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Análise de Citometria de Fluxo de Subconjuntos de Células Imunes dentro do Baço de Murina, Medula Óssea, Linfonodos e Tecido Sinovial em um Modelo de Osteoartrite

Published: April 24, 2020 doi: 10.3791/61008
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Raymond Purves Bone and Joint Research Laboratory, Institute of Bone and Joint Research, Kolling Institute, Royal North Shore Hospital, University of Sydney, 2HTRG - Heidelberg Trauma Research Group, Center for Orthopedics, Trauma Surgery and Spinal Cord Injury, Trauma and Reconstructive Surgery, Heidelberg University Hospital, 3Department of Large Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Michigan State University

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado e reprodutível de citometria de fluxo para identificar subconjuntos de monócito/macrófago e células T usando ensaios de coloração extra e intracelular dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial, utilizando um modelo cirúrgico estabelecido de osteoartrite de murina.

Abstract

A osteoartrite (OA) é uma das doenças musculoesqueléticos mais prevalentes, afetando pacientes que sofrem de dor e limitações físicas. Evidências recentes indicam um potencial componente inflamatório da doença, com células T e monócitos/macrófagos potencialmente associados à patogênese de OA. Outros estudos postularam um papel importante para subconjuntos de ambas as linhagens celulares inflamatórias, como linfócitos de th1, th2, th17 e t-regulatory, e M1, M2, e macrófagos residentes em tecido sinovium. No entanto, a interação entre a resposta celular inflamatória sinovial local e sistêmica e as mudanças estruturais na articulação é desconhecida. Para entender perfeitamente como as células T e os monócitos/macrófagos contribuem para o OA, é importante ser capaz de identificar quantitivamente essas células e seus subconjuntos simultaneamente em tecido sinovial, órgãos linfáticos secundários e sistematicamente (o baço e a medula óssea). Hoje em dia, os diferentes subconjuntos de células inflamatórias podem ser identificados por uma combinação de marcadores de superfície celular tornando a citometria de fluxo multicolorida uma técnica poderosa na investigação desses processos celulares. Neste protocolo, descrevemos etapas detalhadas relativas à colheita de tecido sinovial e órgãos linfáticos secundários, bem como a geração de suspensões de células únicas. Além disso, apresentamos um ensaio de coloração extracelular para identificar monócitos/macrófagos e seus subconjuntos, bem como um ensaio de coloração extra e intracelular para identificar células T e seus subconjuntos dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial. Cada etapa deste protocolo foi otimizada e testada, resultando em um ensaio altamente reprodutível que pode ser utilizado para outros modelos de camundongos OA cirúrgicos e não cirúrgicos.

Introduction

A osteoartrite (OA) é uma doença debilitante e dolorosa que envolve várias patologias de todos os tecidos associados à articulação1. Afetando aproximadamente 3,8% da população global2, o AA é uma das doenças musculoesqueléticos mais prevalentes e deve se tornar a4ª principal causa de incapacidade em todo o mundo até 20203. OA pós-traumático ocorre após uma lesão articular e representa pelo menos 12% de todos os OA e até 25% de OA em articulações suscetíveis como o joelho4,,5. Além disso, a lesão articular aumenta o risco de vida útil de OA em mais de cincovezes 6. Nem todas as lesões com instabilidade aparentemente semelhante continuarão a desenvolver OA e, portanto, a definição de fatores que impulsionam o risco OA de longo prazo permanece desafiadora. É fundamental desenvolver tratamentos eficazes para prevenir e/ou tratar o OA pós-traumático, investigar e definir melhor a patologia, causas e mecanismos específicos da lesão que predispõem à OA1.

OA e sua definição de destruição da cartilagem foram previamente atribuídas inteiramente ao estresse mecânico e, portanto, a OA foi considerada uma doença não inflamatória2. No entanto, estudos mais recentes têm mostrado uma infiltração inflamatória de membranas sinoviais e um aumento de células inflamatórias no tecido sinovial em pacientes com OA em comparação com controles saudáveis2, lançando luz sobre um componente inflamatório como uma potencial força motriz em OA. Outros estudos indicaram que anormalidades tanto no perfil das células T CD4+ quanto em CD8+, bem como monócitos/macrófagos do sistema imunológico inato podem contribuir para a patogênese de OA2,7. Investigações detalhadas sobre essas anormalidades revelaram funções relevantes para vários subconjuntos de células T2, como as populações normando Th18,Th29, Th178 e T (Treg)10,11. Apesar dessa evidência convincente, a relação causal entre a alteração das respostas das células T e o desenvolvimento e progressão da OA ainda é desconhecida2.

Além de células T específicas terem um papel em OA, estudos recentes sugerem que macrófagos polarizados/ativados diferencialmente podem estar associados à patogênese de OA12. Em particular, macrófagos originários de monócitos sanguíneos se acumulam no sinolio e polarizam-se em macrófagos ativados clássicamente (M1) ou macrófagos ativados alternativamente (M2) durante o desenvolvimento de OA, implicando uma correlação entre macrófagos derivados de monocitos e OA13. Em contraste, certos subconjuntos de macrófagos povoam órgãos precocemente durante o desenvolvimento e auto-sustentam seus números em uma matéria independente monócito14. Recentemente, uma função de proteção articular mediada por uma barreira de junção apertada foi mostrada para esses macrófagos residentes em tecido sinovial (STRMs)14. Esses achados indicam que anormalidades em subconjuntos de macrófagos em particular podem desempenhar um papel crucial durante o desenvolvimento do OA. No entanto, as interações entre essa resposta inflamatória celular e as mudanças estruturais na articulação posterior ao trauma são desconhecidas.

Historicamente, a análise das células imunes no tecido sinovial foi restrita à imunohistoquímica (IHC) ou à expressão mRNA por reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) se aproxima15,,16. No entanto, tanto o IHC quanto o RT-PCR não têm a capacidade de identificar vários tipos de células diferentes e seus subconjuntos simultaneamente, limitando assim a aplicabilidade desses métodos. Além disso, o IHC limita-se à análise de pequenas amostras de tecido e pode perder acúmulos de células inflamatórias focais. Ao longo dos últimos anos, uma miríade de marcadores superficiais para vários tipos de células foram desenvolvidos, e subconjuntos de células imunes podem agora ser identificados de forma confiável por combinações distintas desses marcadores. Devido ao progresso técnico constante, os citómetros de fluxo são agora capazes de identificar uma infinidade de diferentes fluorochromes simultaneamente permitindo a análise de grandes painéis de anticorpos multicoloridos.

A citometria de fluxo fornece aos pesquisadores uma técnica poderosa que permite a identificação simultânea e quantificação de uma infinidade de células imunes e seus subconjuntos no nível único das células. Desenvolvemos e otimizamos tanto um ensaio de coloração extracelular para identificar monócitos/macrófagos e seus subconjuntos, bem como um ensaio de coloração extra/intracelular para identificar células T e seus subconjuntos dentro do baço murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial. Cada etapa deste protocolo foi otimizada e testada resultando em um ensaio altamente reprodutível que pode ser utilizado para outros modelos de camundongos OA cirúrgicos e não cirúrgicos17.

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Protocol

O Comitê de Ética Animal do Distrito Sanitário Local de Sydney aprovou todos os procedimentos mencionados neste protocolo. Os camundongos são alojados e cuidados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Health and Medical Research Council of Australia Revised 2010). Para todos os experimentos de 10 a 12 semanas de idade, foram utilizados camundongos C57BL/6 masculinos.

NOTA: Para induzir o OA pós-traumático, foi realizada a desestabilização cirúrgica do menisco medial (DMM) na articulação de sufocamento direito. Informações detalhadas sobre este modelo animal foram publicadas por Glasson et al.18. Em suma, a anestesia geral é induzida em uma câmara de indução usando isoflurano e, posteriormente, mantida usando um cone de nariz. A perna cirúrgica é raspada com uma lâmina de barbear e o local cirúrgico é lavado e esfregado com etanol para minimizar a contaminação. O animal é então movido para o microscópio de operação e colocado em uma toalha estéril e a perna coberta com cortina de papel estéril para isolar o local cirúrgico e minimizar a contaminação. Utilizando o microscópio, é feita uma artrotomia para-patela medial de 0,5 cm, a patela luxou lateralmente, e a almofada de gordura infra-patela elevada para expor o ligamento menisco-tibial medial, que é transectado com fórceps dissecando. A articulação é lavada com soro fisiológico estéril para remover qualquer sangue e a ferida está fechada em três camadas – cápsula articular, tecido subcutâneo (uso de material sutura) e pele (usando cola de tecido cirúrgico). Os métodos descritos neste protocolo, no entanto, podem ser aplicados a outros modelos e métodos para induzir o OA. OA pode ser induzido em ambos os lados do animal, e ao colher tecidos, é importante colher os linfonodos ipsilaterais (drenantes).

1. Isolamento do baço, medula óssea contralateral, linfonodos ipsilaterais drenando o sufoco e tecido sinovial

  1. Eutanize o rato por luxação cervical. Coloque o mouse em uma posição supina sob um microscópio dissecando e limpe o peito, abdômen e pernas com 70% de etanol. Abra cuidadosamente a pele na linha média para o comprimento do abdômen usando uma tesoura reta deixando a cavidade abdominal intacta.
  2. Puxe suavemente a pele do lado direito do animal para longe do músculo subjacente deixando o tecido adiposo subcutâneo preso à pele. Normalmente, tração suave por si só separará a pele e o tecido adiposo subjacente do músculo. As adesões esporádicas devem ser cortadas com uma tesoura fina, a fim de manter a tensão necessária para separar os tecidos ao mínimo e reduzir a chance de danificar os linfonodos. Identifique um cruzamento de três vasos provocando suavemente o tecido adiposo localizado na coxa usando dois fórceps finos curvos. O linfonodo inguinal está localizado na travessia e pode ser identificado por sua forma ovoid e cor ligeiramente mais escura.
  3. Remova o linfonodo inguinal usando fórceps de dissecação fina. Tenha cuidado para não romper a cápsula. Remova a gordura restante na superfície do linfonodo com os fórceps.
  4. Abra a cavidade abdominal e identifique o baço. Corte o baço com uma tesoura fina. Puxe suavemente os intestinos de lado para expor a aorta e sua bifurcação tomando cuidado para não prejudicá-los, a fim de minimizar o risco de contaminação. O linfonodo ilílico está localizado no segmento terminal da aorta abdominal e a origem da artéria ilíaca comum. Remova o linfonodo ilílico direito e prossiga conforme descrito em 1.3.
  5. Remova suavemente a pele de ambos os membros traseiros. Disseque o fêmur esquerdo limpando-o do tecido muscular usando a lâmina e a tesoura fina. Desconecte cuidadosamente tanto o sufocamento quanto a articulação do quadril deixando todo o osso intacto e remova o fêmur.
  6. Identifique o tendão da patela da articulação do sufocamento direito e, em seguida, remova o tecido muscular adjacente proximal a este usando uma tesoura fina até que aproximadamente 5mm de tendão quadríceps proximal à patela seja exposto. Depois disso, corte o tendão do quadríceps aproximadamente 3-4mm proximal à patela para formar uma alça e usando fórceps finos afastá-lo suavemente da articulação. Isso tornará visíveis as bordas da cápsula articular ao fêmur, e usando uma lâmina de bisturi cuidadosamente cortada ao longo das bordas da cápsula articular em ambos os lados, começando pelo fêmur indo em direção à tíbia, a fim de maximizar a quantidade de membrana sinovial que é colhida. Ao cortar é importante manter uma tração suave no tendão do quadríceps e pausar quando o bloco de tecido sinovial está apenas preso à tíbia. Nesta fase, a almofada de gordura intraarticular é agora claramente visível dítala à patela e pode ser suavemente separada da articulação e aspecto anterior do menisco usando a lâmina. Depois disso, corte ao longo da parte restante da cápsula articular (porção tibial) para remover o bloco de tecido sinovial.
    NOTA: Esta etapa tem que ser feita com muita precisão para permitir resultados confiáveis. Após a conclusão da dissecção, o "bloco de tecido sinovial" deve consistir na patela, tendão da patela, almofada de gordura infrapatora, revestimento sinovial de recesso supra e infrapaelar e cápsula articular associada anterior aos ligamentos colaterais. Mantenha todos os tecidos úmidos durante a dissecção usando solução salina de 0,9%.
    NOTA: Coloque cada amostra de bloco de tecido sinovial em um poço separado de uma placa de 24 poços rotulado contendo 1,5 ml de meio RPMI 1640. Combine tanto o ilílico quanto o linfonodo inguinal em um poço e tecidos de piscina de dois ratos.

2. Geração de suspensões celulares únicas de cada tecido

NOTA: Para garantir números celulares suficientes para análise de fluxo, tecidos sinoviais de dois camundongos precisam ser agrupados. No protocolo atual, acumule todos os tecidos dos mesmos dois camundongos para manter a analogia. Além disso, linfonodos ilílicos e inguinais foram combinados para cada animal, resultando em um total de 4 linfonodos para cada amostra. Em geral, os números de células em baço, medula óssea e linfonodos de um animal são suficientes para realizar a análise de fluxo e o protocolo pode ser aplicado. No entanto, ao usar tecidos de apenas um tempo de lise animal pode precisar ser ajustado.

  1. O baço
    1. Coloque os dois baços agrupados em um coador de células de 70 μm em cima de um tubo de 15 mL. Macerar suavemente o baço através do filtro de malha usando um êmbolo de seringa estéril de 3 mL. Lave o coador com frequência com um total de 6 mL de RPMI 1640 médio suplementado com 10% de FBS.
    2. Gire as células (500 x g, 5 min, RT) e resuspense a pelota em 5 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC). Incubar por 5 min no RT e parar a reação diluindo o tampão de lise com 10 mL de PBS. Gire as células (500 x g, 5 min, RT) e repita esta etapa uma vez ou até que não haja mais RBC na pelota.
      NOTA: Refilter a suspensão usando um coador de células de 30 μm em um novo tubo de 15 mL entre as duas rodadas de lise para remover células coaguladas.
    3. Após a lise completa, gire as células (500 x g, 5 min, RT), descarte a supernascedora e a pelota resuspendida em 1 mL de PBS. Conte o número de células vivas em um hemótmetro usando a exclusão azul trypan.
  2. Os linfonodos
    1. Coloque os quatro linfonodos agrupados em um coador de células de 70 μm em cima de um tubo de 15 mL. Provoque suavemente os linfonodos em uma única suspensão celular pressionando com um êmbolo de seringa estéril de 3 mL. Lave o coador com frequência com um total de 6 mL de RPMI com 10% de FBS.
    2. Gire as células (500 x g, 5 min, RT), descarte o supernaspe e resuspense a pelota em 500 μL de PBS. Refilter a suspensão usando um coador de células de 30 μm em um novo tubo de 15 mL para remover células coaguladas. Conte o número de células vivas em um hemótmetro usando a exclusão azul trypan.
  3. A medula óssea
    1. Segure cuidadosamente o fêmur intacto usando um fórceps de tecido sem fraturá-lo. Corte a extremidade do fêmur proximal com uma tesoura afiada, a fim de facilitar a lavagem do osso. Vire o fêmur e posicione uma agulha de 23 G no meio do entalhe intercondílar do fêmur. Ao mesmo tempo em que aplica pressão suave gire a agulha entre o polegar e o dedo indicador, a fim de fazer um furo no entalhe intercondilar para entrar na cavidade óssea.
      NOTA: Às vezes, partículas do osso podem obstruir a agulha após a perfuração do orifício, para evitar uma pressão alta desnecessária durante a descarga de uma troca de agulha antes que a descarga seja recomendada.
    2. Lave o osso com 6 mL de RPMI com 10% de FBS (ou até que a descarga fique branca) usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 23 G em um coador de células de 70 μm que é colocado em um tubo de 15 mL. Pressione suavemente a medula óssea através do coador celular com um êmbolo de uma seringa de 3 mL e enxágue o coador com mais 3 mL de RPMI.
      NOTA: Os ossos devem parecer brancos uma vez que toda a medula tenha sido completamente lavada.
    3. Gire as células (500 x g, 5 min, RT) e resuspense a pelota em 5 mL de tampão de lise RBC. Incubar por 5 min no RT e parar a reação diluindo o tampão de lise com 10 mL de PBS.
    4. Gire as células (500 x g, 5 min, RT), descarte o supernaspe e resuspense a pelota em 1 mL de PBS. Refilter a suspensão usando um coador de células de 30 μm em um novo tubo de 15 mL para remover células coaguladas. Conte o número de células vivas em um hemótmetro usando a exclusão azul trypan.
  4. O tecido sinovial
    1. Pique os dois blocos de tecido sinovial em pequenos pedaços com uma tesoura cirúrgica fina. Transfira as amostras com meio para um tubo de 15 mL. Enxágüe o poço antigo com 0,5 mL adicional de RPMI para obter células remanescentes e tecidos sinoviais, transfira para tubo falcão (volume final de 2 mL).
      DICA: Use uma pipeta de transferência e corte da ponta onde o diâmetro se expande nesta etapa.
    2. Enzima reconstituída e alíquota de acordo com as instruções do fabricante (por exemplo, Liberase). Adicione enzima suficiente para resultar em uma concentração final de 1 Unidade/mL (um total de 2 Unidades por amostra). Digerir a 37 °C por 2 h usando um rotador MACS.
    3. Pare a digestão adicionando 8 mL de RPMI com 10% de FBS e suspensão de células filtrante através de um coador de células de 70 μm em um novo tubo de 15 mL. Enxágüe o antigo tubo de 15 mL com outros 5 mL de RPMI com suspensão de células médias e filtros 10% FCS através do mesmo coador de células no novo tubo (volume final de 15 mL).
    4. Gire as células (500 x g, 10 min, RT), descarte o supernaspe e resuspenque a pelota em 500 μL de PBS. Conte o número de células vivas em um hemótmetro usando a exclusão azul trypan.

3. Alocação de células

  1. Rotule duas placas de 96 poços (forma inferior u) com tipo de tecido, identificação animal e o painel de anticorpos designado. Um total de dois painéis de anticorpos são usados neste protocolo: painel de subconjunto monocito (coloração extracelular) e painel de subconjunto de células T (coloração extra e intracelular).
  2. Forneça 5 x 105 células por poço usando as respectivas suspensões de célula única.
    NOTA: Ao configurar o experimento, avalie o número absoluto de células esperadas por grupo e tipo de tecido (animais tratados têm maior contagem de células em tecidos do que animais de controle). Ao reutilizar a pelota celular durante a última etapa de geração de suspensões de célula única, escolha uma quantidade apropriada de PBS para acabar com uma concentração de 5 x 105 por 200 μL. A placa de 96 poços utilizada aqui pode conter um máximo de 300 μL e, tipicamente, 200 μL é ideal para minimizar o risco de contaminação cruzada devido ao derramamento.
  3. Para cada painel e tipo de tecido, distribua pelo menos 5 x 105 células como controles não manchados em poços que foram claramente marcados.

4. Painel de subconjunto monócito

  1. Realizar a coloração de viabilidade: Células de giro (500 x g,5 min, 4 °C) usando um rotador de placa e lavar as células uma vez com 200 μL de 1x PBS. Prepare uma solução de estoque de corante amina-reativa (mancha de viabilidade) diluída 1:50 em 1x PBS. Posteriormente, resuspenco as pelotas de célula com 100 μL desta solução de estoque resultando em um volume absoluto de 2 μL de mancha de viabilidade por poço. Incubar por 15 min a 4 °C protegido da luz.
    NOTA: A quantidade ideal de mancha de viabilidade necessária deve ser determinada realizando uma curva de titulação de dose. Além disso, a solução diluída de estoque de manchas de viabilidade deve ser usada em um único dia e não ser armazenada. Consulte as instruções do fabricante para obter mais informações sobre como reconstituir, diluir e armazenar a mancha de viabilidade.
  2. Durante a incubação, prepare o coquetel de anticorpos em um volume apropriado de tampão FACS (PBS livre Ca2+ e Mg+ contendo 0,1%BSA e 0,02% de azida de sódio). Lave as células duas vezes com 200 μL de tampão FACS, centrífuga (500 x g, 5 min, 4 °C) e resuspenda cada pelota com 100 μL da mistura de anticorpos ou mistura de controle apropriada. Incubar por 30 min a 4 °C protegido da luz.
    NOTA: Por favor, esteja ciente de que o azida de sódio é tóxico para as células. No protocolo atual, a concentração de azida de sódio no tampão de fluxo é muito baixa (0,02%) e as amostras são executadas imediatamente após a coloração, não causando nenhum problema. Se forem planejados ensaios funcionais a jusante de células classificadas, pode ser benéfico fazer um novo buffer FACS a cada dia de experimentos e não usar qualquer azida de sódio. Ao usar uma infinidade de anticorpos, é aconselhável adicionar uma quantidade apropriada de "Tampão de Mancha Brilhante" ao coquetel de anticorpos para melhorar os resultados.
  3. Lave as células duas vezes com 200 μL de tampão FACS e resuspenja as células em 250 μL de tampão FACS + EDTA (tampão FACS contendo 1 mM EDTA). Transfira amostras para tubos FACS rotulados. Mantenha as amostras a 4 °C e protegia da luz até a aquisição.
    NOTA: As células imunes tendem a ser pegajosas. Para minimizar tanto o risco de bloqueio quanto o número de doublets, recomenda-se adicionar 1 mM EDTA ao buffer de fluxo final.

5. Painel de subconjunto de células T

  1. Realizar a coloração de viabilidade: Células de giro (500 x g,5 min, 4 °C) usando um rotador de placa e lavar as células uma vez com 200 μL de 1x PBS. Prepare uma solução de estoque de corante amina-reativa (mancha de viabilidade) diluída 1:50 em 1x PBS. Posteriormente, resuspenco as pelotas de célula com 100 μL desta solução de estoque resultando em um volume absoluto de 2 μL de mancha de viabilidade por poço. Incubar por 15 min a 4 °C protegido da luz.
  2. Enquanto incuba as amostras, prepare o coquetel de anticorpos de coloração extracelular em um volume apropriado de 1x tampão FACS. Lave as células duas vezes com 200 μL de tampão FACS 1x, gire-as para baixo (500 x g, 5 min, 4 °C) e resuspenda cada pelota com 100 μL da mistura de anticorpos ou mistura de controle apropriada. Incubar por 30 min a 4 °C protegido da luz.
  3. Realize a coloração intracelular com um kit de fixação e permeabilização seguindo as instruções do fabricante. Lave as células duas vezes com 200 μL de 1x tampão FACS e resuspend em 200 μL de buffer de fixação. Incubar por 40 min a 4 °C protegido da luz.
  4. Durante a incubação, prepare o coquetel de anticorpos (coloração intracelular) em um volume apropriado de permeabilização de 1x e tampão de lavagem. Coletar células girando (750 x g, 5 min, 4 °C) e lavar células duas vezes com 200 μL de 1x porm/tampão de lavagem.
    NOTA: A fixação e a permeabilização resultam em células que tendem a ser um pouco mais difíceis de dotizar adequadamente. Para minimizar a perda celular durante as etapas de lavagem subsequentes, aumente a força centrífuga para 750 x g. Alternativamente, um ciclo de fiação mais longo também poderia ser aplicado. No entanto, isso resultaria em um tempo consideravelmente maior que é necessário para preparar as células.
  5. Gire células (750 x g, 5 min, 4 °C) e resuspende cada pelota com 100 μL da mistura de anticorpos ou mistura de controle apropriada. Incubar por 40 min a 4 °C protegido da luz.
  6. Lave as células duas vezes com 200 μL de 1x porm/wash buffer e resuspense as células em 250 μL de tampão FACS + EDTA. Transfira amostras para tubos FACS rotulados. Mantenha as amostras a 4 °C e protegia da luz até a aquisição.
    NOTA: Para cada anticorpo, a concentração ideal precisa ser determinada realizando uma curva de titulação de dose. A concentração entre anticorpos pode diferir drasticamente: CD3 e CD80 foram utilizados com fator de diluição de 1:1, enquanto CD11b e CD4 foram utilizados com fator de diluição de 1:6400. Ao titular a concentração de anticorpos use o mesmo número de células que serão usadas durante os experimentos.

6. Compensação, controles apropriados e gating

  1. Configurando o experimento
    1. Uma vez determinada a concentração ideal de anticorpos, executa controles manchados e únicos para compensação para ajustar para sobreposição espectral.
      NOTA: Execute todos os controles de compensação com células e contas de compensação. Use o que gerar os resultados mais brilhantes (o mais alto MFI de eventos positivos) para compensação. MFI significa intensidade média de fluorescência e é frequentemente usado para descrever e definir a intensidade média do sinal gerado e, portanto, nível de expressão de anticorpos.
    2. Execute controles de fluorescência menos um (FMO) e controles isótipos ao iniciar um novo experimento multicolor. Mais detalhes sobre o FMO foram publicados anteriormente19.
    3. Determine a tensão ideal da Área de Dispersão Para a Frente (FSC-A) e a tensão da Área de Dispersão Lateral (SSC-A) para detectar a população de leucócitos em controles não manchados de cada tipo de tecido.
      NOTA: O processo de fixação e permeabilização altera as dimensões da célula. Assim, as tensões FSC-A e SSC-A para o painel de subconjunto monocito e o painel de subconjunto de células T diferem consideravelmente. Para encontrar as tensões ideais para o Painel de Subconjunto de Células T, use células que foram manchadas com CD3 e portão traseiro em direção às populações leucócitos enquanto ajusta os valores FSC-A e SSC-A.
  2. Estratégia gating
    1. Uma vez determinada a tensão ideal de FSC-A e SSC-A, configure um portão primário na população de leucócitos.
      NOTA: Antes de cada experimento calibrar o citómetro usando contas de calibração de acordo com as instruções do fabricante e executar contas não manchadas. Populações leucócitos de diferentes pontos de tempo devem ter propriedades comparáveis de FSC e SSC (pequenas diferenças entre os tipos de tecido são esperadas e normais). Se FSC e SSC variam problemas consideráveis, atire no citômetro e na geração de amostras.
    2. Exclua os duplos: Plot FSC-A (eixo y) e FSC-H (eixo x). Singlets aparecem como uma diagonal desta trama. Portão em singlets.
    3. Exclua célula morta: Plot FVS510 (mancha de viabilidade) (eixo x) e FSC-A (eixo y). Células mortas aparecerão como eventos positivos, assim portão em células vivas.
      NOTA: As verdadeiras células negativas serão visíveis em controles não manchados. Assim, ajuste este portão para cada conjunto de amostras ao executar os controles não manchados antes de amostras manchadas. Mais gating depende do painel de anticorpos e do tipo celular que é investigado. As estratégias de gating para cada painel utilizado neste protocolo podem ser encontradas na Figura 1 e Figura 4, respectivamente.

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Representative Results

Os resultados representativos do painel de subconjunto de monócito e do painel de subconjunto de células T são descritos abaixo.

A Figura 1 ilustra a estratégia hierárquica de gating para o painel de subconjunto de monócitos em células imunes recolhidas da medula óssea de animais tratados com DMM. A mesma estratégia foi utilizada e verificada em todos os outros tipos de tecidos. Ao configurar o experimento, a tensão de Área de Dispersão Para a Frente (FSC-A) e Área de Dispersão Lateral (SSC-A) foi determinada para cada tipo de tecido identificar monócitos/macrófagos e excluir células T e detritos (G1). Durante cada experimento, foram analisados controles não manchados de cada tipo de tecido e tensão FSC-A e SSC-A ajustadas quando necessário. Espera-se que as tensões permaneçam semelhantes ao longo do tempo, se os parâmetros mudarem drasticamente um bloqueio do citômetro é provável. Além disso, foram utilizados controles não identificados para determinar os verdadeiros negativos para a mancha morta/viva e os portões foram ajustados cada vez que o experimento foi realizado em conformidade(Figura 2A). Ao projetar o experimento, os fluorochromes devem ser escolhidos cuidadosamente, e normalmente marcadores de superfície com baixa expressão são emparelhados com fluorochromes brilhantes (por exemplo, aqui Alexa Fluor 647 foi usada para CD206). Existem várias manchas mortas/vivas que podem ser detectadas por diferentes comprimentos de onda; aqui, FVS510 foi usado.

A Figura 3 ilustra dados amostrais de células imunes isoladas de tecidos sinoviais e manchadas com marcadores de superfície extracelulares 6 semanas após os animais receberem dMM ou cirurgia de controle falso. Todos os subconjuntos podem ser facilmente identificados usando o protocolo tanto no estudo quanto no controle de animais. Em particular, podem ser observadas diferenças entre os grupos para subconjuntos de macrófagos (maior percentual de macrófagos Ly-6C+/MHC-II - (G7) no grupo DMM) e a expressão de macrófagos M1 e M2 (maior percentual de macrófagos M2 no grupo DMM).

A Figura 4 visualiza a estratégia hierárquica de gating para o painel de células T extra e intracelular em células imunes isoladas do baço dos animais tratados com DMM. Os princípios são idênticos aos utilizados para o painel de monócitos. No entanto, o processo de fixação e permeabilização altera o tamanho e a densidade das células. Assim, os parâmetros típicos de FSC e SSC precisam ser determinados usando um processo de back-gating das células CD3+ ao configurar o experimento pela primeira vez para cada tipo de célula. Alguns fluorochromes tendem a agregar ao longo do tempo (por exemplo, PE que foi usado com FoxP3 aqui). Os agregados podem potencialmente modificar os resultados devido ao alto brilho que influencia a sobreposição e compensação espectral. Assim, todos os anticorpos foram vórtices e girados para baixo cada vez antes de seu uso, a fim de diminuir os agregados. Além disso, uma estratégia de gating foi utilizada para reduzir ainda mais a influência dos agregados (G2). Durante a configuração dos experimentos, fluorescência menos um controles (FMOs) foram realizados para cada anticorpo. Os dados da amostra são mostrados na Figura 2B,2C.

As figuras 5 e a Figura 6 mostram células imunes isoladas de linfonodos(Figura 5) e tecido sinovial(Figura 6) e manchadas usando o protocolo do painel de células T 4 semanas após os animais receberem dmm ou cirurgia de controle falso. Os dados mostram maior percentual de células Th1 em animais DMM (G9) em ambos os tecidos. Além disso, a coloração intracelular para células reguladoras T (G11) e Th17 (G12) é bem sucedida usando o protocolo e diferenças podem ser detectadas entre grupos.

Figure 1
Figura 1: Estratégia de gating hierárquico da citometria de fluxo utilizando coloração extracelular para identificar monócitos/macrófagos e seus subconjuntos. As células mielóides são identificadas principalmente usando um gráfico de pontos de dispersão para frente/lado (FSC-A e SSC-A) (G1). Posteriormente, os singlets são detectados usando FSC-A e FSC-H (G2) e, posteriormente, as células vivas são selecionadas (G3). As células do G3 são ainda classificadas usando Ly-6G para identificar neutrófilos (G4) e CD11b para monócito/macrófagos (G5a). O MHC-II é usado para identificar células dendríticas (G5b) entre as células positivas CD11b e F4/80 é usado para selecionar entre macrófagos (G6) e monócitos (G12). Os macrófagos são ainda classificados em seus subconjuntos usando Ly-6C e MHC-II (Ly-6C+/MHC-II- macrófagos (G7); Ly-6C-/MHC-II- macrófagos residentes de tecido (G8); O sangue Ly-6C-/MHC-II+ originou macrófagos (G9)). Mais subconjuntos podem ser selecionados a partir da totalidade dos macrófagos e seus respectivos subconjuntos usando CD206 e CD80 (M1: CD80+/CD206- (G10); M2: CD80-/CD206+ (G11)). Os monócitos são ainda classificados por meio de MHC-II e CD11c (MONócitos MHC-II-/CD11c- monócitos (G13); MHC-II+/CD11c- monócitos (G14)). O nível de ativação é então classificado utilizando-se a expressão de Ly-6C e dividido em baixo (G15), médio (G16) e alto (G17). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Dados de amostra ilustrando controles apropriados tanto no painel monocito quanto no painel de células T. (A) O tecido sinovial foi colhido 6 semanas após a cirurgia DMM (DMM) ou a falsa cirurgia de controle (farsa) e uma única suspensão celular foi manchada usando marcadores de superfície extracelulares. Durante cada experimento, células não manchadas foram usadas para determinar verdadeiros negativos para a mancha morta/viva e para definir portões (Controle). A configuração dos portões usando células não manchadas é mostrada no painel A. (B+C) As células do baço foram colhidas de animais de controle não tratados, uma única suspensão celular gerada e manchada usando marcadores extra e intracelulares. Os controles fluorescentes-menos-um (FMO) foram gerados por células de coloração com todo o painel de anticorpos faltando apenas um anticorpo. Os dados da amostra são mostrados para ambos os anticorpos intracelulares. (B) FMO -RORgt e (C) FMO -Fox-P3. Os FMOs foram realizados para ambos os painéis e utilizados para definir cada portão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Coloração extracelular de monócitos/macrófagos isolados do sinovium de camundongos. Os tecidos amostrais foram coletados 6 semanas após os camundongos receberem dmm-cirurgia (DMM) ou sham-control-surgery (farsa). Mais informações sobre os portões utilizados podem ser encontradas na Figura 1. Os dados da amostra mostram que todos os subconjuntos podem ser identificados de forma confiável e diferenças podem ser vistas entre os grupos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Estratégia de gating hierárquico da citometria de fluxo usando manchas extra e intracelulares para identificar células T e seus subconjuntos. As células T são identificadas principalmente usando um gráfico de pontos de dispersão para frente/lado (FSC-A e SSC-A) (G1). Devido à natureza dos agregados de anticorpos utilizados devem ser excluídos por meio de CD3 e CD4 (G2). Posteriormente, os singlets são detectados usando FSC-A e FSC-H (G3) e, posteriormente, as células vivas são selecionadas (G4). As células do G4 são ainda classificadas usando NK1.1 para identificar células assassinas naturais (G5) e CD3 para identificar células T (G6). O nível de ativação é determinado utilizando-se CD69 (G6b). A partir daí, cd4 e CD8 são usados para identificar células T-killer (cd4-/CD8+ (G7)) e células auxiliares T (CD4+/CD8- (G8)). As células T-helper são classificadas em células Th-X-CR3+/CCR4- (G9)) e Th-2 (C-X-CR3-/CCR4+ (G10)) utilizando C-X-CR3 (CD183) e CCR4 (CD194). Além disso, as células Th-17 (CD25+/RORgt+ (G11)) e células reguladoras T (CD25+/Fox-P3+ (G12)) são identificadas usando marcadores intracelulares. Além disso, subconjuntos de células de memória são identificados a partir de células auxiliares T usando células CD44 e CD62L (CD44-/CD62L+ células ingênuas de memória T (G13); Células de memória T central CD44+/CD62L+ (G14); CD44+/CD62L- células de memória T (G15)). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Coloração extracelular e intracelular de células T isoladas da drenagem de linfonodos de camundongos. Os tecidos amostrais foram coletados 4 semanas após os camundongos receberem dmm-cirurgia (DMM) ou sham-control-surgery (farsa). Mais informações sobre os portões utilizados podem ser encontradas na Figura 4. Os dados da amostra mostram que todos os subconjuntos podem ser identificados de forma confiável e diferenças podem ser vistas entre os grupos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Coloração extracelular e intracelular de células T isoladas do tecido sinovial de camundongos. Os tecidos amostrais foram coletados 4 semanas após os camundongos receberem dmm-cirurgia (DMM) ou sham-control-surgery (farsa). Mais informações sobre os portões utilizados podem ser encontradas na Figura 4. Os dados da amostra mostram que todos os subconjuntos podem ser identificados de forma confiável e diferenças podem ser vistas entre os grupos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Os métodos descritos neste protocolo foram projetados e testados para identificar de forma confiável vários subconjuntos de monócitos/macrófagos e células T dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial em um modelo de murina de osteoartrite (OA). O protocolo atual pode ser facilmente modificado para investigar diferentes tipos de tecidos, ou outros tipos de células, trocando anticorpos, e pode ser usado para modelos murinos alternativos de OA. Ao testar outros tipos de tecidos, é fundamental testar a especificidade de cada anticorpo, pois a expressão dos marcadores superficiais das células imunes varia em cada tecido20. Além disso, ao trocar anticorpos, é necessário realizar uma curva de titulação de dose para estabelecer a concentração ideal de anticorpos, bem como repetir o processo de compensação para lidar com as mudanças na sobreposição espectral.

No protocolo atual, o OA foi induzido usando o mouse DMM modelo18. Os modelos animais mais utilizados e estabelecidos estão no camundongo, pois esta espécie oferece vantagens multiamossas na investigação da fisiopatologia do OA pós-traumático17. No camundongo, em particular, foram descritos modelos cirúrgicos e não cirúrgicos de OA17: sendo o mais comum a desestabilização do menisco medial (DMM), transeção cirúrgica do ligamento cruzado anterior (ACLT) e ruptura da LCA não cirúrgica (ACLR),respectivamente 21. Todos esses modelos animais são adequados para a investigação sobre o papel da inflamação celular na patologia do OA pós-traumático e o protocolo atual foi testado com sucesso para todos os modelos animais mencionados anteriormente em laboratório. Embora todos os modelos animais acima sejam estabelecidos e descritos na literatura, cada um tem suas próprias forças e limitações que foram discutidas em detalhes em outros lugares17 e por isso são discutidas apenas brevemente abaixo. Todos os modelos cirúrgicos estão sujeitos à abordagem cirúrgica, processo de cicatrização da ferida e sua resposta inflamatória associada. Ao avaliar a contribuição das células inflamatórias para o desenvolvimento de OA pós-traumático, essa resposta inflamatória de cura da ferida pode servir como um confundimento, especialmente durante os primeiros pontos de tempo após a intervenção. Além disso, os procedimentos DMM e ACLT precisam ser realizados de forma muito padronizada para minimizar a variabilidade entre os animais. A cirurgia ACLT é muito mais difícil de aprender do que a cirurgia DMM e requer uma exposição cirúrgica maior do que a DMM para identificar e garantir lesões apenas na LCA e evitar danos iatrogênicos a outros tecidos articulares18. A ruptura da LCA não cirúrgica é uma forma padronizada e muito eficiente de induzir o OA pós-traumático. No entanto, é necessário um dispositivo especializado que aplique uma carga compressiva única controlada à tíbia do joelho flexionado. Este dispositivo tem que ser calibrado e testado para obter resultados comparáveis e confiáveis. Além disso, o modelo ACLR induz danos articulares muito graves e progressivos em camundongos com erosão acentuada do planalto tibial medial posterior22 que não é visto com lesão de LCA em outras espécies, incluindo humanos.

A fim de caracterizar de forma abrangente o processo inflamatório e seu componente celular durante o desenvolvimento da OA, é desejável não apenas investigar o tecido sinovial, mas também os linfonodos locais, bem como órgãos linfoides secundários, como o baço e a medula óssea. Os padrões de drenagem linfática da articulação do joelho têm sido caracterizados em camundongos e fluido linfático da articulação do joelho drena tanto o linfonodo ilíaco quanto o linfonodo inguinal em uma dispersão variada23,24. Para facilitar a comparabilidade entre os animais, decidimos neste protocolo agrupar o linfonodo inguinal e ilícito. Em contraste, enquanto está próximo do joelho, o linfonodo popliteal drena o pé traseiro e não desempenha um papel durante processos inflamatórios do joelho.

Camundongos têm um pequeno volume de tecidos sinoviais intra-articular25 e o isolamento das células imunes aqui permanece desafiador. No protocolo atual, técnicas de colheita de tecidos sinoviais foram adaptadas para permitir o isolamento do número máximo de células imunes. Portanto, a técnica de colheita inclui os recessos supra e infrapaelar, bem como a almofada de moda infrapaelar, devido ao seu alto número de células imunes26. O processo de digestão e escolha da enzima foi otimizado para digerir totalmente a membrana sinovial e o tecido gorduroso, deixando o tendão, e a patela e sua cartilagem sem espaço. Assim, o protocolo atual introduz um método reprodutível de colheita de células imunes a partir de tecido sinovial.

A análise da citometria de fluxo tem múltiplas vantagens ao investigar processos imunológicos celulares durante o desenvolvimento de OA; no entanto, essa técnica tem limitações. Devido ao pequeno número de células imunes no tecido sinovial, é necessário reunir amostras de tecido de pelo menos dois animais para obter uma amostra. Devido ao grande número de fluorochromes e cores utilizadas neste protocolo, é preciso prestar atenção especial a uma compensação meticulosa de uma possível sobreposição espectral para cada tipo de tecido e a compensação precisa ser reavaliada consistentemente ao longo do uso desta técnica. Devido ao grande número de marcadores disponíveis e variação considerável entre os estudos para identificar uma determinada população, outra possível limitação é a escolha dos marcadores utilizados para identificar células19. A citometria de fluxo permite quantificação de "eventos", que não necessariamente coordenam para células totais. Para obter uma análise verdadeiramente quantitativa, é preciso adquirir contas de contagem simultaneamente ao executar a análise de fluxo ou contar células em suspensões de células únicas de antemão para obter números absolutos (como feito aqui). Em geral, os princípios deste protocolo (por exemplo, como projetar e configurar um painel de fluxo ou técnicas usadas para preparar suspensões de células únicas) poderiam ser potencialmente adaptados para amostras humanas. No entanto, os marcadores superficiais das células imunes humanas diferem das células murinas e, portanto, anticorpos apropriados precisam ser selecionados e testados. Além disso, a duração da lise RBC e o volume apropriado de buffer precisam ser determinados, pois é mais provável que seja diferente. Antes de adaptar métodos deste protocolo para outras espécies ou tecidos, é necessário testar meticulosamente cada etapa para garantir que os métodos estejam funcionando como planejado.

Apesar de suas limitações, a análise da citometria de fluxo das células imunes continua sendo uma técnica poderosa que permite identificar tanto subconjuntos de células monocíticas quanto células T no nível único celular. Em particular, o protocolo atual introduz uma técnica confiável e reprodutível que pode identificar e quantificar a resposta imune celular durante o desenvolvimento de OA no tecido sinovial e órgãos linfáticos secundários. No futuro, essa técnica pode ajudar a caracterizar a resposta imune em vários modelos de osteoartrite indutores de animais e, a partir de agora, avaliar a eficácia das drogas imuno-moduladoras sobre esta doença debilitante.

Em conclusão, este protocolo de citometria de fluxo descreve um método detalhado e reprodutível para identificar monócitos/macrófagos e subconjuntos de células T utilizando ensaios de coloração extra e intracelular dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial utilizando um modelo de rato de osteoartrite cirúrgica estabelecido.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer andrew Lim, Ph.D. e Giles Best, Ph.D. por sua ajuda na configuração do citómetro de fluxo. Este projeto foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) concedida ao PH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-mouse CD194 (CCR4) BioLegend 131212 T-Cell Panel
Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst BD 566385 Buffers
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 T-Cell Panel
Fixable Viability Stain 510, 100 µg BD 564406 Monocyte Panel
Liberase, Research Grade Roche 5401127001 Enzyme for synovial tissue
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg BD 564985 Monocyte Panel
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg BD 562454 Monocyte Panel
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg BD 742274 T-Cell Panel
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg BD 565250 Monocyte Panel
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg BD 563061 T-Cell Panel
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg BD 557596 T-Cell Panel
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg BD 552775 T-Cell Panel
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg BD 565480 T-Cell Panel
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg BD 565261 T-Cell Panel
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg BD 740664 T-Cell Panel
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg BD 563687 Monocyte Panel
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg BD 563332 T-Cell Panel
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg BD 565411 Monocyte Panel
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg BD 560408 T-Cell Panel
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg BD 563414 Monocyte Panel
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg BD 560593 Monocyte Panel
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg BD 560600 Monocyte Panel
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg BD 564143 T-Cell Panel
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg BD 562894 T-Cell Panel
Red Blood Cell Lysing Buffer N/A N/A Buffers
Transcription Factor Buffer Set 100Tst BD 562574 Buffers

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Haubruck, P., Colbath, A. C., Liu, Y., Stoner, S., Shu, C., Little, C. B. Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model. J. Vis. Exp. (158), e61008, doi:10.3791/61008 (2020).

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