Summary
Vi brukte en geologisk (coring) prøvetakingsprotokoll for å skaffe kortikale beinprøver av ensartet størrelse for SRμCT-eksperimenter fra det fremre aspektet av menneskelig femora. Denne metoden er minimalt ødeleggende, effektiv, resulterer i sylindriske prøver som minimerer bildeartefakter fra uregelmessige prøveformer og forbedrer mikroarkitektitectural visualisering og analyse.
Abstract
Bone er et dynamisk og mekanisk aktivt vev som endres i struktur over menneskets levetid. Produktene i bengjemodelingsprosessen har blitt studert betydelig ved hjelp av tradisjonelle todimensjonale teknikker. Nylige fremskritt innen røntgenbildeteknologi via mikrodatatomografi (μCT) og synchrotron stråling mikro-computertomografi (SRμCT) har tillatt for oppkjøp av høyoppløselige tredimensjonale (3D) skanninger av et større synsfelt (FOV) enn andre 3D-bildeteknikker (f.eks. SEM) som gir et mer komplett bilde av mikroskopiske strukturer innenfor menneskelig kortikale bein. Prøven bør imidlertid være nøyaktig sentrert i FOV for å begrense utseendet på strekartefakter som er kjent for å påvirke dataanalyse. Tidligere studier har rapportert innkjøp av uregelmessig formede rettlinjede beinblokker som resulterer i bildeartefakter på grunn av ujevne kanter eller bildeavkorting. Vi har brukt en geologisk prøvetakingsprotokoll (coring) for å skaffe konsekvent størrelse kortikale beinkjerneprøver for SRμCT-eksperimenter fra det fremre aspektet av menneskelig femora. Denne coring metoden er effektiv og minimalt ødeleggende for vev. Det skaper ensartede sylindriske prøver som reduserer bildeartefakter av natur å være isometrisk under rotasjon og gir en jevn banelengde for røntgenstråler gjennom skanning. Bildebehandling av røntgentomografiske data av korterte og uregelmessig formede prøver bekrefter potensialet i teknikken for å forbedre visualisering og analyse av kortikale beinmikroarkitektur. Et mål med denne protokollen er å levere en pålitelig og repeterbar metode for utvinning av kortikale beinkjerner som kan tilpasses for ulike typer høyoppløselige beinavbildningseksperimenter. Et overordnet mål med arbeidet er å skape en standardisert kortikale beinanskaffelser for SRμCT som er rimelig, konsekvent og grei. Denne prosedyren kan videre tilpasses av forskere på beslektede felt som ofte evaluerer harde komposittmaterialer som i biologisk antropologi, geovitenskap eller materialvitenskap.
Introduction
Med nylige fremskritt innen bildeteknologi er det nå mulig å skaffe røntgenbildedata med svært høy oppløsning. Stasjonære mikro-CT-systemer (μCT) er gjeldende standard for avbildning av avredust bein på grunn av deres ikke-destruktive natur1. Ved avbildning av mikrostrukturelle trekk ved kortikal bein har imidlertid μCT-bruk vært mer begrenset. På grunn av oppløsningsbegrensninger kan ikke skrivebordssystemer oppnå oppløsningen som kreves for å bilde mikrostrukturelle funksjoner som er mindre enn kortikale porer, for eksempel osteocyttlakuna. For dette programmet er SRμCT ideell på grunn av større oppløsning av disse systemene1. For eksempel har eksperimenter ved canadian Light Source (CLS) på BioMedical Imaging and Therapy (BMIT) strålelinjer2 produsert bilder med voxels så små som 0,9 μm. Tidligere studier1,3,4,5 har brukt denne oppløsningen til å skaffe projeksjoner og påfølgende tredimensjonale (3D) gjengir fra kortikale beinprøver fra menneskelige lange bein ( figur1) for å kvantifisere osteocyttlakunar tetthet4,6,7,8,9 ogvariasjon i lacunar form ogstørrelse 3 over den menneskelige levetid og mellom kjønnene. Videre studier har vist tilstedeværelsen av osteonbanding hos mennesker10, et fenomen som tidligere er anerkjent for å være forbundet med bare ikke-menneskelige pattedyr i rettsmedisinsk antropologisk litteratur.
For å oppnå eksepsjonell oppløsning må røntgenstrålen være fint fokusert innen synsfeltet (FOV), som ofte begrenser den maksimale prøvestørrelsen til noen få millimeter i diameter. For tiden har det ikke vært noen omfattende, standardiserte prosedyrer beskrevet i litteraturen som beskriver beinprøveanskaffelser som oppfyller disse restriksjonene. Sentreringsprøver i FOV er avgjørende for å sikre at 1) prøven forblir sentrert når den roterer 180° under bildebehandling, og 2) skanneartefakter er begrenset siden det ikke er noen bildeavkorting. Med andre ord, ingen deler av prøven utenfor FOV forstyrrer strålen som kommer inn i fokuspunktet inne i FOV. Hvis dette skjer, er rekonstruksjonsalgoritmen fratatt noen av dempingsdataene som trengs for en fullstendig korrekt rekonstruksjon. Det er videre verdt å notere at 360° (full rotasjon) skanner minimere effekten av stråleherding, men øke artefakter forårsaket av feiljustering og prøvebevegelse under avbildning. Dermed, mens en 360° skanning vanligvis vil generere renere data, er bildetiden doblet og derfor må et kompromiss mellom eksperimentell kostnad og datakvalitet tas opp.
Et viktig og ofte oversett aspekt ved beinbildeeksperimenter er den nøyaktige og replikerbare prøveforberedelsesteknikken som utføres før skanning. Studier som inkorporerer SRμCT-metoder i sine eksperimenter nevner kort deres prøvetakingsprotokoll, men forfatterne gir liten eller ingen detaljer om den spesielle metodikken som brukes til å samle sine prøver. Mange slike studier nevner kutte rettlinjede bein blokker av vilkårlige dimensjoner, men generelt gir ingen ytterligere informasjon om verktøy eller innebygging materialer sombrukes 3,4,10,11,12,13,14. Noen forskere bruker vanligvis håndholdte roterende verktøy (f.eks Dremel) for å fjerne rettlinjede benblokker fra et område av interesse (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Denne metoden resulterer i prøver av ikke-uniform størrelse som kan være større enn FOV, noe som øker sannsynligheten for skanneartefakter og bildeavkorting. Slike prøver krever ofte ytterligere raffinering ved hjelp av en presisjon diamant-wafer sag (f.eks Buehler Isomet). Anskaffe prøver med konsistente dimensjoner (til to hundredeler /mm) er avgjørende for å sikre at de anskaffede datasettene er av høyeste kvalitet, og de påfølgende resultatene replikeres.
Den begrensede rapporteringen av eksempelinnkjøpsmetodikk legger til et ekstra vanskelighetslag når du prøver å bruke og/eller validere metoder som utføres i en tidligere studie. For tiden må forskere kontakte forfattere direkte for ytterligere detaljer om sine prøvetakingsprosedyrer. Protokollen som er beskrevet her gir biomedisinske forskere en grundig dokumentert, replikerbar og kostnadseffektiv prøvetakingsteknikk. Hovedmålet med denne artikkelen er å gi en omfattende veiledning om hvordan du anskaffer konsekvent størrelse kortikale beinkjerneprøver ved hjelp av en mill-drill trykk og diamant coring bit for nøyaktig visualisering og utvinning av mikroarkitektitectural data. Denne metoden er modifisert fra prosedyrer som brukes til rutinemessig å samle uniform, liten diameter (1-5 mm) sylindere fra blokker av harde materialer i høytrykks rock mekanikk15,16,17,18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksemplarene ble hentet fra embalmed cadaveric donorer ved University of Toledo, College of Medicine and Life Sciences og Northeast Ohio Medical University (NEOMED), med informert samtykke fra giveren selv eller giverens pårørende. University of Akron Institutional Review Board for the Protection of Human Subjects (IRB) anså disse prøvene unntatt fra full IRB gjennomgang som de ikke ble anskaffet fra levende individer. Demografisk informasjon, inkludert alder, kjønn og dødsårsak, var tilgjengelig for alle givere. De utvalgte personene hadde ikke dokumentert bein-påvirker tilstander eller eksponering for behandlingsregimer som kan ha påvirket bein remodeling på tidspunktet for dødsfallet. Kortikale beinprøver ble hentet fra femora av kadaveriske moderne menn og kvinner med alderen fra 19 til 101 år (gjennomsnitt = 73,9 år). Lårbenshalsen har blitt studert mye, inkludert undersøkelser av variasjon i kortikal porøsitet20,21,22,23,24 og materialtetthet av beinvev25,26,27, og har dermed blitt et vanlig sted for mikrostrukturelle analyser.
1. Vev innkjøp og maceration
- Bruk en oscillerende sag utstyrt med et lite skjærekarbidblad (for komposittmaterialer) for å skaffe ~ 7,5 cm beinblokker fra midten av diafysene til venstre femora.
- Bløtlegg lårbensblokker i en ildfast glassfat fylt med et pulverisert proteaseenzym og vannoppløsning fra springen i 1 time i en inkubatorsett ved 45 °C.
- Etter inkubasjon, fjern forsiktig eventuelle gjenværende bløtvev og periosteum ved hjelp av stump disseksjon eller tannverktøy.
MERK: Unngå bruk av skarpe verktøy (f.eks. skalpell) for å fjerne bløtvev. Slike instrumenter kan forårsake skade på beinet som kan påvises i μCT-skanninger, noe som påvirker prøvebevaring og skannedatakvalitet. - Fjern rusk eller okklusjoner i det medullære hulrommet ved å plassere beinblokker i en ultralydsvasker i 5-10 minutter med 20:1 deler vann fra springen til rengjøringsløsning (se Materialtabell) eller ved hjelp av en håndholdt vannflakser (f.eks. Waterpik).
- Dypp beinblokken i en prøvekopp og fyll med 70% etanol. La beinet suge i minst 24 timer for å fjerne lipider.
MERK: Xylens kan også brukes til å fjerne lipider. Utvidet soaking i xylens, men kan gjøre beinet sprø eller kalkaktig som det er en emulgator. - Etter 24 timer, fjern beinblokker fra etanol og la det lufttørke ved omgivelsestemperatur i 24-48 timer.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
2. Vevsseksjon
- Plasser et 75 x 25 mm glassmikroskopsklie på en kokeplate satt til 140 °C. Smelte en generøs mengde termisk epoksyharpiks (se Materialtabell) på midten av lysbildet.
- Hvis du forbereder flere tynne seksjoner for mikroskopi (<50 μm), kan det hende at beinblokken må bygges inn i en todelt epoksy for å bevare trabeculae. Videre, når du implementerer denne protokollen for skjøre prøver (f.eks diagenetisk bein eller svært travaskulariserte prøver) er det nødvendig med å bygge inn prøver i en epoksy.
MERK: Beinprøver som brukes i denne protokollen ble hentet fra embalmed kadaveriske prøver. Hvis ferske prøver samles inn ved obduksjon eller fra et kirurgisk tilfelle for å undersøke bløtvevsstrukturer (f.eks. vaskulatur) via SRμCT, kan impregnering med epoksy forårsake skade på slike vev. I slike tilfeller anbefales et alternativt klebemiddel eller monteringsmedium (f.eks. dobbeltsidig tape, modelleringsleire).
- Hvis du forbereder flere tynne seksjoner for mikroskopi (<50 μm), kan det hende at beinblokken må bygges inn i en todelt epoksy for å bevare trabeculae. Videre, når du implementerer denne protokollen for skjøre prøver (f.eks diagenetisk bein eller svært travaskulariserte prøver) er det nødvendig med å bygge inn prøver i en epoksy.
- Trykk det dårligere aspektet av beinblokken inn i den termiske epoksyharpiksen på mikroskopet lysbildet, med lengden på beinet vinkelrett på lysbildet. Skift prøven frem og tilbake for å belegge undersiden av beinet og sikre sikker vedheft til lysbildet.
- La den monterte prøven hvile på kokeplaten i ~5 min for å la den termiske epoksyen transportere inn i porene og/eller sprekker.
MERK: Epoksyen på lysbildet skal være fri for bobler for best vedheft. Hvis du vil fjerne bobler, flytter du prøven frem og tilbake på lysbildet. Bobler dannes ofte på grunn av vann og/eller etanol fanget i beinet som rømmer og fordamper. - Fjern lysbildet med den monterte prøven fra kokeplaten ved hjelp av stumpe tang og la det avkjøles ved romtemperatur i ~10 minutter. Fjern eventuell epoksy fra kanten av lysbildet ved hjelp av et barberblad for å sikre at chucken griper lysbildet tilstrekkelig.
- Fest skyvet med den vedvarende prøven til en glassglider chuck og monter chucken til dreibar arm av en langsom snittesag (se Materialtabell, Figur 2).
MERK: Mens en Buehler IsoMet-sag ble brukt i denne protokollen, er det tilgjengelige andre presisjonsseksjonssager som kan brukes i stedet for IsoMet (f.eks. Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire). - Juster dreibar arm ved hjelp av posisjoneringshjulet for å sikre at bladkontaktene og transekter prøven. Plasser prøven slik at et tverrsnitt av beinet vil bli kuttet vinkelrett på lengden.
- Legg vekter til den andre siden av skjærearmen for å motvirke vekten av armen.
MERK: Hvis det ikke brukes tilstrekkelig motvekt, kan prøven bære ned på bladet og få bladet til å brekke. - Tilsett skjærevæske (20:1 deler vann til skjærevæske) til væskebeholderen på sagen.
- Fest diamantwaferbladet godt og sørg for at væskenivået senker klippedelen av bladet. Sett hastigheten på 200 o/min og senk prøven langsomt ned på bladet (figur 3).
- Pass på at bladet og chucken ikke vakler og/eller spretter. Hvis det er merket av for mye bevegelse, må du umiddelbart stoppe sagen og stramme til bladet og/eller chuckarmenheten før du fortsetter kappingen. Legg til flere motvekter hvis chucken beveger seg aggressivt opp og ned. Overdreven bevegelse, inkludert synlig side-til-side bevegelse kan føre til at bladet sprekker.
- Den første tykke delen er et "avfallskutt" for å gi en veldefinert overflate parallelt med hvert ekstra kutt. Etter det første avfallet kappes, hev svingarmen og beveger chucken mot bladet 5 mm ved hjelp av posisjoneringshjulet. Ytterligere tykke seksjoner (~ 1 mm) for mikroskopi kan videre samles med denne metoden.
MERK: For å spare verdifullt vev, kan avfallskuttet utelates. Ved snitting av en prøve med ujevn kant er det imidlertid avgjørende at toppen av prøven settes opp tangentielt til kanten av koringborekronen.- Pass på å ta hensyn til knivens skulder ved snitting. Hvis du for eksempel vil ha en 5 mm del fra et blad som har en 0,5 mm, flytter du prøven og kaster 5,5 mm mot bladet.
- Når snittingen er fullført, plasserer du glasssklien med den monterte prøven på en kokeplate for å smelte den termiske epoksyen. Dette gjør det mulig for rask fjerning av beinblokker fra lysbildet.
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
3. Eksempel coring
- Monter 5 mm beinseksjoner til bunnen av en grunn aluminiumsform (~8 cm i diameter) ved hjelp av den termiske epoksybindingsteknikken som beskrevet i trinn 2,2-2,4.
- Plasser formen på et XY-maskinbord på mølleborpressen (se Materialtabell) og trekk til festeklemmene (figur 4).
- Sett 2 mm hulsmedsmed med innvendig diameter (se Materials bord)inn i mølleboret chucken. Juster dybdebegrenseren for å unngå at den korerer gjennom formen (figur 5).
- Juster det sentrale fremre aspektet av beinprøven under borkronen, samtidig som du unngår nær kontakt med enten periosteum, endosteum eller svært trabecularized områder.
MERK: Automatisert valg av mid-fremre lårben er ikke mulig da kortikal tykkelse varierer mellom individer, spesielt med økende alder. - Fyll formen med destillert vann for å dekke prøven helt. Dette forhindrer varmeoppbygging, brenning av prøven og/eller skade på borkronen under koring.
MERK: For å vurdere muligheten for varmeskader forårsaket av coring, ble et infrarødt termometer brukt til å oppnå temperaturavlesninger fra det destillerte vannet da koringsbiten først trengte inn i beinoverflaten. Temperaturen varierte med 1 °C, fra 22,9 – 23,9 °C blant de ti prøvene som ble kjernet for denne testen. Dermed hevder vi at varmeindusert skade er ubetydelig. - For de første tilfellene av kontakt mellom kjernebiten og beinet, bruk mildt trykk for å bære en ring på den overlegne overflaten av beinet. Dette forhindrer nedbøyning av borkronen i begynnelsen av coring prosessen og sikrer riktig plassering av bitt.
- Under koring løfter du borkronen inn og ut av prøven mens du holder bittspissen under vannoverflaten. Fortsett denne teknikken med noen få sekunder for å skylle ut fanget beinstøv og sørg for at rusk ikke er okkludert borkronen.
MERK: Hvis kjernen danner en konisk form, er det sannsynlig på grunn av 1) slik at utilstrekkelig tid til å skylle beinstøv fra coring bit, og 2) coring oppstår for fort. Økt hastighet kan bryte av store biter fra prøven og pulverisere det overlegne aspektet. - Etter at korsingen er fullført, kan den resulterende beinkjernen bli sittende fast i den hule-stammede borkronen (figur 6). Bruk et par fintippede tang eller en liten unbrakonøkkel til å løsne kjernen fra bittet (figur 2).
- Oppbevar den kjernede prøven i et merket mikrocentrifugerør på et kjølig og tørt sted til bildebehandling.
4. Bildebehandlingsrutiner for evaluering av beinmikroarkitekturparametre fra kortikale beinkjerner
- Rekonstruksjon av μCT-bilder
- Last ned og installer den nyeste NRecon-versjonen https://www.bruker.com/products/microtomography.html for gjenoppbygging av SRμCT-projeksjonsbildene.
- Velg NRecon-snarveien på skrivebordet, og den tilknyttede GPUReconServer vises.
- Åpne ønsket datasett i popup-vinduet. Hvis vinduet ikke vises, velger du mappeikonet øverst til venstre i dataviewervinduet.
- Velg den første projeksjonen fra SRμCT-oppkjøpet. Fjern valgenefor Bruk avkastning og Skaler på under Utdata.
- Velg mål for gjenoppbyggingsfilen. Velg Bla gjennom, og opprett en ny mappe med navnet Recon. Det valgte filformatet skal være BMP(8).
- Kontroller kompensasjon for feiljustering.
MERK: Denne estimeringen er ofte nær riktig. Den grove 3D-gjengivelsen kan justeres manuelt ved å flytte pilene opp og ned for å flytte de overlappende bildene slik at høyre og venstre kant justeres så tett som mulig. - Under Innstillingervelger du ønskede valg for å bruke utjevning, stråleherding, CS-rotasjon, Objekt større enn FOV og algoritmer for ringartefakter.
- Juster histogrammet under Utdata ved å velge Auto.
MERK: Det resulterende bildet kan være svakt. - Velg Start for å begynne å behandle rekonstruksjonen.
- Bruk standard nomenklatur for kanal/osteocytt lacunar indekser28. Disse kan omfatte: totalt VOI vev volum (TV), kanalvolum (Ca.V), totalt antall kanaler (Ca.N), gjennomsnittlig kanaldiameter (Ca.Dm), kortikal porøsitet (Ca.V / TV), gitt i prosent, totalt antall lacunae (N.Lc), og gjennomsnittlig lacunar volum (Lc.V), blant andre. For å fastslå lacunar tetthet per mm3 (N.Lc/BV), beregnes beinvolum (BV) som totalt volum minus kanalvolum (TV-Ca.V).
MERK: Protokollen kan settes på pause her.
- Innsamling av mikroarkitekturdata fra rekonstruerte bilder
- Last ned og installer den nyeste versjonen av CTAnalyser https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html for analyse av mikroarkitekturparametere.
MERK: Den gratis versjonen av CTAnalyser er begrenset i funksjonalitet. Derfor anbefales det å kjøpe en full lisens til å utføre mer detaljerte analyser. - Under Bilde | Eiendommer | Endre pikselstørrelse, må du kontrollere at pikselstørrelsen samsvarer med den brukte μCT-bildeprotokollen.
MERK: Hvis du redigerer bilder i ImageJ eller et lignende program, vær oppmerksom på at når du lagrer, endres overskriften som er innebygd i TIFF-filen, og analyseprogramvaren vil endre pikselstørrelsen når du importerer datasettet. - Velg Tilpasset behandling for å opprette en oppgaveliste (se Supplerende materialer) for å analysere beinmikroarkitekturen fra skannedatasettet. En generell protokoll for osteocytt lacunar nettverksparametere ved hjelp av plugins proprietære til CTAnalyser følger her:
MERK: Plugin-oppgavelisten fungerer bra for datasett der eksemplet er det eneste motivet som er synlig i FOV. Hvis tomt rom omgir prøven, kreves bruk av en avkastning. Ellers vil verdiene som samles inn i 3D-analyse og individuell objektanalyse bli kunstig redusert.- Last bildene på nytt for å tilbakestille og/eller justere eventuelle endringer (f.eks. fra redigering i ImageJ eller lignende) før du åpner menyen Egendefinert behandling i analyseprogramvaren.
- For å redusere støy i bildene, bruk et gaussisk lavpassfilter i 3D-plass med en rund kjerne og en radius på 2-3.
MERK: Disse innstillingene ble brukt på datasett fra de rapporterte SRμCT-eksperimentene gjennom prøving og feiltesting. Målet var å få de beste kvalitetsrekonstruksjonene for dataene. Juster rekonstruksjonsinnstillingene slik at de passer til hvert unike eksperimentelle oppsett. - Bruk en global gråtoneterskel på bildene ved å velge lave og høye verdier for å markere vaskulære kanaler. De rekonstruerte skivene sett i figur 8B og 8D viser en eksempelterskel på 0-155.
MERK: I likhet med trinn 4.2.3.2 ble terskelinnstillingene som ble brukt her valgt gjennom omfattende prøving og feiling. Terskeling bør justeres for hvert eksperimentelle oppsett og μCT bildesystem som brukes. - Despeckle (denoise) for å fjerne hvite flekker i 3D-plass som er innenfor volumetrisk piksel (voxel) størrelsesområde av osteocytt lacunae for å isolere kanaler bare.
MERK: For en SRμCT-skanning av humant kortikale bein tatt ved 0,9 μm pikselstørrelse, er den nedre grensen for osteocyttlakuna 13 voxels. - Despeckle å fjerne eventuelle svarte flekker i 2D plass for å fjerne gjenstander i kanalene. Disse kan være ganske store i 2D, og dermed fjerne funksjoner som er <15 000 piksler.
- Dilater porene i 3D-plass ved hjelp av morfologisk operasjonsfunksjon med en rund kjerne på 2 eller 3 radius, avhengig av kvaliteten på bildene, for å isolere eventuelle bløtvev fanget i kanaler.
- Utfør en ekstra Despeckle-funksjon ved hjelp av de samme innstillingene som trinn 4.2.3.5. for å fjerne isolert bløtvev i kanaler.
- Erodere dilatasjonen fra trinn 4.2.3.6. ved hjelp av en morfologisk operasjonsfunksjon ved hjelp av en rund kjerne med enten 2 eller 3 radius. Radiusen for dette trinnet må samsvare med radiusen som brukes i prosedyre 4.2.3.6.
- Kjør 3D-analyse og velg hvilke parametere som skal beregnes for volumet av vaskulære kanaler. Vanligvis vil de grunnleggende verdiene gi tilstrekkelig informasjon.
- Lagre de behandlede bildene med Lagre punktgrafikk i en egendefinert undermappe i katalogen.
MERK: Hvis du oppretter et 3D-rekonstruksjonsbilde fra de behandlede bildene ved hjelp av et program som Amira / Avizo, Dragonfly, Drishti, etc., anbefales det å lagre bildene som monokrom (1 bit). - Beregn antall vaskulære kanaler og beskriv størrelse, form og orientering ved hjelp av funksjonen Individuell objektanalyse.
- Gjenta trinn 4.2.3.1 – 4.2.3.3. for å tilbakestille bildet for osteocytt lacunar analyse.
- Fjern hvite flekker i 3D-plass ved hjelp av Despeckle-funksjonen, slik at slike artefakter er mindre enn den nedre grensen for lacunar størrelse. Dette trinnet fjerner støy fra skanningen som kan synes å være kortikale porer, samtidig som det bevarer ekte osteocyttlakuna. For menneskelige SRμCT-skanninger av 0,9 μm pikselstørrelse er denne nedre grensen 13 voxels.
- Despeckle igjen for å fjerne hvite flekker som er større enn den øvre grensen for lacunar størrelse. For humane SRμCT-datasett med innstillingene oppført i trinn 4.2.3.13, er denne grensen 2743 voxels.
- Utfør 3D-analyse for å trekke ut mikrostrukturell informasjon knyttet til osteocyttlakuna spesielt.
- Velg Lagre punktgrafikk for å lagre de behandlede bildene for å isolere osteocyttlakunaen.
- Utfør individuell objektanalyse for å beregne antall osteocytter i 3D i det valgte interessevolumet (VOI).
MERK: Når oppgavelisten er etablert og testet, har CTAnalyser en batch manager (BatMan)-funksjon som kan brukes til å akselerere datautvinning og sikre ensartet bildebehandling. En oppgaveliste med eksempelinnstillinger for prosedyre 4.2.3. finnes i tilleggsmaterialet.
- Last ned og installer den nyeste versjonen av CTAnalyser https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html for analyse av mikroarkitekturparametere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne metoden for kjerneprøvetaking viste seg å være svært effektiv og effektiv. Coring prøver ved hjelp av denne protokollen tillatt for innkjøp av > 300 konsekvent størrelse prøver for eksperimenter på CLS BMIT-BM strålelinje2, med en FOV på ~ 2 mm på 1,49 μm voxel størrelse. For å validere konsistensen av kjernediameteren ble tre målinger tatt langs lengden (topp, midten, bunnen) av en undergruppe av menneskelige fremre lårbenskjerner (n= 69). Den gjennomsnittlige diameteren på kjernene var 1,96 ± 0,11 mm, og gjennomsnittlig tynning langs lengden av kjernen var 0,06 ± 0,06 mm/mm For å understreke anvendeligheten til andre harde komposittmaterialer forsøkte vi denne metoden på prøver av dolomitt (n= 32) som resulterte i en gjennomsnittlig diameter på 1,06 ± 0,02 mm. Tynning langs lengden av kjerneprøven ble registrert som 0,01 ± 0,005 mm/mm. Representative tall som sammenligner bildebehandlingsarbeidsflyten for et kjernet utvalg og en anskaffet ved hjelp av et roterende verktøy (f.eks Dremel), som beskrevet i trinn 4.2.3, kan vises i figur 7. Prøven kuttet ved hjelp av det vanlige roterende verktøyet viste et økt antall kanaler (Ca.N) og lacunae (Lc.N), og en redusert gjennomsnittlig kanaldiameter (Ca.Dm), kanalvolum (Ca.V) og kortikal porøsitet (Ca.V / TV) sammenlignet med den kortede prøven. Mens noen av disse forskjellene kan skyldes bein mikrostrukturell variasjon mellom individer, det høyere antall kanaler og lacunae hentet fra roterende verktøy datasett ble trolig kunstig økt på grunn av skanning artefakter og støy (Figur 7). Porøsitetsdataene som samles inn fra trinn 4.2.3.9 for hver prøve, er plassert i tabell 1. Det er verdt å legge til at selv om coring-protokollen reduserer artefakter observert i SRμCT-skanninger, representerer de lavere kvalitet, artefaktbelastede tallene fra de rettlinjede beinblokkeksperimentene (figur 7A) et mangefassettert problem. Visse artefakter (f.eks. fasekontrastsignaler) kan ha blitt forårsaket av synchrotron-anlegget eller beamline-spesifikke problemer. Skanneparametere for både representative sett med eksperimenter og tilhørende tall (figur 7A, 7B) finnes i tilleggsmaterialene (tabell S1, S2).
Synchrotron mikro-CT bilder samlet fra kjerneprøver vellykket undertrykt skanning artefakter, som demonstrert ovenfor, inkludert strek artefakter. Etterfølgende bildebehandling bekreftet potensialet i teknikken for å forbedre visualiseringen av kortikale beinmikroarkitektur. For eksempel ble det observert mineraliseringsforskjeller, forbedret avgrensning av osteonale grenser og konsekvent visualisering av bløtvev i vaskulære kanaler (figur 8C, 8D). Sistnevnte er avgjørende for bildebehandling som delvis visualisering av bløtvev i kanaler kan resultere i unøyaktige beregninger av prosent porøsitet og pore tykkelse, siden porene ikke er fullt fylt. Grensene for osteocytt lacunae ble også forbedret på grunn av redusert birefringence, noe som åpner for kvantifisering av formparametere. De potensielle fordelene med den beskrevne coring teknikken inkluderer enkel sentrering av prøven i FOV, reduserte analytiske krav, og konsekvent visualisering av bløtvev i vaskulære kanaler.
Lignende prosedyrer har blitt brukt med hell til kjerne enkeltkrystaller av ortopyroxene18,polykrystallinsk magnesitt19 og andre geologiskematerialer 15,16,17 for høytrykks steindeformasjonseksperimenter. Disse eksperimentene krever kjerner i spesifikke retninger i forhold til krystallografiske akser i enkeltkrystaller18 eller justerte krystaller i polykrystallinskebergarter 19 for å bestemme orienteringsspesifikke styrker. Tilnærmingene beskrevet ovenfor har blitt brukt til først å lage orienterte plater og deretter samle flere uniformer, sylindriske kjerner for serie av deformasjonseksperimenter. Disse metodene kan brukes til å samle kjerner av noe hardt materiale, for eksempel bein, keramikk eller briller. For eksempel kan ovennevnte metodikk brukes av biologiske antropologer for å evaluere kjerner fra bestemte regioner innenfor kortikale bein og deres tilknyttede biomekaniske (f.eks. spenning/ kompresjon) akser.
Figur 1. Sylindrisk VOI fra en venstre fremre menneskelig mid-aksel lårben. En enkelt SRμCT rekonstruert skive av en hel kjerne fra en venstre fremre menneskelig mid-aksel femur (21 år gammel kvinne) (A), og 3D gjengir en sylindrisk VOI fra overlegen (B) og fremre synspunkter (C) visualiseres. Projeksjoner ble tatt på 0,9 μm, med vaskulære kanaler uthevet i rødt og osteocyttlakuna i grått. Skaleringsstolper angir 0,25 mm (A) og 0,02 mm (B,C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. En lårbensprøve (5 mm tykkelse) montert på et glassmikroskopsklie med termisk epoksy (se Materialtabell) og festet til en glassglider chuck. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Glassglid chuck med montert prøve festet til dreibar arm av en lav hastighet snitting sag (se Table of Materials) før snitting. Den laterale posisjonen til svingarmen i forhold til sagbladet og snittehastigheten (RPM) vises på henholdsvis øverste og nedre rader på LCD-skjermen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. En 5 mm lårbensseksjon montert på en aluminiumsform og festet til et XY mølleboremaskinbord ved hjelp av fikseringsklemmer som forberedelse til coring. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Mølleborpressen som er brukt i den utarbeidede protokollen (A). Pilen identifiserer dybdebegrenseren, som hindrer borkronen i å trenge dypt inn i prøven eller gjennom bunnen av formen (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. En 5 mm lårben tverrsnitt etter kjerneinnkjøp fra fremre aspekt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7. Enkelt SRμCT rekonstruerte skiver av det fremre aspektet av venstre lårben fra to personer. Prøven (A) ble delt ved hjelp av et vanlig roterende verktøy og (B) ble anskaffet ved hjelp av coring-metoden som er beskrevet her. Hver skive sammenlignes med deres segmenterte motstykke (C og D). Legg merke til hvor enkelt det er å isolere kortikal porøsitet i den kortede prøven (D) i motsetning til prøven som er samlet med det roterende verktøyet (C). Dette fremgår videre i 3D-gjengivelsene av de vaskulære kanalene i hver prøve (E og F). Støy rundt periferien av B er tydelig og prøven forlater FOV, noe som begge resulterer i økte utfordringer under bildebehandling. Skaleringslinjen i panelet (D) betegner 250 μm for paneler (A-D). Skaleringslinjenei paneler ( E og F) betegner henholdsvis 700 og 600 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8. En representativ avkastning fra et utvalg anskaffet med et roterende verktøy (A-C) og en kjerne ved hjelp av metoden som presenteres her (D-F). Paneler (A) og (D) representerer den angitte avkastningen fra SRμCT-skanningene. Paneler (B) og (E) representerer behandlingsstadiet som brukes til å isolere og trekke ut vaskulære kanalparametere. Øverst til høyre på panelet (B) er det unødvendige objekter (piler) som er klassifisert som vaskulære kanaler ved bildebehandlingsprogramvare. Paneler (C) og (F) representerer behandlingsstadiet som brukes til å isolere og trekke ut lacunae. Skaleringslinjer betegner 0,1 mm for alle paneler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Vev volum (TV) | Kanalvolum (Ca.V) | Kanaloverflaten (Ca.S) | Kortikal porøsitet (Ca.V/TV) | Kanaloverflate til vevsvolum (Ca.S/TV) | Gjennomsnittlig kanaldiameter (Ca.Dm) | Gjennomsnittlig kanalseparasjon (Ca.Sp) | Nei. av kanaler (Ca.N) | Nei. av Lacunae (Lc.N) | Pore Tetthet (Pores/TV) | |
| Enheter | mm³ (andre | mm³ (andre | 1000 00 | % | 1/mm (andre personer) | Μm | Μm | # | # | porene/μm³ |
| Roterende kutt | 0.15861 | 0.01780 | 0.00287 | 11.23 | 0.01808 | 51.05 | 122.81 | 459 | 64662 | 0.00041 |
| Cored (Denne metoden) | 0.15747 | 0.02451 | 0.00216 | 15.56 | 0.01373 | 120.73 | 145.38 | 76 | 30531 | 0.00019 |
Tabell 1. Representative resultater for trinn 4.2.3.9 av roterende verktøy og kjerneprøver visualisert i figur 8. Legg merke til redusert Ca.V, Ca.V/TV, Ca.Dm, antall porer og poretetthet for den roterende kuttprøven, samt det økte antallet vaskulære kanaler og lacunae. Skann artefakter delvis indusert av den ujevnt kuttede prøven sannsynligvis bidratt til en kunstig økning i lacunae og kortikale porer.
Tilleggsmaterialer. Vennligst klikk her for å laste ned disse materialene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har ikke vært noen omfattende, standardisert protokoll for anskaffe ensartet og sylindrisk kortikale beinkjerneprøver for høyoppløselig SRμCT-avbildning med begrensede FOV-oppsett. Protokollen som er beskrevet her fyller det ugyldige ved å gi en omfattende veiledning om hvordan du anskaffer konsekvent størrelse kortikale beinkjerneprøver for SRμCT-bildebehandling og påfølgende nøyaktig visualisering og ekstraksjon av mikroarkitektitectural data. Vi har vist at vår protokoll gir en mer standardisert og pålitelig metode for å anskaffe kortikale beinkjerner enn tidligere beskrivelser av snitting av rettlinjede beinblokker av vilkårlige dimensjoner. Dermed, forskere som har stolt på håndholdte roterende verktøy (f.eks Dremel) for å fjerne uregelmessig størrelse blokker av bein sannsynligvis opplevd mye lengre prøve oppsett ganger under avbildning og større feil i tersklering og kortikale pore utvinning under analyse. Denne uoverensstemmelsen understreker behovet for og betydningen av denne standardiserte protokollen med hensyn til bendeprøveforberedelse, påfølgende visualisering og analyse og tolkning av resultater.
Prosedyren som er skissert her kan videre tilpasses av forskere i relaterte felt som ofte evaluerer beinvev som biologiske antropologer og arkeologer. Ingen diagenetiske eller arkeologiske/historiske beinprøver ble imidlertid kjernet for den beskrevne forskningsprotokollen. Diagenese, i geologi, refererer til endringer i et materiale (f.eks bein) etter avsetning og kan omfatte endringer forårsaket av fysiske, kjemiske eller biologiskemidler 29,30. Grunnvann, sopp og annen mikrobiell infiltrasjon kan alle fungere som diagenetiske midler og endre beinvevmikromorfologi31. Slike prøver kan kreve ytterligere prosedyremessige skritt før coring, for eksempel innebygging i metylmetakrylat (MMA) eller en todelt epoksyharpiks. Innebygging av lårbensblokkene var ikke nødvendig for de beskrevne eksperimentene på grunn av den tette naturen til lårkortikale bein, og det faktum at kadavriske prøver ble embalmed kort tid etter døden. Hvis du vurderer skjøre skjelettelementer og deres trabeculae (f.eks. ribbein), anbefaler vi imidlertid å bygge inn hele beinblokken før koring.
Alle beinvev evaluert i denne studien ble embalmed mens frisk. Forfatterne hadde ikke tilgang til den spesifikke kombinasjonen av kjemikalier som brukes under balsameringsprosessen, selv om bevaringskjemikamikamer vanligvis inkluderer formaldehyd, etanol, fenol, etylenglykol og glutaraldehyd. Rettsmedisinske antropologiske data som dokumenterer endringer i mikrostrukturen av formaldehyd mettede bein er begrenset, selv om Freidlander32 viste at formaldehyd fiksering ikke endrer morfologien til visse funksjoner, inkludert haversiske kanaler og sekundære osteoner. Formaldehyd metning har imidlertid dokumentert effekter på visse mekaniske egenskaper og brudd egenskaper av ikke-menneskelig bein som slagstyrke og brudd seighet33,34.
Vi har rapportert en metode for å legge kortikale beinprøver før avbildning med høyoppløselige røntgensystemer (SRμCT). Denne metoden er kostnadseffektiv, på grunn av det faktum at materialer og utstyr kan hentes fra lokale maskinvareforretninger, effektiv og sikrer en jevn prøvestørrelse på tvers av prøver. Det er vårt håp at våre forslag vil redusere henvendelser knyttet til hvordan prøver skal anskaffes, korreleres og analyseres for SRμCT, da den eksisterende litteraturen forblir sparsom og mangler kritiske detaljer om forberedelse og påfølgende analyse. Vårt primære mål er å motivere forskere til å anvende denne coring protokollen som standardisert prosedyre for høyoppløselig bein imaging forskning. Vi håper videre at de nevnte vanskelighetene vi opplevde med å utvikle denne teknikken, vil lindre vanlige spørsmål og gi veiledning for feilsøking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskning beskrevet i denne artikkelen ble utført ved BMIT-anlegget ved canadian Light Source, som støttes av Canada Foundation for Innovation, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, University of Saskatchewan, regjeringen i Saskatchewan, Western Economic Diversification Canada, National Research Council Canada og Canadian Institutes of Health Research. Forfatterne vil gjerne takke strålelinjeforskerne ved den kanadiske lyskilden, spesielt Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov og Ning Zu for hjelpen i oppsett og feilsøking av SkyScan SRμCT og hvitstrålemikroskopsystemer. Vi ønsker også å takke Beth Dalzell fra The University of Toledo College of Medicine and Life Sciences og Dr. Jeffrey Wenstrup fra Northeast Ohio Medical University for tilgang til kadaveriske prøver for denne studien. JM Andronowski støttes gjennom oppstartsforskningsmidler levert av The University of Akron og national Institute of Justice Research and Development in Forensic Science for Criminal Justice Purposes grant (2018-DU-BX-0188). RA Davis støttes av et graduate assistantship levert av The University of Akron. Utstyr og forsyninger som brukes til coring og saging ble kjøpt ved oppstartsmidler levert av The University of Akron og NSF gi EAR-1624242 til CW Holyoke.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1/8" plunge cutting carbide for composites | Warrior | 61812 | 28.6mm plunge |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | BP8201500 | 3.8 Liters |
| Blunt-tipped forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Centrifuge tubes | ThermoFisher | 55398 | |
| Crystalbond 509-3 Epoxy | Ted Pella | 821-3 | |
| CTAnalyser | Bruker microCT | v.1.15.4.0 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html |
| Dental Tool Kit | Amazon | 787269885110 | |
| Diamond wafering saw blade for composite material | Buehler | #11-4247 | |
| Drill Press | Jet Mill/Drill | 350017 | Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem |
| Fine-tipped forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
| Fixturing clamps for XY machine table for mill/drill | MSC Industrial Supply | #04804571 | |
| Glass microscope slides | Ted Pella | 26005 | 75x50mm slides, 1mm thick |
| Glass slide chuck | Buehler | #112488 | Large enough to hold 75x50mm glass slides |
| Hot plate capable of reaching 140 °C | ThermoScientific | HP88850105 | |
| Incubator | NAPCO | Model 4200 | |
| Isocut Fluid | Buehler | 111193032 | Lubricant; 30mL |
| Jeweler's diamond coring drill bit | Otto Frei | #119.050 | 2mm inner diameter hollow stem coring bit |
| NRecon | Bruker microCT | v.1.6.10.2 | Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html |
| Oscillating saw | Harbor Freight | 62866 | |
| Oven-safe glass dishes | Pyrex | 1117715 | Glass food storage container |
| Precision slow-speed saw (Isomet 1000) | Buehler | 111280160 | |
| Razor blades | Amazon | 25181 | |
| Shallow aluminum tins | Amazon | B01MRWLD0R | ~8cm diameter |
| Specimen cups | Amazon | 616784425436 885334344729 | |
| Tergazyme detergent | Alconox | 1304-1 | 1.8kg box |
| Ultrasonic cleaner | MTI Corporation | KJ201508006 |
References
- Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
- Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source - part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
- Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
- Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
- Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
- Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
- Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
- Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
- Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
- Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
- Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
- Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
- Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
- Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C.
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K.
- Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J.
- Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
- Millard, J. W., et al.
- Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
- Jowsey, J.
- Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
- Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
- Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
- Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
- De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
- Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
- Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
- Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
- Pfeiffer, S.
- Bone Hedges, R. E. M.
- Friedlander, H. The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures. , Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017).
- Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
- Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).
