Summary
该协议描述了毛细管气溶胶发生器的设置和使用，用于从多物种液体溶液中连续产生受控气溶胶，适用于稳定的大体积气溶胶输送（例如， 体内 吸入研究）。
Abstract
毛细管气溶胶发生器（CAG）的原理是通过在初始阶段加热电子液体来进行热液体蒸发，然后通过气流混合物调节成核和冷凝以产生气溶胶，例如在电子烟（EC）中。CAG在连续产生大量气溶胶方面特别有用，例如 体内 吸入毒理学研究，其中EC的使用不可行。从CAG产生气溶胶的热效应在EC中施加的温度方面是相似的，因此允许研究人员在规模和再现性上评估电子液体的蒸气。由于CAG的操作允许用户控制关键参数，例如电子液体的流速，加热温度和稀释气流，因此它允许研究人员在控制良好的设备中测试各种电子液体配方。诸如气溶胶粒径之类的性质被证明可以随相对于电子液体流动和电子液体组合物的空气流速进行调节。然而，复合年利益集团在评估与欧共体有关的常见问题方面受到限制，例如其要素过热。我们试图通过使用所选的电子液体配方评估化学和物理气溶胶特性来证明CAG可以产生可重复和连续的气溶胶。该协议描述了液体流速，稀释空气流速的操作参数以及需要优化 体内 毒理学研究所需的气溶胶浓度和粒径的操作程序。通过介绍该协议的代表性结果并讨论使用CAG的挑战和应用，我们证明了CAG可以以可重复的方式使用。从先前的工作中开发的技术和协议为实验室控制的气溶胶生成研究的未来创新奠定了基础。
Introduction
常见的电子液体含有丙二醇，甘油，水，尼古丁和所选香料的混合物。EC设备产生的气溶胶的组成不仅取决于液体配方，还取决于设备的材料，设计和特性。因此，许多EC设备可能会在气溶胶输出1中引入很大的可变性，包括特定于设备产生过量成分的升高，泡气体积变化，由于通风孔阻塞而导致的气流变化以及“干膨化”（当液体容器几乎空时，由于部分输送的能量不用于液体蒸发，导致设备过热）2.此外，在长期吸入研究中，充电，再填充和清洁EC设备将成为物流方面的巨大额外限制3。由于这些原因，应考虑使用其他气溶胶发生器来大规模生产气溶胶和适当评估液体配方，同时避免与设备相关的气溶胶成分变化并减少工作负荷4，5。然而，装置产生的气溶胶仍应是风险评估战略的一部分，因为由于装置的加热/冷却特性，欧共体装置中某些成分的水平可能比实验室控制的标准化气溶胶发生器中的含量高6，7，8。
由于目前关于监管要求的信息有限，电子烟（EC）产生的气溶胶潜在毒性的评估方法仍在发展9，10，11。然而，准确的 体外 和 体内 评估需要随着时间的推移产生表征良好且可重复的气溶胶体积。从具有受控膨化方案的EC设备产生气溶胶，从用户消费的角度来看，这无疑是最具代表性的过程。对于监管毒性研究，考虑到用户可能经常自己制备的各种可能的液体制剂，同时修改某些设备特性（例如，传递的能量），使用EC设备进行长期重复暴露的毒理学研究不仅具有挑战性，而且可能不足。
毛细管气溶胶发生器（CAG）由菲利普莫里斯12，13 开发并由弗吉尼亚联邦大学14进一步改进，其原理是从电加热的毛细管产生热蒸汽流，随后用环境空气冷却，导致颗粒核形成和随后的冷凝，导致气溶胶形成。由于相同的物理过程导致EC中气溶胶形成（除了通过CAG中的泵将液体输送到毛细管外，在EC中，通常被作用于芯吸材料上的毛细管力取代，从EC中的储液器中抽取液体），CAG产生的气溶胶的特性与EC气溶胶的特性非常相似14 （图1).CAG允许生产大量的气溶胶，处理要求很少;因此，它特别适用于 体内 吸入研究。
CAG是一种实验室设备，由加热的毛细管组成，只需连接到温度控制器并通过蠕动泵连接到 液体储液 器（图2A）。毛细管（160 mm，21 G，不锈钢）由四个加热元件加热，全部嵌入到铝块中（图2B）。温度通常设定在250-275°C，以模拟EC设备15的线圈加热条件。泵送通过毛细管的液体被加热并转化为从毛细管尖端流出的热蒸汽。CAG组件（图2C）需要额外的元件来将产生的蒸汽与冷空气混合并形成气溶胶。热的过饱和蒸汽与冷气流突然混合导致成核和随后的冷凝，导致气溶胶形成（图2C）。在我们的CAG设计（图3）中，额外的加热气流首先冷却外部主体，然后沿着加热块循环以加热气流，同时防止液体回流在毛细管尖端冷凝并稳定蒸汽射流爆发。此外，它还会产生不必要的热蒸汽屏蔽，从而影响成核过程。因此，应用于该气流的流速应最小，并符合应用的目的。在整个手稿中，这种气流将被称为“加热气流”，尽管必须理解这种气流是由加热块被动加热的，而不是用户故意加热的。
冷却气流速率对产生的气溶胶颗粒的大小有很大的影响。在用于 体内 吸入研究的气溶胶生产中，稀释气流将决定暴露剂量，并且在到达暴露室之前可能必须进一步稀释。除了气溶胶的化学成分外，还必须确定气溶胶粒度分布（PSD）的特征，以确保产生的气溶胶与EC产生的气溶胶相似，并且在经合组织指南建议的吸入粒度范围内（通常通过PSD与质量中值空气动力学直径[MMAD]和几何标准偏差[GSD]的对数正态性假设进行参数化）。
生成的气溶胶的MMD可以根据设备设计，配方的物理化学液体性质（例如，密度，粘度和表面张力），空气流速和温度决定热力学条件14，16，17而有很大差异。对于 体内 暴露实验，气流通常由22±2°C和60%±5%相对湿度的经过过滤的空气组成。然后可以根据研究要求进一步稀释产生的气溶胶，以达到测试气氛中的目标浓度。然后 通过 玻璃管道将其输送到暴露室，以减少过滤损失。在这里介绍的结果中，建立了温度和气流设置，以证明CAG可用于连续产生受控气溶胶，具有一致且可吸入的PSD和定义浓度，用于 体内 吸入研究。
在协议中，我们将描述如何：1）组装CAG，2）确定从CAG产生气溶胶所需的参数，3）执行气溶胶生成，以及4）分析气溶胶中感兴趣的物理和化学成分。对于这些初步运行，我们考虑基于气溶胶形成组分混合物的液体溶液：丙二醇（PG），甘油（VG），水和尼古丁在规定的质量分数。最后，我们将分享示例数据，以评估实验中产生的复杂多物种混合物（涉及上述成分与其他风味成分混合）。我们将讨论总体结果和挑战，以及这种实验方法在评估此类混合物方面的适用性。
Protocol
1. CAG系统组装
- 复合血浆的组装
- 将毛细管放在铝制加热块的毛细管槽中，输出端突出约5毫米。
- 轻轻拧紧铝制加热块两半的螺钉。
- 将加热元件（a）和热电偶（b）组装在铝制加热块（c）中，电线通过铝制后盖（d）突出（图4A）。
- 确保加热元件的导线连接到适配器，并确保它们是直的。
- 将内部 PEEK 管 （g） 与外部 SS 管 （e） 组装。确保 2 x 4 mm 快插接头 （f） 牢固地固定在外部 SS 管 （e） 上（图 4B）。
- 将O形圈（3 x 30 mm）放在内PEEK管（g）的两个凹槽上，并将内PEEK管（g）从前端插入外SS管（e）。
- 将组装好的铝制加热元件放在SS后背衬（i）上，铝制后盖朝向SS后背衬，然后将内部PEEK/外部SS管组件滑过铝制加热元件，以与SS后背衬（i）紧密配合（图4C）。
- 将铝制前盖（h）放在内部PEEK管内的铝制加热元件上。确保毛细管从铝制前盖略微突出。将三个 SS 丝杠 （j） 安装在 SS 后背衬周围，然后拧紧。
- 将 PEEK 适配器 （k） 放在内部 PEEK 管前部。确保 PEEK 适配器安装在内部 PEEK 管的前凹槽上。将 25 mm 调度程序 （l） 放在 PEEK 适配器上，并通过三个 SS 丝杠。用手拧紧调度程序上的螺母，使PEEK适配器紧固（图4D）。
- 将加热元件连接到温度控制器，将毛细管连接到蠕动泵和测试液体溶液。
- 通过 2 x 4 mm 快插接头将用于加热的空气流连接到 CAG（图 4B，[f]）。
- 将CAG组装到玻璃片上，并连接CAG冷却和第一稀释气流（处理后的空气; 图 3）。必要时添加第二个稀释流入口以及气溶胶采样口和调节T形结（图5）。
- CAG清洁程序
- 从CAG玻璃组件设置中取出CAG，并用干擦拭布清洁玻璃，直到玻璃明显干燥。
- 观察 CAG 的毛细血管输出是否有梗阻。如果可以在毛细管出口处观察到颗粒沉积，则改变毛细管。同样，在注意到气溶胶输送减少后，用新的毛细管替换毛细管。
- 按照步骤 1.1.9 到 1.1.1 拆卸 CAG。
- 更换毛细管后，按照步骤 1.1.1 到 1.1.9 重新组装 CAG。
2. CAG气溶胶浓度和稀释度的计算
- TDF的理论计算
- 根据液体配方的浓度（此处称为储备溶液/浓度）和LFR计算TDF：
TDF：总稀释气流（升/分钟）
C库存：库存浓度 2%，w/w）
LFR：液体流速（克/分钟）
C靶标：靶标浓度（微克/升） - 使用含有2%（w / w）尼古丁的溶液，目标尼古丁气溶胶浓度为15μg/ L，LFR为0.35g / min，假设100%产率如下：
- 根据液体配方的浓度（此处称为储备溶液/浓度）和LFR计算TDF：
- LFR的理论计算
- 根据液体储备溶液和TDF的浓度计算LFR：
LFR：液体流速（克/分钟）
C靶标：靶标浓度（微克/升）
TDF：总稀释气流（升/分钟）
C库存：库存浓度 （%， w/w） - 使用含有2%（w/ w）尼古丁的溶液，目标尼古丁气溶胶浓度为15μg/ L，TDF为300 L / min，假设100%的产率如下：
- 根据液体储备溶液和TDF的浓度计算LFR：
- 基于实验数据计算实际收率（%）
- 基于上述理论计算，进行初始工程运行以量化实际气溶胶成分浓度（CActual）并获得CAG气溶胶的实际产率（AY）。通过使用相同的计算来调整TDF或LFR，对气溶胶浓度进行进一步的微调。
AY：实际收益率（%）
C实际：实际气溶胶成分浓度（微克/升）
TDF：总稀释气流（升/分钟）
C库存：库存浓度 （%， w/w）
LFR：液体流速（克/分钟） - 使用含有2%（w / w）尼古丁的溶液，测得的尼古丁气溶胶浓度为15μg/ L，TDF为320 L / min，LFR为0.35g / min，将导致以下尼古丁AY：
- 基于上述理论计算，进行初始工程运行以量化实际气溶胶成分浓度（CActual）并获得CAG气溶胶的实际产率（AY）。通过使用相同的计算来调整TDF或LFR，对气溶胶浓度进行进一步的微调。
3. CAG气溶胶生成
- 开始气溶胶生成
- 称量并记录测试液体、磁力搅拌器和瓶子的值，精确到0.01 g。液体储备制剂是用 表1中描述的组分制备的。
- 提供相应的气流设置（±5%）（图5）：
用于加热流量的压缩空气：2 L/min
冷却流量：10升/分钟
第一次稀释流量：150升/分钟
第二次稀释流量：160升/分钟
废物流量：172升/分钟 - 将数字温度控制器上的温度控制设定点设置为250°C，并开始加热CAG。
- 将液体储备溶液与磁力搅拌棒放在磁力搅拌器上。将蠕动泵的进水管放入测试溶液中。
- 打开蠕动泵，将流量设置为 LFR ±5% （g/min）。
- 当CAG温度达到250±1°C时，通过启动蠕动泵开始气溶胶生成，以将测试液体输送到CAG。
- 检查毛细管尖端附近是否产生气溶胶，并根据需要记录时间以计算质量流速。如果未产生气溶胶，请再次检查所有设备和设置。如果仍然没有产生气溶胶，则很可能毛细管被阻塞并需要更换。
- 在气溶胶生成期间
- 每60分钟排出玻璃装置中冷凝的液体，以确保持续稳定的气溶胶产生。
- 阻止气溶胶的产生
- 从测试溶液瓶中取出管道，将测试液体切换到去离子水，并记录计算质量流量的时间。
- 等到水蒸气从毛细管出来，关闭温度控制器，并保持蠕动泵至少10分钟，以冲洗和清洁毛细管。
- 称量并记录测试液体和瓶子的值，以最接近的0.01 g，并使用以下公式计算质量流量：
- 关闭用作加热流的压缩空气。
- 如有必要，从组件设置中取出CAG，用干抹布清洁玻璃管，然后重新组装CAG。
4. 成分的分析测定
注意：气溶胶采样在两个位置进行：a）在未稀释的气溶胶上（在未稀释的采样过程中，第一稀释空气和第二稀释流都被关闭）和b）在提供所有稀释液的稀释液上对稀释的气溶胶进行（图5）。每个采样位置a和b最多有三个采样端口，允许同时收集ACM和其他设备/探头，用于分析气溶胶特性。采样管线垂直于气溶胶流动方向安装，并连接到真空泵，该真空泵允许吸入一定体积的气溶胶（取决于泵的流量和样品持续时间）。
- 气溶胶收集质量 （ACM） 的测定
注意：气溶胶的颗粒相被困在玻璃纤维过滤垫上（直径：44 mm，粒度保留：1.6 μm）。取样前后的 ACM 砝码使用过滤器支架进行测量，以最大限度地减少由于挥发性成分蒸发而导致的称量损失。- 将过滤器放在过滤器支架中并放置过滤器盖。
- 在收集样品之前，使用过滤器将过滤器支架称重至最接近的0.0001 g，并记录重量。
- 将包含过滤器的过滤器支架连接到气溶胶流并开始样品收集。
- 收集样品后，用过滤器支架和盖子称量过滤器，并记录最终重量。
- 使用以下公式计算 ACM：
含血性硬化剂：含酸单品的浓度（微克/升）
Wb：采样前过滤器和过滤器支架的重量（g）至最接近的0.0001 g
Wa：采样后过滤器和过滤器支架的重量（g）至最接近的0.0001 g
V气溶胶：通过过滤器的气溶胶 （L） 体积，计算公式为：
采样时间（分钟）x 采样流量（升/分钟） - 从过滤器支架上取下过滤垫，并将其沉积到含有5 mL乙醇的25 mL玻璃瓶中。通过在实验室摇床上以400rpm摇动过滤垫30分钟来提取ACM。
- 将25mL玻璃小瓶以290× g 离心5分钟，并收集上清液以定量PG / VG和尼古丁的颗粒相。
- 尼古丁（或香精）浓度的测定
注意：气溶胶被困在含有经过特殊处理的宽孔硅藻土的样品柱上，硅藻土是一种化学惰性基质，可在pH值为1至13的范围内使用（图6）。- 在开始气溶胶样品收集之前，在15分钟内准备样品柱。
- 为了测定尼古丁浓度，加入2毫升0.5米硫酸。为了确定风味，加入2mL异丙醇。
- 检查采样流。
- 打开真空泵，使用精度为1 ccm/min的校准流量设备，使用连接到采样管路的样品柱检查流速。使用针阀将流量调节到700 ccm/min的范围±5%。
- 关闭真空泵。
- 样品采集
- 根据其入口和出口侧将两个适配器添加到样品柱中（图6）。 通过 出口适配器将管子连接到真空采样管路。
- 通过入口适配器将样品柱组件连接到采样端口。
- 通过打开真空泵开始样品采集。
- 记录采样开始时间。
- 预设采样时间后，在未稀释的采样点A处10分钟，在稀释的采样点B处30分钟，关闭真空泵并记录时间。
- 从采样端口中取出样品柱。
- 从样品柱上取下适配器，并用薄膜膜密封样品柱，以防止因蒸发或污染而造成的损失。根据相应的样品名称标记样品柱。
- 将密封的样品柱储存在冰箱（2-8°C）中直至分析。
- 羰基浓度的测定
注意：羰基被困在玻璃过滤器垫上，该垫与一个微型撞击器串联，该微冲击器充满溶解在乙腈中的2，4-二硝基苯肼（DNPH）。
- 在开始气溶胶样品收集之前，在15分钟内准备样品柱。
- 陷印准备
- 在微冲击器中加入10 mL的15 mM DNPH乙腈。
- 准备一个过滤垫（见第4.1段）。
- 检查采样流程
- 打开真空泵，并使用校准的流量设备检查采样管路的流量，该设备提供1 ccm / min的精度。使用针阀将流量调节到700 ccm/min的范围±5%。
- 关闭真空泵。
- 采样收集
- 将与微型撞击器相连的过滤器支架连接到采样端口。
- 将真空采样管路连接到微型冲击器的出口。
- 通过打开真空泵开始样品采集。
- 记录采样开始时间。
- 预设采样时间后，在未稀释的采样点a处10分钟，在稀释的采样点b处30分钟，关闭真空泵并记录时间。
- 断开采样阱与采样端口的连接。
- 将冲击器倒入玻璃瓶中。用乙腈将DNPH溶液加满至10 mL。
- 确定过滤垫的重量，并通过摇动将其提取到DNPH-乙腈溶液中。提取后丢弃过滤垫。
- 取1mL等分试样羰基DNPH溶液，加入50μL吡啶以稳定溶液。
- 将等分试样储存在≤-12°C的冰箱中直至分析。
- 在微冲击器中加入10 mL的15 mM DNPH乙腈。
Representative Results
CAG气溶胶的再现性
为了证明CAG产生的气溶胶的可重复性，使用了含有PG，VG，尼古丁，水和乙醇（分别为71.72%，17.93%，2%，5.85%和2.5%）的碱液溶液，共进行了10次单独的气溶胶生成运行。气雾化和采样参数汇总于 表2中。CAG产生的气溶胶的化学表征证实了使用该系统获得的结果的高度再现性。在相同的加热，冷却和稀释气流以及相同的采样条件下，ACM，尼古丁，VG和PG的浓度在气溶胶生成运行中保持稳定，ACM，尼古丁，VG和PG的相对标准偏差分别为2.48%，3.28%，3.43%和3.34%（图7）。
在连续三次CAG气溶胶生成运行中测量了8种羰基（即乙醛，丙酮，丙烯醛，丁醛，巴豆醛，甲醛，甲基乙基酮和丙醛）的浓度。正如在恒定控制条件下产生的气溶胶所预期的那样，所有羰基分析物的产率仍然很低（表3），未达到大多数化合物分析方法的定量（LOQ）极限。只有乙醛和甲醛的产率高于LOQ.稀释气溶胶样品中的甲醛浓度显示出很高的变异性（±32%），由于该分析物的挥发性以及接近LOQ的产率。数据证实CAG产生的气溶胶中没有液体热降解产物。香料混合物的添加对气溶胶的羰基组成有影响。在本案中，乙醛和丁醛的产率急剧增加，在用于进入暴露室的稀释气溶胶中，其产率分别从接近LOQ的值增加到2.06和1.56 μg/L。这些数据突出了调味剂混合物的组成对气溶胶组成的影响，并强调需要在早期阶段调查电子液体制剂中某些调味物质的潜在毒性，然后在 体内 进行最终评估长期暴露研究。
CAG产生的气溶胶的PSD
在不同的冷却和第一稀释流下测量CAG产生的气溶胶的PSD，以评估这些条件对仅含有PG，VG，水和尼古丁的基础液体溶液产生的气溶胶的物理特性的影响。该程序对于确定生产粒径在可吸入范围内的气溶胶的适当条件至关重要。
在本研究中，冷却和第一稀释流量以10 L / min的步骤进行修改，以保持相同的气溶胶流量总量（表4）。液体流量（0.5 mL / min），加热流量（2 L / min）和第二次稀释流量（150 L / min）保持恒定。从稀释的采样点b取气溶胶样品（图5）。PSD是通过使用空气动力学粒度仪测定的，该测量器以5 L / min的样品流速测量0.5至20μm的粒径，并适当稀释以用于设备。空气动力学粒度仪报告了MMAD和GSD，用于每次气溶胶生成运行。
冷却流量的增加和第一稀释流量同时的减少对气溶胶颗粒大小有影响（表4）。当冷却流量从10 L / min更改为20 L / min并且第一次稀释流量从160更改为150 L / min时，观察到对粒度的最大影响。在这些条件下，MMAD从1.47μm增加到4.03μm，增加了一倍多。平均气溶胶粒径随着冷却流速的增加而继续增长，尽管其比率低于10至20 L / min之间的比率。当比较在10 L / min冷却流下产生的气溶胶与在20-50 L / min下产生的气溶胶时，气溶胶颗粒的空气动力学直径的分布明显向较大直径移动（图8）。
电子液体香精的捕集效率
如前所述，由于其挥发性，各种液体成分根据当地的热力学条件不断容易发生气液传质。此外，分析方法具有一定的能力来捕获这些成分。实际产量测量使我们能够测量化学方法对所选成分进行准确检测和定量的能力（例如，由于其缩合电位或反应，某些成分可能无法到达目的地，即吸入研究中的暴露室）。因此，在评估各种调味电子液体配方时，必须能够确定最有效的气溶胶化学评估捕获方法。随后，这使我们能够测量每种成分的转移速率，这是由气溶胶从产生地到暴露室的运输而经常存在的损失决定的。在本例中，使用含有调味物质混合物的液体进行进一步研究。使用 表2 中列出的CAG参数生成气溶胶并在稀释后捕获（位置b， 图5），采样流速设置为0.7 L / min30分钟。在用2mL异丙醇预处理的取样柱上进行捕获。在捕获期完成后不久用异丙醇洗脱试样，直到回收20mL溶液。我们发现，通常应该针对每种风味成分进行研究和确定诱捕效率。
对于70%的所研究的风味成分，我们的回收率>60%，这与香料的沸点（挥发性）密切相关。这一事实意味着，在进行含有复杂混合物的吸入毒理学研究时，应特别注意气溶胶向暴露部位的转移和输送。
图 1：毛细管气溶胶发生器 （CAG） 的功能原理。 液体被泵入电加热的毛细管中，输送热的过饱和蒸汽，这些蒸汽被气流冷却，导致突然成核和冷凝，导致气溶胶形成。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：典型的 CAG 实验设置和关键要素。（A） CAG 组件的一般视图，显示了将液体储备溶液连接到 CAG、稀释空气管道和气溶胶形成过程的蠕动泵。（B）CAG的详细视图，包括毛细管和加热元件。（C）CAG组件气溶胶生成装置的横截面图。冷却和稀释气流的详细信息。玻璃管有两个独立的隔间。冷却流被推向CAG并与液体产生的蒸汽接触以产生气溶胶。稀释流被推向形成的气溶胶以稀释后者。请点击此处查看此图的大图。
图 3：CAG 设备详细信息：横截面视图。 加热流在加热元件周围引入，用于冷却外部CAG体，防止毛细管尖端的液体回流冷凝，并用于稳定蒸汽射流爆破。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：CAG 组件。 毛细管和加热元件（A）插入内部PEEK管中，该组件滑入外部不锈钢管（B）。组件采用不锈钢丝杠（C，D）盖上并紧紧固定在支架上。从后端突出的毛细管 通过 管道连接到蠕动泵和液体配方。缩写：不锈钢，不锈钢。 请点击此处查看此图的大图。
图5：用于 体内 暴露实验的CAG气溶胶生成设置。 用于分析的气溶胶取样在两个位置进行：（a） 未稀释的气溶胶 -在取样过程中关闭第一个稀释步骤;（b） 未稀释的气溶胶 -- 在取样过程中关闭第一个稀释步骤;（b） 稀释的气溶胶，就在进入暴露室之前。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：带有适配器的示例色谱柱。 在取样之前，样品柱用0.5M硫酸预处理用于尼古丁分析或异丙醇用于风味分析。入口适配器连接到CAG产生的气溶胶流量，出口适配器连接到真空泵。 请点击此处查看此图的大图。
图7：CAG产生的气溶胶表征和再现性。 ACM、尼古丁、PG 和 VG 浓度超过 10 个单独的实验气溶胶生成，使用相同的液碱溶液运行。ACM， 1105.45 ± 27.4 μg/L;尼古丁， 20.16 ± 0.7 微克/升;VG， 227.15 ± 7.8 微克/升;PG， 656.59 ± 22.0 μg/L.误差线表示标准偏差。缩写：ACM，气溶胶收集质量;丙二醇PG;VG，甘油。 请点击此处查看此图的大图。
图 8：在各种冷却流速下产生的气溶胶粒径分布的变化。请点击此处查看此图的放大版本。
| 底座（PG/VG/N） | 口味 （PG/VG/N/F） | |
| 元件 | PG/VG/N （g/1000g） | PG/VG/N/F （g/1000g） |
| 苯甲酸 | 3.33 | 3.33 |
| 断续器 | 240.00 | 238.91 |
| 水 | 150.00 | 150.00 |
| 乳酸 | 3.33 | 3.33 |
| 醋酸 | 3.33 | 3.33 |
| 混合风味混合 | 0.00 | 1.20 |
| 甘油 | 560.01 | 559.90 |
| 烟碱 | 40.00 | 40.00 |
| 和 | 1000.00 | 1000.00 |
表1：电子液体原液配方成分18
| 气雾化方案 | 采样协议 | ||||
| 参数 | 未稀释 | 稀释 | 参数 | 未稀释位置 A | 摊薄位置 B |
| 复合热温度（°C） | 250 | ||||
| 泵流量（毫升/分钟） | 0.5 | 0.5 | 采样时间（分钟） | 10 | 30 |
| 加热气流（升/分钟） | 2 | 2 | 采样流量 （ACM） （升/分钟） | 0.7 | 1.5 |
| 冷却气流（升/分钟） | 10 | 10 | 取样流量极端（升/分钟） | 0.7 | 0.7 |
| 第一次空气稀释（升/分钟） | 那 | 150 | 采样流量 羰基（升/分钟） | 0.7 | 0.7 |
| 第二次空气稀释（升/分钟） | 那 | 160 | |||
| 废料（升/分钟） | 那 | 172 | |||
表 2：气溶胶生成、稀释和采样的参数
| 羰基 | 基础液体（PG/VG/尼古丁） | 含尼古丁的高浓度风味储备溶液 （PG/VG/尼古丁/香料） |
||
| 未稀释的气溶胶样品微克/升 | 稀释的气溶胶样品 μg/L | 未稀释的气溶胶样品微克/升 | 稀释的气溶胶样品 μg/L | |
| 乙醛 | 0.834 ± 0.096 | 0.119* | 45.346 ± 1.134 | 2.058 ± 0.202 |
| 丙酮 | <最低点数 | <最低点数 | <最低点数 | <最低点数 |
| 丙烯醛 | <最低点数 | <最低点数 | <最低点数 | <最低点数 |
| 丁醛 | <最低点数 | <最低点数 | 36.475 ± 0.996 | 1.557 ± 0.179 |
| 巴豆醛 | <最低点数 | <最低点数 | 0.052 ± 0.001 | <最低点数 |
| 甲醛 | 0.731 ± 0.072 | 0.072 ± 0.023 | 0.158 ± 0.007 | 0.026 ± 0.004 |
| 甲基乙基酮 | <最低点数 | <最低点数 | 0.570 ± 0.015 | <最低点数 |
| 丙醛 | <最低点数 | <最低点数 | 0.085 ± 0.001 | <最低点数 |
表3：CAG生成的气溶胶中羰基的测定。 三次气溶胶生成的平均值仅使用相同的液体碱溶液和风味混合物。在三次运行中，只有一个样本的值大于该方法的定量下限（LOQ）。
| 设置（升/分钟） | 气溶胶液滴直径 | ||
| 冷却流量 | 第一稀释流程 | MMAD （μm） | 断续器 |
| 10 | 160 | 1.47 ± 0.04 | 2.07 ± 0.01 |
| 20 | 150 | 4.03 ± 0.18 | 2.13 ± 0.04 |
| 30 | 140 | 4.74 ± 0.04 | 1.89 ± 0.02 |
| 40 | 130 | 5.35 ± 0.04 | 1.80 ± 0.01 |
| 50 | 120 | 5.23 ± 0.03 | 1.76 ± 0.01 |
表4：不同气流条件下气溶胶粒径（液滴直径）的测定。 缩写：MMAD，质量中位数空气动力学直径;GSD，几何标准偏差。
Discussion
使用CAG生成气溶胶有助于减少EC设备特定气雾化过程的可变性，从而允许对雾化电子液体配方本身进行客观和可控的评估。CAG产生的气溶胶已被证明是EC 7产生的气溶胶的代表。它们可以以相同的组成和特性可重复地产生，因此 特别适用于在 体内长期暴露于需要大量气溶胶在很长一段时间内进行的长期暴露研究8。
CAG设置相对容易组装和维护。然而，操作参数，如液体流速和相应的空气流速对于生产受控气溶胶仍然至关重要，这需要根据CAG产生的气溶胶的应用目的进行方法优化。
本研究结果表明，冷却气流速率对气溶胶粒径分布有明显影响。冷却气流不仅对产生的蒸汽成核有直接影响，而且对冷凝也有直接影响，因为产生的气溶胶在其中流动的内部管道的冷却。此外，致密的气溶胶容易产生实质性的凝血作用。综合起来，这些过程是复杂的，它们对气溶胶形成的相互作用和影响对于特定的电子液体，温度和流动是相当难以推广的。补充气流成分（干燥或加湿，相对湿度的固定百分比） - 特别是含水量 - 将影响热量和质量交换，不仅导致气溶胶颗粒的冷凝增长调节，而且导致壁冷凝。因此，对此方法参数的修改被视为用于控制PSD17，19。
低溶解度或高沸点的化学物质的存在可能会限制CAG产生的气溶胶的有效性，因为毛细管内的沉淀和毛细管随着时间的推移而堵塞。根据气溶胶中存在的化学物质，必须调整CAG操作的温度以产生蒸汽。此外，应定期评估液体制剂的稳定性。添加具有不同沸点的成分，包括香料，将对最终的气溶胶组成14 和气液分配产生影响。可能需要调整毛细管温度和加热气流，以防止回流和热毛细管附近的液体沉积，这可能导致产生不受控制的热降解产物（如羰基），因为液体在高温下保留的时间很长。此外，控制用于在毛细管中产生蒸汽的温度会影响蒸汽在毛细管中开始形成的位置 - 温度越高，蒸汽形成得越早。随着毛细管温度的升高，从毛细管流出来的蒸汽将需要更长的时间才能被冷却气流冷却，因此将开始成核并凝结成远离毛细管尖端的气溶胶，有助于避免回流效应19。
目前的电子烟 体内 毒理学研究在复制电子烟气溶胶方面受到限制，因为满足所需的气溶胶规模的后勤复杂性，例如在经合组织TG 413研究中20。本研究中介绍的方案概述了菲利普莫里斯国际公司用于 体内 气溶胶生成的CAG组装和设置长期暴露研究18。这些数据可以作为在另一个实验室环境（例如，药物递送系统21）中进一步微调或适应特定研究的特定要求的良好起点。
Disclosures
这里报告的方法以及特定的CAG组件已经开发出来，用于评估电子液体产生的气溶胶，以满足 体内 暴露研究的要求。所有作者都是菲利普莫里斯国际（PMI）的员工，或根据合同协议为PMI工作。菲利普莫里斯国际是这项研究的唯一资金来源和赞助商。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminium front cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| Aluminium heating block, groove diameter 0.4mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | B-505432 | 2 x |
| Aluminium rear cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
| Cambridge glass filter pads | GE Healthcare UK Limited | 9703-9654 | 44 mm diameter |
| Capillary 21 G SS, 160 mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | 304H21RW | 1 x |
| Dry wipes | Contec Inc. , SC, USA | Prosat Wipes saturated with isopropyl alcohol | cleaning material |
| Flowmeter | TSI, Shoreview, MI, USA | 4100 Series, 0-20 L/min | or equivalent |
| Gilibrator-2 calibrator | Sensidyne, St-Petersburg FL, USA | Gilian Gilibrator-2 | Air flow calibrator |
| Glass Couplings | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | |
| Glass piping | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | Pipe 25 and 40 mm |
| Heating elements | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | LDC01864 | 4 x |
| High heat grease | Lubriplate Lubricant Company, NJ, USA | High temperature multipurpose grease | CAG maintenance |
| Inner PEEK tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
| Magnetic stirrer | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany | C-MAG HS 4 | or equivalent |
| Micro impingers | Labo Service, Kontich, Belgium | Custom Built | |
| Outer SS tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
| PEEK adaptor | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| Peristaltic pump | Watson-Marlow Fluid Technology Group, Falmouth, UK | Watson-Marlow 530 U | or equivalent |
| Push-in fitting | Festo Pte Ltd | NPQM-DK-M5-Q4-P10 | 1 x |
| Sample Column Extrelut NT3 cartridge | Merk Sigma-Aldrich | 115095 | |
| SS 25 mm assembly cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| SS M8 lead screw | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
| SS M8 nut | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
| SS rear backing | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| Temperature controller | Cole Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Digi-Sense TC 9600 | or equivalent |
| Thermocouple type K | RS Components GmbH, Wädenswil, Switzerland | 814-0147 | 1 x |
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