Summary
Hier beschreiben wir ein detailliertes und reproduzierbares Flusszytometrieprotokoll zur Identifizierung von Monozyten-Makrophagen- und T-Zell-Subsets mit extra- und intrazellulären Färbetests innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovialgewebes unter Verwendung eines etablierten chirurgischen Modells der murinen Arthrose.
Abstract
Osteoarthritis (OA) ist eine der häufigsten Muskel-Skelett-Erkrankungen, die Patienten mit Schmerzen und körperlichen Einschränkungen betrifft. Jüngste Erkenntnisse deuten auf eine mögliche entzündliche Komponente der Krankheit hin, wobei sowohl T-Zellen als auch Monozyten/Makrophagen potenziell mit der Pathogenese von OA in Verbindung gebracht werden können. Weitere Studien postulierten eine wichtige Rolle für Teilmengen der beiden entzündlichen Zelllinien, wie Th1, Th2, Th17 und T-regulatorische Lymphozyten, und M1, M2, und Synovium-Gewebe-residenten Makrophagen. Die Wechselwirkung zwischen der lokalen synovialen und systemischen entzündlichen zellulären Reaktion und den strukturellen Veränderungen im Gelenk ist jedoch unbekannt. Um vollständig zu verstehen, wie T-Zellen und Monozyten/Makrophagen zu OA beitragen, ist es wichtig, diese Zellen und ihre Teilmengen gleichzeitig in Synovialgewebe, sekundären Lymphorganen und systemisch (Milz und Knochenmark) quantitativ identifizieren zu können. Heutzutage können die verschiedenen entzündlichen Zelluntermengen durch eine Kombination von Zell-Oberflächen-Markern identifiziert werden, was die mehrfarbige Durchflusszytometrie zu einer leistungsstarken Technik bei der Untersuchung dieser zellulären Prozesse macht. In diesem Protokoll beschreiben wir detaillierte Schritte zur Gewinnung von Synovialgewebe und sekundären lymphatischen Organen sowie zur Erzeugung von einzelzelligen Suspensionen. Darüber hinaus präsentieren wir sowohl einen extrazellulären Färbetest zur Identifizierung von Monozyten/Makrophagen und deren Teilmengen als auch einen extra- und intrazellulären Färbetest zur Identifizierung von T-Zellen und deren Teilmengen innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovials. Jeder Schritt dieses Protokolls wurde optimiert und getestet, was zu einem hochreproduzierbaren Assay führte, der für andere chirurgische und nicht-chirurgische OA-Mausmodelle verwendet werden kann.
Introduction
Osteoarthritis (OA) ist eine schwächende und schmerzhafte Krankheit mit verschiedenen Pathologien aller Gewebe, die mit dem Gelenk1verbunden sind. OA betrifft etwa 3,8 % der Weltbevölkerung2, OA ist eine der am weitesten verbreiteten Muskel-Skelett-Erkrankungen und es soll die4. führende Ursache von Behinderungen weltweit bis 20203werden. Posttraumatische OA tritt nach einer Gelenkverletzung auf und macht mindestens 12% aller OA und bis zu 25% der OA in anfälligen Gelenken wie dem Knie4,5aus. Darüber hinaus erhöht Gelenkverletzung das Lebenslange Risiko von OA um mehr als das Fünffachevon 6. Nicht alle Verletzungen mit scheinbar ähnlicher Instabilität werden OA entwickeln, und daher bleiben die Definition von Faktoren, die das langfristige OA-Risiko antreiben, herausfordernd. Es ist von entscheidender Bedeutung, um wirksame Behandlungen zu entwickeln, um posttraumatische OA zu verhindern und/oder zu behandeln, die verletzungsspezifische Pathologie, Ursachen und Mechanismen zu untersuchen und besser zu definieren, die OA1prädisponieren.
OA und seine definierende Knorpelzerstörung wurde früher vollständig auf mechanische Beanspruchung zurückgeführt und oA wurde daher als nicht-entzündliche Erkrankung angesehen2. Jedoch, neuere Studien haben gezeigt, eine entzündliche Infiltration von Synovialmembranen und eine Zunahme der entzündlichen Zellen im Synovialgewebe bei Patienten mit OA im Vergleich zu gesunden Kontrollen2, Licht auf eine entzündliche Komponente als potenzielle treibende Kraft in OA. Weitere Studien zeigten, dass Anomalien sowohl im CD4+ als auch im CD8+ T-Zell-Profil sowie Monozyten/Makrophagen des angeborenen Immunsystems zur Pathogenese von OA2,7beitragen können. Detaillierte Untersuchungen dieser Anomalien ergaben relevante Rollen für verschiedene T-Zell-Teilmengen2, wie Th18, Th29, Th178 und T regulatorische (Treg) Populationen10,11. Trotz dieser überzeugenden Beweise ist der kausale Zusammenhang zwischen der Veränderung der T-Zell-Antworten und der Entwicklung und Progression von OA noch unbekannt2.
Zusätzlich zu bestimmten T-Zellen, die eine Rolle in OA spielen, deuten neuere Studien darauf hin, dass differenziell polarisierte/aktivierte Makrophagen mit der Pathogenese von OA12in Verbindung gebracht werden können. Insbesondere akkumulieren Makrophagen aus Blutmonozyten im Synovium und polarisieren entweder in klassisch aktivierte Makrophagen (M1) oder alternativ aktivierte Makrophagen (M2) während der OA-Entwicklung, was eine Korrelation zwischen monozytenabgeleiteten Makrophagen und OA13impliziert. Im Gegensatz dazu bevölkern bestimmte Teilmengen von Makrophagen Organe früh während der Entwicklung und unterstützen ihre Zahl in einer monozytenunabhängigen Materie14. Kürzlich wurde eine gemeinsame Schutzfunktion gezeigt, die durch eine enge Kreuzungsbarriere vermittelt wurde, für diese synovial-geweberesidenten Makrophagen (STRMs)14. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Anomalien in bestimmten Makrophagen-Teilmengen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von OA spielen können. Die Wechselwirkungen zwischen dieser entzündlichen zellulären Reaktion und den strukturellen Veränderungen im Gelenk nach dem Trauma sind jedoch unbekannt.
Historisch gesehen beschränkte sich die Analyse von Immunzellen im Synovialgewebe auf die Immunhistochemie (IHC) oder mRNA-Expression durch Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Ansätze15,16. Sowohl IHC als auch RT-PCR sind jedoch nicht in der Lage, mehrere verschiedene Zelltypen und deren Teilmengen gleichzeitig zu identifizieren, wodurch die Anwendbarkeit dieser Methoden eingeschränkt wird. Darüber hinaus beschränkt sich IHC auf die Analyse von kleinen Gewebeproben und kann fokale entzündliche Zellansammlungen verpassen. In den letzten Jahren wurden unzählige Oberflächenmarker für verschiedene Zelltypen entwickelt, und Untermengen von Immunzellen können nun durch unterschiedliche Kombinationen dieser Marker zuverlässig identifiziert werden. Aufgrund des stetigen technischen Fortschritts sind Durchflusszytometer nun in der Lage, eine Vielzahl verschiedener Fluorchrome gleichzeitig zu identifizieren, was die Analyse großer mehrfarbiger Antikörperplatten ermöglicht.
Die Durchflusszytometrie bietet den Forschern eine leistungsstarke Technik, die die gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung einer Vielzahl von Immunzellen und deren Teilmengen auf Einzelzellebene ermöglicht. Wir haben sowohl einen extrazellulären Färbetest zur Identifizierung von Monozyten/Makrophagen und deren Teilmengen als auch einen extra-intrazellulären Färbetest entwickelt und optimiert, um T-Zellen und ihre Untergruppen in muriner Milz, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe zu identifizieren. Jeder Schritt dieses Protokolls wurde optimiert und getestet, was zu einem hochreproduzierbaren Assay führte, der für andere chirurgische und nicht-chirurgische OA-Mausmodelle17verwendet werden kann.
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Protocol
Die Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee hat alle in diesem Protokoll genannten Verfahren genehmigt. Mäuse werden gemäß dem Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Health and Medical Research Council of Australia Revised 2010) untergebracht und gepflegt. Für alle Experimente wurden 10-12 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse eingesetzt.
HINWEIS: Um posttraumatische OA zu induzieren, wurde eine chirurgische Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM) im rechten Stimmlergelenk durchgeführt. Detaillierte Informationen zu diesem Tiermodell wurden von Glasson et al.18veröffentlicht. Kurz gesagt, die Vollnarkose wird in einer Induktionskammer mit Isofluran induziert und anschließend mit einem Nasenkegel aufrechterhalten. Das chirurgische Bein wird mit einer Rasierklinge rasiert und die chirurgische Stelle wird gewaschen und mit Ethanol getupft, um die Kontamination zu minimieren. Das Tier wird dann zum Operationsmikroskop bewegt und auf ein steriles Handtuch gelegt und das Bein mit sterilem Papierdraps drapiert, um die chirurgische Stelle zu isolieren und die Kontamination zu minimieren. Mit Hilfe des Mikroskops wird eine 0,5 cm mediale Para-Patella-Arthrotomie hergestellt, die Patella seitlich luxiert und das Infra-Patella-Fettpolster erhöht, um das mediale Menisko-Tibialband freizulegen, das mit sezierenden Zangen transsektiert wird. Das Gelenk wird mit steriler Herzwäsche gespült, um Blut zu entfernen und die Wunde wird in drei Schichten geschlossen – Gelenkkapsel, Subkutangewebe (mit Nahtmaterial) und Haut (mit chirurgischem Gewebekleber). Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden können jedoch auf andere Modelle und Methoden zum Induzieren von OA angewendet werden. OA kann auf beiden Seiten des Tieres induziert werden, und bei der Ernte von Geweben ist es wichtig, die ipsilateralen (draining) Lymphknoten zu ernten.
1. Isolierung der Milz, kontralaterales Knochenmark, ipsilaterale Lymphknoten, die das Stifle und das Synovialgewebe entwässern
- Euthanisieren Sie die Maus durch zervikale Dislokation. Legen Sie die Maus in eine Supine-Position unter einem Sezieren mikroskop und wischen Sie Brust, Bauch und Beine mit 70% Ethanol ab. Öffnen Sie die Haut an der Mittellinie vorsichtig für die Länge des Bauches mit einer geraden Schere, die die Bauchhöhle intakt lässt.
- Ziehen Sie die Haut auf der rechten Seite des Tieres vorsichtig vom darunter liegenden Muskel weg und lassen Sie das subkutane Fettgewebe an der Haut hängen. Normalerweise trennt die sanfte Traktion allein die Haut und das darunter liegende Fettgewebe vom Muskel. Sporadische Haftungen sollten mit einer feinen Schere durchgeschnitten werden, um die spannung zu halten, die notwendig ist, um Gewebe zu trennen und die Wahrscheinlichkeit zu verringern, die Lymphknoten zu schädigen. Identifizieren Sie eine Kreuzung von drei Gefäßen, indem Sie das fette Gewebe am Oberschenkel mit zwei gekrümmten feinen Zangen sanft herausheben. Der Leistenlymphknoten befindet sich an der Kreuzung und kann durch seine eiförmige Form und etwas dunklere Farbe identifiziert werden.
- Entfernen Sie den Leistenlymphknoten mit feiner Sezieren der Zange. Achten Sie darauf, die Kapsel nicht zu brechen. Entfernen Sie das restliche Fett auf der Oberfläche des Lymphknotens mit der Zange.
- Öffnen Sie die Bauchhöhle und identifizieren Sie die Milz. Die Milz mit einer feinen Schere ausschneiden. Ziehen Sie den Darm vorsichtig zur Seite, um die Aorta und ihre Bifurkation freizulegen, die darauf achtet, sie nicht zu beschädigen, um das Risiko einer Kontamination zu minimieren. Der iliac Lymphknoten befindet sich am Endsegment der Bauchaorta und dem Ursprung der gemeinsamen Iliasarterie. Entfernen Sie den rechten iliac Lymphknoten und gehen Sie wie in 1.3 beschrieben.
- Entfernen Sie vorsichtig die Haut beider Hinterbeine. Sezieren Sie den linken Oberschenkelknochen, indem Sie ihn mit der Klinge und der feinen Schere aus dem Muskelgewebe reinigen. Trennen Sie vorsichtig sowohl das Ersticken als auch das Hüftgelenk und lassen Sie den gesamten Knochen intakt und entfernen Sie den Oberschenkelknochen.
- Identifizieren Sie die Patellasehne des rechten Stäubegelenks, dann entfernen Sie das angrenzende Muskelgewebe proximal, um dies mit einer feinen Schere, bis etwa 5mm Quadrizepssehne proximal zur Patella ausgesetzt ist. Danach durchschneiden Sie durch die Quadrizepssehne ca. 3-4mm proximal zur Patella, um einen Griff zu bilden und mit feinen Zangen sanft vom Gelenk wegzuziehen. Dies wird die Ränder der Gelenkkapsel Befestigung an Oberschenkelknochen sichtbar machen, und mit einem Skalpell Klinge sorgfältig entlang der Kanten der Gelenkkapsel auf beiden Seiten geschnitten, beginnend am Oberschenkelin in Richtung tibia, um die Menge der Synovialmembran, die geerntet wird zu maximieren. Beim Schneiden ist es wichtig, eine sanfte Traktion auf der Quadrizepssehne zu erhalten und innezuhalten, wenn der Synovialgewebeblock nur an der Tibia befestigt ist. In diesem Stadium ist das intraartikuläre Fettpolster nun deutlich sichtbar distal zur Patella und kann mit der Klinge sanft vom Gelenk und vorderen Aspekt der Meniszien gelöst werden. Danach schneiden Sie entlang des verbleibenden Teils der Gelenkkapsel (tibialen Teil), um den Synovialgewebeblock zu entfernen.
HINWEIS: Dieser Schritt muss sehr präzise durchgeführt werden, um zuverlässige Ergebnisse zu ermöglichen. Nach Abschluss der Zerlegung sollte der "Synovialgewebeblock" aus Patella, Patellasehnenartde, Infrapatellarfettpad, supra- und infrapatellarer Aussparung synovialauskleidung und der damit verbundenen Gelenkkapsel vor den Kollateralbändern bestehen. Halten Sie alle Gewebe feucht während der Zerlegung mit 0,9% Saline-Lösung.
HINWEIS: Legen Sie jede Synovialgewebeblockprobe in einen separaten Brunnen einer gekennzeichneten 24-Well-Platte mit 1,5 ml RPMI 1640 Medium. Kombinieren Sie sowohl den Ilias als auch den Leistenlymphknoten in einem Brunnen und bündeln Sie Gewebe von zwei Mäusen.
2. Erzeugung von einzelzelligen Suspensionen aus jedem Gewebe
HINWEIS: Um ausreichende Zellzahlen für die Strömungsanalyse zu gewährleisten, müssen Synovialgewebe von zwei Mäusen gepoolt werden. Im aktuellen Protokoll, bündeln Sie alle Gewebe von den gleichen beiden Mäusen, um Analogie zu erhalten. Darüber hinaus wurden iliac und leistende Lymphknoten für jedes Tier kombiniert, was zu insgesamt 4 Lymphknoten für jede Probe führte. Im Allgemeinen reichen Zellnummern in Milz, Knochenmark und Lymphknoten eines Tieres aus, um eine Strömungsanalyse durchzuführen, und das Protokoll kann angewendet werden. Bei der Verwendung von Geweben aus nur einer Tierlysing-Zeit müssen jedoch möglicherweise Anpassungen erforderlich sein.
- Die Milz
- Legen Sie die beiden gepoolten Milz auf ein 70 m Zellsieb auf einem 15 ml Rohr. Die Milz vorsichtig durch den Netzfilter mit einem sterilen Spritzenkolben von 3 ml mazerieren. Spülen Sie das Sieb häufig mit insgesamt 6 ml RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10% FBS.
- Drehen Sie die Zellen (500 x g, 5 min, RT) und setzen Sie das Pellet in 5 ml roter Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer wieder auf. Inkubieren Sie für 5 min bei RT und stoppen Sie die Reaktion durch Verdünnung des Lysepuffers mit 10 ml PBS. Drehen Sie die Zellen (500 x g, 5 min, RT) und wiederholen Sie diesen Schritt einmal oder bis sich kein RBC mehr im Pellet befinden.
HINWEIS: Filtern Sie die Suspension mit einem 30-m-Zellsieb in ein neues 15 ml-Rohr zwischen den beiden Lysing-Runden, um koagulierte Zellen zu entfernen. - Nach Abschluss der Lysing drehen Sie die Zellen (500 x g, 5 min, RT), verwerfen Überstand und resuspendpellet in 1 ml PBS. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypan-Blauausschluss.
- Die Lymphknoten
- Legen Sie die vier gepoolten Lymphknoten auf ein 70 m Zellsieb auf einem 15 ml-Rohr. Necken Sie die Lymphknoten vorsichtig in eine einzellige Suspension, indem Sie sie mit einem sterilen 3 ml Spritzenkolben pressen. Spülen Sie das Sieb häufig mit insgesamt 6 ml RPMI mit 10% FBS.
- Drehen Sie die Zellen (500 x g, 5 min, RT), entsorgen Sie Überstand und setzen Sie das Pellet in 500 l PBS wieder auf. Filtern Sie die Suspension mit einem 30-m-Zellsieb in ein neues 15 ml-Rohr, um koagulierte Zellen zu entfernen. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypan-Blauausschluss.
- Das Knochenmark
- Greifen Sie den intakten Oberschenkelknochen vorsichtig mit einer Gewebe-Daumenzange, ohne ihn zu brechen. Schneiden Sie das Ende des proximalen Oberschenkelknochens mit einer scharfen Schere ab, um die Spülung des Knochens zu erleichtern. Drehen Sie den Oberschenkelknochen um und positionieren Sie eine 23 G Nadel in der Mitte der interkondylaren Kerbe des Oberschenkelknochens. Während des sanften Drucks drehen Sie die Nadel zwischen Daumen und Zeigefinger, um ein Loch in die intercondylar Kerbe zu bohren, um in die Knochenhöhle einzutreten.
HINWEIS: Manchmal können Partikel des Knochens die Nadel nach dem Bohren des Lochs behindern, um unnötigen hohen Druck beim Spülen eines Nadelwechsels vor dem Spülen zu vermeiden. - Spülen Sie den Knochen mit 6 ml RPMI mit 10% FBS (oder bis der Flush weiß wird) mit einer 10 ml Spritze mit einer 23 G Nadel auf ein 70-m-Zellsieb, das auf ein 15 ml-Rohr gelegt wird. Drücken Sie das Knochenmark vorsichtig durch das Zellsieb mit einem Kolben einer 3 ml Spritze und spülen Sie das Sieb mit weiteren 3 ml RPMI.
HINWEIS: Die Knochen sollten weiß erscheinen, sobald das gesamte Mark vollständig ausgespült wurde. - Drehen Sie die Zellen (500 x g, 5 min, RT) und setzen Sie das Pellet in 5 ml RBC-Lysepuffer wieder auf. Inkubieren Sie für 5 min bei RT und stoppen Sie die Reaktion durch Verdünnung des Lysepuffers mit 10 ml PBS.
- Drehen Sie die Zellen (500 x g, 5 min, RT), entsorgen Sie Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml PBS wieder auf. Filtern Sie die Suspension mit einem 30-m-Zellsieb in ein neues 15 ml-Rohr, um koagulierte Zellen zu entfernen. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypan-Blauausschluss.
- Greifen Sie den intakten Oberschenkelknochen vorsichtig mit einer Gewebe-Daumenzange, ohne ihn zu brechen. Schneiden Sie das Ende des proximalen Oberschenkelknochens mit einer scharfen Schere ab, um die Spülung des Knochens zu erleichtern. Drehen Sie den Oberschenkelknochen um und positionieren Sie eine 23 G Nadel in der Mitte der interkondylaren Kerbe des Oberschenkelknochens. Während des sanften Drucks drehen Sie die Nadel zwischen Daumen und Zeigefinger, um ein Loch in die intercondylar Kerbe zu bohren, um in die Knochenhöhle einzutreten.
- Das Synovialgewebe
- Die beiden Synovialgewebeblöcke mit einer feinen chirurgischen Schere in winzige Stücke zerkleinern. Übertragen Sie die Proben mit Medium in ein 15 ml Rohr. Spülen Sie den alten Brunnen mit zusätzlichen 0,5 ml RPMI, um verbleibende Zellen und Synovialgewebe zu erhalten, in das Falkenrohr zu übertragen (Endvolumen 2 ml).
TIPP: Verwenden Sie eine Transferpipette und schneiden Sie die Spitze, wo sich der Durchmesser in diesem Schritt vergrößert. - Rekonstituieren Enzym und aliquot nach Herstelleranweisungen (z.B. Liberase). Fügen Sie genügend Enzym hinzu, um eine Endkonzentration von 1 Einheit/ml (insgesamt 2 Einheiten pro Probe) zu erreichen. Mit einem MACS-Rotator bei 37 °C für 2 h verdauen.
- Beenden Sie die Verdauung, indem Sie 8 ml RPMI mit 10% FBS und Filterzellensuspension durch ein 70-m-Zellsieb in ein neues 15 ml-Rohr geben. Spülen Sie das alte 15 ml-Rohr mit weiteren 5 ml RPMI mit 10% FCS-Medium und Filterzellensuspension durch gleiches Zellsieb in das neue Rohr (15 ml Endvolumen).
- Drehen Sie die Zellen (500 x g, 10 min, RT), entsorgen Sie Überstand und setzen Sie das Pellet in 500 l PBS wieder auf. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypan-Blauausschluss.
- Die beiden Synovialgewebeblöcke mit einer feinen chirurgischen Schere in winzige Stücke zerkleinern. Übertragen Sie die Proben mit Medium in ein 15 ml Rohr. Spülen Sie den alten Brunnen mit zusätzlichen 0,5 ml RPMI, um verbleibende Zellen und Synovialgewebe zu erhalten, in das Falkenrohr zu übertragen (Endvolumen 2 ml).
3. Zuweisung von Zellen
- Beschriften Sie zwei 96-Well-Platten (U-Boden-Form) mit Gewebetyp, Tier-ID und dem dafür vorgesehenen Antikörper-Panel. In diesem Protokoll werden insgesamt zwei Antikörper-Panels verwendet: Monozyten-Untersatz-Panel (extrazelluläre Färbung) und T-Zell-Untermengenpanel (extra- und intrazelluläre Färbung).
- Stellen Sie 5 x 105 Zellen pro Brunnen mit den jeweiligen einzelzelligen Suspensionen zur Verfügung.
ANMERKUNG: Bewerten Sie beim Einrichten des Experiments die absolute Anzahl der Zellen, die pro Gruppe und Gewebetyp erwartet werden (behandelte Tiere haben eine höhere Zellzahl in Geweben als Kontrolltiere). Wenn Sie das Zellpellet während des letzten Schritts der Erzeugung von Einzelzellsuspensionen wieder aufhängen, wählen Sie eine angemessene Menge an PBS, um am Ende eine Konzentration von 5 x 105 pro 200 l zu haben. Die hier verwendete 96-Well-Platte kann maximal 300 l aufnehmen, und in der Regel sind 200 l ideal, um das Risiko einer Kreuzkontamination durch Verschüttung zu minimieren. - Verteilen Sie für jedes Panel und jeden Gewebetyp mindestens 5 x 105 Zellen als ungefärbte Kontrollen in gut markierten Brunnen.
4. Monozyten-Teilsatz-Panel
- Durchführbarkeitsfärbung durchführen: Spinzellen (500 x g, 5 min, 4 °C) mit einem Plattenspinner und waschen Sie die Zellen einmal mit 200 l 1x PBS. Bereiten Sie eine Stammlösung aus zellimpermeant Amin-reaktivem Farbstoff (Lebensfähigkeitsfleck) verdünnt 1:50 in 1x PBS. Danach setzen Sie die Zellpellets mit 100 l dieser Stammlösung wieder auf, was zu einem absoluten Volumen von 2 l Lebensfähigkeitsfleck pro Bohrgut führt. 15 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
HINWEIS: Die optimale Menge an Rentabilität Fleck benötigt sollte durch die Durchführung einer Dosis Titration Kurve bestimmt werden. Darüber hinaus sollte die verdünnte Lebensfähigkeits-Fleckenstofflösung an einem einzigen Tag verwendet und nicht gelagert werden. Weitere Informationen zur Rekonstituieren, Verdünnung und Lagerung des Rentabilitätsflecks finden Sie in den Anweisungen des Herstellers. - Während der Inkubation den Cocktail von Antikörpern in einem geeigneten Volumen FACS-Puffer (Ca2+ und Mg+ freie PBS mit 0,1%BSA und 0,02% Natriumazid) zubereiten. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 l FACS-Puffer, Zentrifuge (500 x g, 5 min, 4 °C) und setzen Sie jedes Pellet mit 100 l des Antikörpergemisches oder eines geeigneten Kontrollgemisches wieder auf. 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass Natriumazid für Zellen giftig ist. Im aktuellen Protokoll ist die Natriumazidkonzentration im Strömungspuffer sehr gering (0,02%) und Proben werden so unmittelbar nach der Färbung ausgeführt, was kein Problem verursacht. Wenn nachgelagerte funktionelle Assays von sortierten Zellen geplant sind, könnte es von Vorteil sein, jeden Tag der Experimente einen frischen FACS-Puffer zu bilden und kein Natriumazid zu verwenden. Bei der Verwendung einer Vielzahl von Antikörpern, Es wird empfohlen, eine angemessene Menge an "Brilliant Stain Buffer" zu dem Cocktail von Antikörpern hinzufügen, um die Ergebnisse zu verbessern. - Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 L FACS-Puffer und setzen Sie die Zellen in 250 L FACS + EDTA-Puffer (FACS-Puffer mit 1 mM EDTA) wieder aus. Übertragen Sie Proben in beschriftete FACS-Rohre. Proben bei 4 °C aufbewahren und bis zur Erfassung vor Licht schützen.
HINWEIS: Immunzellen neigen dazu, klebrig zu sein. Um sowohl das Risiko einer Verstopfung als auch die Anzahl der Doublets zu minimieren, wird empfohlen, dem endgültigen Durchflusspuffer 1 mM EDTA hinzuzufügen.
5. T-Zell-Teilmengen-Panel
- Durchführbarkeitsfärbung durchführen: Spinzellen (500 x g, 5 min, 4 °C) mit einem Plattenspinner und waschen Sie die Zellen einmal mit 200 l 1x PBS. Bereiten Sie eine Stammlösung aus zellimpermeant Amin-reaktivem Farbstoff (Lebensfähigkeitsfleck) verdünnt 1:50 in 1x PBS. Danach setzen Sie die Zellpellets mit 100 l dieser Stammlösung wieder auf, was zu einem absoluten Volumen von 2 l Lebensfähigkeitsfleck pro Bohrgut führt. 15 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
- Während der Inkubation der Proben bereiten Sie den extrazellulären Färbe-Antikörper-Cocktail in einem entsprechenden Volumen von 1x FACS-Puffer vor. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 l 1x FACS Puffer, drehen Sie sie nach unten (500 x g, 5 min, 4 °C) und setzen Sie jedes Pellet mit 100 l des Antikörpergemisches oder eines geeigneten Kontrollgemisches wieder auf. 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
- Führen Sie die intrazelluläre Färbung mit einem Fixierungs- und Permeabilisationskit nach den Anweisungen des Herstellers durch. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 l 1x FACS-Puffer und suspendieren Sie in 200 l Fixationspuffer. 40 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
- Während der Inkubation den Cocktail von Antikörpern (intrazelluläre Färbung) in einem geeigneten Volumen von 1x Permeabilisation und Waschpuffer vorbereiten. Sammeln Sie Zellen durch Spinnen (750 x g, 5 min, 4 °C) und waschen Sie Zellen zweimal mit 200 l von 1x perm/Waschpuffer.
HINWEIS: Fixierung und Permeabilisierung führt zu Zellen, die in der Regel etwas schwieriger zu pellet. Um den Zellverlust während der nachfolgenden Waschschritte zu minimieren, erhöhen Sie die Fliehkraft auf 750 x g. Alternativ könnte auch ein längerer Spinnzyklus angewendet werden. Dies würde jedoch zu einer wesentlich längeren Zeit führen, die für die Vorbereitung der Zellen erforderlich ist. - Spinzellen (750 x g, 5 min, 4 °C) und jedes Pellet mit 100 l des Antikörpergemischs oder des geeigneten Kontrollgemisches wieder aufhängen. 40 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 L 1x Perm/Waschpuffer und setzen Sie die Zellen in 250 l FACS + EDTA-Puffer wieder auf. Übertragen Sie Proben in beschriftete FACS-Rohre. Proben bei 4 °C aufbewahren und bis zur Erfassung vor Licht schützen.
HINWEIS: Für jeden Antikörper muss die optimale Konzentration durch DieDurchführung einer Dosistitrationskurve bestimmt werden. Die Konzentration zwischen Antikörpern kann sich drastisch unterscheiden: CD3 und CD80 wurde mit einem Verdünnungsfaktor von 1:1 verwendet, während CD11b und CD4 mit einem Verdünnungsfaktor von 1:6400 verwendet wurden. Verwenden Sie bei der Titierung der Antikörperkonzentration die gleiche Anzahl von Zellen, die während der Experimente verwendet werden.
6. Entschädigung, angemessene Kontrollen und Gating
- Einrichten des Experiments
- Sobald die optimale Antikörperkonzentration bestimmt wurde, laufen sie ungefärbt und einzelne gebeizte Kontrollen zur Kompensation, um sich an spektralen Überlappungen anzupassen.
HINWEIS: Führen Sie alle Kompensationskontrollen mit Zellen und Kompensationsperlen aus. Verwenden Sie alles, was die hellsten Ergebnisse (höchstem MFI positiver Ereignisse) für die Kompensation generiert. MFI steht für mittlere Fluoreszenzintensität und wird häufig verwendet, um die mittlere Intensität des erzeugten Signals und damit die Höhe der Antikörperexpression zu beschreiben und zu definieren. - Führen Sie Fluoreszenz minus eins (FMO) und Isotypsteuerungen aus, wenn Sie ein neues Multicolor-Experiment starten. Weitere Einzelheiten zum FMO wurden bereits veröffentlicht19.
- Bestimmen Sie die optimale Forward Scatter Area (FSC-A) Spannung und Side Scatter Area (SSC-A) Spannung, um die Leukozytenpopulation in ungefärbten Kontrollen jedes Gewebetyps zu erkennen.
HINWEIS: Der Fixierungs- und Permeabilisierungsprozess ändert die Abmessungen der Zelle. Somit unterscheiden sich die FSC-A- und SSC-A-Spannungen für das Monocyte Subset Panel und das T Cell Subset Panel erheblich. Um die optimalen Spannungen für das T Cell Subset Panel zu finden, verwenden Sie Zellen, die einzeln mit CD3 und back gate in Richtung der Leukozytenpopulationen gefärbt wurden, während Sie die FSC-A- und SSC-A-Werte anpassen.
- Sobald die optimale Antikörperkonzentration bestimmt wurde, laufen sie ungefärbt und einzelne gebeizte Kontrollen zur Kompensation, um sich an spektralen Überlappungen anzupassen.
- Gating-Strategie
- Sobald die optimale FSC-A- und SSC-A-Spannung ermittelt wurde, richten Sie ein primäres Tor auf die Leukozytenpopulation ein.
HINWEIS: Vor jedem Experiment kalibrieren Sie das Zytometer mit Kalibrierperlen gemäß den Anweisungen des Herstellers und führen Sie ungefärbte Perlen. Leukozytenpopulationen mit unterschiedlichen Zeitpunkten sollten vergleichbare FSC- und SSC-Eigenschaften aufweisen (leichte Unterschiede zwischen den Gewebetypen werden erwartet und normal). Wenn FSC und SSC variiert erhebliche Probleme schießen das Zytometer und Probe-Generierung. - Doppelgänger ausschließen: Plot FSC-A (y-Achse) und FSC-H (x-Achse). Singlets werden als Diagonale dieses Diagramms angezeigt. Tor auf Singlets.
- Totzelle ausschließen: Plot FVS510 (Lebensfähigkeitsfleck) (x-Achse) und FSC-A (y-Achse). Abgestorbene Zellen erscheinen als positive Ereignisse, also Tor auf lebenden Zellen.
HINWEIS: Echte negative Zellen werden in nicht befleckten Steuerelementen sichtbar. Passen Sie daher dieses Tor für jeden Satz von Proben an, wenn Sie die ungefärbten Steuerelemente vor den gebeizten Proben ausführen. Weitere Gating hängt von der Antikörper-Panel und Zelltyp, die untersucht wird. Gating-Strategien für jedes in diesem Protokoll verwendete Panel finden Sie in Abbildung 1 bzw. Abbildung 4.
- Sobald die optimale FSC-A- und SSC-A-Spannung ermittelt wurde, richten Sie ein primäres Tor auf die Leukozytenpopulation ein.
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Representative Results
Repräsentative Ergebnisse sowohl aus dem Monozyten-Teilmengenbereich als auch aus dem T-Zell-Teilmengenbereich werden unten beschrieben.
Abbildung 1 zeigt die hierarchische Gating-Strategie für das Monozyten-Untersatzpanel auf Immunzellen, die aus Knochenmark von DMM-behandelten Tieren gewonnen wurden. Die gleiche Strategie wurde in allen anderen Gewebetypen verwendet und verifiziert. Beim Einrichten des Experiments wurde für jeden Gewebetyp die Spannung des Vorwärtsstreubereichs (FSC-A) und des Side Scatter Area (SSC-A) ermittelt, um Monozyten/Makrophagen zu identifizieren und T-Zellen und Schmutz (G1) auszuschließen. Während jedes Experiments wurden ungefärbte Kontrollen jedes Gewebetyps analysiert und FSC-A und SSC-A Spannung bei Bedarf angepasst. Es wird erwartet, dass die Spannungen im Laufe der Zeit ähnlich bleiben, wenn sich die Parameter drastisch ändern, ist eine Verstopfung des Zytometers wahrscheinlich. Darüber hinaus wurden ungefärbte Kontrollen verwendet, um die wahren Negative für den toten/lebendigen Fleck zu bestimmen, und Die Tore wurden jedes Mal angepasst, wenn das Experiment entsprechend durchgeführt wurde (Abbildung 2A). Bei der Entwicklung des Experiments sollten Fluorchrome sorgfältig ausgewählt werden, und normalerweise werden Oberflächenmarker mit niedrigem Ausdruck mit hellen Fluorchromen gepaart (z.B. wurde hier Alexa Fluor 647 für CD206 verwendet). Es gibt verschiedene tote/lebende Flecken, die durch verschiedene Wellenlängen erkannt werden können; hier wurde FVS510 verwendet.
Abbildung 3 zeigt Probendaten von Immunzellen, die aus Synovialgeweben isoliert und mit extrazellulären Oberflächenmarkern gefärbt wurden, 6 Wochen nachdem Tiere entweder DMM oder Scheinkontrolloperationen erhalten haben. Alle Teilmengen können mit dem Protokoll sowohl bei der Untersuchung als auch bei der Kontrolle von Tieren leicht identifiziert werden. Insbesondere können Unterschiede zwischen den Gruppen bei Makrophagen-Teilmengen (höherer Prozentsatz von Ly-6C+/MHC-II- Makrophagen (G7) in der DMM-Gruppe) und der Expression von M1- und M2-Makrophagen (höherer Prozentsatz der M2-Makrophagen in der DMM-Gruppe) beobachtet werden.
Abbildung 4 visualisiert die hierarchische Gating-Strategie für das extra- und intrazelluläre T-Zell-Panel auf Immunzellen, die aus der Milz von DMM-behandelten Tieren isoliert sind. Die Prinzipien sind identisch mit denen, die für das Monozytenpanel verwendet werden. Der Fixierungs- und Permeabilisierungsprozess ändert jedoch die Größe und Dichte der Zellen. Daher müssen typische FSC- und SSC-Parameter mithilfe eines Back-Gating-Prozesses aus CD3+-Zellen ermittelt werden, wenn das Experiment für jeden Zelltyp eingerichtet wird. Einige Fluorchrome neigen dazu, sich im Laufe der Zeit zu aggregieren (z. B. PE, das hier mit FoxP3 verwendet wurde). Aggregate können die Ergebnisse aufgrund der hohen Helligkeit, die die Spektralüberlappung und Kompensation beeinflusst, möglicherweise ändern. So wurden alle Antikörper vor ihrer Verwendung jedes Mal gewirbelt und ausgesponnen, um Aggregate zu verringern. Darüber hinaus wurde eine Gating-Strategie verwendet, um den Einfluss von Aggregaten weiter zu reduzieren (G2). Während der Einrichtung der Experimente wurden für jeden Antikörper Fluoreszenz minus eine Steuerung (FMOs) durchgeführt. Die Beispieldaten sind in Abbildung 2B,2Cdargestellt.
Abbildung 5 und Abbildung 6 zeigen Immunzellen, die aus Lymphknoten ( Abbildung5) und Synovialgewebe isoliert wurden (Abbildung 6) und mit dem T-Zell-Panel-Protokoll 4 Wochen nach der Operation der Tiere entweder DMM oder Scheinkontrolle gefärbt wurden. Die Daten zeigen einen höheren Prozentsatz der Th1-Zellen bei DMM-Tieren (G9) in beiden Geweben. Darüber hinaus ist die intrazelluläre Färbung von T-regulatorischen Zellen (G11) und Th17-Zellen (G12) mit dem Protokoll erfolgreich und Unterschiede können zwischen Gruppen nachgewiesen werden.
Abbildung 1: Hierarchische Gating-Strategie für die Strömungszytometrie mit extrazellulärer Färbung, um Monozyten/Makrophagen und deren Teilmengen zu identifizieren. Myeloide Zellen werden in erster Linie mit einem Vorwärts-/Seitenstreuung (FSC-A und SSC-A) Punktdiagramm (G1) identifiziert. Danach werden Singlets mit FSC-A und FSC-H (G2) nachgewiesen und anschließend lebende Zellen ausgewählt (G3). Zellen aus G3 werden weiter mit Ly-6G klassifiziert, um Neutrophile (G4) und CD11b für Monozyten/Makrophagen (G5a) zu identifizieren. MHC-II wird verwendet, um dendritische Zellen (G5b) unter CD11b-positiven Zellen zu identifizieren und F4/80 wird verwendet, um zwischen Makrophagen (G6) und Monozyten (G12) zu wählen. Makrophagen werden weiter in ihre Teilmengen mit Ly-6C und MHC-II (Ly-6C+/MHC-II- Makropages (G7) eingeteilt; Ly-6C-/MHC-II- Gewebe-Resident-Makrophagen (G8); Ly-6C-/MHC-II+ Blut entstand Makrophagen (G9)). Weitere Teilmengen können aus der Gesamtheit der Makrophagen und der jeweiligen Teilmengen mit CD206 und CD80 ausgewählt werden (M1: CD80+/CD206- (G10); M2: CD80-/CD206+ (G11)). Monozyten werden weiter mit MHC-II und CD11c (MHC-II-/CD11c- Monozyten (G13) klassifiziert; MHC-II+/CD11c- Monozyten (G14)). Der Aktivierungsgrad wird dann mit der Expression von Ly-6C klassifiziert und in Niedrig (G15), Medium (G16) und Hoch (G17) unterteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beispieldaten zur Veranschaulichung geeigneter Steuerelemente sowohl im Monozyten- als auch im T-Zell-Bedienfeld. (A) Synovialgewebe wurde 6 Wochen nach dMM-Operation (DMM) oder Schein-Kontroll-Chirurgie (Schein) geerntet und eine einzellige Suspension wurde mit extrazellulären Oberflächenmarkern gefärbt. Während jedes Experiments wurden ungefärbte Zellen verwendet, um wahre Negative für den toten/lebendigen Fleck zu bestimmen und Tore zu setzen (Control). Das Setzen von Toren mit ungefärbten Zellen ist in Tafel A dargestellt. (B+C) Milzzellen wurden von unbehandelten Kontrolltieren geerntet, eine einzellige Suspension erzeugt und mit extra- und intrazellulären Markern gefärbt. Fluorescent-minus-one (FMO) Kontrollen wurden durch Färbezellen erzeugt, wobei das gesamte Antikörperpanel nur einen Antikörper fehlte. Für beide intrazellulären Antikörper werden Beispieldaten angezeigt. (B) FMO -RORgt und (C) FMO -Fox-P3. FMOs wurden für beide Panels durchgeführt und verwendet, um jedes Tor einzustellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Extrazelluläre Färbung von Monozyten/Makrophagen, die aus dem Synovium von Mäusen isoliert sind. Probengewebe wurden 6 Wochen nach der DMM-Chirurgie (DMM) oder der Scheinkontrolloperation (Schein) gesammelt. Weitere Informationen zu den genutzten Toren finden Sie in Abbildung 1. Beispieldaten zeigen, dass alle Teilmengen zuverlässig identifiziert werden können und Unterschiede zwischen Gruppen erkennbar sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Hierarchische Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie, bei der sowohl extra- als auch intrazelluläre Färbung verwendet wird, um T-Zellen und ihre Teilmengen zu identifizieren. T-Zellen werden in erster Linie mit einem Vorwärts-/Seitenstreuung (FSC-A und SSC-A) Punktdiagramm (G1) identifiziert. Aufgrund der Art der verwendeten Antikörper sollten Aggregate mit CD3 und CD4 (G2) ausgeschlossen werden. Danach werden Singlets mit FSC-A und FSC-H (G3) und anschließend lebende Zellen (G4) nachgewiesen. Zellen aus G4 werden weiter mit NK1.1 klassifiziert, um natürliche Killerzellen (G5) und CD3 zu identifizieren, um T-Zellen (G6) zu identifizieren. Der Aktivierungsgrad wird mit CD69 (G6b) bestimmt. Danach werden CD4 und CD8 verwendet, um T-Killerzellen (CD4-/CD8+ (G7)) und T-Helferzellen (CD4+/CD8- (G8)) zu identifizieren. T-Helferzellen werden in Th-1 (C-X-CR3+/CCR4- (G9)) und Th-2-Zellen (C-X-CR3-/CCR4+ (G10)) mit C-X-CR3 (CD183) und CCR4 (CD194) klassifiziert. Darüber hinaus werden Th-17-Zellen (CD25+/RORgt+ (G11)) und T-regulierungsspezifische Zellen (CD25+/Fox-P3+ (G12)) mit intrazellulären Markern identifiziert. Darüber hinaus werden Speicherzellteilmengen aus T-Helferzellen mit CD44 und CD62L (CD44-/CD62L+ naive T-Speicherzellen (G13) identifiziert; CD44+/CD62L+ zentrale T-Speicherzellen (G14); CD44+/CD62L-Effektor T-Speicherzellen (G15)). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Extrazelluläre und intrazelluläre Färbung von T-Zellen, die aus entwässernden Lymphknoten von Mäusen isoliert sind. Probengewebe wurden 4 Wochen nach der DMM-Chirurgie (DMM) oder der Scheinkontrolloperation (Schein) gesammelt. Weitere Informationen zu den genutzten Toren finden Sie in Abbildung 4. Beispieldaten zeigen, dass alle Teilmengen zuverlässig identifiziert werden können und Unterschiede zwischen Gruppen erkennbar sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Extrazelluläre und intrazelluläre Färbung von T-Zellen, die aus dem Synovialgewebe von Mäusen isoliert sind. Probengewebe wurden 4 Wochen nach der DMM-Chirurgie (DMM) oder der Scheinkontrolloperation (Schein) gesammelt. Weitere Informationen zu den genutzten Toren finden Sie in Abbildung 4. Beispieldaten zeigen, dass alle Teilmengen zuverlässig identifiziert werden können und Unterschiede zwischen Gruppen erkennbar sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden entwickelt und getestet, um verschiedene Teilmengen sowohl aus Monozyten/Makrophagen als auch aus T-Zellen innerhalb der murinen Milz, des Knochenmarks, der Lymphknoten und des Synovialgewebes in einem murinen Modell der Arthrose (OA) zuverlässig zu identifizieren. Das aktuelle Protokoll kann leicht geändert werden, um verschiedene Gewebetypen oder andere Zelltypen durch Austausch von Antikörpern zu untersuchen, und kann für alternative murine Modelle von OA verwendet werden. Bei der Prüfung anderer Gewebetypen ist es wichtig, die Spezifität jedes Antikörpers zu testen, da die Expression von Oberflächenmarkern von Immunzellen in jedem Gewebe variiert20. Darüber hinaus ist es beim Austausch von Antikörpern notwendig, eine Dosistitrationskurve durchzuführen, um die optimale Konzentration des Antikörpers zu ermitteln und den Kompensationsprozess zu wiederholen, um Veränderungen der spektralen Überschneidung zu adressieren.
Im aktuellen Protokoll wurde OA mit dem DMM-Mausmodell18induziert. Die am häufigsten verwendeten und etablierten Tiermodelle befinden sich in der Maus, da diese Art vielfältige Vorteile bei der Untersuchung der Pathophysiologie des posttraumatischen OA17bietet. Insbesondere bei der Maus wurden chirurgische und nicht-chirurgische OA-Modelle beschrieben17:die häufigste ist die Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM), die chirurgische Transektion des vorderen Kreuzbandes (ACLT) und der nicht-chirurgische ACL-Ruptur (ACLR), bzw.21. Alle diese Tiermodelle eignen sich gut für die Untersuchung der Rolle der zellulären Entzündung in der Pathologie der posttraumatischen OA und das aktuelle Protokoll wurde erfolgreich für alle zuvor genannten Tiermodelle im Labor getestet. Obwohl alle oben genannten Tiermodelle etabliert sind und in der Literatur beschrieben wurden, hat jedes seine eigenen Stärken und Grenzen, die an anderer Stelle ausführlich diskutiert wurden17 und werden daher nur kurz unten diskutiert. Alle chirurgischen Modelle unterliegen dem chirurgischen Ansatz, dem Wundheilungsprozess und der damit verbundenen Entzündungsreaktion. Bei der Beurteilung des Beitrags von Entzündungszellen zur Entwicklung von posttraumatischem OA könnte diese entzündliche Wundheilungsreaktion als Konstifter dienen, insbesondere in den frühen Zeiten nach der Intervention. Darüber hinaus müssen DMM- und ACLT-Verfahren sehr standardisiert durchgeführt werden, um die Variabilität zwischen Tieren zu minimieren. Die ACLT-Operation ist viel schwieriger zu erlernen als die DMM-Chirurgie und erfordert eine größere chirurgische Exposition als DMM, um Verletzungen nur der ACL endgültig zu identifizieren und sicherzustellen und iatrogene Schäden an anderen Gelenkgeweben zu vermeiden18. Nicht-chirurgischer ACL-Ruptur ist eine standardisierte und sehr effiziente Art, posttraumatische OA zu induzieren. Es ist jedoch ein spezielles Gerät erforderlich, das eine kontrollierte einzelne Drucklast auf die Tibia des gebeugten Knies anwendet. Dieses Gerät muss kalibriert und getestet werden, um vergleichbare und zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Darüber hinaus verursacht das ACLR-Modell sehr schwere und progressive Gelenkschäden bei Mäusen mit ausgeprägter Erosion des hinteren medialen Tibialplateaus22, die bei ACL-Verletzungen bei anderen Arten, einschließlich Menschen, nicht zu sehen ist.
Um den entzündungshemmenden Prozess und seine zelluläre Komponente während der Entwicklung von OA umfassend zu charakterisieren, ist es wünschenswert, nicht nur das Synovialgewebe, sondern auch die lokalen Lymphknoten sowie sekundäre Lymphorgane, wie Milz und Knochenmark, zu untersuchen. Lymphdrainagemuster des Kniegelenks wurden bei Mäusen und Lymphflüssigkeit aus dem Kniegelenk durch den Ilias- und Leisten-Lymphknoten bei einer unterschiedlichen Dispersion23,24charakterisiert. Um die Vergleichbarkeit zwischen Tieren zu erleichtern, haben wir in diesem Protokoll beschlossen, den Leisten- und Ilias-Lymphknoten zu bündeln. Im Gegensatz dazu entleert der popliteale Lymphknoten in unmittelbarer Nähe zum Knie den Hinterfuß und spielt bei entzündlichen Knieprozessen keine Rolle.
Mäuse haben ein kleines Volumen an intraartikulären Synovialgeweben25 und die Isolierung der Immunzellen bleibt hierin herausfordernd. Im aktuellen Protokoll wurden Erntetechniken für Synovialgewebe angepasst, um die Isolierung der maximalen Anzahl von Immunzellen zu ermöglichen. Daher umfasst die Erntetechnik die supra- und infrapatellaren Aussparungen sowie das infrapatellar emodelar Pad aufgrund seiner hohen Anzahl an Immunzellen26. Der Verdauungsprozess und die Wahl des Enzyms wurde optimiert, um die Synovialmembran und das Fettgewebe vollständig zu verdauen, während die Sehne und die Patella und ihr Knorpel unbeeinträchtigt bleiben. So führt das aktuelle Protokoll eine reproduzierbare Methode zur Gewinnung von Immunzellen aus Synovialgewebe ein.
Die Analyse der Durchflusszytometrie hat mehrere Vorteile bei der Untersuchung zellulärer Immunprozesse während der Entwicklung von OA; dennoch hat diese Technik Grenzen. Aufgrund der geringen Anzahl von Immunzellen im Synovialgewebe ist es notwendig, Gewebeproben von mindestens zwei Tieren zu bündeln, um eine Probe zu erhalten. Aufgrund der großen Anzahl von Fluorchromen und Farben, die in diesem Protokoll verwendet werden, muss besonderes Augenmerk auf eine sorgfältige Kompensation einer möglichen Spektralüberlappung für jeden Gewebetyp und Kompensation muss konsequent während der Verwendung dieser Technik neu bewertet werden. Aufgrund der großen Anzahl verfügbarer Marker und erheblicher Unterschiede zwischen den Studien zur Identifizierung einer bestimmten Population ist eine weitere mögliche Einschränkung die Wahl der Marker, die zur Identifizierung von Zellen verwendet werden19. Die Durchflusszytometrie ermöglicht die Quantifizierung von "Ereignissen", die nicht notwendigerweise mit Gesamtzellen koordinieren. Um eine wirklich quantitative Analyse zu erhalten, muss man entweder zählbare Perlen gleichzeitig bei der Durchführung der Strömungsanalyse erwerben oder Zellen in einzelzelligen Suspensionen vorher zählen, um absolute Zahlen zu erhalten (wie hier getan). Im Allgemeinen könnten die Prinzipien dieses Protokolls (z. B. die Gestaltung und Einrichtung eines Flusspanels oder Techniken zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen) potenziell für menschliche Proben angepasst werden. Jedoch, Oberflächenmarker menschlicher Immunzellen unterscheiden sich von murinen Zellen und daher müssen geeignete Antikörper ausgewählt und getestet werden. Darüber hinaus müssen die Dauer der RBC-Lyse und das entsprechende Puffervolumen bestimmt werden, da es höchstwahrscheinlich unterschiedlich ist. Vor der Anpassung der Methoden aus diesem Protokoll an andere Arten oder Gewebe ist eine sorgfältige Prüfung jedes Schritts erforderlich, um sicherzustellen, dass die Methoden wie beabsichtigt funktionieren.
Trotz ihrer Einschränkungen bleibt die Durchflusszytometrieanalyse von Immunzellen eine leistungsfähige Technik, die es ermöglicht, sowohl monozytäre Zell- als auch T-Zell-Teilmengen auf Einzelzellebene zu identifizieren. Insbesondere führt das aktuelle Protokoll eine zuverlässige und reproduzierbare Technik ein, die die zelluläre Immunantwort während der Entwicklung von OA im Synovialgewebe und sekundären Lymphorganen identifizieren und quantifizieren kann. In Zukunft kann diese Technik helfen, die Immunantwort in verschiedenen Arthrose-induzierenden Tiermodellen zu charakterisieren und im Folgenden die Wirksamkeit von immunmodulierenden Medikamenten auf diese schwächende Krankheit zu bewerten.
Zusammenfassend beschreibt dieses Flow-Zytometrie-Protokoll eine detaillierte und reproduzierbare Methode zur Identifizierung von Monozyten/Makrophagen und T-Zell-Subsets, die sowohl extra- als auch intrazelluläre Färbungs-Assays in muriner Milz, Knochenmark, Lymphknoten und Synovialgewebe verwenden, wobei ein etabliertes chirurgisches Arthrose-Mausmodell verwendet wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Andrew Lim, Ph.D. und Giles Best, Ph.D. für ihre Hilfe beim Aufbau des Durchflusszytometers. Unterstützt wurde das Projekt von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) an die PH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD194 (CCR4) | BioLegend | 131212 | T-Cell Panel |
| Brilliant Stain Buffer Plus 1000Tst | BD | 566385 | Buffers |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | T-Cell Panel |
| Fixable Viability Stain 510, 100 µg | BD | 564406 | Monocyte Panel |
| Liberase, Research Grade | Roche | 5401127001 | Enzyme for synovial tissue |
| Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µg | BD | 564985 | Monocyte Panel |
| Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µg | BD | 562454 | Monocyte Panel |
| Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µg | BD | 742274 | T-Cell Panel |
| Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µg | BD | 565250 | Monocyte Panel |
| Ms CD25 BV605 PC61, 50 µg | BD | 563061 | T-Cell Panel |
| Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µg | BD | 557596 | T-Cell Panel |
| Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µg | BD | 552775 | T-Cell Panel |
| Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µg | BD | 565480 | T-Cell Panel |
| Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µg | BD | 565261 | T-Cell Panel |
| Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µg | BD | 740664 | T-Cell Panel |
| Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µg | BD | 563687 | Monocyte Panel |
| Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µg | BD | 563332 | T-Cell Panel |
| Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µg | BD | 565411 | Monocyte Panel |
| Ms Foxp3 PE MF23, 100 µg | BD | 560408 | T-Cell Panel |
| Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µg | BD | 563414 | Monocyte Panel |
| Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µg | BD | 560593 | Monocyte Panel |
| Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µg | BD | 560600 | Monocyte Panel |
| Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µg | BD | 564143 | T-Cell Panel |
| Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µg | BD | 562894 | T-Cell Panel |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | N/A | N/A | Buffers |
| Transcription Factor Buffer Set 100Tst | BD | 562574 | Buffers |
References
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).
- Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond. Frontiers in Immunology. 8, 356 (2017).
- Woolf, A. D., Pfleger, B.
- Little, C. B., Hunter, D. J. Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials. Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).
- Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention. Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).
- Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).
- Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis. Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).
- Yamada, H., et al. Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints. Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).
- Sakkas, L. I., et al. T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis. Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).
- Guo, S. Y., et al. Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis. Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).
- Moradi, B., et al. CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood. Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97 (2014).
- Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees. Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).
- Zhang, H., et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).
- Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572, 670-675 (2019).
- Mocellin, S., et al. Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment. Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).
- Ward, J. M., et al. Immunohistochemical markers for the rodent immune system. Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).
- Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Lorenz, J., Grassel, S.
- Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
- Shi, J., et al. Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice. Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).
- Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A.
- Zhao, J., et al. A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts. Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).
- Belluzzi, E., et al. Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain. BioMed Research International. 2019, 18 (2019).
