNA,表达。然而，IHC和RT-PCR都缺乏同时识别多个不同细胞类型及其子集的能力，因此限制了这些方法的适用性。此外，IHC仅限于分析小组织样本，并可能错过焦点炎症细胞积累。在过去的几年中，已经开发出了各种细胞类型的无数表面标记，免疫细胞的子集现在可以通过这些标记的不同组合可靠地识别出来。由于技术的进步，流动细胞计现在能够同时识别多种不同的氟化物，从而能够分析大型多色抗体面板。
流细胞学为研究者提供了一种强大的技术，允许在单细胞水平上同时识别和量化大量免疫细胞及其子集。我们开发和优化了细胞外染色分析，以识别单细胞/巨噬细胞及其子集，以及额外的/细胞内染色检测，以识别T细胞及其子集在骨髓脾脏，骨髓，淋巴结和合成组织。该协议的每一步都进行了优化和测试，结果一个高度可重复的检测，可用于其他手术和非手术OA小鼠模型17。
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Protocol
北悉尼当地卫生区动物伦理委员会已批准本协议中提到的所有程序。根据《实验室动物护理和使用指南》（澳大利亚国家健康和医学研究理事会2010年修订版）对小鼠进行安置和护理。在所有实验中，10-12周大，使用雄性C57BL/6小鼠。
注： 为了诱导创伤后OA，手术破坏右半月板（DMM）在右窒息关节的稳定。有关这种动物模型的详细资料由格拉森等人18日发表。简言之，一般麻醉在诱导室中使用异氟兰诱导，然后使用鼻锥维持。手术腿用剃刀剃光，手术场地用乙醇清洗和擦拭，以尽量减少污染。然后将动物移到手术显微镜上，放在无菌毛巾上，用无菌纸窗帘将腿部披上，以隔离手术地点并最大限度地减少污染。使用显微镜，做了0.5厘米的中侧副动脉切除术，帕泰拉横向豪华，和红外线脂肪垫升高，以暴露中侧半月板-半身韧带，这是通过解剖钳子转切。关节用无菌盐水冲洗以去除任何血液，伤口在三层中闭合 - 关节胶囊、皮下组织（使用缝合材料）和皮肤（使用手术组织胶水）。但是，本协议中描述的方法可以应用于诱导 OA 的其他模型和方法。OA 可以在动物的两侧诱导，在收获组织时，必须收获异体（排水）淋巴结。
1. 分离脾脏、反向骨髓、吸气淋巴结，排出窒息和突触组织
- 通过宫颈脱位使鼠标安乐死。将鼠标放在解剖显微镜下，用70%乙醇擦拭胸部、腹部和腿部。用直剪刀小心地打开中线的皮肤，使腹腔完好无损。
- 轻轻地将动物右侧的皮肤从底层肌肉上拉开，使皮下脂肪组织附着在皮肤上。通常，仅轻轻的牵引力会将皮肤和底层脂肪组织与肌肉分离。零星的粘附应用细剪刀切开，以保持将组织分离到最低，并降低伤害淋巴结的机会所需的张力。使用两个弯曲的细钳轻轻调出位于大腿上的脂肪组织，识别三个血管的交叉。内结淋巴结位于交叉点，可以通过卵巢形状和略暗的颜色来识别。
- 使用精细解剖钳去除内结淋巴结。小心不要使胶囊破裂。用钳子去除淋巴结表面的剩余脂肪。
- 打开腹腔并识别脾脏。用细剪刀切掉脾脏。轻轻将肠子拉到一边，露出大道及其分叉，小心不要伤害它们，以尽量减少污染风险。腹腔淋巴结位于腹主动脉的终端段和普通腹腔动脉的起源。取出右 iliac 淋巴结，然后按照 1.3 中所述进行。
- 轻轻去除两个后肢的皮肤。使用刀片和细剪刀从肌肉组织中清洁左股骨，以解剖左股骨。小心断开窒息和臀部关节保持完好无损，并去除股骨。
- 识别右侧窒息关节的肌腱，然后用细剪刀将相邻的肌肉组织近在一起，直到约 5mm 的四头肌肌腱近向 patella 暴露。此后，切入四头肌腱约3-4mm近到帕泰拉形成一个手柄，并使用细钳轻轻地将其从关节拉开。这会使关节胶囊附着到股骨的边缘可见，并使用手术刀刀片小心地沿着关节胶囊的边缘在两侧切割，从股骨向头骨开始，以最大限度地增加收获的合成膜量。虽然切割，重要的是保持一个温和的牵引力四头肌腱和暂停时，突触组织块只连接到头骨。在此阶段，关节内脂肪垫现在清晰可见，从面膜的关节和前部使用刀片轻轻地分离。此后，沿着关节胶囊的剩余部分（三分之一部分）切割，以去除突触组织块。
注：必须非常精确地执行此步骤，以便获得可靠的结果。完成解剖后，"合成组织块"应包括帕泰拉，帕泰拉肌腱，内皮拉脂肪垫，超和外膜凹槽突触衬里和相关关节胶囊前前辅助韧带。使用 0.9% 盐水溶液在解剖期间保持所有组织湿润。
注：将每个突触组织块样品放在标签为 24 井的 24 井板的单独井中，该井包含 1.5 ml 的 RPMI 1640 介质。将伊利亚克和内结淋巴结组合成一个井，从两只小鼠中汇集组织。
2. 从每个组织生成单细胞悬浮液
注：为了确保足够的细胞数用于流量分析，需要将两只小鼠的突触组织进行汇集。在目前的协议中，汇集来自同一两只小鼠的所有组织，以保持类比。此外，每个动物的腹腔和内结合并，导致每个样本总共4个淋巴结。一般来说，一种动物的脾脏、骨髓和淋巴结的细胞数足以进行流动分析，并可以应用该协议。然而，当使用组织从只有一个动物的lysing时间可能需要调整。
- 脾脏
- 将两个池状水放在 15 mL 管顶部的 70 μm 细胞过滤器上。使用无菌 3 mL 注射器柱塞，通过网状过滤器轻轻搅拌水合。经常用 6 mL 的 RPMI 1640 介质冲洗过滤器，并辅以 10% FBS。
- 旋转细胞（500 x g，5分钟，RT），并在5 mL的红血球（RBC）裂解缓冲液中重新填充颗粒。在RT下孵育5分钟，用10mL的PBS稀释解液缓冲液，停止反应。旋转细胞（500 x g， 5分钟，RT），重复此步骤一次或直到没有更多的RBC在颗粒中。
注：使用30μm细胞过滤器将悬浮液重新筛选成两轮裂入之间的新15 mL管，以去除凝固细胞。 - 裂化完成后，旋转细胞（500 x g， 5分钟，RT），丢弃上经剂，并在1 mL的PBS中重新产生颗粒。使用 Trypan 蓝色排除计算血细胞计上的活细胞数。
- 淋巴结
- 将四个池状淋巴结放在 15 mL 管顶部的 70 μm 细胞过滤器上。用无菌的 3 mL 注射器柱塞按压，将淋巴结轻轻梳理成单个细胞悬浮液。使用 10% FBS 的 RPMI 共冲洗 6 mL 的应变器。
- 旋转细胞（500 x g， 5分钟，RT），丢弃上因物，在500μL的PBS中重新产生颗粒。使用 30 μm 细胞过滤器将悬浮液重新筛选到新的 15 mL 管中，以去除凝固的细胞。使用 Trypan 蓝色排除计算血细胞计上的活细胞数。
- 骨髓
- 使用组织拇指钳小心地抓住完整的股骨，而不会压裂。用锋利的剪刀切断近端骨的端部，以方便骨骼的冲洗。转动股骨，将 23 G 针定位在股骨的凹槽中间。施加温和压力时，在拇指和食指之间旋转针头，以便在间孔槽中钻孔进入骨腔。
注：有时在钻孔后，骨骼颗粒会阻塞针头，以避免在冲洗时出现不必要的高压，建议在冲洗前更换针头。 - 使用 6 mL 的 RPMI 用 10% FBS（或直到冲洗变成白色）将骨质用 10 mL 注射器与 23 G 针冲洗到放置在 15 mL 管上的 70 μm 细胞过滤器上。用 3 mL 注射器的柱塞轻轻压穿骨髓，然后用另一个 3 mL 的 RPMI 冲洗过滤器。
注：一旦骨髓全部被完全冲走，骨骼应显示为白色。 - 旋转细胞（500 x g，5分钟，RT），并在5 mL的RBC裂解缓冲液中重新填充颗粒。在RT下孵育5分钟，用10mL的PBS稀释解液缓冲液，停止反应。
- 旋转细胞（500 x g， 5分钟，RT），丢弃上因物，在 1 mL 的 PBS 中重新暂停颗粒。使用 30 μm 细胞过滤器将悬浮液重新筛选到新的 15 mL 管中，以去除凝固的细胞。使用 Trypan 蓝色排除计算血细胞计上的活细胞数。
- 使用组织拇指钳小心地抓住完整的股骨，而不会压裂。用锋利的剪刀切断近端骨的端部，以方便骨骼的冲洗。转动股骨，将 23 G 针定位在股骨的凹槽中间。施加温和压力时，在拇指和食指之间旋转针头，以便在间孔槽中钻孔进入骨腔。
- 合成组织
- 用精细的手术剪刀将两个突触组织块切成小块。用介质将样品转移到 15 mL 管中。用额外的0.5 mL的RMI冲洗旧井，以获得剩余的细胞和突触组织，转移到猎鹰管（最终体积2 mL）。
提示：在此步骤中，使用移液器和尖端的切口，直径变宽。 - 根据制造商说明（如利贝酶）重组酶和等分酶。加入足够的酶，最终浓度为1单位/mL（每个样品共2个单位）。使用 MACS 旋转器在 37 °C 下消化 2 小时。
- 通过添加 8 mL 的 RPMI 与 10% FBS 和过滤细胞悬浮液通过 70 μm 细胞过滤器到一个新的 15 mL 管停止消化。用 10% FCS 介质和过滤细胞悬浮液通过同一细胞滤机将旧 15 mL 管冲洗到新管（15 mL 最终体积）中。
- 旋转细胞（500 x g， 10分钟，RT），丢弃上因物，在500μL的PBS中重新下水。使用 Trypan 蓝色排除计算血细胞计上的活细胞数。
- 用精细的手术剪刀将两个突触组织块切成小块。用介质将样品转移到 15 mL 管中。用额外的0.5 mL的RMI冲洗旧井，以获得剩余的细胞和突触组织，转移到猎鹰管（最终体积2 mL）。
3. 细胞分配
- 用组织类型、动物 ID 和指定的抗体面板标记两个 96 孔板（U 底部形状）。该协议共使用两个抗体面板：单细胞子板（细胞外染色）和T细胞子板（细胞外和细胞内染色）。
- 使用各自的单细胞悬浮液，每井提供5 x 10 5个细胞。
注：在设置实验时，评估每个组和组织类型的预期细胞的绝对数量（经过治疗的动物组织中比对照动物的细胞计数更高）。在生成单细胞悬浮液的最后一步重新悬浮细胞颗粒时，选择适当数量的 PBS，以最终获得每 200 μL 5 x10 5 的浓度。此处使用的 96 井板最多可容纳 300 μL，通常为 200 μL，是将溢出引起的交叉污染风险降至最低的理想之选。 - 对于每种面板和组织类型，在已明确标记的井中将至少5 x 10 5 个细胞作为未污染的对控制点进行分配。
4. 单核子集面板
- 执行生存能力染色：使用板微调器旋转细胞（500 x g， 5 分钟， 4 °C），用 200 μL 的 1x PBS 清洗细胞一次。准备一种在1xPBS中稀释1：50的细胞不渗透胺反应染料（活性污渍）的库存溶液。此后，用这种库存溶液的 100 μL 重新暂停细胞颗粒，使每井的生存能力污渍的绝对体积达到 2 μL。在4°C下孵育15分钟，防止光线。
注：应执行剂量滴定曲线确定所需的最佳可行性染色量。此外，稀释的生存能力染色剂库存溶液应在一天使用，而不是存储。有关如何重建、稀释和存储可行性污渍，请参阅制造商的说明。 - 在孵育过程中，在适当体积的 FACS 缓冲液（Ca2+ 和 Mg+ 无铅 PBS 中准备抗体的鸡尾酒，其中含有 0.1%BSA 和 0.02% 的亚兹德钠）。用200μL的FACS缓冲液、离心机（500 x g、5分钟、4°C）清洗细胞，用100μL的抗体混合物或适当的控制混合物重新填充每个颗粒。在4°C下孵育30分钟，防止光线。
注：请注意，阿齐德钠对细胞有毒。在目前的协议中，液缓冲液中阿齐德钠的浓度非常低（0.02%）样品在染色后立即运行，不会引起任何问题。如果计划进行下游功能测定，那么在实验的每一天，不使用任何亚兹德钠，可能是有益的。当使用多种抗体时，建议在抗体的鸡尾酒中加入适当数量的"亮渍缓冲液"，以提高结果。 - 用 200 μL 的 FACS 缓冲液清洗细胞两次，并在 250 μL 的 FACS + EDTA 缓冲液（包含 1 mM EDTA 的 FACS 缓冲液）中重新填充细胞。将样品转移到有标签的 FACS 管中。将样品保持4°C，防止光线，直到采集。
注意：免疫细胞有粘性的倾向。为了最大限度地降低阻塞风险和双精度值，建议向最终流量缓冲器添加 1 mM EDTA。
5. T 单元格子集面板
- 执行生存能力染色：使用板微调器旋转细胞（500 x g， 5 分钟， 4 °C），用 200 μL 的 1x PBS 清洗细胞一次。准备一种在1xPBS中稀释1：50的细胞不渗透胺反应染料（活性污渍）的库存溶液。此后，用这种库存溶液的 100 μL 重新暂停细胞颗粒，使每井的生存能力污渍的绝对体积达到 2 μL。在4°C下孵育15分钟，防止光线。
- 在孵育样品时，在适当体积的1x FACS缓冲液中准备细胞外染色抗体鸡尾酒。用200μL的1x FACS缓冲液洗涤细胞两次，旋转它们（500 x g，5分钟，4°C），用100μL的抗体混合物或适当的控制混合物重新暂停每个颗粒。在4°C下孵育30分钟，防止光线。
- 按照制造商的说明，使用固定和渗透套件执行细胞内染色。用200μL的1x FACS缓冲液清洗细胞两次，并在200μL的固定缓冲液中重新暂停。在4°C下孵育40分钟，防止光线。
- 在孵育过程中，以适当的1倍渗透和洗涤缓冲液，准备抗体的鸡尾酒（细胞内染色）。通过旋转（750 x g，5分钟，4°C）和洗涤细胞两次与200μL的1x perm/洗涤缓冲液收集细胞。
注：固定和渗透导致细胞往往更难正确颗粒。为了尽量减少细胞损失，在后续的洗涤步骤，增加离心力到 750xg。或者，也可以应用更长的旋转周期。但是，这将导致准备单元格所需的时间要长得多。 - 旋转细胞（750 x g，5分钟，4°C），用100μL的抗体混合物或适当的控制混合物重新暂停每个颗粒。在4°C下孵育40分钟，防止光线。
- 用 200 μL 的 1x perm/洗涤缓冲液清洗细胞两次，并在 250 μL 的 FACS + EDTA 缓冲液中重新填充细胞。将样品转移到有标签的 FACS 管中。将样品保持4°C，防止光线，直到采集。
注：对于每种抗体，需要通过执行剂量滴定曲线确定最佳浓度。抗体之间的浓度可能大相径庭：CD3和CD80的稀释系数为1：1，而CD11b和CD4的稀释系数为1：6400。当滴定抗体浓度时，使用实验中使用的相同数量的细胞。
6. 补偿、适当控制和浇注
- 设置实验
- 一旦确定了最佳抗体浓度，运行无污染和单染色控制，以补偿调整光谱重叠。
注：使用单元格和补偿珠运行所有补偿控件。使用任何生成最亮的结果（正事件的最高 MFI）进行补偿。MFI 代表平均荧光强度，通常用于描述和定义生成的信号的均强度，从而用于抗体表达水平。 - 在开始新的多色实验时，运行荧光减去一 （FMO） 控制和等值控制。有关FMO的更多细节已公布于19日。
- 确定最佳的向前散射区 （FSC-A） 电压和侧散射区 （SSC-A） 电压，以检测每种组织类型的未污染控制中的白细胞群体。
注：固定和渗透过程改变细胞的尺寸。因此，单核子体子板和T细胞子板的FSC-A和SSC-A电压差别很大。为了找到T细胞子集面板的最佳电压，在调整FSC-A和SSC-A值的同时，使用单染色CD3和后门的细胞对白细胞群体。
- 一旦确定了最佳抗体浓度，运行无污染和单染色控制，以补偿调整光谱重叠。
- 门控策略
- 确定最佳FSC-A和SSC-A电压后，在白细胞群体上设置一个主栅门。
注：在每次实验之前，根据制造商的说明使用校准磁珠校准细胞计，并运行未污染的磁珠。不同时间点的白细胞群应具有可比的FSC和SSC特性（组织类型之间的轻微差异是预料的和正常的）。如果 FSC 和 SSC 变化相当麻烦拍摄细胞仪和样品生成。 - 排除双精度：绘图 FSC-A（y 轴）和 FSC-H（x 轴）。单曲显示为此绘图的对角线。单打门。
- 排除死细胞：绘制 FVS510（可行性污渍）（x 轴）和 FSC-A（y 轴）。死细胞将显示为正事件，从而进入活细胞。
注：真正的负单元格将在未污染的控件中可见。因此，在染色样品之前运行未染色的控件时，请为每组样本调整此门。进一步浇注取决于所调查的抗体面板和细胞类型。此协议中使用的每个面板的浇注策略分别如图 1 和 图 4所示。
- 确定最佳FSC-A和SSC-A电压后，在白细胞群体上设置一个主栅门。
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Representative Results
下面介绍了单核子集面板和 T 细胞子面板的代表性结果。
图1 说明了从DMM治疗动物骨髓中采集的免疫细胞上单细胞子集面板的分层浇注策略。在所有其他组织类型中都使用了同样的策略并验证了这种策略。在设置实验时，确定了每种组织类型的前射散区 （FSC-A） 和侧散射区 （SSC-A） 电压，以识别单细胞/巨噬细胞并排除 T 细胞和碎屑 （G1）。在每个实验中，对每种组织类型的未污染控制进行分析，必要时调整FSC-A和SSC-A电压。如果参数发生巨大变化，预计电压会随着时间的推移保持相似，因此，细胞仪的阻塞可能会很大。此外，使用未染色的控制措施来确定死亡/活污渍的真实底数，每次实验进行相应调整时，闸门都进行了调整（图2A）。在设计实验时，应仔细选择氟化物，并且通常低表达的表面标记与明亮的氟化物配对（例如，此处使用 Alexa Fluor 647 用于 CD206）。存在各种死亡/活的污渍，可以通过不同的波长检测;在这里， Fvs510 被使用。
图3 显示了从突触组织中分离出的免疫细胞的样本数据，在动物接受DMM或假控制手术6周后，这些免疫细胞被染上了细胞外表面标记。在研究和控制动物时，可以使用该协议轻松识别所有子集。特别是，巨噬细胞子集（DMM组中Ly-6C+/MHC-II-巨噬细胞（G7）的较高百分比）和M1和M2巨噬细胞的表达（DMM组中M2巨噬细胞的百分比较高）的组之间的差异。
图4 可视化了从DMM治疗动物脾脏分离的免疫细胞上的细胞外T细胞面板的分层浇注策略。原理与用于单核细胞面板的原理相同。然而，固定和渗透过程改变细胞的大小和密度。因此，在首次为每种单元类型设置实验时，需要使用 CD3+ 单元的回门处理确定典型的 FSC 和 SSC 参数。随着时间的推移，一些氟化物往往会聚合（例如，此处与 FoxP3 一起使用的 PE）。由于影响光谱重叠和补偿的高亮度，聚合可能会修改结果。因此，所有抗体在使用前每次被旋涡并旋转，以减少聚合。此外，还使用了浇注策略来进一步减少聚合 （G2） 的影响。在建立实验时，对每种抗体进行荧光减去一个对等控制（FMOs）。示例数据如图 2B，2C 所示。
图5和图6显示了从淋巴结（图5）和突触组织（图6）分离的免疫细胞，在动物接受DMM或假对照手术4周后，使用T细胞面板协议染色。数据显示，DMM动物（G9）中，Th1细胞在两种组织中的比例较高。此外，T-调节细胞（G11）和Th17细胞（G12）的细胞内染色使用协议是成功的，可以检测到组之间的差异。
图1：使用细胞外染色来识别单细胞/巨噬细胞及其子集的流细胞学分层门控策略。骨髓细胞主要使用正向/侧散射（FSC-A和SSC-A）点图（G1）进行识别。此后，使用 FSC-A 和 FSC-H （G2） 检测单细胞，然后选择活细胞 （G3）。G3中的细胞进一步分类使用Ly-6G来识别嗜中性粒细胞（G4）和CD11b的单细胞/巨噬细胞（G5a）。MHC-II用于识别CD11b阳性细胞之间的树突状细胞（G5b），F4/80用于在巨噬细胞（G6）和单细胞（G12）之间进行选择。使用Ly-6C和MHC-II（Ly-6C+/MHC-II-巨噬细胞（G7），巨噬细胞进一步分类到其子集中;Ly-6C-/MHC-II-组织居民巨噬细胞（G8）;Ly-6C-/MHC-II+血液起源于巨噬细胞（G9）。使用 CD206 和 CD80（M1：CD80+/CD206-（G10）可以从整个巨噬细胞及其各自的子集中选择更多子集;M2：CD80-/CD206+ （G11）。使用MHC-II和CD11c（MHC-II-/CD11c-单核细胞（G13）进一步分类单核细胞;MHC-II=/CD11c- 单核细胞（G14）。然后使用 Ly-6C 的表达式对激活级别进行分类，并分为低 （G15）、中等 （G16） 和高 （G17）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 2：示例数据，说明单核和 T 细胞面板中的适当控件。（A） 在DMM手术（DMM）或假对照手术（sham）6周后，合成组织被采集，单个细胞悬浮液使用细胞外表面标记被染色。在每个实验中，未染色的细胞都用于确定死/活污渍的真实底片，并设置门（控制）。使用未染色细胞设置门显示在面板 A. （B+C） 脾细胞从未经治疗的对照动物中采集，使用细胞外标记和细胞内标记生成和染色的单细胞悬浮液。荧光-减一（FMO）控制是由染色细胞产生的，整个抗体面板只缺少一个抗体。显示了两个细胞内抗体的样本数据。（B） FMO -RORGT和 （ C ）FMO-福克斯-P3.对两个面板执行 FFM，并用于设置每个门。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：从小鼠的合成物中分离出的单细胞/巨噬细胞的细胞外染色。样本组织收集6周后，小鼠接受DMM手术（DMM）或假对照手术（sham）。有关已利用门的进一步信息，请如图 1 所示。示例数据显示，可以可靠地标识所有子集，并可以看到组之间的差异。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：使用细胞外染色和细胞内染色来识别T细胞及其子集的流细胞测量分层浇注策略。T 细胞主要使用正向/侧散射（FSC-A 和 SSC-A）点图 （G1） 进行识别。由于所用抗体的性质，应使用CD3和CD4（G2）排除使用所用抗体的聚合体。此后，使用 FSC-A 和 FSC-H （G3） 检测单细胞，然后选择活细胞 （G4）。G4 中的细胞进一步分类，使用 NK1.1 来识别自然杀伤细胞 （G5） 和 CD3 来识别 T 细胞 （G6）。激活级别使用 CD69 （G6b） 确定。此后，CD4 和 CD8 用于识别 T-杀手细胞（CD4-/CD8+ （G7））和 T-帮助细胞 （CD4+/CD8- （G8）。）。使用C-X-CR3（CD183）和CCR4（CD194），T-帮助细胞分为Th-1（C-X-CR3+/CCR4）和Th-2细胞（C-X-CR3-/CCR4+（G10）。此外，使用细胞内标记识别Th-17细胞（CD25+/RORgt®（G11））和T-调节细胞（CD25+/福克斯-P3+（G12）。此外，使用CD44和CD62L（CD44-/CD62L+天真T记忆细胞（G13）;使用CD44和CD62L（CD44-/CD62L+naveT记忆细胞）从T-帮助细胞中识别记忆细胞子集;CD44+/CD62L+ 中央T记忆细胞（G14）;CD44+/CD62L- 效应器 T 记忆细胞 （G15）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：从小鼠的淋巴结中分离出的T细胞的细胞外和细胞内染色。样本组织收集4周后，小鼠接受DMM手术（DMM）或假对照手术（sham）。有关已利用门的进一步信息，请如图 4所示。示例数据显示，可以可靠地标识所有子集，并可以看到组之间的差异。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：从小鼠的合成组织中分离的T细胞的细胞外和细胞内染色。样本组织收集4周后，小鼠接受DMM手术（DMM）或假对照手术（sham）。有关已利用门的进一步信息，请如图 4所示。示例数据显示，可以可靠地标识所有子集，并可以看到组之间的差异。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本协议中描述的方法经过设计和测试，能够可靠地识别骨髓脾脏、骨髓、淋巴结和骨髓（OA）骨髓模型中的单细胞/巨噬细胞和T细胞的各种子集。通过交换抗体，可以方便地修改当前协议，以研究不同的组织类型或其他细胞类型，并可用于OA的替代穆林模型。在测试其他组织类型时，由于免疫细胞的表面标记在20组织中不同，因此测试每个抗体的特异性至关重要。此外，在交换抗体时，有必要执行剂量滴定曲线，以确定抗体的最佳浓度，并重复补偿过程，以解决光谱重叠的变化。
在当前协议中，使用DMM鼠标模型18诱导OA。最常用的和成熟的动物模型是在小鼠，因为这一物种提供了多重优势，在研究创伤后OA17的病理生理学。特别是在小鼠中，手术和非手术的OA模型被描述17：最常见的是中侧半月板（DMM），手术转切前十字韧带（ACLT）和非手术ACL破裂（ACLR），分别21。所有这些动物模型都非常适合研究细胞炎症在创伤后OA病理学中的作用，目前的协议已经成功地在实验室中测试了所有前面提到的动物模型。虽然上述所有动物模型都已经建立，并在文献中进行了描述，但每种模型都有自己的优势和局限性，这些优点和局限性在17 号其他地方已经详细讨论过，因此下面只简要讨论。所有手术模型都受手术方法、伤口愈合过程及其相关的炎症反应的接受。当评估炎症细胞对创伤后OA发展的贡献时，这种炎症性伤口愈合反应可能作为混淆剂，特别是在干预后的早期时间点。此外，DMM 和 ACLT 程序需要以非常标准化的方式进行，以尽量减少动物之间的变异性。ACLT手术比DMM手术更难学，需要比DMM更大的手术暴露，以明确识别和确保伤害只对ACL和避免对其他关节组织18的抗原性损伤。非手术ACL破裂是诱导创伤后OA的一种标准化和非常有效的方法。然而，一个专用装置，应用一个受控的单压缩负载弯曲膝盖的头骨是必要的。该器件必须经过校准和测试，以获得可比和可靠的结果。此外，ACLR 模型在小鼠中诱发非常严重和渐进的关节损伤，其后中庭高原22 明显侵蚀，在包括人类在内的其他物种中未见 ACL 损伤。
为了在OA的发育过程中全面描述炎症过程及其细胞成分，不仅需要研究突触组织，而且研究局部淋巴结以及继发淋巴器官，如脾脏和骨髓。膝关节的淋巴排水模式已经特征在小鼠和淋巴液从膝盖关节排水通过伊利亚克和内关节淋巴结在一个不同的分散23，24。23,为了促进动物之间的可比性，我们决定在该协议中汇集 inguinal和 iliac 淋巴结。相比之下，虽然靠近膝盖，流行淋巴结排干后脚，在膝盖的炎症过程中不发挥作用。
小鼠具有少量关节内突触组织25和分离 免疫细胞在这里仍然具有挑战性。在目前的协议中，对合成组织的采集技术进行了调整，以便分离最大数量的免疫细胞。因此，收获技术包括超和下部凹槽以及红外线时尚垫，由于其大量的免疫细胞26。酶的消化过程和选择得到优化，完全消化突触膜和脂肪组织，同时离开肌腱，和软骨不受损伤。因此，目前的协议引入了一种从突触组织中采集免疫细胞的可重复方法。
流细胞学分析在OA开发过程中研究细胞免疫过程具有多种优势;尽管如此，这种技术还是有局限性的。由于突触组织中免疫细胞数量很少，因此需要从至少两种动物身上采集组织样本以获得一个样本。由于本协议中使用的氟化物和颜色数量庞大，因此必须特别注意对每种组织类型可能的光谱重叠进行细致的补偿，并且在整个使用本技术过程中需要一致地重新评估补偿。由于大量的可用标记和研究之间的相当大的差异，以确定一定的人口，另一个可能的限制是选择用于识别细胞19的标记。流细胞学允许量化"事件"，它不一定与总细胞协调。为了获得真正的定量分析，一个人需要在运行流量分析时同时获取计数珠子，或者事先在单细胞悬浮液中计数细胞以获得绝对数字（如这里所示）。一般来说，本协议的原则（例如，如何设计和设置一个流板或用于准备单细胞悬浮液的技术）可能适用于人类样本。然而，人类免疫细胞的表面标记物与穆林细胞不同，因此，需要选择和测试适当的抗体。此外，需要确定 RBC 解解的持续时间和适当的缓冲量，因为它很可能不同。在将本协议中的方法调整到其他物种或组织之前，必须对每一步进行细致的测试，以确保方法能够正常工作。
尽管存在局限性，但免疫细胞的流动细胞学分析仍然是一种强大的技术，允许在单细胞水平上同时识别单细胞和T细胞子集。特别是，目前的协议引入了一种可靠和可重复的技术，可以识别和量化细胞免疫反应在合成组织和继发淋巴器官的OA发展期间。在未来，这项技术可能有助于描述各种骨关节炎诱导动物模型的免疫反应，并随后评估免疫调节药物对这种使人衰弱的疾病的疗效。
总之，该流式细胞学方案描述了一种详细且可重复的方法，使用骨髓脾脏、骨髓、淋巴结和突触组织内的细胞外染色测定，利用已建立的外科骨关节炎小鼠模型，识别单细胞/巨噬细胞和T细胞子集。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢安德鲁林，博士和吉尔斯贝斯特，博士，他们在建立流动细胞仪的帮助。该项目得到了授予PH的德国 Forschungsgemeinschaft （DFG-HA 8481/1-1） 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD194 (CCR4) | BioLegend | 131212 | T-Cell Panel |
| Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst | BD | 566385 | Buffers |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | T-Cell Panel |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | Monocyte Panel |
| Liberase, Research Grade | Roche | 5401127001 | Enzyme for synovial tissue |
| Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg | BD | 564985 | Monocyte Panel |
| Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg | BD | 562454 | Monocyte Panel |
| Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg | BD | 742274 | T-Cell Panel |
| Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg | BD | 565250 | Monocyte Panel |
| Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg | BD | 563061 | T-Cell Panel |
| Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg | BD | 557596 | T-Cell Panel |
| Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg | BD | 552775 | T-Cell Panel |
| Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg | BD | 565480 | T-Cell Panel |
| Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg | BD | 565261 | T-Cell Panel |
| Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg | BD | 740664 | T-Cell Panel |
| Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg | BD | 563687 | Monocyte Panel |
| Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg | BD | 563332 | T-Cell Panel |
| Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg | BD | 565411 | Monocyte Panel |
| Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg | BD | 560408 | T-Cell Panel |
| Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg | BD | 563414 | Monocyte Panel |
| Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg | BD | 560593 | Monocyte Panel |
| Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg | BD | 560600 | Monocyte Panel |
| Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg | BD | 564143 | T-Cell Panel |
| Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg | BD | 562894 | T-Cell Panel |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | N/A | N/A | Buffers |
| Transcription Factor Buffer Set 100Tst | BD | 562574 | Buffers |
References
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
- Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).
- Woolf, A. D., Pfleger, B.
- Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
- Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
- Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
- Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
- Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
- Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
- Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
- Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97 (2014).
- Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
- Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
- Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
- Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
- Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Lorenz, J., Grassel, S.
- Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
- Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A.
- Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
- Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18 (2019).
