Summary
Protokollet beskriver inställningarna och användningen av en kapillär aerosolgenerator för kontinuerlig produktion av kontrollerad aerosol från en flytande lösning av flera arter, lämplig för stadig aerosoltillförsel med stora volymer (t.ex. in vivo-inhalationsstudier).
Abstract
Kapillär aerosolgenerator (CAG) drivs med principen om termisk vätskeavdunstning genom uppvärmning av e-vätska i den inledande fasen, följt av kärnbildning och kondens som regleras genom en blandning av luftflöde för att generera aerosoler, såsom i en elektronisk cigarett (EC). CAG är särskilt användbart för att generera aerosoler av stora volymer på ett kontinuerligt sätt, till exempel in vivo inhalationstoxikologiska studier, där användning av EG inte är möjlig. De termiska effekterna av att generera aerosol från CAG är likartade när det gäller temperatur som appliceras i en EG, vilket gör det möjligt för utredare att bedöma ångorna från e-vätskor i stor skala och reproducerbarhet. Eftersom driften av CAG tillåter användare att styra kritiska parametrar som flödeshastigheten för e-vätska, uppvärmningstemperaturer och utspädningsluftflöden, tillåter det utredare att testa olika e-vätskeformuleringar i en välkontrollerad enhet. Egenskaper, såsom aerosolpartikelstorlek, har visat sig regleras med luftflödeshastigheten med avseende på e-vätskeflödet och e-vätskekompositionen. CAG är dock begränsad när det gäller att bedöma vanliga EG-relaterade frågor, såsom överhettning av dess element. Vi försöker visa att CAG kan generera aerosol som är reproducerbar och kontinuerlig genom att bedöma de kemiska och fysikaliska aerosolegenskaperna med en vald e-vätskeformulering. Protokollet beskriver driftsparametrarna för vätskeflödeshastighet, utspädningsluftflöde och driftsprocedurer som behöver optimera aerosolkoncentrationen och partikelstorleken som krävs för en in vivo-toxikologisk studie. Genom att presentera de representativa resultaten från protokollet och diskutera utmaningarna och tillämpningarna av att arbeta med en CAG visar vi att CAG kan användas på ett reproducerbart sätt. Tekniken och protokollet, som har utvecklats från tidigare arbete, fungerar som en grund för framtida innovationer för laboratoriekontrollerade aerosolgenereringsundersökningar.
Introduction
Vanliga e-vätskor innehåller en blandning av propylenglykol, glycerol, vatten, nikotin och utvalda smaker. Sammansättningen av en aerosol som genereras från en EC-anordning beror inte bara på vätskeformuleringen utan också på anordningens material, design och egenskaper. Följaktligen kan många EG-anordningar medföra en stor variation i aerosolutgången1, inklusive produktspecifik produktion av förhöjda halter av oönskade beståndsdelar, puffvolymvariation, förändring i luftflödet på grund av blockerade ventilationshål och "torr puffning" (när vätskebehållaren är nästan tom, vilket orsakar överhettning av anordningen eftersom en del av den levererade energin inte används för vätskeindunstning)2 . Dessutom skulle laddning, påfyllning och rengöring av EC-enheter under långsiktiga inhalationsstudier bli en enorm ytterligare begränsning när det gäller logistik3. Av dessa skäl bör andra aerosolgeneratorer övervägas för storskalig produktion av aerosoler och korrekt utvärdering av flytande formuleringar samtidigt som man undviker produktrelaterade variationer i aerosolsammansättningen och minskar arbetsbelastningen 4,5. Produktgenererade aerosoler bör dock förbli en del av riskbedömningsstrategierna, eftersom halterna av vissa beståndsdelar i EG-produkter kan vara högre än i laboratoriekontrollerade standardiserade aerosolgeneratorer på grund av produkternas värme-/kylspecificiteter 6,7,8.
På grund av den begränsade information om lagstadgade krav som för närvarande finns tillgänglig utvecklas fortfarande utvärderingsmetoderna för den potentiella toxiciteten hos aerosoler som genereras av elektroniska cigaretter (EC) 9,10,11. Noggrann in vitro- och in vivo-utvärdering kräver emellertid generering av väl karakteriserade och reproducerbara volymer aerosol över tiden. Att producera aerosol från en EG-enhet med en kontrollerad puffningsregim skulle säkert vara den mest representativa processen ur användarkonsumtionens perspektiv. När det gäller studier av lagstadgad toxicitet, med beaktande av en mängd olika möjliga flytande formuleringar som användarna ofta kan förbereda själva och samtidigt ändra vissa produktegenskaper (t.ex. levererad energi), är användningen av EG-produkter för att utföra toxikologiska studier med långvarig upprepad exponering inte bara utmanande utan också potentiellt otillräcklig.
Kapillär aerosolgenerator (CAG) - utvecklad av Philip Morris12,13 och ytterligare förfinad av Virginia Commonwealth University14 - arbetar med principen att skapa en stråle med varmt ångflöde från en elektriskt uppvärmd kapillär, som därefter kyls ner med omgivande luft, vilket orsakar partikelkärnbildning och efterföljande kondensation, vilket leder till aerosolbildning. Eftersom samma fysikaliska processer leder till aerosolbildning i EC (bortsett från leverans av vätskan till kapillären av en pump i CAG, som i en EG vanligtvis ersätts av kapillärkrafter som verkar på det transporterande materialet som drar vätskan från behållaren i EG), är egenskaperna hos CAG-genererade aerosoler mycket lika dem hos EG-aerosoler14 (Figur 1 ). CAG tillåter produktion av stora volymer aerosol, med få hanteringskrav; Den är därför särskilt lämplig för in vivo-inhalationsstudier.
CAG är en laboratorieanordning som består av ett uppvärmt kapillärrör som helt enkelt är anslutet till en temperaturregulator och till en vätskebehållare via en peristaltisk pump (figur 2A). Kapillären (160 mm, 21 G, rostfritt stål) värms upp av fyra värmeelement, alla inbäddade i ett aluminiumblock (figur 2B). Temperaturen är vanligtvis inställd på 250-275 ° C för att efterlikna spoluppvärmningsförhållandena för enEC-enhet 15. Vätskan som pumpas genom kapillären värms upp och förvandlas till varm ånga som kommer ut från kapillärens spets. CAG-enheten (figur 2C) kräver ytterligare element för att blanda den genererade ångan med kall luft och bilda en aerosol. Den plötsliga blandningen av den heta övermättade ångan med en kall luftström resulterar i kärnbildning och efterföljande kondensation, vilket leder till aerosolbildning (figur 2C). I vår CAG-design (figur 3) kyler ett ytterligare uppvärmt luftflöde först ner den yttre kroppen och cirkulerar därefter längs värmeblocken för att värma upp luftflödet, vilket samtidigt förhindrar kondens av vätskeflödet vid kapillärens spets och stabiliserar ångstrålen. Dessutom skapar det oönskad avskärmning av heta ångor, vilket påverkar kärnbildningsprocessen. Av denna anledning bör flödeshastigheten som appliceras för detta luftflöde vara minimal och passa syftet med applikationen. Detta luftflöde kommer att kallas "uppvärmt luftflöde" i hela detta manuskript, även om det måste förstås att denna ström värms passivt av värmeblocken och inte avsiktligt av användaren.
Kylluftflödeshastigheten har ett starkt inflytande på storleken på de genererade aerosolpartiklarna. Vid aerosolproduktion för in vivo-inhalationsstudier kommer utspädningsluftflödet att bestämma exponeringsdosen och kan behöva spädas ytterligare innan exponeringskammaren nårs. Förutom aerosolernas kemiska sammansättning är det viktigt att karakterisera aerosolpartikelstorleksfördelningen (PSD) för att säkerställa att den genererade aerosolen liknar den som genereras av ECs och inom det inhalationspartikelstorleksintervall som rekommenderas i OECD:s riktlinjer (ofta parametriserat genom antagandet om log-normalitet för PSD med aerodynamisk massmediandiameter [MMAD] och geometrisk standardavvikelse [GSD]).
MMAD för de genererade aerosolerna kan variera mycket beroende på enhetens design, fysikalisk-kemiska vätskeegenskaper hos formuleringen (t.ex. densitet, viskositet och ytspänning), luftflödeshastighet och temperatur som dikterar termodynamiska förhållanden 14,16,17. För in vivo-exponeringsexperiment består luftflödet i allmänhet av konditionerad, filtrerad luft vid 22 ± 2 °C och 60 % ± 5 % relativ luftfuktighet. Den genererade aerosolen kan sedan spädas ytterligare beroende på studiekraven för att uppnå målkoncentrationer i testatmosfären. Den levereras sedan via glasrör till exponeringskammaren för att minska filtreringsförlusten. I de resultat som presenteras här fastställs temperatur- och luftflödesinställningarna för att visa att CAG kan användas för kontinuerlig produktion av en kontrollerad aerosol med konsekvent och inandningsbar PSD och definierade koncentrationer för in vivo-inhalationsstudier.
I protokollet kommer vi att beskriva hur man: 1) montera CAG, 2) bestämma parametrar som krävs för att generera aerosol från CAG, 3) utföra aerosolgenerering och 4) analysera fysikaliska och kemiska beståndsdelar av intresse för aerosolen. För dessa preliminära körningar betraktar vi en flytande lösning baserad på en blandning av aerosolbildande komponenter: propylenglykol (PG), glycerol (VG), vatten och nikotin vid föreskrivna massfraktioner. Slutligen kommer vi att dela exempeldata för bedömning av en komplex blandning av flera arter som genereras i våra experiment (med ovan nämnda beståndsdelar blandade med ytterligare smakbeståndsdelar). Vi kommer att diskutera de övergripande resultaten och utmaningarna tillsammans med tillämpligheten av denna experimentella metod för bedömning av sådana blandningar.
Protocol
1. Montering av CAG-system
- Montering av CAG
- Placera kapillären i kapillärspåret på aluminiumvärmeblocken, med utgångsänden utskjutande med ca 5 mm.
- Dra åt skruvarna på de två halvorna av aluminiumvärmeblocken lätt.
- Montera värmeelementen (a) och termoelementet (b) i aluminiumvärmeblocken (c), med ledningarna utskjutande genom aluminiumets bakre lock (d) (figur 4A).
- Se till att värmeelementens ledningar är anslutna till en adapter och se till att de är raka.
- Montera det inre PEEK-röret (g) med det yttre SS-röret (e). Se till att de 2 x 4 mm push-in-armaturerna (f) är ordentligt fastsatta på det yttre SS-röret (e) (figur 4B).
- Placera O-ringar (3 x 30 mm) på de två spåren i det inre PEEK-röret (g) och sätt in det inre PEEK-röret (g) i det yttre SS-röret (e) från framänden.
- Placera de monterade aluminiumvärmeelementen på SS bakre baksida (i), med aluminiumets bakre lock mot SS bakre baksida, och skjut den inre PEEK / yttre SS-rörenheten över aluminiumvärmeelementen igenom för att passa tätt med SS bakre baksida (i) (figur 4C).
- Placera aluminiumlocket (h) över aluminiumvärmeelementet, inuti det inre PEEK-röret. Se till att kapillären sticker ut något från aluminiumlocket. Montera de tre SS-ledningsskruvarna (j) runt SS bakre underlag och dra åt ordentligt.
- Placera PEEK-adaptern (k) över det inre PEEK-rörets framsida. Se till att PEEK-adaptern passar på det främre spåret på det inre PEEK-röret. Placera 25 mm Scheduler (l) över PEEK-adaptern och genom de tre SS-ledningsskruvarna. Dra åt muttrarna för hand över schemaläggaren så att PEEK-adaptern är tät (figur 4D).
- Anslut värmeelementen till temperaturregulatorn och kapillären till peristaltiska pumpen och testvätskelösningen.
- Anslut tryckluften för uppvärmt luftflöde till CAG via push-in-armaturerna på 2 x 4 mm (figur 4B, [f]).
- Montera CAG på glasstycket och anslut CAG-kylning och första utspädningsluftflöden (bearbetad luft; Figur 3). Lägg till en andra utspädningsflödesinmatning vid behov samt aerosolprovtagningsportar och en reglerande T-korsning (figur 5).
- CAG rengöringsprocedur
- Ta bort CAG från CAG-glasmonteringsinställningen och rengör glaset med torra våtservetter tills glaset är synligt torrt.
- Observera kapillärutgången från CAG för obstruktion. Om partikelavsättning kan observeras på kapillärens utlopp, byt kapillären. På samma sätt, efter att ha märkt minskad aerosolleverans, byt ut kapillären med en ny.
- Demontera CAG enligt steg 1.1.9 till 1.1.1.
- Sätt tillbaka CAG enligt stegen 1.1.1 till 1.1.9 när kapillären har ändrats.
2. Beräkning av CAG-aerosolkoncentration och utspädning
- Teoretisk beräkning av TDF
- Beräkna TDF baserat på koncentrationen av den flytande formuleringen (kallad stamlösning/koncentration här) och LFR:
TDF: totalt utspädningsluftflöde (L/min)
C-lager: beståndskoncentration 2 %, vikt/vikt)
LFR: vätskeflöde (g/min)
C-mål: målkoncentration (μg/L) - Om du använder en lösning med 2 % nikotin , med en målkoncentration av nikotinaerosol vid 15 μg/l och en LFR på 0,35 g/min, antar du att 100 % utbyte kommer att vara följande:
- Beräkna TDF baserat på koncentrationen av den flytande formuleringen (kallad stamlösning/koncentration här) och LFR:
- Teoretisk beräkning av LFR
- Beräkna LFR baserat på koncentrationen av den flytande stamlösningen och TDF:
LFR: vätskeflöde (g/min)
C-mål: målkoncentration (μg/L)
TDF: totalt utspädningsluftflöde (L/min)
C-bestånd: lagerkoncentration (%, vikt/vikt) - Om du använder en lösning med 2 % nikotin, med en målkoncentration av nikotinaerosol vid 15 μg/l och en TDF på 300 l/min, antar vi att ett 100 % utbyte kommer att vara följande:
- Beräkna LFR baserat på koncentrationen av den flytande stamlösningen och TDF:
- Beräkning av faktisk avkastning (%) baserat på experimentella data
- Baserat på ovanstående teoretiska beräkningar, utför de initiala tekniska körningarna för att kvantifiera den faktiska aerosolkomponentkoncentrationen (CActual) och erhålla det faktiska utbytet (AY) för CAG-aerosolen. Utför ytterligare finjustering av aerosolkoncentrationen genom att använda samma beräkningar för justering av TDF eller LFR.
AY: faktisk avkastning (%)
CFaktisk: faktisk koncentration av aerosolbeståndsdelar (μg/L)
TDF: totalt utspädningsluftflöde (L/min)
C-bestånd: lagerkoncentration (%, vikt/vikt)
LFR: vätskeflöde (g/min) - Användning av en lösning innehållande 2 % nikotin med en uppmätt aerosolkoncentration av nikotin på 15 μg/l, TDF på 320 l/min och LFR på 0,35 g/min kommer att resultera i följande nikotin-AY:
- Baserat på ovanstående teoretiska beräkningar, utför de initiala tekniska körningarna för att kvantifiera den faktiska aerosolkomponentkoncentrationen (CActual) och erhålla det faktiska utbytet (AY) för CAG-aerosolen. Utför ytterligare finjustering av aerosolkoncentrationen genom att använda samma beräkningar för justering av TDF eller LFR.
3. CAG aerosol generering
- Starta aerosolgenerering
- Väg och registrera värdet på testvätskan, magnetomröraren och flaskan till närmaste 0,01 g. Flytande stamformuleringar framställs med komponenter som beskrivs i tabell 1.
- Ange respektive luftflödesinställningar (±5 %) (figur 5):
Tryckluft för uppvärmt flöde: 2 L/min
Kylflöde: 10 L/min
Första utspädningsflödet: 150 L/min
Andra utspädningsflödet: 160 L/min
Avfallsflöde: 172 L/min - Ställ in temperaturkontrollens skarpunkt på den digitala temperaturregulatorn till 250 °C och börja värma CAG.
- Placera den flytande stamlösningen med en magnetisk omrörningsstång på en magnetisk omrörare. Placera inloppsröret från den peristaltiska pumpen i testlösningen.
- Slå på den peristaltiska pumpen och ställ in flödet på LFR-±5% (g / min).
- När CAG-temperaturen når 250 ± 1 ° C, börja aerosolgenereringen genom att starta den peristaltiska pumpen för att leverera testvätska till CAG.
- Kontrollera om aerosolen genereras nära kapillärspetsen och registrera den tid som behövs för att beräkna massflödeshastigheten. Om ingen aerosol genereras, kontrollera all utrustning och inställningar igen. Om fortfarande ingen aerosol genereras är det mycket troligt att kapillären är blockerad och behöver bytas ut.
- Under aerosolgenerering
- Töm vätskan som kondenserar i glasuppsättningen var 60: e minut för att säkerställa konstant och stabil aerosolgenerering.
- Stoppa aerosolgenerering
- Ta bort slangen från testlösningsflaskan och byt testvätskan till avjoniserat vatten och registrera tiden för beräkning av massflödeshastigheten.
- Vänta tills vattenånga kommer ut från kapillären, stäng av temperaturregulatorn och håll den peristaltiska pumpen på i minst 10 minuter för att spola och rengöra kapillären.
- Väg och registrera värdet på testvätskan och flaskan till närmaste 0,01 g och beräkna massflödet med hjälp av följande ekvation:
- Stäng av tryckluften som används som uppvärmt flöde.
- Ta vid behov bort CAG från monteringsinställningen och rengör glasslangen med torra våtservetter och sätt ihop CAG igen.
4. Analytisk bestämning av beståndsdelar
OBS: Aerosolprovtagning utförs i två lägen: a) på den outspädda aerosolen (både första utspädningsluften och det andra utspädningsflödet stängs av under outspädd provtagning) och b) på den utspädda aerosolen med alla utspädningar (figur 5). Upp till tre provtagningsportar finns tillgängliga vid var och en av provtagningspositionerna, a och b, vilket möjliggör samtidig insamling av ACM och annan utrustning/sonder för analys av aerosolegenskaper. Provtagningsledningen installeras vinkelrätt mot aerosolflödesriktningen och ansluts till en vakuumpump som gör det möjligt att dra en viss volym aerosol (beroende på pumpens flödeshastighet och provlängd).
- Bestämning av aerosoluppsamlad massa (ACM)
OBS: Aerosolens partikelfas fångas på en glasfiberfilterplatta (diameter: 44 mm, partikelstorleksretention: 1,6 μm). ACM-vikter före och efter provtagning mäts med filterhållare för att minimera förluster vid vägning på grund av avdunstning av flyktiga komponenter.- Placera ett filter i filterhållaren och placera filterlocken.
- Väg filterhållaren till närmaste 0,0001 g med filtret före provtagning och dokumentera vikten.
- Anslut filterhållaren som innehåller filtret till aerosolflödet och starta provtagningen.
- Efter provtagning, väg filtret med filterhållaren och locken och dokumentera slutvikten.
- Beräkna ACM med följande formel:
ACM: koncentration av ACM (μg/L)
Wb: filtrets och filterhållarens vikt före provtagning (g) till närmaste 0,0001 g
Wa: filtrets och filterhållarens vikt efter provtagning (g) till närmaste 0,0001 g
Vaerosol: Volym aerosol (L) som passerar genom filtret, beräknad med hjälp av:
Provtagningstid (min) x provtagningsflöde (L/min) - Ta bort filterplattan från filterhållaren och lägg den i en 25 ml glasflaska som innehåller 5 ml etanol. Extrahera ACM genom att skaka filterplattan på en laboratorieskakare i 30 minuter vid 400 rpm.
- Centrifugera glasflaskan på 25 ml i 5 minuter vid 290 x g och samla supernatanten för kvantifiering av PG/VG och partikelfasen av nikotin.
- Bestämning av nikotinkoncentration (eller smak)
OBS: Aerosolen fångas på en provkolonn som innehåller speciellt bearbetad diatoméjord med bred por, en kemiskt inert matris för användning i ett pH-intervall från 1 till 13 (figur 6).- Förbered provkolonnen inom 15 minuter innan aerosolprovinsamlingen påbörjas.
- För bestämning av nikotinkoncentrationer, tillsätt 2 ml 0,5 M svavelsyra. För att bestämma smaker, tillsätt 2 ml isopropanol.
- Kontrollera provtagningsflödet.
- Slå på vakuumpumpen och kontrollera flödeshastigheten med en provkolonn ansluten till provtagningsledningen med hjälp av den kalibrerade flödesutrustningen som ger en noggrannhet till 1 ccm/min. Justera flödet med nålventilen till intervallet 700 ccm/min ± 5 %.
- Stäng av vakuumpumpen.
- Exempel på insamling
- Lägg till de två adaptrarna i provkolonnen enligt dess inlopps- och utloppssida (figur 6). Anslut röret till vakuumprovtagningsledningen via utloppsadaptern.
- Anslut provkolonnenheten till provtagningsporten via inloppsadaptern.
- Starta provtagningen genom att slå på vakuumpumpen.
- Registrera starttiden för samplingen.
- Efter en förinställd provtagningstid, 10 min vid outspädd provtagningspunkt A och 30 min vid utspädd provtagningspunkt B, stäng av vakuumpumpen och registrera tiden.
- Ta bort exempelkolumnen från samplingsporten.
- Ta bort adaptrerna från provkolonnen och försegla provkolonnen med ett filmmembran för att förhindra förluster på grund av avdunstning eller kontaminering. Märk exempelkolumnen enligt motsvarande exempelnamn.
- Förvara den förseglade provpelaren i kylskåp (2–8 °C) tills analysen.
- Bestämning av karbonylkoncentrationer
OBS: Karbonyler fångas på en glasfilterplatta som är ansluten i serie till en mikroimpinger fylld med 2,4-dinitrofenylhydrazin (DNPH) upplöst i acetonitril.
- Förbered provkolonnen inom 15 minuter innan aerosolprovinsamlingen påbörjas.
- Förberedelse för fångst
- Fyll mikroimpingern med 10 ml 15 mM DNPH i acetonitril.
- Förbered en filterplatta (se punkt 4.1).
- Kontrollera provtagningsflödet
- Slå på vakuumpumpen och kontrollera provtagningsledningens flödeshastighet med hjälp av en kalibrerad flödesutrustning som ger en noggrannhet på 1 ccm/min. Justera flödet med nålventilen till intervallet 700 ccm/min ± 5 %.
- Stäng av vakuumpumpen.
- Insamling av provtagning
- Anslut filterhållaren som är kopplad till mikroimpingern till provtagningsporten.
- Anslut vakuumprovtagningsledningen till mikroimpingerns utlopp.
- Starta provtagningen genom att slå på vakuumpumpen.
- Registrera starttiden för samplingen.
- Efter en förinställd provtagningstid, 10 min vid outspädd provtagningspunkt a och 30 min vid utspädd provtagningspunkt b, stäng av vakuumpumpen och registrera tiden.
- Koppla bort provtagningsfällan från provtagningsporten.
- Töm impingern i en glasflaska. Fyll på DNPH-lösningen till 10 ml med acetonitril.
- Bestäm filterplattans vikt och extrahera den i DNPH-acetonitrillösningen genom att skaka. Kassera filterplattan efter extraktion.
- Ta en 1 ml alikvot av karbonyl-DNPH-lösningen och tillsätt 50 μL pyridin för att stabilisera lösningen.
- Förvara alikvoterna i en frys vid ≤–12 °C tills analysen.
- Fyll mikroimpingern med 10 ml 15 mM DNPH i acetonitril.
Representative Results
Reproducerbarhet av CAG-aerosoler
För att demonstrera reproducerbarheten hos den CAG-genererade aerosolen användes en basflytande lösning innehållande PG, VG, nikotin, vatten och etanol (71,72%, 17,93%, 2%, 5,85% respektive 2,5% över 10 separata aerosolgenereringskörningar. Aerosoliserings- och provtagningsparametrarna sammanfattas i tabell 2. Kemisk karakterisering av de CAG-genererade aerosolerna bekräftade den höga graden av reproducerbarhet av de resultat som erhölls med hjälp av systemet. Under samma värme-, kyl- och utspädningsluftflöden samt samma provtagningsförhållanden var koncentrationerna av ACM, nikotin, VG och PG stabila under aerosolgenereringskörningarna, med den relativa standardavvikelsen på 2,48%, 3,28%, 3,43% och 3,34% av ACM, nikotin, VG respektive PG (figur 7).
Koncentrationerna av åtta karbonyler - nämligen acetaldehyd, aceton, akrolein, butyraldehyd, krotonaldehyd, formaldehyd, metyletylketon och propionaldehyd - mättes under tre på varandra följande CAG-aerosolgenereringskörningar. Som förväntat med aerosoler som genererades vid konstant kontrollerade förhållanden förblev utbytet av alla karbonyllanalyter lågt (tabell 3) och nådde inte kvantifieringsgränserna (LOQ) för analysmetoden för de flesta föreningar. Endast acetaldehyd och formaldehyd hade utbyten över LOQ. Formaldehydkoncentrationerna i det utspädda aerosolprovet visade hög variabilitet (±32%) på grund av flyktigheten hos denna analyt samt utbyten nära LOQ. Uppgifterna bekräftade frånvaron av flytande termiska nedbrytningsprodukter i CAG-genererade aerosoler. Tillsats av en blandning av smaker hade ett inflytande på aerosolens karbonylsammansättning. I förevarande fall ökade acetaldehyd- och butyraldehydutbytena drastiskt, från värden nära LOQ till 2,06 respektive 1,56 μg/l i den utspädda aerosol som var avsedd att komma in i exponeringskammaren. Dessa data belyser effekten av smakblandningens sammansättning på aerosolsammansättningen och betonar behovet av att undersöka den potentiella toxiciteten hos vissa smakämnen i en e-vätskeformulering i ett tidigt skede, innan den slutliga bedömningen i in vivo långtidsexponeringsstudier.
PSD för cag-genererade aerosoler
PSD för de CAG-genererade aerosolerna mättes under olika kyl- och första utspädningsflöden för att utvärdera effekterna av dessa förhållanden på de fysiska egenskaperna hos aerosolen som genereras från den basflytande lösningen innehållande PG, VG, vatten och nikotin. Denna procedur är avgörande för att identifiera lämpliga förhållanden för framställning av aerosoler med partikelstorlekar i det respirabla området.
I den aktuella studien modifierades kyl- och första utspädningsflöden i steg om 10 l/min för att bibehålla samma totala volym aerosolflöde (tabell 4). Vätskeflödet (0,5 ml/min), det uppvärmda flödet (2 l/min) och det andra utspädningsflödet (150 l/min) hölls konstant. Aerosolprover togs från den utspädda provtagningspunkten b (figur 5). PSD bestämdes med hjälp av en aerodynamisk partikelstor som mäter partikelstorlekar från 0,5 till 20 μm, med en provflödeshastighet på 5 l/min och späds ut på lämpligt sätt för användning med utrustning. MMAD och GSD rapporterades av den aerodynamiska partikelstoren för varje aerosolgenerationskörning.
Ökningen av kylflödet och den samtidiga minskningen av det första utspädningsflödet påverkade aerosolpartikelstorleken (tabell 4). Det största inflytandet på partikelstorleken observerades vid ändring av kylflödet från 10 till 20 l/min och det första utspädningsflödet från 160 till 150 l/min. MMAD mer än fördubblades under dessa förhållanden från 1,47 till 4,03 μm. Den genomsnittliga aerosolpartikelstorleken fortsatte att växa med de ökande kylflödena, om än i lägre förhållanden än de som observerades mellan 10 och 20 L / min. Fördelningen av aerosolpartiklarnas aerodynamiska diameter förskjutits tydligt mot större diametrar när man jämförde aerosoler som genererades vid 10 l/min kylflöde med de som genererades vid 20–50 l/min (figur 8).
Fångsteffektivitet av e-flytande smaker
Som diskuterats tidigare, på grund av deras flyktighet, är olika flytande beståndsdelar kontinuerligt benägna att överföra gas-flytande massa beroende på lokala termodynamiska förhållanden. Dessutom har analysmetoder en viss förmåga att fälla sådana beståndsdelar. Faktiska avkastningsmätningar gör det möjligt för oss att mäta kemiska metoders förmåga att exakt detektion och kvantifiering av utvalda beståndsdelar (till exempel på grund av deras kondensationspotential eller reaktioner kanske vissa beståndsdelar inte når sin destination, dvs exponeringskammaren vid inhalationsstudier). Vid bedömning av olika smaksatta e-vätskeformuleringar är det således viktigt att kunna bestämma den mest effektiva fångstmetoden för kemisk bedömning av aerosolen. Därefter tillåter detta oss att mäta överföringshastigheten för varje beståndsdel, vilket dikteras av de ofta närvarande förlusterna på grund av aerosoltransport från produktionsplatsen till exponeringskammaren. I förevarande fall utfördes ytterligare en studie med en vätska innehållande en blandning av smakämnen. Aerosol genererades med de CAG-parametrar som anges i tabell 2 och fångades efter utspädning (position b, figur 5), med provtagningsflödet inställt på 0,7 l/min i 30 minuter. Fångst utfördes på provtagningskolonner förkonditionerade med 2 ml isopropanol. Patronerna eluerades med isopropanol strax efter avslutad fångstperiod, tills 20 ml av lösningen återfanns. Vi fann att fångsteffektivitet i allmänhet bör undersökas och bestämmas för varje smakbeståndsdel.
För 70% av de undersökta smakbeståndsdelarna hade vi återvinningsgrader >60%, vilket var väl korrelerat med smakernas kokpunkter (flyktighet). Detta faktum innebär att inhalationstoxikologiska studier som innehåller komplexa blandningar bör utföras med särskild uppmärksamhet på överföring och leverans av aerosol till exponeringsstället.
Figur 1: Funktionsprincip för kapillär aerosolgenerator (CAG). Vätskan pumpas in i en elektriskt uppvärmd kapillär som levererar skurar av heta övermättade ångor, som kyls ner av luftflödet, vilket orsakar plötslig kärnbildning och kondensation, vilket leder till aerosolbildning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Typisk CAG-experimentell inställning och nyckelelement. (A) Allmän bild av CAG-enheten, som visar den peristaltiska pumpen som förbinder vätskesallösningen med CAG, utspädningsluftkanalen och aerosolbildningsprocessen. (B) Detaljerad vy över CAG, med kapillär- och värmeelement. (C) Tvärsnittsvy av CAG-enhetens aerosolgenereringsinställning. Detaljer om kyl- och utspädningsluftflödena. Glasslangen har två separata fack. Kylflödet skjuts mot CAG och kommer i kontakt med den vätskegenererade ångan för att producera aerosolen. Utspädningsflödet skjuts mot den bildade aerosolen för att späda ut den senare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Information om CAG-enhet: tvärsnittsvy. Värmeflödet införs runt värmeelementen för kylning av den yttre CAG-kroppen, vilket förhindrar kondens av vätskeflödet vid kapillärens spets och för att stabilisera ångstrålen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: CAG-montering. Kapillär- och värmeelementet (A) sätts in i ett inre PEEK-rör, och denna enhet glider in i ett yttre rostfritt stålrör (B). Aggregatet är täckt och tätt fastsatt på ett stöd med blyskruvar i rostfritt stål (C,D). Kapillären som sticker ut från bakänden är kopplad via slangar till den peristaltiska pumpen och vätskeformuleringen. Förkortningar: SS, rostfritt stål. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: CAG-aerosolgenereringsinställningar för exponeringsexperiment in vivo . Aerosolprovtagning för analys sker i två lägen: a) outspädd aerosol – det första utspädningssteget stängs av under provtagningen. b) Utspädd aerosol, strax innan den kommer in i exponeringskammaren. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Provpelare med bifogade adaptrar. Före provtagning är provkolonnen förkonditionerad med 0,5 M svavelsyra för nikotinanalys eller isopropanol för smakanalys. Inloppsadaptern är ansluten till det CAG-genererade aerosolflödet och utloppsadaptern till vakuumpumpen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: CAG-genererad aerosolkarakterisering och reproducerbarhet. Koncentration av ACM-, nikotin-, PG- och VG-koncentrationer över 10 separata experimentella aerosolgenereringskörningar med samma flytande baslösning. ACM, 1105,45 ± 27,4 μg/L; Nikotin, 20,16 ± 0,7 μg/l; VG, 227,15 ± 7,8 μg/L; PG, 656,59 ± 22,0 μg/L. Felstaplar representerar standardavvikelse. Förkortningar: ACM, aerosoluppsamlad massa; PG, propylenglykol; VG, glycerol. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Förändringar i partikelstorleksfördelningen av aerosol som genereras under olika kylflödeshastigheter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| BAS (PG/VG/N) | SMAK (PG/VG/N/F) | |
| Komponent | PG/VG/N (g/1000g) | PG/VG/N/F (g/1000g) |
| Bensoesyra | 3.33 | 3.33 |
| PG | 240.00 | 238.91 |
| Vatten | 150.00 | 150.00 |
| Mjölksyra | 3.33 | 3.33 |
| Ättiksyra | 3.33 | 3.33 |
| Blandad smakblandning | 0.00 | 1.20 |
| Glycerin | 560.01 | 559.90 |
| Nikotin | 40.00 | 40.00 |
| Summa | 1000.00 | 1000.00 |
Tabell 1: Komponenter för formulering av E-flytande lager18
| Aerosoliseringsprotokoll | Provtagningsprotokoll | ||||
| Parametrar | Outspädd | Utspädd | Parametrar | Outspädd plats A | Utspädd plats B |
| CAG-temperatur (°C) | 250 | ||||
| Pumpens flöde (ml/min) | 0.5 | 0.5 | Provtagningstid (min) | 10 | 30 |
| Uppvärmt luftflöde (L/min) | 2 | 2 | Provtagningsflöde (ACM) (L/min) | 0.7 | 1.5 |
| Kylluftsflöde (L/min) | 10 | 10 | Provtagningsflöde Extrelut (L/min) | 0.7 | 0.7 |
| Första luftutspädningen (L/min) | NA | 150 | Provtagningsflöde Karbonyler (L/min) | 0.7 | 0.7 |
| 2: a luftutspädning (L / min) | NA | 160 | |||
| Avfall (L/min) | NA | 172 | |||
Tabell 2: Parametrar för aerosolgenerering, utspädning och provtagning
| Karbonyler | Basvätska (PG/VG/Nikotin) | Smakstockslösning hög koncentration med nikotin (PG/VG/Nikotin/Smaker) |
||
| Outspätt aerosolprov μg/L | Utspätt aerosolprov μg/L | Outspätt aerosolprov μg/L | Utspätt aerosolprov μg/L | |
| Acetaldehyd | 0,834 ± 0,096 | 0.119* | 45.346 ± 1.134 | 2.058 ± 0.202 |
| Aceton | < LOQ | < LOQ | < LOQ | < LOQ |
| Acrolein | < LOQ | < LOQ | < LOQ | < LOQ |
| Butyraldehyd | < LOQ | < LOQ | 36.475 ± 0.996 | 1.557 ± 0.179 |
| Crotonaldehyd | < LOQ | < LOQ | 0,052 ± 0,001 | < LOQ |
| Formaldehyd | 0,731 ± 0,072 | 0,072 ± 0,023 | 0,158 ± 0,007 | 0,026 ± 0,004 |
| Metyletylketon | < LOQ | < LOQ | 0,570 ± 0,015 | < LOQ |
| Propionaldehyd | < LOQ | < LOQ | 0,085 ± 0,001 | < LOQ |
Tabell 3: Bestämning av karbonyler i den CAG-genererade aerosolen. Medelvärden från tre aerosolgenerationskörningar med samma flytande baslösning ensam och med en smakblandning. Endast ett prov över tre körningar hade värden som var större än metodens nedre kvantifieringsgräns (LOQ).
| Inställningar (L/min) | Aerosoldroppdiameter | ||
| Kylflöde | 1: a utspädningsflödet | MMAD (μm) | GSD |
| 10 | 160 | 1.47 ± 0.04 | 2.07 ± 0.01 |
| 20 | 150 | 4,03 ± 0,18 | 2.13 ± 0.04 |
| 30 | 140 | 4.74 ± 0.04 | 1.89 ± 0.02 |
| 40 | 130 | 5.35 ± 0.04 | 1.80 ± 0.01 |
| 50 | 120 | 5.23 ± 0.03 | 1.76 ± 0.01 |
Tabell 4: Bestämning av aerosolpartikelstorlek (droppdiameter) under olika luftflödesförhållanden. Förkortningar: MMAD, massmedian aerodynamisk diameter; GSD, geometrisk standardavvikelse.
Discussion
Att generera aerosoler med CAG hjälper till att minska variationen i EC-enhetsspecifika aerosoliseringsprocesser, vilket möjliggör objektiv och kontrollerbar bedömning av själva aerosoliserad e-vätskeformulering. CAG-genererade aerosoler har visat sig vara representativa för de aerosoler som genereras av ECs7. De kan reproduceras med samma sammansättning och egenskaper och är därför särskilt lämpliga för in vivo långtidsexponeringsstudier som kräver stora volymer aerosol under en längre tidsperiod8.
CAG-installationen är relativt enkel att montera och lätt att underhålla. Driftsparametrarna, såsom vätskeflödeshastighet och respektive luftflödeshastigheter, är dock fortfarande kritiska för produktion av kontrollerad aerosol, vilket kräver metodoptimering enligt syftet med appliceringen av den CAG-genererade aerosolen.
Resultaten som presenteras i den aktuella studien visar att kylluftflödeshastigheten har en tydlig effekt på aerosolpartikelstorleksfördelningen. Kylluftflödet har en direkt inverkan inte bara på kärnbildningen av de genererade ångorna utan också på kondens på grund av kylningen av det inre slangen i vilket den genererade aerosolen flyter. Dessutom är den täta aerosolen benägen för betydande koagulationseffekter. Tillsammans är dessa processer komplexa och deras interaktion och inflytande på aerosolbildning är ganska svåra att generalisera för de specifika e-vätskorna, temperaturerna och flödena. Kompletterande luftflödeskomposition (torr eller fuktad med en fast procentandel relativ luftfuktighet) - i synnerhet vattenhalten - kommer att påverka värme och massutbyte, vilket leder till inte bara modulerad kondenstillväxt av aerosolpartiklar utan även väggkondensation. Således anses ändringar av denna metods parametrar vara för användningsändamål när det gäller att kontrollera PSD17,19.
Närvaron av kemikalier med låg löslighet eller höga kokpunkter kan begränsa effektiviteten hos CAG-genererad aerosol på grund av utfällning i kapillären och igensättning av kapillären över tiden. Beroende på de kemikalier som finns i aerosolen måste temperaturen för drift av CAG justeras för att generera ångan. Dessutom bör stabiliteten hos den flytande formuleringen regelbundet bedömas. Tillsats av beståndsdelar, inklusive smaker, med olika kokpunkter kommer att påverka den slutliga aerosolkompositionen14 och gas-vätskepartitionering. Det kan vara nödvändigt att anpassa kapillärtemperaturen och värmeluftflödet för att förhindra återflöde och vätskeavsättning nära den heta kapillären, vilket kan leda till generering av okontrollerade produkter med termisk nedbrytning (t.ex. karbonyler) på grund av den långa varaktigheten av kvarhållandet av vätskan vid en hög temperatur. Dessutom har styrning av temperaturen som används för att generera ångan i kapillären en inverkan på var ångan börjar bildas i kapillären - ju högre temperaturen desto tidigare bildas ångan. Med en högre kapillärtemperatur kommer ångan som kommer ut ur kapillären att ta längre tid att kylas ner av kylluftflödet och kommer därför att börja kärna och kondensera till en aerosol längre bort från kapillärspetsen, vilket hjälper till att undvika en återflödeseffekt19.
Nuvarande e-vätska in vivo toxikologiska studier är begränsade när det gäller att reproducera e-cigarettaerosoler på grund av den logistiska komplexiteten för att uppfylla den aerosolskala som krävs, såsom i en OECD TG 413-studie20. Protokollet som presenteras i denna studie ger en översikt över CAG-montering och inställningar som används vid Philip Morris International för aerosolgenerering i in vivo långtidsexponeringsstudier18. Dessa data kan fungera som en bra utgångspunkt för ytterligare finjustering i en annan laboratoriemiljö (t.ex. drug delivery-system21) eller för anpassning till specifika krav i en viss studie.
Disclosures
Metoden som rapporteras här samt den specifika CAG-enheten har utvecklats för utvärdering av aerosoler genererade från e-vätskor för att uppfylla kraven i in vivo-exponeringsstudier . Alla författare är anställda hos Philip Morris International (PMI) eller har arbetat för PMI enligt avtal. Philip Morris International är den enda källan till finansiering och sponsor av denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminium front cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| Aluminium heating block, groove diameter 0.4mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | B-505432 | 2 x |
| Aluminium rear cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
| Cambridge glass filter pads | GE Healthcare UK Limited | 9703-9654 | 44 mm diameter |
| Capillary 21 G SS, 160 mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | 304H21RW | 1 x |
| Dry wipes | Contec Inc. , SC, USA | Prosat Wipes saturated with isopropyl alcohol | cleaning material |
| Flowmeter | TSI, Shoreview, MI, USA | 4100 Series, 0-20 L/min | or equivalent |
| Gilibrator-2 calibrator | Sensidyne, St-Petersburg FL, USA | Gilian Gilibrator-2 | Air flow calibrator |
| Glass Couplings | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | |
| Glass piping | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | Pipe 25 and 40 mm |
| Heating elements | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | LDC01864 | 4 x |
| High heat grease | Lubriplate Lubricant Company, NJ, USA | High temperature multipurpose grease | CAG maintenance |
| Inner PEEK tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
| Magnetic stirrer | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany | C-MAG HS 4 | or equivalent |
| Micro impingers | Labo Service, Kontich, Belgium | Custom Built | |
| Outer SS tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
| PEEK adaptor | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| Peristaltic pump | Watson-Marlow Fluid Technology Group, Falmouth, UK | Watson-Marlow 530 U | or equivalent |
| Push-in fitting | Festo Pte Ltd | NPQM-DK-M5-Q4-P10 | 1 x |
| Sample Column Extrelut NT3 cartridge | Merk Sigma-Aldrich | 115095 | |
| SS 25 mm assembly cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| SS M8 lead screw | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
| SS M8 nut | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
| SS rear backing | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| Temperature controller | Cole Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Digi-Sense TC 9600 | or equivalent |
| Thermocouple type K | RS Components GmbH, Wädenswil, Switzerland | 814-0147 | 1 x |
References
- Williams, M., Talbot, P. Variability among electronic cigarettes in the pressure drop, airflow rate, and aerosol production. Nicotine and Tobacco Research. 13 (12), 1276-1283 (2011).
- Farsalinos, K. E., Voudris, V., Poulas, K. E-cigarettes generate high levels of aldehydes only in 'dry puff' conditions. Addiction. 110 (8), 1352-1356 (2015).
- Werley, M. S., et al. Toxicological assessment of a prototype e-cigaret device and three flavor formulations: a 90-day inhalation study in rats. Inhalation Toxicology. 28 (1), 22-38 (2015).
- Werley, M. S., et al. Non-clinical safety and pharmacokinetic evaluations of propylene glycol aerosol in Sprague-Dawley rats and Beagle dogs. Toxicology. 287 (1-3), 76-90 (2011).
- Werley, M. S., et al. Prototype e-cigarette and the capillary aerosol generator (CAG) comparison and qualification for use in subchronic inhalation exposure testing. Aerosol Science and Technology. 50 (12), 1284-1293 (2016).
- Williams, M., Villarreal, A., Bozhilov, K., Lin, S., Talbot, P. Metal and silicate particles including nanoparticles are present in electronic cigarette cartomizer fluid and aerosol. PLoS One. 8 (3), 57987 (2013).
- Bekki, K., Uchiyama, S., Ohta, K., Inaba, Y., Kunugita, N. Carbonyl compounds generated from electronic cigarettes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 11 (11), 11192-11200 (2014).
- Flora, J. W., et al. Characterization of potential impurities and degradation products in electronic cigarette formulations and aerosols. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 74, 1-11 (2016).
- European Commission. Tobacco Products Directive. Directive 2014/40/EU of the European Parliament and of the Council on 3 April 2014. , Available from: https://ec.europa.eu/health/sites/health/files/tobacco/docs/dir_201440_en.pdf (2014).
- Farsalinos, K. E., Le Houezec, J. Regulation in the face of uncertainty: the evidence on electronic nicotine delivery systems (e-cigarettes). Risk Management and Healthcare Policy. 8, 157-167 (2015).
- McNeill, A., Brose, L., Calder, R., Bauld, L., Robson, D. Evidence review of e-cigarettes and heated tobacco products 2018. A report commissioned by Public Health England. Public Health England. , London. (2018).
- Howell, T. M., Sweeney, W. R. Aerosol and a method and apparatus for generating an aerosol. US Patent. , US5743251 (1998).
- Dutra, L. M., Grana, R., Glantz, S. A. Philip Morris research on precursors to the modern e-cigarette since 1990. Tobacco Control. 26, 97-105 (2017).
- Gupta, R., Hindle, M., Byron, P. R., Cox, K. A., McRae, D. D. Investigation of a novel Condensation Aerosol Generator: solute and solvent effects. Aerosol Science and Technology. 37 (8), 672-681 (2003).
- Geiss, O., Bianchi, I., Barrero-Moreno, J. Correlation of volatile carbonyl yields emitted by e-cigarettes with the temperature of the heating coil and the perceived sensorial quality of the generated vapours. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 219 (3), 268-277 (2016).
- Hong, J. N., Hindle, M., Byron, P. R. Control of particle size by coagulation of novel condensation aerosols in reservoir chambers. Journal of Aerosol Medicine. 15 (4), 359-368 (2002).
- Taylor, G., Warren, S., McRae, D., Venitz, J. Human deposition and exposure studies with propylene glycol aerosols produced using the CAG technology platform. Respiratory Drug Delivery. 1, 183-190 (2006).
- Wong, E. T., et al. A 6-month inhalation toxicology study in Apoe -/- mice demonstrates substantially lower effects of e-vapor aerosol compared with cigarette smoke in the respiratory tract. Archive of Toxicology. 95 (5), 1805-1829 (2021).
- Shen, X., Hindle, M., Byron, P. R. Effect of energy on propylene glycol aerosols using the capillary aerosol generator. International Journal of Pharmaceutics. 275 (1-2), 249-258 (2004).
- Phillips, B., et al. Toxicity of the main electronic cigarette components, propylene glycol, glycerin, and nicotine, in Sprague-Dawley rats in a 90-day OECD inhalation study complemented by molecular endpoints. Food and Chemical Toxicology. 109, 315-332 (2017).
- Hindle, M., Cox, K. A., Gupta, R. Adding pharmaceutical flexibility to the capillary aerosol generator. Proceedings of Respiratory Drug Delivery IX. (Volume III). , River Grove, IL. ISBN 1-930114-63-X, www.RDDOnline.org 247-253 (2004).
