Summary
Nous avons utilisé un protocole d’échantillonnage géologique (carottage) pour se procurer des spécimens d’os corticals de taille uniforme pour les expériences SRμCT de l’aspect antérieur du femora humain. Cette méthode est minimalement destructrice, efficace, se traduit par des spécimens cylindriques qui minimisent l’imagerie des artefacts à partir de formes d’échantillons irrégulières et améliore la visualisation et l’analyse microarchitecturales.
Abstract
L’os est un tissu dynamique et mécaniquement actif qui change de structure au cours de la durée de vie humaine. Les produits du processus de remodelage d’os ont été étudiés substantiellement utilisant les techniques bidimensionnelles traditionnelles. Les progrès récents de la technologie d’imagerie aux rayons X par l’intermédiaire de la tomographie micro-calculée de bureau (μCT) et de la tomographie micro-calculée par rayonnement synchrotron (SRμCT) ont permis l’acquisition de balayages tridimensionnels à haute résolution (3D) d’un plus grand champ de vision (FOV) que d’autres techniques d’imagerie 3D (p. ex., SEM) fournissant une image plus complète des structures microscopiques dans l’os cortical humain. Toutefois, le spécimen doit être centré avec précision à l’intérieur du FOV afin de limiter l’apparence des artefacts de stries connus pour avoir un impact sur l’analyse des données. Des études antérieures ont signalé l’achat de blocs osseux rectilinaires de forme irrégulière qui entraînent des artefacts d’imagerie en raison de bords inégaux ou de troncature d’image. Nous avons appliqué un protocole d’échantillonnage géologique (carottage) pour se procurer des spécimens de carottes osseuses corticales de taille constante pour des expériences SRμCT de l’aspect antérieur du femora humain. Cette méthode de carottage est efficace et minimalement destructrice pour les tissus. Il crée des échantillons cylindriques uniformes qui diminuent les artefacts d’imagerie par nature d’être isométrique pendant la rotation et de fournir une longueur de chemin uniforme pour les faisceaux de rayons X tout au long de la numérisation. Le traitement d’image des données tomographiques de rayon X des échantillons cored et irrégulièrement formés confirme le potentiel de la technique pour améliorer la visualisation et l’analyse de la microarchitecture corticale d’os. L’un des objectifs de ce protocole est de fournir une méthode fiable et reproductible pour l’extraction de noyaux d’os corticals adaptables à divers types d’expériences d’imagerie osseuse à haute résolution. Un objectif global du travail est de créer un approvisionnement normalisé d’os cortical pour SRμCT qui est abordable, cohérent, et simple. Cette procédure peut en outre être adaptée par des chercheurs dans des domaines connexes qui évaluent généralement des matériaux composites durs tels que dans l’anthropologie biologique, les géosciences, ou les sciences des matériaux.
Introduction
Avec les progrès récents de la technologie d’imagerie, il est maintenant possible d’acquérir des données d’imagerie par rayons X avec une très haute résolution. Les systèmes de micro-CT de bureau (μCT) sont la norme actuelle pour l’imagerie des os cancellous en raison de leur nature non destructive1. Quand les dispositifs microstructuraux de formation image de l’os cortical, cependant, l’utilisation de μCT a été plus limitée. En raison de contraintes de résolution, les systèmes de bureau ne peuvent pas atteindre la résolution requise pour l’image des caractéristiques microstructurales plus petites que les pores corticals, tels que les lacunae ostéocytes. Pour cette application, SRμCT est idéal en raison de la plus grande résolution de ces systèmes1. Par exemple, des expériences menées à la Source lumineuse canadienne (CLS) sur les lignes de faisceaux d’imagerie et de thérapie biomédicales (BMIT)2 ont produit des images avec des voxels aussi petits que 0,9 μm. Des étudesantérieures 1,3,4,5 ont utilisé cette résolution pour acquérir des projections et des rendus tridimensionnels subséquents (3D) à partir de spécimens d’os corticals provenant d’os longs humains ( figure1) pour quantifier la densité lacunaire ostéocyte4,6,7,8,9 et la variation de la forme lacunaire et de la taille3 à travers la durée de vie humaine et entre les sexes. D’autres études ont démontré la présence de baguage d’ostéonchez l’homme 10, un phénomène précédemment reconnu pour être associé à seulement les mammifères non humains dans la littérature anthropologique médico-légale.
Afin d’obtenir une résolution exceptionnelle, le faisceau de rayons X doit être finement concentré dans le champ de vision (FOV), ce qui limite souvent la taille maximale du spécimen à quelques millimètres de diamètre. À l’heure actuelle, il n’y a pas eu de procédures complètes et normalisées décrites dans la documentation décrivant l’approvisionnement en échantillons d’os qui répondent à ces restrictions. Il est essentiel de centrer les spécimens à l’intérieur du FOV pour s’assurer que 1) l’échantillon reste centré pendant qu’il tourne à 180° pendant l’imagerie, et 2) les artefacts de balayage sont limités puisqu’il n’y a pas de troncature d’image. En d’autres termes, aucune partie de l’échantillon à l’extérieur du FOV n’interfère avec le faisceau entrant dans son point focal à l’intérieur du FOV. Si cela se produit, l’algorithme de reconstruction est privé de certaines des données d’atténuation nécessaires pour une reconstruction entièrement correcte. Il est également intéressant de noter que les balayages à 360° (rotation complète) minimisent les effets du durcissement du faisceau, mais augmentent les artefacts causés par le désalignement et le mouvement de l’échantillon pendant l’imagerie. Ainsi, alors qu’une analyse à 360° génère généralement des données plus propres, le temps d’imagerie est doublé et un compromis entre coût expérimental et qualité des données doit donc être abordé.
Un aspect important et souvent négligé des expériences d’imagerie osseuse est la technique précise et reproductible de préparation des spécimens effectuée avant la numérisation. Les études qui intègrent les méthodes SRμCT dans leurs expériences mentionnent brièvement leur protocole d’échantillonnage, mais les auteurs fournissent peu ou pas de détails sur la méthodologie particulière utilisée pour recueillir leurs spécimens. Beaucoup de ces études mentionnent la coupe des blocs rectilinaires d’os de dimensions arbitraires, mais ne fournissent généralement aucune autre information sur les outils ou les matériauxd’intégration utilisés 3,4,10,11,12,13,14. Certains chercheurs utilisent couramment des outils rotatifs portatifs (p. ex., Dremel) pour enlever les blocs rectilinaires d’os d’une régiond’intérêt(ROI)3,4,10,11,12,13,14. Cette méthode se traduit par des échantillons de taille non uniforme qui peuvent être plus grands que le FOV, augmentant la probabilité de scanner des artefacts et de tronquer l’image. Ces spécimens nécessitent souvent un raffinage plus important à l’aide d’une scie à gaufrettes de précision (p. ex., Buehler Isomet). Il est essentiel d’obtenir des échantillons aux dimensions cohérentes (jusqu’aux deux centièmes/mm) pour s’assurer que les ensembles de données acquis sont de la plus haute qualité et que les résultats subséquents sont reproductibles.
La production limitée de rapports sur la méthodologie d’approvisionnement des échantillons ajoute une couche supplémentaire de difficulté lorsqu’on tente d’employer et/ou de valider les méthodes effectuées dans une étude antérieure. À l’heure actuelle, les chercheurs doivent communiquer directement avec les auteurs pour obtenir de plus amples détails sur leurs procédures d’échantillonnage. Le protocole détaillé ici fournit aux chercheurs biomédicaux une technique d’échantillonnage soigneusement documentée, reproductible et rentable. L’objectif principal de cet article est de fournir un tutoriel complet sur la façon de se procurer des échantillons de carottes osseuses corticales de taille constante à l’aide d’une presse à forer et d’un morceau de carottage de diamants pour la visualisation et l’extraction précises des données microarchitecturales. Cette méthode est modifiée à partir de procédures utilisées pour recueillir régulièrement uniforme, petit diamètre (1-5 mm) cylindres à partir de blocs de matériaux durs dans la mécanique de roche àhaute pression 15,16,17,18,19.
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Protocol
Tous les spécimens proviennent de donneurs cadavériques embaumés de l’Université de Tolède, du College of Medicine and Life Sciences et de la Northeast Ohio Medical University (NEOMED), avec le consentement éclairé du donneur lui-même ou du plus proche parent du donneur. La Commission d’examen institutionnel de la protection des sujets humains (CISR) de l’Université d’Akron a jugé ces spécimens exemptés de l’examen complet de la CISR, car ils n’ont pas été obtenus de personnes vivantes. Des renseignements démographiques, y compris l’âge, le sexe et la cause du décès, étaient disponibles pour tous les donneurs. Les personnes sélectionnées n’ont pas documenté les conditions os-affectant ni l’exposition aux régimes de traitement qui peuvent avoir affecté le remodelage d’os au moment du décès. Des échantillons corticals d’os ont été obtenus de femora des mâles et des femelles modernes cadavériques avec des âges s’étendant de 19 à 101 ans (moyen = 73.9 ans). Le milieu de forme fémoral a été étudié intensivement comprenant des examens de la variation de la porositécorticale 20,21,22,23,24 et la densité matérielle du tissuosseux 25,26,27, et est ainsi devenu un site couramment utilisé pour les analyses microstructurales.
1. Approvisionnement et macération des tissus
- Utilisez une scie oscillante équipée d’une lame de carbure de coupe plongeante (pour les matériaux composites) pour obtenir des blocs d’os d’environ 7,5 cm à partir des diaphyses intermédiaires du femora gauche.
- Faire tremper les blocs fémoraux dans un plat en verre allant au four rempli d’une enzyme protéase en poudre et d’une solution d’eau du robinet pendant 1 h dans un incubateur fixé à 45 °C.
- Après l’incubation, retirez soigneusement les tissus mous restants et le périoste à l’aide d’une dissection émoussée ou d’outils dentaires.
REMARQUE : Évitez l’utilisation d’outils pointus (p. ex., scalpel) pour enlever les tissus mous. Ces instruments peuvent endommager l’os qui est détectable dans les balayages de μCT, affectant la conservation de spécimen et la qualité de données de balayage. - Enlever les débris ou les occlusions dans la cavité médullaire en plaçant des blocs osseux dans un nettoyeur à ultrasons pendant 5 à 10 minutes avec 20:1 parties d’eau du robinet pour nettoyer la solution (voir table des matériaux)ou en utilisant un flosser d’eau portatif (p. ex., Waterpik).
- Immerger le bloc osseux dans une tasse à spécimens et remplir de 70 % d’éthanol. Laisser tremper l’os pendant au moins 24 heures pour éliminer les lipides.
REMARQUE : Les xylènes peuvent également être utilisés pour éliminer les lipides. Le trempage prolongé dans les xylènes, cependant, peut rendre l’os cassant ou crayeux car il est un émulsifiant. - Après 24 heures, retirer les blocs osseux de l’éthanol et laisser sécher à l’air libre à température ambiante pendant 24 à 48 heures.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
2. Sectionment des tissus
- Déposer une lame de microscope en verre de 75 x 25 mm sur une plaque chaude fixée à 140 °C. Faire fondre une généreuse quantité de résine époxy thermique (voir tableau des matériaux)au centre de la lame.
- Si vous préparez d’autres sections minces pour la microscopie (<50 μm), le bloc osseux peut devoir être incorporé dans un époxy en deux parties pour préserver le trabeculae. En outre, lors de la mise en œuvre de ce protocole pour les spécimens fragiles (p. ex., os diagénétique ou spécimens fortement trabecularisés), il est nécessaire d’intégrer des spécimens dans un époxy.
REMARQUE : Des échantillons d’os utilisés dans ce protocole ont été prélevés sur des spécimens cadavériques embaumés. Si des spécimens frais sont prélevés à l’autopsie ou dans un cas chirurgical pour examiner les structures des tissus mous (p. ex., vascularisation) par l’intermédiaire du SRμCT, l’imprégnation par époxy peut causer des dommages à ces tissus. Dans ces cas, un autre support adhésif ou de montage est recommandé (p. ex., ruban adhésif à double face, argile de modélisation).
- Si vous préparez d’autres sections minces pour la microscopie (<50 μm), le bloc osseux peut devoir être incorporé dans un époxy en deux parties pour préserver le trabeculae. En outre, lors de la mise en œuvre de ce protocole pour les spécimens fragiles (p. ex., os diagénétique ou spécimens fortement trabecularisés), il est nécessaire d’intégrer des spécimens dans un époxy.
- Appuyez sur l’aspect inférieur du bloc osseux dans la résine époxy thermique sur la glissière du microscope, avec la longueur de l’os perpendiculaire à la lame. Déplacez l’échantillon d’avant en arrière afin d’enduire le dessous de l’os et d’assurer une adhérence sécuritaire à la glissière.
- Laissez reposer le spécimen monté sur la plaque chaude pendant ~5 min pour permettre à l’époxy thermique de se évacuer dans les pores et/ou les fissures.
REMARQUE: L’époxy sur la diapositive doit être exempt de bulles pour une meilleure adhérence. Pour enlever les bulles, déplacez l’échantillon d’avant en arrière sur la diapositive. Des bulles se forment souvent à cause de l’eau et/ou de l’éthanol emprisonnés dans l’os qui s’échappent et s’évaporent. - Retirez la lame avec le spécimen monté de la plaque chaude à l’aide de forceps contondants et laissez refroidir à température ambiante pendant ~10 minutes. Retirez tout époxy du bord de la lame à l’aide d’une lame de rasoir pour vous assurer que le mandrin saisit adéquatement la lame.
- Fixez la glissière avec l’échantillon adhérent à un mandrin de glissière en verre et montez le mandrin au bras pivotant d’une scie à sectionnement à vitesse lente (voir tableau des matériaux, figure 2).
REMARQUE : Bien qu’une scie Buehler IsoMet ait été utilisée dans ce protocole, d’autres scies de sectionnement de précision sont disponibles qui pourraient être utilisées à la place de l’IsoMet (p. ex., Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire). - Ajustez le bras pivotant à l’aide du cadran de positionnement pour vous assurer que la lame entre en contact et transecte l’échantillon. Placez le spécimen de telle sorte qu’une coupe transversale de l’os soit coupée perpendiculairement à sa longueur.
- Ajouter des poids de l’autre côté du bras de coupe pour contrer le poids du bras.
REMARQUE : Si un contrepoids insuffisant est utilisé, l’échantillon peut porter sur la lame et provoquer la fracture de la lame. - Ajouter le liquide de coupe (20:1 parties d’eau au fluide de coupe) au réceptacle fluide de la scie.
- Fixez fermement la lame de gaufrette de diamant et assurez-vous que le niveau de fluide submerge la partie de coupe de la lame. Réglez la vitesse à 200 RPM et abaissez lentement l’échantillon sur la lame (figure 3).
- Assurez-vous que la lame et le mandrin ne vacillent pas et/ou ne rebondissent pas. Si un mouvement excessif est constaté, arrêtez immédiatement la scie et serrez la lame et/ou le bras de mandrin avant de reprendre la coupe. Ajoutez des contrepoids supplémentaires si le mandrin se déplace agressivement de haut en bas. Un mouvement excessif, y compris un mouvement visible d’un côté à l’autre, peut provoquer la fracture de la lame.
- La première section épaisse est une « coupe des déchets » pour fournir une surface bien définie parallèle à chaque coupe supplémentaire. Après la coupe initiale des déchets, soulevez le bras pivotant et déplacez le mandrin vers la lame de 5 mm à l’aide du cadran de positionnement. D’autres sections épaisses (~1 mm) pour la microscopie peuvent encore être collectées avec cette méthode.
REMARQUE : Afin d’économiser des tissus précieux, la coupe des déchets peut être omise. Toutefois, lors de la section d’un échantillon avec un bord inégal, il est essentiel que le pic du spécimen soit aligné tangentiellement jusqu’au bord du foret de carottage.- Assurez-vous de tenir compte de la bordure de la lame lors de la section. Par exemple, pour obtenir une section de 5 mm à partir d’une lame qui a une bordure de 0,5 mm, déplacez l’échantillon et jerez 5,5 mm vers la lame.
- Une fois la section terminée, placez la glissière de verre avec le spécimen monté sur une plaque chaude pour faire fondre l’époxy thermique. Cela permet d’enlever rapidement les blocs d’os de la lame.
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
3. Carottage d’échantillon
- Monter des sections osseuses de 5 mm au fond d’une boîte en aluminium peu profonde (~8 cm de diamètre) en utilisant la technique de liaison époxy thermique décrite dans les étapes 2.2-2.4.
- Placez l’étain sur une table de machine XY de la presse de forage de moulin (voir table des matériaux)et serrez à la main des pinces fixturing (figure 4).
- Insérez le foret de carottage à bout de diamant de 2 mm de diamètre creux (voir tableau des matériaux)dans le mandrin de forage de l’usine. Ajustez le limiteur de profondeur pour éviter le carottage à travers l’étain( Figure 5).
- Alignez l’aspect antérieur central de l’échantillon osseux sous le foret tout en évitant tout contact étroit avec le périoste, l’endostée ou les zones fortement trabecularisées.
REMARQUE : La sélection automatisée des cortices fémoraux mi-antérieurs n’est pas faisable car l’épaisseur corticale varie entre les individus, particulièrement avec l’âge croissant. - Remplir l’étain d’eau distillée pour couvrir complètement l’échantillon. Cela empêche l’accumulation de chaleur, la combustion de l’échantillon et/ou les dommages au foret pendant le carottage.
REMARQUE : Pour évaluer la possibilité de dommages causés par la chaleur causés par le carottage, un thermomètre infrarouge a été utilisé pour obtenir des relevés de température à partir de l’eau distillée, car le morceau de carottage a d’abord pénétré la surface des os. La température variait de 1 °C, de 22,9 à 23,9 °C parmi les dix échantillons prélevés pour cet essai. Ainsi, nous soutenons que les dommages causés par la chaleur sont négligeables. - Pour les premiers cas de contact entre le noyau et l’os, appliquez une pression douce afin de porter un anneau sur la surface supérieure de l’os. Cela empêche la déflexion du foret au début du processus de carottage et assure un placement correct du bit.
- Pendant le carottage, soulevez le foret dans et hors de l’échantillon tout en gardant la pointe du bit sous la surface de l’eau. Poursuivez cette technique toutes les quelques secondes pour éliminer la poussière osseuse emprisonnée et vous assurer que les débris n’occluent pas le foret.
REMARQUE : Si le noyau forme une forme conique, il est probablement dû à 1) permettant un temps insuffisant pour rincer la poussière d’os du morceau de carottage, et 2) le carottage se produit trop rapidement. Une vitesse accrue peut détacher de gros morceaux de l’échantillon et pulvériser l’aspect supérieur. - Une fois le carottage terminé, le noyau osseux qui en résulte peut se loger dans le foret à tige creuse(figure 6). Utilisez une paire de forceps à pointe fine ou une petite clé Allen pour déloger le noyau du bit (Figure 2).
- Conservez l’échantillon cœuré dans un tube de microcentrifugeuse étiqueté dans un endroit frais et sec jusqu’à l’imagerie.
4. Routines de traitement d’image pour évaluer les paramètres microarchitecturaux d’os des noyaux corticals d’os
- Reconstruction d’images μCT
- Téléchargez et installez la dernière version NRecon https://www.bruker.com/products/microtomography.html pour la reconstruction des images de projection SRμCT.
- Sélectionnez le raccourci NRecon sur le bureau et le GPUReconServer associé s’affiche.
- Ouvrez l’ensemble de données désiré dans la fenêtre contexturée. Si la fenêtre n’apparaît pas, sélectionnez l’icône du dossier dans le coin supérieur gauche de la fenêtre dataviewer.
- Sélectionnez la première projection de l’acquisition de SRμCT. Sous Sortie,supprimer les sélections pour l’utilisation roi et scales ON.
- Choisissez la destination du fichier de reconstruction. Sélectionnez Parcourir et créer un nouveau dossier nommé Recon. Le format de fichier sélectionné doit être BMP(8).
- Vérifiez l’indemnisation des mauvais alignés.
REMARQUE : Cette estimation est souvent proche de la correction. Le rendu 3D rugueux peut être ajusté manuellement en déplaçant les flèches de haut en bas pour déplacer les images qui se chevauchent de sorte que les bords droit et gauche s’alignent aussi étroitement que possible. - Sous Paramètres,choisissez les sélections souhaitées pour appliquer le lissage, le durcissement du faisceau, la rotation CS, l’objet plus grand que fov, et les algorithmes d’artefacts d’anneau.
- Ajustez l’histogramme sous sortie en sélectionnant Auto.
REMARQUE : L’image qui en résulte peut être faible. - Sélectionnez Démarrer pour commencer le traitement de la reconstruction.
- Utilisez la nomenclature standard pour les indices lacunaires de canal/ostéocyte28. Il peut s’agir du volume total des tissus VOI (TV), du volume du canal (Ca.V), du nombre total de canaux (Ca.N), du diamètre moyen du canal (Ca.Dm), de la porosité corticale (Ca.V/TV), en pourcentage, du nombre total de lacunaes (N.Lc) et du volume lacunaire moyen (Lc.V), entre autres. Pour déterminer la densité lacunaire par mm3 (N.Lc/BV), le volume osseux (BV) est calculé comme volume total moins volume du canal (TV-Ca.V).
REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
- Collecte de données microarchitecturales à partir d’images reconstruites
- Téléchargez et installez la dernière version de CTAnalyser https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html pour l’analyse des paramètres microarchitecturaux.
REMARQUE : La version gratuite de CTAnalyser est limitée en fonctionnalité. Par conséquent, il est recommandé d’acheter une licence complète pour effectuer des analyses plus détaillées. - Sous image | Propriétés | Modifier la taille des pixels,s’assurer que la taille des pixels correspond à celle du protocole d’imagerie μCT appliqué.
REMARQUE : Si vous modifiez des images d’ImageJ ou d’un programme similaire, notez qu’à l’enregistrement, l’en-tête intégré dans le fichier TIFF sera modifié et le logiciel d’analyse modifiera la taille des pixels lors de l’importation de l’ensemble de données. - Sélectionnez Traitement personnalisé afin de créer une liste de tâches (voir Matériaux supplémentaires) pour analyser la microarchitecture osseuse à partir de l’ensemble de données de balayage. Voici un protocole général pour les paramètres du réseau lacunaire ostéocyte utilisant des plugins propres à CTAnalyser :
REMARQUE : La liste de tâches plugin fonctionne bien pour les ensembles de données où l’échantillon est le seul sujet visible dans le FOV. Si un espace vide entoure le spécimen, l’application d’un retour sur investissement est nécessaire. Dans le cas contraire, les valeurs rassemblées dans l’analyse 3D et l’analyse individuelle des objets seront artificiellement diminuées.- Rechargez les images pour réinitialiser et/ou ajuster toute modification (par exemple, à partir de l’édition dans ImageJ ou similaire) avant d’ouvrir le menu traitement personnalisé dans le logiciel d’analyse.
- Pour réduire le bruit dans les images, appliquez un filtre gaussien à faible passage dans l’espace 3D avec un noyau rond et un rayon de 2-3.
REMARQUE : Ces paramètres ont été appliqués aux ensembles de données des expériences SRμCT signalées au moyen de tests d’essais et d’erreurs. L’objectif était d’obtenir les meilleures reconstructions de qualité pour les données. Ajustez les paramètres de reconstruction en fonction de chaque configuration expérimentale unique. - Appliquez un seuil global à échelle grise sur les images en sélectionnant des valeurs faibles et élevées pour mettre en évidence les canaux vasculaires. Les tranches reconstruites des figures 8B et 8D représentent un seuil d’exemple de 0 à 155.
REMARQUE : À l’approche de l’étape 4.2.3.2, les paramètres du seuil appliqués ici ont été choisis au moyen d’essais et d’erreurs importants. Le seuil doit être ajusté pour chaque système expérimental d’installation et d’imagerie μCT utilisé. - Despeckle (denoise) pour enlever les taches blanches dans l’espace 3D qui sont dans le pixel volumétrique (voxel) gamme de taille des lacunae ostéocyte afin d’isoler les canaux seulement.
REMARQUE : Pour un balayage de SRμCT de l’os cortical humain pris à la taille de pixel de 0.9 μm, la limite inférieure pour le lacunae d’ostéocyte est 13 voxels. - Despeckle pour enlever les taches noires dans l’espace 2D pour enlever les artefacts dans les canaux. Ceux-ci peuvent être assez grands en 2D, ainsi supprimer les fonctionnalités qui sont <15,000 pixels.
- Dilater les pores dans l’espace 3D en utilisant la fonction de fonctionnement morphologique avec un noyau rond de 2 ou 3 rayon, selon la qualité des images, afin d’isoler les tissus mous emprisonnés dans les canaux.
- Effectuez une fonction Despeckle supplémentaire en utilisant les mêmes paramètres que l’étape 4.2.3.5. afin d’éliminer les tissus mous isolés dans les canaux.
- Éroder la dilatation de l’étape 4.2.3.6. à l’aide d’une fonction d’opération morphologique à l’aide d’un noyau rond avec un rayon de 2 ou 3. Le rayon de cette étape doit correspondre au rayon utilisé dans la procédure 4.2.3.6.
- Exécutez l’analyse 3D et sélectionnez les paramètres à calculer pour le volume des canaux vasculaires. En général, les valeurs fondamentales fourniront suffisamment d’informations.
- Enregistrez les images traitées avec Save Bitmaps dans un sous-ensemble personnalisé dans le répertoire.
REMARQUE : Si la création d’une image de reconstruction 3D à partir des images traitées à l’aide d’un programme tel qu’Amira/Avizo, Libellule, Drishti, etc., il est recommandé d’enregistrer les images en monochrome (1 bit). - Calculez le nombre de canaux vasculaires et décrivez leur taille, leur forme et leur orientation à l’aide de la fonction d’analyse individuelle des objets.
- Répétez les étapes 4.2.3.1 - 4.2.3.3. pour réinitialiser l’image pour l’analyse lacunaire ostéocyte.
- Enlevez les taches blanches dans l’espace 3D à l’aide de la fonction Despeckle, en veillant à ce que ces artefacts soient plus petits que la limite inférieure de la taille lacunaire. Cette étape élimine le bruit de l’analyse qui peut sembler être des pores corticals, tout en préservant les lacunes ostéocyte vrai. Pour les scans SRμCT humains de 0,9 μm de taille pixel, cette limite inférieure est de 13 voxels.
- Despeckle une fois de plus pour enlever les taches blanches qui sont plus grandes que la limite supérieure de la taille lacunaire. Pour les ensembles de données SRμCT humains avec les paramètres énumérés à l’étape 4.2.3.13, cette limite est de 2743 voxels.
- Effectuez une analyse 3D pour extraire des informations microstructurales relatives spécifiquement aux lacunes de l’ostéocyte.
- Sélectionnez Enregistrer bitmaps pour enregistrer les images traitées afin d’isoler les lacunes de l’ostéocyte.
- Effectuer une analyse individuelle des objets pour calculer le nombre d’ostéocytes en 3D dans le volume d’intérêt sélectionné (VOI).
REMARQUE : Une fois que la liste de tâches a été établie et testée, CTAnalyser dispose d’une fonction de gestionnaire de lots (BatMan) qui peut être utilisée pour accélérer l’extraction des données et assurer un traitement uniforme de l’image. Une liste de tâches avec des paramètres d’exemple pour la procédure 4.2.3. peuvent être trouvés dans les matériaux supplémentaires.
- Téléchargez et installez la dernière version de CTAnalyser https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html pour l’analyse des paramètres microarchitecturaux.
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Representative Results
La méthode décrite d’échantillonnage de base s’est avérée très efficace et efficiente. Les échantillons de coring utilisant ce protocole ont permis l’achat d’échantillons de taille constante pour des expériences sur la ligne de faisceau CLS BMIT-BM2,avec un FOV d’environ 2 mm à 1,49 μm voxel. Pour valider la consistance du diamètre du noyau, trois mesures ont été prises le long de la longueur (en haut, au milieu, en bas) d’un sous-ensemble de noyaux fémoraux antérieurs humains(n=69). Le diamètre moyen des noyaux était de 1,96 ± 0,11 mm, et l’amincissement moyen le long de la longueur du noyau était de 0,06 ± 0,06 mm/mm Afin de mettre l’accent sur l’applicabilité à d’autres matériaux composites durs, nous avons essayé cette méthode sur des échantillons de dolomite(n=32) résultant en un diamètre moyen de 1,06 ± 0,02 mm. L’amincissement le long de la longueur de l’échantillon de carotte a été enregistré ± 0,005 mm/mm. Les chiffres représentatifs comparant le flux de travail de traitement d’image d’un échantillon cœuré et un échantillon acheté à l’aide d’un outil rotatif (p. ex., Dremel), tel que décrit à l’étape 4.2.3, peuvent être consultés à la figure 7. La coupe d’échantillon à l’aide de l’outil rotatif commun présentait un nombre accru de canaux (Ca.N) et de lacunes (Lc.N), ainsi qu’une diminution du diamètre moyen du canal (Ca.Dm), du volume du canal (Ca.V) et de la porosité corticale (Ca.V/TV) par rapport à l’échantillon cœuré. Bien que certaines de ces différences puissent être dues à la variation microstructurale osseuse entre les individus, le nombre plus élevé de canaux et de lacunes extraits de l’ensemble de données des outils rotatifs a probablement été artificiellement augmenté en raison de l’analyse des artefacts et du bruit (figure 7). Les données sur la porosité recueillies à partir de l’étape 4.2.3.9 pour chaque échantillon se trouvent dans le tableau 1. Il convient de noter que, bien que le protocole de carottage diminue les artefacts observés dans les scans SRμCT, les figures de moindre qualité chargées d’artefacts des expériences rectilinear bloc osseux (Figure 7A) représentent un problème à multiples facettes. Certains artefacts (p. ex., signaux de contraste de phase) peuvent avoir été causés par des problèmes d’installation de synchrotron ou de faisceaux spécifiques. Les paramètres d’analyse pour les deux ensembles représentatifs d’expériences et les chiffres associés (Figures 7A, 7B) peuvent être trouvés dans les matériaux supplémentaires (Tableaux S1, S2).
Les images micro-CT synchrotron recueillies à partir d’échantillons cored ont réussi à supprimer les artefacts de balayage, comme démontré ci-dessus, y compris les artefacts stries. Le traitement d’image suivant a confirmé le potentiel de la technique pour améliorer la visualisation de la microarchitecture corticale d’os. Par exemple, des différences de minéralisation, une délimitation améliorée des limites ostéonales et une visualisation cohérente des tissus mous dans les canaux vasculaires ont été observées (Figures 8C, 8D). Ce dernier est essentiel pour le traitement de l’image car la visualisation partielle des tissus mous dans les canaux peut entraîner des calculs inexacts de la porosité pour cent et l’épaisseur des pores, puisque les pores ne sont pas entièrement remplis. Les limites des lacunes d’ostéocyte ont également été améliorées en raison de la birefringence diminuée, permettant la quantification des paramètres de forme. Les avantages potentiels de la technique de carottage décrite incluent la facilité de centrer le spécimen dans le FOV, les exigences analytiques réduites, et la visualisation cohérente des tissus mous dans les canaux vasculaires.
Des procédures similaires ont été utilisées avec succès pour noyaur des cristaux simples d’orthopyroxène18,de magnésie polycrystalline19 et d’autres matériauxgéologiques 15,16,17 pour des expériences de déformation de roche à haute pression. Ces expériences nécessitent des carottes dans des orientations spécifiques par rapport aux axes cristallographic dans les cristauxsimples 18 ou les cristaux alignés dans les roches polycrystallines19 afin de déterminer les forces spécifiques à l’orientation. Les approches décrites ci-dessus ont d’abord été utilisées pour créer des dalles orientées et, par la suite, recueillir plusieurs noyaux uniformes et cylindriques pour une série d’expériences de déformation. Ces méthodes peuvent être utilisées pour recueillir des noyaux de n’importe quel matériau dur, comme l’os, la céramique ou les verres. Par exemple, la méthodologie ci-dessus pourrait être appliquée par les anthropologues biologiques pour évaluer les carottes de régions spécifiques dans l’os cortical et leurs axes biomécaniques associés (p. ex., tension/compression).
Figure 1. VOI cylindrique d’un fémur humain antérieur gauche de milieu d’arbre. Une seule tranche reconstituée SRμCT d’un noyau entier à partir d’un fémur mi-arbre humain antérieur gauche (femelle de 21 ans) (A) et des rendus 3D d’un VOI cylindrique de vues supérieures (B) et antérieures (C) sont visualisés. Les projections ont été prises à 0,9 μm, avec des canaux vasculaires mis en évidence dans les lacunes rouges et ostéocytes en gris. Les barres d’échelle dénotent 0,25 mm (A) et 0,02 mm (B,C). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Un échantillon fémoral mi-arbre (épaisseur de 5 mm) monté sur une lame de microscope en verre avec époxy thermique (voir tableau des matériaux) et fixé à un mandrin de glissière en verre. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Mandrin de glissière en verre avec spécimen monté fixé au bras pivotant d’une scie à sectionnement à basse vitesse (voir tableau des matériaux) avant la sectionnement. La position latérale du bras pivotant par rapport à la lame de scie et la vitesse de sectionnement (RPM) sont affichées sur les rangées supérieure et inférieure de l’écran LCD, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Une section fémorale de 5 mm montée sur une boîte en aluminium et fixée à une table de presse xy usine-perceuse à l’aide de pinces fixturing en préparation pour le carottage. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5. La presse de forage d’usine employée dans le protocole conçu (A). La flèche identifie le limiteur de profondeur, ce qui empêche le foret de pénétrer profondément dans l’échantillon ou à travers le fond de l’étain (B). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6. Une coupe transversale fémorale d’os de 5 millimètres suivant l’approvisionnement principal de l’aspect antérieur. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7. Les tranches reconstituées simples de SRμCT de l’aspect antérieur du fémur gauche de deux individus. Spécimen (A) a été sectionné à l’aide d’un outil rotatif commun et (B) a été acheté en utilisant la méthode de carottage décrit ici. Chaque tranche est comparée à leur contrepartie segmentée (C et D). Notez la facilité d’isoler la porosité corticale dans l’échantillon cored (D) par opposition au spécimen recueilli avec l’outil rotatif (C). Cela est démontré plus loin dans les rendus 3D des canaux vasculaires de chaque échantillon (E et F). Le bruit autour de la périphérie de B est évident et le spécimen quitte le FOV, ce qui entraîne des défis accrus lors du traitement de l’image. La barre d’échelle dansle panneau( D ) indique 250 μm pour les panneaux (A-D). Les barres d’échelle dans lespanneaux ( E et F) dénotent 700 et 600 μm, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8. Un retour sur investissement représentatif à partir d’un échantillon obtenu avec un outil rotatif (A-C) et un cored en utilisant la méthode présentée ici (D-F). Les panneaux( A) et (D) représentent le retour sur investissement désigné des scans SRμCT. Les panneaux( B) et (E) représentent l’étape de traitement utilisée pour isoler et extraire les paramètres du canal vasculaire. En haut à droite du panneau (B) il ya des objets étrangers (flèches) qui ont été classés comme canaux vasculaires par logiciel de traitement d’image. Les panneaux( C) et (F) représentent l’étape de traitement utilisée pour isoler et extraire les lacunes. Les barres d’échelle dénotent 0,1 mm pour tous les panneaux. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Volume des tissus (TV) | Volume du canal (Ca.V) | Surface du canal (Ca.S) | Porosité corticale (Ca.V/TV) | Canal Surface to Tissue Volume (Ca.S/TV) | Diamètre moyen du canal (Ca.Dm) | Séparation moyenne du canal (Ca.Sp) | Non. de Canals (Ca.N) | Non. de Lacunae (Lc.N) | Densité des pores (Pores/TV) | |
| Unités | mm³ (en) | mm³ (en) | mm² (mm²) | % | 1/mm | Μm | Μm | # | # | pores/μm³ |
| Coupe rotative | 0.15861 | 0.01780 | 0.00287 | 11.23 | 0.01808 | 51.05 | 122.81 | 459 | 64662 | 0.00041 |
| Cored (Cette méthode) | 0.15747 | 0.02451 | 0.00216 | 15.56 | 0.01373 | 120.73 | 145.38 | 76 | 30531 | 0.00019 |
Tableau 1. Résultats représentatifs de l’étape 4.2.3.9 de l’outil rotatif et des spécimens à noyaux visualisés dans la figure 8. Notez la diminution de ca.v, ca.v/tv, Ca.Dm, le nombre de pores et la densité des pores pour l’échantillon coupé rotatif ainsi que le nombre accru de canaux vasculaires et de lacunes. Les artefacts de balayage partiellement induits par l’échantillon inégalement coupé ont probablement contribué à une augmentation artificielle des lacunes et des pores corticals.
Matériaux supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ces documents.
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Discussion
Il n’y a pas eu de protocole complet et normalisé pour l’achat d’échantillons de carottes corticales uniformes et cylindriques pour l’imagerie SRμCT haute résolution avec des configurations FOV limitées. Le protocole détaillé ici comble ce vide en fournissant un tutoriel complet sur la façon de se procurer des échantillons de carottes osseuses corticales de taille constante pour l’imagerie SRμCT et la visualisation et l’extraction précises subséquentes des données microarchitecturales. Nous avons montré que notre protocole fournit une méthode plus standardisée et fiable pour l’achat de noyaux d’os corticals que les descriptions précédentes de la section des blocs d’os rectilinaires de dimensions arbitraires. Ainsi, les chercheurs qui se sont appuyés sur des outils rotatifs portatifs (p. ex., Dremel) pour enlever des blocs d’os de taille irrégulière ont probablement connu des temps de mise en place d’échantillons beaucoup plus longs pendant l’imagerie et de plus grandes erreurs dans le seuil et l’extraction corticale des pores pendant l’analyse. Cet écart souligne la nécessité et l’importance de ce protocole normalisé en ce qui concerne la préparation de l’échantillon osseux, la visualisation et l’analyse subséquentes et l’interprétation des résultats.
La procédure décrite ici peut encore être adaptée par des chercheurs dans des domaines connexes qui évaluent couramment les tissus osseux tels que les anthropologues biologiques et les archéologues. Cependant, aucun spécimen d’os diagénétique, ni archéologique/historique n’a été noyauté pour le protocole de recherche décrit. La diagenèse, en géologie, se réfère aux altérations d’un matériau (p. ex., os) après dépôt et peut englober les changements causés par des moyens physiques, chimiques oubiologiques 29,30. Les eaux souterraines, les champignons et d’autres infiltrations microbiennes peuvent tous agir comme agents diagénétiques et modifier la micromorphologie des tissusosseux 31. Ces spécimens peuvent nécessiter des étapes procédurales supplémentaires avant le carottage, comme l’intégration dans le méthyl méthacrylate (MMA) ou une résine époxy en deux parties. L’intégration des blocs fémoraux n’était pas nécessaire pour les expériences décrites en raison de la nature dense de l’os cortical fémoral, et du fait que les spécimens cadavériques ont été embaumés peu de temps après la mort. Toutefois, si nous évaluons les éléments squelettiques fragiles et leurs trabeculae (p. ex., côtes), nous vous recommandons d’intégrer tout le bloc osseux avant le carottage.
Tous les tissus osseux évalués dans cette étude ont été embaumés tandis que frais. Les auteurs n’ont pas eu accès à la combinaison spécifique de produits chimiques utilisés pendant le processus d’embaumement, bien que les produits chimiques de conservation incluent généralement le formaldéhyde, l’éthanol, le phénol, l’éthylène glycol et le glutaraldehyde. Les données anthropologiques médico-légales documentant les changements dans la microstructure des os saturés de formaldéhyde sont limitées, bien que Freidlander32 aient démontré que la fixation du formaldéhyde ne modifie pas la morphologie de certaines caractéristiques, y compris les canaux haversiens et les ostéons secondaires. La saturation de formaldéhyde, cependant, a documenté des effets sur certaines propriétés mécaniques et caractéristiques de rupture de l’os non humain tels que la force d’impact et la dureté de rupture33,34.
Nous avons rapporté une méthode pour le carottage des échantillons d’os cortical avant la formation image avec des systèmes à haute résolution de rayon X (SRμCT). Cette méthode est rentable, en raison du fait que les matériaux et l’équipement peuvent être provenant de quincailleries locales, efficaces et assurent une taille d’échantillon uniforme entre les spécimens. Nous espérons que nos suggestions réduiront les demandes de renseignements sur la façon dont les échantillons devraient être achetés, cored, et analysés pour SRμCT, car la littérature existante reste clairsemée et manque de détails critiques concernant la préparation et l’analyse subséquente. Notre objectif principal est de motiver les chercheurs à appliquer ce protocole de carottage comme procédure normalisée pour la recherche en imagerie osseuse à haute résolution. Nous espérons en outre que les difficultés susmentionnées que nous avons rencontrées dans le développement de cette technique atténueront les questions courantes et fourniront des conseils pour le dépannage.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les recherches décrites dans cet article ont été effectuées à l’installation bmit de la Source lumineuse canadienne, qui est appuyée par la Fondation canadienne pour l’innovation, les sciences naturelles et le Conseil de recherches en génie du Canada, l’Université de la Saskatchewan, le gouvernement de la Saskatchewan, Diversification de l’économie occidentale Canada, le Conseil national de recherches du Canada et les Instituts de recherche en santé du Canada. Les auteurs aimeraient remercier les scientifiques de la ligne de faisceau à la Source lumineuse canadienne, en particulier Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov et Ning Zu pour leur aide dans la mise en place et le dépannage des systèmes de microscope SkyScan SRμCT et à faisceau blanc. Nous tenons également à remercier Beth Dalzell de l’Université de Toledo College of Medicine and Life Sciences et le Dr Jeffrey Wenstrup de l’Université médicale du Nord-Est de l’Ohio pour l’accès à des échantillons cadavériques pour cette étude. JM Andronowski est soutenu par des fonds de recherche de démarrage fournis par l’Université d’Akron et une subvention de l’Institut national de recherche et de développement de la justice en sciences judiciaires à des fins de justice pénale (2018-DU-BX-0188). RA Davis est soutenu par un poste d’assistant diplômé fourni par l’Université d’Akron. L’équipement et les fournitures utilisés pour le carottage et le sciage ont été achetés par des fonds de démarrage fournis par l’Université d’Akron et la subvention de la FNS EAR-1624242 à CW Holyoke.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
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