Summary
このプロトコルは、定常的な大容量エアロゾル送達(例えば、 インビボ 吸入研究)に適した、多種液体溶液からの制御されたエアロゾルの連続生産のためのキャピラリーエアロゾル発生器の設定および使用を記載する。
Abstract
キャピラリーエアロゾル発生器(CAG)は、初期段階での電子液体の加熱による熱液体蒸発の原理で動作し、続いて気流の混合物を介して調整された核生成および凝縮により、電子タバコ(EC)などのエアロゾルを生成する。CAGは、ECの使用が不可能な in vivo 吸入毒物学研究などの事例で、連続的に大量のエアロゾルを生成するのに特に有用である。CAGからエアロゾルを生成する熱的影響は、ECに適用される温度の点で類似しているため、研究者は電子液体の蒸気を大規模かつ再現性で評価することができます。CAGの動作により、ユーザーは電子液体の流量、加熱温度、希釈空気流などの重要なパラメータを制御できるため、研究者は十分に制御されたデバイスでさまざまな電子液体製剤をテストできます。エアロゾル粒径などの特性は、電子液体流および電子液体組成物に対する空気流速によって調節されることが実証される。しかし、CAGは、その要素の過熱など、一般的なEC関連の問題を評価するのに限界があります。我々は、CAGが、選択された電子液体製剤で化学的および物理的エアロゾル特性を評価することによって、再現性および連続的なエアロゾルを生成できることを実証しようとしている。このプロトコルは、 in vivo 毒物学研究に必要なエアロゾル濃度と粒子サイズを最適化するために必要な液体流量、希釈空気流量、および操作手順の動作パラメータを記述しています。プロトコルの代表的な結果を提示し、CAGを使用する際の課題とアプリケーションについて議論し、CAGが再現可能な方法で使用できることを実証します。以前の研究から開発された技術とプロトコルは、実験室で制御されたエアロゾル生成研究のための将来の革新の基盤として機能します。
Introduction
一般的な電子液体は、プロピレングリコール、グリセロール、水、ニコチン、および選択されたフレーバーの混合物を含有する。EC装置から生成されるエアロゾルの組成は、液体製剤だけでなく、装置の材料、設計、特性にも依存する。その結果、多くのEC機器は、デバイス固有の不要な成分の生成、パフ体積の変動、換気孔の閉塞による気流の変化、「ドライパフリング」(液体容器がほぼ空の場合、供給されたエネルギーの一部が液体蒸発に使用されないため、デバイスの過熱を引き起こす)2.さらに、長期吸入研究中のECデバイスの充電、補充、および洗浄は、物流の面で大きな追加制約になります3。これらの理由から、エアロゾル組成物の装置関連の変動を回避し、作業負荷を低減しながら、エアロゾルの大規模生産および液体製剤の適切な評価のために、他のエアロゾル発生器を考慮するべきである4,5。それにもかかわらず、装置の加熱/冷却特異性のために、EC装置中の特定の成分のレベルは実験室制御の標準化されたエアロゾル発生器のレベルよりも上昇する可能性があるため、装置生成エアロゾルはリスク評価戦略の一部であり続けるべきである6,7,8。
現在利用可能な規制要件に関する情報が限られているため、電子タバコ(EC)によって生成されるエアロゾルの潜在的な毒性の評価方法は依然として進化しています9,10,111。しかしながら、正確なインビトロおよびインビボ評価は、時間の経過とともに十分に特徴付けられ、再現可能な量のエアロゾルの生成を必要とする。制御された膨らみレジメンを備えたEC装置からエアロゾルを製造することは、ユーザーの消費の観点から確かに最も代表的なプロセスです。規制毒性試験では、ユーザーがしばしば自分で調製し、同時にいくつかのデバイス特性(例えば、送達エネルギー)を変更する可能性のある様々な液体製剤を考慮すると、長期間の反復暴露毒物学研究を実施するためのECデバイスの使用は困難であるだけでなく、潜在的に不十分である。
Philip Morris 12,13によって開発され、バージニアコモンウェルス大学14によってさらに洗練されたキャピラリーエアロゾル発生器(CAG)は、電気的に加熱されたキャピラリーから熱い蒸気流のジェットを作り出し、その後周囲空気で冷却され、粒子核の形成とその後の凝縮を引き起こし、エアロゾル形成につながるという原理に取り組んでいます。同じ物理的プロセスがECにおけるエアロゾル形成につながるため(ECでは、通常、EC内のリザーバから液体を引き出す吸汗材料に作用する毛細管力によって置き換えられるCAG内のポンプによる毛細血管への液体の送達は別として)、CAGによって生成されたエアロゾルの特性はECエアロゾル14の特性と非常によく似ています(図1).CAGは、処理要件をほとんど必要とせずに、大量のエアロゾルの製造を可能にします。したがって、インビボ吸入研究に特に適している。
CAGは、温度コントローラとペリスタルティックポンプ を介して 液体リザーバに簡単に接続された加熱キャピラリーチューブからなる実験装置です(図2A)。キャピラリー(160mm、21G、ステンレス鋼)は、すべてアルミニウムブロックに埋め込まれた4つの発熱体によって加熱されます(図2B)。温度は、EC装置15のコイル加熱条件を模倣するために、典型的には250〜275°Cに設定される。キャピラリーを通ってポンプで送られた液体は加熱され、キャピラリーの先端から出る熱い蒸気に変わります。CAGアセンブリ(図2C)は、生成された蒸気を冷たい空気と混合し、エアロゾルを形成するための追加の要素を必要とする。高温の過飽和蒸気と冷たい空気流の突然の混合は、核生成とその後の凝縮をもたらし、エアロゾル形成をもたらす(図2C)。当社のCAG設計(図3)では、追加の加熱空気流が最初に外部ボディを冷却し、その後加熱ブロックに沿って循環して空気流を加熱し、同時にキャピラリーの先端での液体逆流の凝縮を防ぎ、蒸気ジェットバーストを安定化させます。さらに、高温蒸気の不要な遮蔽を作成し、核生成プロセスに影響を与えます。このため、この空気流に適用される流量は最小限に抑え、アプリケーションの目的に適合する必要があります。この気流は、この原稿全体を通して「加熱気流」と呼ばれますが、この流れは加熱ブロックによって受動的に加熱され、ユーザーによって意図的に加熱されないことを理解しなければなりません。
冷却空気流量は、生成されたエアロゾル粒子のサイズに強い影響を及ぼす。 インビボ 吸入研究のためのエアロゾル製造において、希釈空気流は曝露用量を決定し、曝露チャンバに到達する前にさらに希釈されなければならないかもしれない。エアロゾルの化学組成に加えて、生成されたエアロゾルがECによって生成されたものと類似し、OECDガイドラインによって推奨される吸入粒径範囲内にあることを保証するために、エアロゾル粒径分布(PSD)を特徴付けることが不可欠である(多くの場合、質量中央値空気力学的直径[MMAD]および幾何学的標準偏差[GSD]を有するPSDの対数正規性の仮定によってパラメータ化される)。
生成されたエアロゾルのMMADは、装置設計、製剤の物理化学的液体特性(例えば、密度、粘度、および表面張力)、空気流量、および温度決定熱力学的条件14、16、17に応じて大きく変化し得る。in vivo暴露実験の場合、気流は一般に、22 ± 2 °Cおよび60%±5%の相対湿度で調整されたろ過された空気からなる。生成されたエアロゾルは、次いで、試験雰囲気中の目標濃度を達成するために、研究要件に応じてさらに希釈することができる。その後、ろ過損失を低減するために、ガラス配管を介して露光チャンバに送達されます。ここで提示された結果では、CAGが、インビボ吸入研究のために一貫した吸入可能なPSDおよび定義された濃度を有する制御されたエアロゾルの連続生産に使用できることを実証するために、温度および気流設定が確立されている。
プロトコルでは、1)CAGを組み立てる方法、2)CAGからエアロゾルを生成するために必要なパラメータを決定する方法、3)エアロゾル生成を実行する方法、および4)エアロゾルの関心のある物理的および化学的成分を分析する方法について説明します。これらの予備実行のために、我々は、エアロゾル形成成分の混合物に基づく液体溶液を検討する:プロピレングリコール(PG)、グリセロール(VG)、水およびニコチンを所定の質量分率で。最後に、我々の実験で生成された複雑な多種混合物(上記の成分と追加のフレーバー成分との混合を含む)の評価のためのサンプルデータを共有する。我々は、全体的な結果と課題を、そのような混合物の評価のためのこの実験的アプローチの適用可能性とともに議論する。
Protocol
1. CAGシステムアセンブリ
- CAGの組み立て
- アルミニウム加熱ブロックのキャピラリー溝にキャピラリーを置き、出力端を約5mm突出させる。
- アルミ加熱ブロックの2つの半分のネジを軽く締めます。
- 発熱体(a)と熱電対(b)をアルミニウム製加熱ブロック(c)に組み立て、ワイヤをアルミニウム製リアキャップ(d)から突き出させます(図4A)。
- 発熱体のワイヤがアダプタに接続されていることを確認し、まっすぐであることを確認します。
- 内側のPEEKチューブ(g)を外側のSSチューブ(e)で組み立てます。2 x 4 mmのプッシュイン継手(f)が外側のSSチューブ(e)にしっかりと固定されていることを確認します(図4B)。
- 内側のPEEKチューブ(g)の2つの溝にOリング(3 x 30 mm)を置き、内側のPEEKチューブ(g)を前端から外側のSSチューブ(e)に挿入します。
- 組み立てたアルミニウム発熱体をSSリアバッキング(i)に置き、アルミニウムリアキャップをSSリアバッキングに向かわせ、内側のPEEK/外側SSチューブアセンブリをアルミニウム製発熱体の上にスライドさせてSSリアバッキング(i)にしっかりとフィットさせます(図4C)。
- アルミニウム製のフロントキャップ(h)をアルミニウム製の発熱体の上に置き、内側のPEEKチューブの内側に置きます。キャピラリーがアルミ製のフロントキャップからわずかに突き出ていることを確認します。SSリアバッキングの周りに3本のSSリードネジ(j)を取り付け、しっかりと締め付けます。
- PEEK アダプター (k) を内側の PEEK チューブ前面に置きます。PEEK アダプターが内側の PEEK チューブの前面溝に収まっていることを確認します。25 mm スケジューラー (l) を PEEK アダプターの上に置き、3 本の SS リードねじを通して置きます。スケジューラのナットを手で締めて、PEEKアダプタがきつく締まるようにします(図4D)。
- 発熱体を温度コントローラに接続し、キャピラリーをペリスタルティックポンプと試験液溶液に接続します。
- 加熱空気流用の圧縮空気を、2 x 4 mmのプッシュイン継手 を介して CAGに接続します(図4B、[f])。
- CAGをガラス片に組み立て、CAG冷却と最初の希釈空気の流れ(処理された空気; 図3)。必要に応じて、2番目の希釈フローエントリ、エアロゾルサンプリングポート、規制Tジャンクションを追加します(図5)。
- CAGクリーニング手順
- CAG ガラスアセンブリのセットアップから CAG を取り出し、ガラスが目に見えるほど乾くまでドライワイプでガラスをクリーニングします。
- CAGからの毛細血管出力の閉塞を観察します。キャピラリーの出口に粒子堆積が観察できる場合は、キャピラリーを変更する。同様に、エアロゾル送達の減少に気づいたら、キャピラリーを新しいものと交換する。
- 手順 1.1.9 ~ 1.1.1 に従って CAG を分解します。
- キャピラリーが変更されたら、手順 1.1.1 ~ 1.1.9 に従って CAG を組み立て直します。
2. CAGエアロゾル濃度と希釈率の計算
- TDFの理論計算
- 液体製剤の濃度(ここでは原液/濃度と呼ばれます)とLFRに基づいてTDFを計算します。
TDF:総希釈空気流量(L /分)
C銘柄:在庫濃度2%、w/w)
LFR:液体流量(グラム/分)
Cターゲット:ターゲット濃度(μg/L) - 2%(w/w)ニコチンを含む溶液を使用し、目標ニコチンエアロゾル濃度が15μg/LでLFRが0.35g/minの場合、100%収率が次のようになると仮定します。
- 液体製剤の濃度(ここでは原液/濃度と呼ばれます)とLFRに基づいてTDFを計算します。
- LFRの理論計算
- 液体原液の濃度とTDFに基づいてLFRを計算します。
LFR:液体流量(グラム/分)
Cターゲット:ターゲット濃度(μg/L)
TDF:総希釈空気流量(L /分)
C銘柄:在庫濃度(%/w) - 2%(w/w)ニコチンを含む溶液を使用し、目標ニコチンエアロゾル濃度が15μg/L、TDFが300L/minの場合、100%収率は次のようになります。
- 液体原液の濃度とTDFに基づいてLFRを計算します。
- 実験データに基づく実収量(%)の算出
- 上記の理論計算に基づいて、最初のエンジニアリングを実行して実際のエアロゾル構成濃度(C実績)を定量化し、CAGエアロゾルの実際の収率(AY)を得る。TDFまたはLFRの調整に同じ計算を使用して、エアロゾル濃度のさらなる微調整を実行します。
AY:実収量(%)
C実績:実際のエアロゾル構成濃度(μg/L)
TDF:総希釈空気流量(L /分)
C銘柄:在庫濃度(%/w)
LFR:液体流量(グラム/分) - 測定されたニコチンエアロゾル濃度が15μg/L、TDFが320L/分、LFRが0.35g/minの2%(w/w)ニコチンを含む溶液を使用すると、以下のニコチンAYが得られます。
- 上記の理論計算に基づいて、最初のエンジニアリングを実行して実際のエアロゾル構成濃度(C実績)を定量化し、CAGエアロゾルの実際の収率(AY)を得る。TDFまたはLFRの調整に同じ計算を使用して、エアロゾル濃度のさらなる微調整を実行します。
3. CAGエアロゾル生成
- エアロゾル生成の開始
- 試験液、マグネチックスターラー、およびボトルの値を最も近い0.01gまで秤量し、記録する。液体原液製剤は、 表1に記載の成分を用いて調製される。
- それぞれのエアフロー設定(±5%)を入力します(図5)。
加熱流用圧縮空気:2 L/分
冷却流量:10リットル/分
最初の希釈流量:150 L/分
第2希釈流量:160 L/分
廃棄物流量:172リットル/分 - デジタル温度コントローラの温度制御設定値を250°Cに設定し、CAGの加熱を開始します。
- マグネチックスターラー付きの液体原液をマグネチックスターラーの上に置きます。ペリスタルティックポンプからの入口チューブを試験溶液中に置く。
- ペリスタルティックポンプの電源を入れ、LFR ±5%(g/min)に流量を設定します。
- CAG温度が250±1°Cに達したら、ペリスタルティックポンプを起動してエアロゾル生成を開始し、CAGに試験液を送達する。
- エアロゾルがキャピラリー先端付近で発生しているかどうかを確認し、必要に応じて時間を記録して質量流量を計算します。エアロゾルが生成されない場合は、すべての機器と設定をもう一度確認してください。それでもエアロゾルが生成されない場合は、毛細血管がブロックされており、交換する必要がある可能性が高いです。
- エアロゾル生成時
- ガラスセットアップで凝縮する液体を60分ごとに排出し、一定で安定したエアロゾル生成を確保します。
- エアロゾル発生の停止
- 試験液ボトルからチューブを取り外し、試験液を脱イオン水に切り替え、質量流量を計算する時間を記録する。
- キャピラリーから水蒸気が出てくるまで待ち、温度コントローラをオフにし、ペリスタルティックポンプを少なくとも10分間オンにしてキャピラリーを洗い流して清掃します。
- 試験液とボトルの値を最も近い0.01gまで計量して記録し、次の式を使用して質量流量を計算します。
- 加熱フローとして使用される圧縮空気をオフにします。
- 必要に応じて、アセンブリセットアップからCAGを取り外し、ドライワイプでガラスチューブを清掃し、CAGを組み立て直します。
4. 成分の分析的決定
注:エアロゾルサンプリングは、a)希釈されていないエアロゾル(希釈されていないサンプリング中に第1の希釈空気と第2の希釈フローの両方がオフになります)とb)すべての希釈が提供された希釈エアロゾル上の2つの位置で実行されます(図5)。aとbの各サンプリング位置に最大3つのサンプリングポートがあり、ACMやその他のエアロゾル特性を分析するための機器/プローブを同時に収集できます。サンプリングラインは、エアロゾルの流れ方向に対して垂直に設置され、一定量のエアロゾルを引き出すことを可能にする真空ポンプに接続されています(ポンプ流量およびサンプル持続時間に応じて)。
- エアロゾル収集質量(ACM)の測定
注:エアロゾルの微粒子相は、ガラス繊維フィルターパッド(直径:44mm、粒径保持:1.6μm)に捕捉される。サンプリング前後のACMウェイトは、揮発性成分の蒸発による計量の損失を最小限に抑えるために、フィルタホルダで測定されます。- フィルターホルダーにフィルターを置き、フィルターキャップを置きます。
- サンプル採取前にフィルターホルダーをフィルターで0.0001g近くまで計量し、重量を文書化します。
- フィルターを入れたフィルターホルダーをエアロゾル流に接続し、サンプル採取を開始します。
- サンプル収集後、フィルターホルダーとキャップでフィルターの重量を量り、端の重量を文書化します。
- 次の式を使用して ACM を計算します。
ACM: ACM の濃度 (μg/L)
Wb:サンプリング前のフィルターとフィルターホルダーの重量(g)を最も近い0.0001g
Wa:サンプリング後のフィルターとフィルターホルダーの重量(g)を最も近い0.0001g
Vエアロゾル:フィルターを通過するエアロゾル(L)の体積を、以下を用いて計算する:
サンプリング時間(分)×サンプリング流量(L/分) - フィルターホルダーからフィルターパッドを取り出し、5 mLのエタノールを含む25 mLのガラスバイアルに堆積させます。実験室用シェーカーのフィルターパッドを400rpmで30分間振ってACMを抽出します。
- 25 mL ガラスバイアルを 290 x g で 5 分間遠心分離し、PG/VG の定量のために上清とニコチンの粒子相を収集します。
- ニコチン(またはフレーバー)濃度の測定
注:エアロゾルは、1~13のpH範囲で使用するための化学的に不活性なマトリックスである、特別に処理された広い細孔珪藻土を含むサンプルカラムに捕捉されます(図6)。- エアロゾルサンプルの収集を開始する前に、15分以内にサンプルカラムを準備します。
- ニコチン濃度を決定するために、2mLの0.5M硫酸を加える。風味を決定するために、2mLのイソプロパノールを加える。
- サンプリングフローを確認してください。
- 真空ポンプの電源を入れ、1ccm/minの精度を提供する校正済み流量装置を使用して、サンプリングラインに接続されたサンプルカラムで流量を確認します。ニードルバルブで流量を700ccm/分±5%の範囲に調整します。
- 真空ポンプの電源を切ります。
- サンプルコレクション
- サンプルカラムの入口側と出口側に従って、2つのアダプタを追加します(図6)。出口アダプター を介して チューブを真空サンプリングラインに接続します。
- サンプルカラムアセンブリを入口アダプタ を介して サンプリングポートに接続します。
- 真空ポンプの電源を入れてサンプル採取を開始します。
- サンプリングの開始時刻を記録します。
- 予め設定されたサンプリング時間の後、希釈されていないサンプリングポイントAで10分、希釈サンプリングポイントBで30分、真空ポンプの電源を切って時間を記録します。
- サンプルカラムをサンプリングポートから取り外します。
- サンプルカラムからアダプターを取り外し、サンプルカラムをフィルムメンブレンで密封して、蒸発や汚染による損失を防ぎます。対応するサンプル名に従ってサンプル列にラベルを付けます。
- 密封したサンプルカラムを分析時まで冷蔵庫(2-8°C)に保管する。
- カルボニル濃度の測定
注:カルボニルは、アセトニトリルに溶解した2,4-ジニトロフェニルヒドラジン(DNPH)で満たされたマイクロインピンジャーに直列に接続されたガラスフィルターパッドに捕捉される。
- エアロゾルサンプルの収集を開始する前に、15分以内にサンプルカラムを準備します。
- トラップの準備
- マイクロインピンジャーにアセトニトリル中の15mM DNPHを10mL充填する。
- フィルターパッドを準備します(段落4.1を参照)。
- サンプリングフローの確認
- 真空ポンプの電源を入れ、1ccm/minの精度を提供する較正された流量装置を使用してサンプリングラインの流量を確認してください。ニードルバルブで流量を700ccm/分±5%の範囲に調整します。
- 真空ポンプの電源を切ります。
- サンプリングコレクション
- マイクロインピンジャーにリンクされたフィルターホルダーをサンプリングポートに接続します。
- 真空サンプリングラインをマイクロインピンジャーの出口に接続します。
- 真空ポンプの電源を入れてサンプル採取を開始します。
- サンプリングの開始時刻を記録します。
- 予め設定されたサンプリング時間の後、希釈されていないサンプリングポイントaで10分、希釈サンプリングポイントbで30分、真空ポンプの電源を切って時間を記録します。
- サンプリングトラップをサンプリングポートから外します。
- インピンジャーをガラスバイアルに空にします。DNPH溶液をアセトニトリルで10mLに補充する。
- フィルターパッドの重量を求め、振とうしてDNPH-アセトニトリル溶液に抽出します。抽出後、フィルターパッドを破棄します。
- カルボニル-DNPH溶液の1mLアリコートを取り、50μLのピリジンを加えて溶液を安定化させる。
- アリコートを分析≤-12°Cの冷凍庫に保管する。
- マイクロインピンジャーにアセトニトリル中の15mM DNPHを10mL充填する。
Representative Results
CAGエアロゾルの再現性
CAG生成エアロゾルの再現性を実証するために、PG、VG、ニコチン、水、およびエタノール(それぞれ71.72%、17.93%、2%、5.85%、および2.5%)を含むベース液体溶液を、10回の別々のエアロゾル生成ランにわたって使用した。エアロゾル化およびサンプリングパラメータを 表2に要約する。CAG生成エアロゾルの化学的特性評価は、システムを使用して得られた結果の再現性の高さを確認した。同じ加熱、冷却、希釈空気流、および同じサンプリング条件下で、ACM、ニコチン、VG、およびPGの濃度はエアロゾル生成ランにわたって安定しており、ACM、ニコチン、VG、およびPGの相対標準偏差はそれぞれ2.48%、3.28%、3.43%、および3.34%でした(図7)。
8つのカルボニル、すなわちアセトアルデヒド、アセトン、アクロレイン、ブチルアルデヒド、クロトンアルデヒド、ホルムアルデヒド、メチルエチルケトン、およびプロピオンアルデヒドの濃度を、3回の連続したCAGエアロゾル生成ラン中に測定した。一定の制御条件下で生成されたエアロゾルで予想されたように、すべてのカルボニル分析物の収率は低いままであり(表3)、ほとんどの化合物について分析方法の定量限界(LOQ)に達しなかった。希釈エアロゾルサンプル中のホルムアルデヒド濃度は、この分析物の揮発性およびLOQに近い収率のために高い変動性(±32%)を示した。このデータは、CAG生成エアロゾル中に液体熱分解生成物が存在しないことを確認した。フレーバーの混合物の添加は、エアロゾルのカルボニル組成に影響を与えた。この場合、アセトアルデヒドおよびブチルアルデヒド収率は、LOQに近い値から、それぞれ2.06および1.56μg/Lまで、露光チャンバに入ることを意味する希釈エアロゾル中で劇的に増加した。これらのデータは、エアロゾル組成物に対するフレーバー混合物の組成物の効果を強調し、 in vivo 長期曝露研究における最終評価の前に、電子液体製剤中の特定の香味物質の潜在的な毒性を早期に調査する必要性を強調する。
CAG生成エアロゾルのPSD
CAGで生成されたエアロゾルのPSDを、PG、VG、水、およびニコチンのみを含むベース液体溶液から生成されたエアロゾルの物理的特性に対するこれらの条件の影響を評価するために、異なる冷却および第1希釈フロー下で測定した。この手順は、呼吸域範囲の粒径を有するエアロゾルを製造するための適切な条件を特定するために不可欠である。
本研究では、冷却流と第1希釈流を10L/minのステップで修正し、エアロゾル流の総体積を同じに維持した(表4)。液体の流れ(0.5 mL/分)、加熱された流れ(2 L/分)、および第2の希釈の流れ(150 L/分)は一定に保たれました。エアロゾルサンプルは、希釈サンプリングポイントbから採取した(図5)。PSDは、0.5~20μmの粒子径を測定する空力学的粒子サイザーを用いて、サンプル流速5L/minで測定し、機器で使用するために適切に希釈することによって測定した。MMADおよびGSDを、各エアロゾル生成ランについて空気力学的粒子サイザーによって報告した。
冷却流の増加と第1希釈流の同時減少は、エアロゾル粒径に影響を与えた(表4)。粒径に最も大きな影響が認められたのは、冷却流を10L/分から20L/分に、第1希釈流を160L/分から150L/分に変更した場合であった。MMADは、これらの条件下で1.47μmから4.03μmに2倍以上に増加しました。平均エアロゾル粒径は、10〜20L/minの間に観察されたものよりも低い比率ではあるが、冷却流量の増加とともに成長し続けた。エアロゾル粒子の空気力学的直径の分布は、10L/分の冷却流で生成されたエアロゾルと20-50L/minで生成されたエアロゾルを比較すると、より大きな直径に明らかにシフトした(図8)。
電子液体フレーバーのトラップ効率
前述のように、その揮発性のために、様々な液体成分は、局所的な熱力学的条件に応じて気液物質移動を連続的に生じやすい。さらに、分析方法は、そのような成分を捕捉する一定の能力を有する。実際の収率測定により、選択した成分を正確に検出および定量するための化学的方法の能力を測定することができます(例えば、凝縮の可能性または反応のために、一部の成分は目的地、すなわち吸入研究の場合の曝露チャンバに到達しない可能性がある)。したがって、様々な風味付け電子液体製剤を評価する場合、エアロゾルの化学的評価のための最も効率的な捕捉方法を決定できることが不可欠である。その後、これにより、各成分の伝達速度を測定することができ、これは、生成場所から露光チャンバへのエアロゾル輸送によるしばしば存在する損失によって決定される。本件では、香味物質の混合物を含む液体を用いて追加の研究を行った。エアロゾルは、 表2 に列挙されたCAGパラメータで生成され、希釈後に捕捉され(位置b、 図5)、サンプリング流量を0.7L/minに設定して30分間捕捉した。トラップは、2mLのイソプロパノールで予備調整されたサンプリングカラムに対して行った。カートリッジを、トラップ期間の完了直後にイソプロパノールで溶出し、溶液の20mLが回収されるまでした。我々は、トラップ効率は、一般的にフレーバー成分ごとに調査し、決定されるべきであることを見出した。
調査したフレーバー成分の70%について、回収率は>60%であり、フレーバーの沸点(揮発性)とよく相関していた。この事実は、複雑な混合物を含む吸入毒物学研究が、曝露部位へのエアロゾルの移動および送達に特別な注意を払って実施されるべきであることを意味する。
図1:キャピラリーエアロゾル発生器(CAG)の機能原理。 液体は電気的に加熱されたキャピラリーにポンプで送られ、熱い過飽和蒸気のバーストをもたらし、空気流によって冷却され、突然の核生成および凝縮を引き起こし、エアロゾル形成をもたらす。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:典型的なCAG実験セットアップと重要な要素。(A)CAGアセンブリの一般図、液体原液をCAG、希釈エアダクト、およびエアロゾル形成プロセスに接続するペリスタルティックポンプを示す。(B)キャピラリーと発熱体を備えたCAGの詳細図。(c)CAGアセンブリエアロゾル生成セットアップの断面図。冷却および希釈空気の流れの詳細。ガラス管には2つの別々のコンパートメントがあります。冷却流はCAGに向かって押し出され、液体生成蒸気と接触してエアロゾルを生成する。希釈流は、形成されたエアロゾルに向かって押し出され、後者を希釈する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:CAG装置詳細:断面図。加熱流は、外部CAG本体を冷却し、キャピラリーの先端で液体逆流の結露を防ぎ、蒸気ジェットバーストを安定化させるために、発熱体の周囲に導入される。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:CAGアセンブリ キャピラリーと発熱体(A)を内側のPEEKチューブに挿入し、このアセンブリを外側のステンレス鋼チューブ(B)に滑り込ませます。アセンブリは蓋をされ、ステンレス鋼のリードネジ(C、D)を使用して支持体にしっかりと固定されています。後端から突出したキャピラリーは、チューブ を介して 蠕動ポンプおよび液体製剤に連結される。略称:SS、ステンレス鋼。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5: インビボ ばく露実験のためのCAGエアロゾル生成設定。 分析のためのエアロゾルサンプリングは、2つの位置で行われる:(a)希釈されていないエアロゾル−第1希釈ステップは、サンプリング中にオフに切り替わる。(b)希釈エアロゾルを、露光チャンバに入る直前に。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:アダプターが取り付けられたサンプルカラム サンプリングの前に、サンプルカラムをニコチン分析用に0.5 M硫酸またはフレーバー分析用にイソプロパノールで予備調整します。入口アダプターは、CAG で生成されたエアロゾル流に接続され、出口アダプターは真空ポンプに接続されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:CAG生成エアロゾルの特性評価と再現性。 ACM、ニコチン、PG、およびVG濃度の濃度は、10個の別々の実験用エアロゾル生成を同じ液体ベース溶液で実行します。ACM, 1105.45 ± 27.4 μg/L;ニコチン, 20.16 ± 0.7 μg/L;VG, 227.15 ± 7.8 μg/L;PG、656.59 ± 22.0 μg/L。エラーバーは標準偏差を表します。略語:ACM、エアロゾル収集質量;PG, プロピレングリコール;VG, グリセロール. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 8: さまざまな冷却流量で生成されるエアロゾルの粒度分布の変化。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ベース (PG/VG/N) | フレーバー (PG/VG/N/F) | |
| コンポーネント | PG/VG/N (G/1000g) | PG/VG/N/F (g/1000g) |
| 安息香酸 | 3.33 | 3.33 |
| ティッカー | 240.00 | 238.91 |
| 水 | 150.00 | 150.00 |
| 乳酸 | 3.33 | 3.33 |
| 酢酸 | 3.33 | 3.33 |
| ブレンドフレーバーミックス | 0.00 | 1.20 |
| グリセリン | 560.01 | 559.90 |
| ニコチン | 40.00 | 40.00 |
| 和 | 1000.00 | 1000.00 |
表1:E液ストック製剤成分18
| エアロゾル化プロトコル | サンプリングプロトコル | ||||
| パラメーター | 原液 | 薄い | パラメーター | 希釈されていないロケーション A | 希釈場所 B |
| CAG温度(°C) | 250 | ||||
| ポンプ流量(mL/分) | 0.5 | 0.5 | サンプリング時間(分) | 10 | 30 |
| 加熱空気流量(L/分) | 2 | 2 | サンプリング流量 (ACM) (L/分) | 0.7 | 1.5 |
| 冷却空気流量(L/分) | 10 | 10 | サンプリングフローエクストレルト(L/分) | 0.7 | 0.7 |
| 第1空気希釈(L/分) | ティッカー | 150 | サンプリングフローカルボニル(L/分) | 0.7 | 0.7 |
| 第2空気希釈(L/分) | ティッカー | 160 | |||
| 廃棄物(リットル/分) | ティッカー | 172 | |||
表2:エアロゾル生成、希釈、サンプリングのパラメータ
| カルボニル | ベース液体(PG/VG/ニコチン) | ニコチンを高濃度とするフレーバー原液 (PG / VG /ニコチン/フレーバー) |
||
| 原液エアロゾルサンプルμg/L | 希釈エアロゾルサンプルμg/L | 原液エアロゾルサンプルμg/L | 希釈エアロゾルサンプルμg/L | |
| アセトアルデヒド | 0.834 ± 0.096 | 0.119* | 45.346 ± 1.134 | 2.058 ± 0.202 |
| アセトン | < LOQ | < LOQ | < LOQ | < LOQ |
| アクロレイン | < LOQ | < LOQ | < LOQ | < LOQ |
| ブチルアルデヒド | < LOQ | < LOQ | 36.475 ± 0.996 | 1.557 ± 0.179 |
| クロトンアルデヒド | < LOQ | < LOQ | 0.052 ± 0.001 | < LOQ |
| ホルムアルデヒド | 0.731 ± 0.072 | 0.072 ± 0.023 | 0.158 ± 0.007 | 0.026 ± 0.004 |
| メチルエチルケトン | < LOQ | < LOQ | 0.570 ± 0.015 | < LOQ |
| プロピオンアルデヒド | < LOQ | < LOQ | 0.085 ± 0.001 | < LOQ |
表3:CAG生成エアロゾル中のカルボニルの測定。 3つのエアロゾル生成からの平均値は、同じ液体ベース溶液単独およびフレーバー混合物で実行される。3回の実行で1つのサンプルのみが、方法の定量下限(LOQ)を超える値を有しました。
| 設定 (L/分) | エアロゾル液滴径 | ||
| 冷却の流れ | 第1希釈フロー | MMAD (μm) | ティッカー |
| 10 | 160 | 1.47 ± 0.04 | 2.07 ± 0.01 |
| 20 | 150 | 4.03 ± 0.18 | 2.13 ± 0.04 |
| 30 | 140 | 4.74 ± 0.04 | 1.89 ± 0.02 |
| 40 | 130 | 5.35 ± 0.04 | 1.80 ± 0.01 |
| 50 | 120 | 5.23 ± 0.03 | 1.76 ± 0.01 |
表4:異なる気流条件下でのエアロゾル粒径(液滴径)の測定。 略語:MMAD、質量中央値空気力学的直径;GSD、幾何標準偏差。
Discussion
CAGでエアロゾルを生成することで、ECデバイス固有のエアロゾル化プロセスの変動性を低減し、エアロゾル化された電子液体製剤自体の客観的で制御可能な評価を可能にします。CAGで生成されたエアロゾルは、ECs7によって生成されたエアロゾルの代表であることが示されている。それらは、同じ組成および特性で再現性よく生成することができ、したがって、長期間にわたって大量のエアロゾルを必要とするインビボ長期曝露研究に特に適している8。
CAGセットアップは比較的簡単に組み立てられ、メンテナンスも簡単です。しかしながら、液体流量および各空気流量などの動作パラメータは、制御されたエアロゾルの製造にとって依然として重要であり、CAG生成エアロゾルの適用目的に応じた方法の最適化が必要である。
今回の研究で発表された結果は、冷却空気流量がエアロゾルの粒度分布に明確な影響を与えることを示している。冷却空気流は、生成されたエアロゾルが流れる内部チューブの冷却のために、生成された蒸気の核生成だけでなく、凝縮にも直接的な影響を及ぼす。さらに、緻密なエアロゾルは実質的な凝固効果を起こしやすい。これらのプロセスを組み合わせると複雑であり、それらの相互作用とエアロゾル形成への影響は、特定の電子液体、温度、および流れについて一般化することはかなり困難です。補助気流組成物(乾燥または加湿された相対湿度の一定の割合)は、特に含水率に影響を及ぼし、熱および質量交換に影響を与え、エアロゾル粒子の変調凝縮成長だけでなく、壁凝縮ももたらします。したがって、この方法のパラメータに対する修正は、PSD17、19を制御する観点からの使用目的とみなされる。
低溶解度または高沸点の化学物質の存在は、キャピラリー内の沈殿および経時的なキャピラリーの閉塞のためにCAG生成エアロゾルの有効性を制限する可能性がある。エアロゾル中に存在する化学物質に応じて、CAGを動作させるための温度を調整して蒸気を生成する必要があります。さらに、液体製剤の安定性は定期的に評価されるべきである。異なる沸点を有するフレーバーを含む構成成分の添加は、最終的なエアロゾル組成物14 および気液分配に影響を及ぼすであろう。高温の毛細血管付近の逆流や液体の堆積を防ぐために、毛細管の温度と加熱気流を適応させる必要があるかもしれません、そしてそれは高温での液体の保持の長い持続時間のために熱劣化の制御されない生成物(カルボニルのような)の生成をもたらすかもしれません。さらに、キャピラリー内の蒸気を生成するために使用される温度を制御することは、キャピラリー内の蒸気が形成され始める場所に影響を与えます - 温度が高いほど、蒸気は早く形成されます。キャピラリー温度が高いほど、キャピラリーから出てくる蒸気は冷却空気流によって冷却されるまでに時間がかかり、したがって、キャピラリー先端からさらに離れたエアロゾルに核形成および凝縮し始め、逆流効果19を回避するのに役立つ。
現在の電子液体 in vivo 毒物学研究は、OECD TG 413研究20のように、必要なエアロゾルの規模を満たすための物流上の複雑さのために、電子タバコエアロゾルの再生が制限されている。この研究で提示されたプロトコルは、in vivo 長期曝露研究におけるエアロゾル生成のためにフィリップ・モリス・インターナショナルで使用されたCAGアセンブリおよび設定の概要を提供する18。これらのデータは、別の実験室環境(例えば、薬物送達システム21)におけるさらなる微調整のための、または特定の研究の特定の要件への適応のための良い出発点として役立ち得る。
Disclosures
ここで報告された方法および特定のCAGアセンブリは、 in vivo 曝露研究の要件を満たすために、電子液体から生成されたエアロゾルの評価のために開発されました。すべての著者はフィリップモリスインターナショナル(PMI)の従業員であるか、契約契約に基づいてPMIで働いています。フィリップ・モリス・インターナショナルは、この研究の唯一の資金源であり、スポンサーです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminium front cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| Aluminium heating block, groove diameter 0.4mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | B-505432 | 2 x |
| Aluminium rear cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
| Cambridge glass filter pads | GE Healthcare UK Limited | 9703-9654 | 44 mm diameter |
| Capillary 21 G SS, 160 mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | 304H21RW | 1 x |
| Dry wipes | Contec Inc. , SC, USA | Prosat Wipes saturated with isopropyl alcohol | cleaning material |
| Flowmeter | TSI, Shoreview, MI, USA | 4100 Series, 0-20 L/min | or equivalent |
| Gilibrator-2 calibrator | Sensidyne, St-Petersburg FL, USA | Gilian Gilibrator-2 | Air flow calibrator |
| Glass Couplings | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | |
| Glass piping | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | Pipe 25 and 40 mm |
| Heating elements | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | LDC01864 | 4 x |
| High heat grease | Lubriplate Lubricant Company, NJ, USA | High temperature multipurpose grease | CAG maintenance |
| Inner PEEK tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
| Magnetic stirrer | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany | C-MAG HS 4 | or equivalent |
| Micro impingers | Labo Service, Kontich, Belgium | Custom Built | |
| Outer SS tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
| PEEK adaptor | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| Peristaltic pump | Watson-Marlow Fluid Technology Group, Falmouth, UK | Watson-Marlow 530 U | or equivalent |
| Push-in fitting | Festo Pte Ltd | NPQM-DK-M5-Q4-P10 | 1 x |
| Sample Column Extrelut NT3 cartridge | Merk Sigma-Aldrich | 115095 | |
| SS 25 mm assembly cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| SS M8 lead screw | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
| SS M8 nut | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
| SS rear backing | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| Temperature controller | Cole Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Digi-Sense TC 9600 | or equivalent |
| Thermocouple type K | RS Components GmbH, Wädenswil, Switzerland | 814-0147 | 1 x |
References
- Williams, M., Talbot, P. Variability among electronic cigarettes in the pressure drop, airflow rate, and aerosol production. Nicotine and Tobacco Research. 13 (12), 1276-1283 (2011).
- Farsalinos, K. E., Voudris, V., Poulas, K. E-cigarettes generate high levels of aldehydes only in 'dry puff' conditions. Addiction. 110 (8), 1352-1356 (2015).
- Werley, M. S., et al. Toxicological assessment of a prototype e-cigaret device and three flavor formulations: a 90-day inhalation study in rats. Inhalation Toxicology. 28 (1), 22-38 (2015).
- Werley, M. S., et al. Non-clinical safety and pharmacokinetic evaluations of propylene glycol aerosol in Sprague-Dawley rats and Beagle dogs. Toxicology. 287 (1-3), 76-90 (2011).
- Werley, M. S., et al. Prototype e-cigarette and the capillary aerosol generator (CAG) comparison and qualification for use in subchronic inhalation exposure testing. Aerosol Science and Technology. 50 (12), 1284-1293 (2016).
- Williams, M., Villarreal, A., Bozhilov, K., Lin, S., Talbot, P. Metal and silicate particles including nanoparticles are present in electronic cigarette cartomizer fluid and aerosol. PLoS One. 8 (3), 57987 (2013).
- Bekki, K., Uchiyama, S., Ohta, K., Inaba, Y., Kunugita, N. Carbonyl compounds generated from electronic cigarettes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 11 (11), 11192-11200 (2014).
- Flora, J. W., et al. Characterization of potential impurities and degradation products in electronic cigarette formulations and aerosols. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 74, 1-11 (2016).
- European Commission. Tobacco Products Directive. Directive 2014/40/EU of the European Parliament and of the Council on 3 April 2014. , Available from: https://ec.europa.eu/health/sites/health/files/tobacco/docs/dir_201440_en.pdf (2014).
- Farsalinos, K. E., Le Houezec, J. Regulation in the face of uncertainty: the evidence on electronic nicotine delivery systems (e-cigarettes). Risk Management and Healthcare Policy. 8, 157-167 (2015).
- McNeill, A., Brose, L., Calder, R., Bauld, L., Robson, D. Evidence review of e-cigarettes and heated tobacco products 2018. A report commissioned by Public Health England. Public Health England. , London. (2018).
- Howell, T. M., Sweeney, W. R. Aerosol and a method and apparatus for generating an aerosol. US Patent. , US5743251 (1998).
- Dutra, L. M., Grana, R., Glantz, S. A. Philip Morris research on precursors to the modern e-cigarette since 1990. Tobacco Control. 26, 97-105 (2017).
- Gupta, R., Hindle, M., Byron, P. R., Cox, K. A., McRae, D. D. Investigation of a novel Condensation Aerosol Generator: solute and solvent effects. Aerosol Science and Technology. 37 (8), 672-681 (2003).
- Geiss, O., Bianchi, I., Barrero-Moreno, J. Correlation of volatile carbonyl yields emitted by e-cigarettes with the temperature of the heating coil and the perceived sensorial quality of the generated vapours. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 219 (3), 268-277 (2016).
- Hong, J. N., Hindle, M., Byron, P. R. Control of particle size by coagulation of novel condensation aerosols in reservoir chambers. Journal of Aerosol Medicine. 15 (4), 359-368 (2002).
- Taylor, G., Warren, S., McRae, D., Venitz, J. Human deposition and exposure studies with propylene glycol aerosols produced using the CAG technology platform. Respiratory Drug Delivery. 1, 183-190 (2006).
- Wong, E. T., et al. A 6-month inhalation toxicology study in Apoe -/- mice demonstrates substantially lower effects of e-vapor aerosol compared with cigarette smoke in the respiratory tract. Archive of Toxicology. 95 (5), 1805-1829 (2021).
- Shen, X., Hindle, M., Byron, P. R. Effect of energy on propylene glycol aerosols using the capillary aerosol generator. International Journal of Pharmaceutics. 275 (1-2), 249-258 (2004).
- Phillips, B., et al. Toxicity of the main electronic cigarette components, propylene glycol, glycerin, and nicotine, in Sprague-Dawley rats in a 90-day OECD inhalation study complemented by molecular endpoints. Food and Chemical Toxicology. 109, 315-332 (2017).
- Hindle, M., Cox, K. A., Gupta, R. Adding pharmaceutical flexibility to the capillary aerosol generator. Proceedings of Respiratory Drug Delivery IX. (Volume III). , River Grove, IL. ISBN 1-930114-63-X, www.RDDOnline.org 247-253 (2004).
