Summary
여기에 제시된 1 차적인 인간 혈액 단화 절연을 위한 프로토콜은 대식세포 및 수지상 세포로의 분화뿐만 아니라 다세포 인간 폐 모델로 상피 세포를 조립한다. 염증 성 자극에 노출되면 갓 분리되거나 해동 된 단핵구로부터 분화 된 면역 세포로 구성된 공동 배양의 생물학적 반응이 비교됩니다.
Abstract
인간 폐포 세포 컬배시 모델은 폐포 상피 형 II 세포와 두 가지 유형의 면역 세포(즉, 인간 단핵구 유래 대식세포[MDM] 및 수지상 세포 [MDDC])로 구성된 폐포 상피 조직 장벽의 시뮬레이션을 위해 여기에 설명된다. 다세포 모델을 조립하기 위한 프로토콜이 제공됩니다. 폐포 상피 세포(A549 세포주)는 2챔버 우물의 투과성 인서치에 대한 침수된 조건하에서 재배되고 분화된 다음 분화된 MDM 및 MDDC와 결합된다. 마지막으로, 세포는 며칠 동안 공기 액체 인터페이스에 노출됩니다. 인간 1차 면역 세포가 인간 버피 코트로부터 분리되어야 하기 때문에, 신선한 또는 해동된 단핵구로부터 분화된 면역 세포는 실험적 필요에 따라 방법을 맞춤화하기 위해 비교된다. 새로 분리되거나 해동된 단핵구 유래 면역 세포를 가진 폐포 세포로 구성된 3차원 모델은, 미처리된 세포에 비해 염증성 자극(lipopolysaccharide 및 종양 괴사인자 α)에 노출되면 세포카인(interleukins 6 및 8)의 통계적으로 유의한 증가를 보여준다. 한편, 공동배양에서 관찰되는 사이토카인 방출 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 없다. 이는 제시된 모델이 신선하거나 해동된 말초 혈액 모노사이클(PBM)과 차별화된 MDM 및 MDDC의 존재에서 선동성 자극에 반응한다는 것을 보여준다. 따라서, 에어로졸화 약물이나 나노물질을 포함한 상이한 물질에 대한 급성 생물학적 반응에 대한 조사를 위한 강력한 도구이다.
Introduction
체외 폐 세포 배양은 에어로졸1의위험을 평가하기 위해 비용 효율적이고 견고하며 잘 제어되는 플랫폼을 제공합니다. 인간 폐포 폐렴구체에 대한 모델 세포 시스템으로서, 폐아암에서 분리된 상피 A549 세포주는 종종2로사용된다. 이들 세포는 폐포 영역3으로부터 편평상피 세포(II)를 나타내며 위험성 및 독성평가1,4,,5,,66,7,,,8,9,9,10에널리 사용되는 폐 세포주이다. A549 세포주는 조밀하게 포장된인지질3를포함하는 특징적인 라멜라 바디의 존재와 같은 폐포 상피 형 II 세포의 관련 특징을 가지고 있습니다.
세포가 공기-액체 인터페이스(ALI)에서 배양될 때, 계면활성제는 공기 노출 상피 세포의 정압측에 방출되어 표면장력(11,,12,13)을13감소시키는 것으로 나타났다. 이 기능은 나노 물질 호흡기 위험 및 독성 조사에서 특히 중요합니다. 흡입된 나노 물질/독성물질이 폐포 부위에 증착되면, 그들은 먼저 폐 계면활성제와 상호 작용하고 폐 세포와의 상호 작용이 일어나는 수성 저상으로 습윤하는 힘에 의해 대체된다14,,15. A549 세포가 단층(ALI에서 재배될 때 나중에 다층으로 과도하게 성장할 수 있음)을 형성하고 계면활성제를 생성하더라도, 단점은 부족한 접합 형성으로 인해 낮은 환전성 전기 저항 값을 초래하지만 여전히 세포간(nano) 입자전좌(16,,17,18)에18대한 기능적 장벽을 제시한다.
폐에서는, 항상성을 통제하고 유지하기 위하여 세포 세포 접촉 또는 세포 간 신호를 통해 직접 통신하는 phagocytic 및 직업적인 항원 제시 세포 (즉, 대식세포 및 수지상 세포)를 포함하여 다양한 면역 세포 집단이 있습니다. 대식세포 및 수지상 세포는 적응성 면역반응(19)의중요한 타고난 면역 효과및 개시자이다. 상피 의 내부 또는 아래에 거주하는 수지상 세포는 항원을 잡기 위해 루멘에 상피를 가로 질러 돌출부를 형성 할 수 있습니다. 폐포 대식세포는 상피의 정표면에 위치하며 파신 세포로 작용하며, 세균성, 바이러스 및 곰팡이 감염뿐만 아니라 이물질에 대한 첫 번째 세포 방어를 나타냅니다. 이들의 페노티픽 가소성은 이러한 자극에 반응하여 염증 반응을 빠르게 유도할 수 있게 해주며, 항염증제(즉, 억제)반응(20)을발동하는 것으로 이동한다.
인간 폐포 상피 조직 장벽을 시뮬레이션하기 위해, 우리는 각각17에인간 혈액 단화 유래 대식세포 (MDM) 및 수지상 세포 (MDDC)로 보충된 A549 세포와 함께 삼중 공동 배양 모델을 확립했다. ALI에서 이 모델의 재배는 이전에16,심지어 72 h 노출후 노출 21까지보고되었습니다. 탄소 나노튜브 노출에 대한 급성 면역 반응은 침수된조건(22)과비교하여 ALI에 노출된 세포 배양에서 현저히 향상되었다. ALI에서 상이한 물질에 배양되고 노출된 이 문화 모델은 산화 아연에 노출되면 세포독성, 산화 스트레스 및 염증 반응을 조사하는 데 사용되었으며,24개,금 나노입자25,23 26,탄소 나노튜브21,화산재 및 디젤 배기입자(27)에대한 노출시.,
더욱이, 체외 인간 폐 모델에서 면역 이펙터 세포로서 대식세포 및 수지상 세포의 중요한 역할이 확인되었다. 특히, 모델에서 증가된 염증 반응은 단일배양 시스템에 비해 면역 세포의 존재에서만 관찰되었다7. 1 차적인 단핵구 유래 면역 세포를 사용하는 잠재적인 단점은 PBM의 제한된 접근성뿐만 아니라 기증자 - 기증자 변이입니다. 이러한 잠재적 단점에 대한 해결책으로서, 여기에 제시된 것은 세포 배양 모형 조립을 위한 갓 고립된 PBM28의 냉동 보존을 도입하는 프로토콜이다. 이 연구의 목적은 인간 버피 코트에서 PBM의 격리를 포함하여 3D 인간 폐포 상피 조직 모델 조립을 입증하는 것입니다. 염증 자극에 대한 응답성은 신선한 PBM과 차별화되거나 냉동/해동된 PBM과 차별화된 MDM 및 MDDC로 구성된 모델과 비교됩니다.
테스트되지 않은 인간 혈액 샘플과 함께 일하는 것은 HIV (인간 면역 결핍 바이러스), B형 간염 및 C형 간염과 같은 감염증의 잠재적 인 전염을 방지하기 위해 특정 치료를 포함합니다. 따라서 장갑, 가운, 마스크 및 눈 보호와 같은 개인 보호 조치의 사용은 매우 중요하며 좋은 실험실 연습 원칙에 따라야합니다. 이러한 보호는 잠재적으로 전염성 있는 액체에 피부 또는 점막을 드러내기의 리스크를 감소시킵니다. 또한, 버피 코트와 PBM을 취급하는 관련시킨 사람들을 위해, B형 간염 바이러스에 대하여 예방 접종은 필수이고, 항체 항체 반대로 B형 간염의 혈액 타이터 수준은 100 IU/L 이상이어야 합니다 (국가 특정 입법 요구 사항은 해결되어야 합니다). 또한 모든 작업은 생물 안전 수준 2 실험실에서 수행되어야합니다 (국가 별 입법 요구 사항을 해결해야함). 실험실 환경에서 작업하고 폐기물 처리를 포함한 포유류 세포 배양을 처리하는 것과 관련된 표준 건강 및 안전 예방 조치는 전체 프로토콜을 수행 할 때 채택되어야합니다.
Protocol
인간의 혈액에서 분리 된 기본 단핵구를 포함하는 일은 공중 위생 스위스연방사무소의 위원회에 의해 승인되었습니다 (참조 번호: 611-1, 멜둥 A110635/2) 아돌프 머클 연구소에 대한.
1. 인간 버피 코트에서 말초 혈액 단핵구 (PBM)의 격리
참고: 다음 섹션에서는 스위스 베른의 스위스 수혈 센터에서 구입한 버피 코트 의 50mL 봉지에서 면역 세포의 분리를 설명합니다.
- 시약 준비
- 버피 코트 당 자기 분리 버퍼 100mL 준비: 0.5% [w/v] 소 혈청 알부민 (BSA; 인산염 완충식염 [PBS]) 2 mM 에틸렌디아민트라 테 트라아제산 (EDTA),와 pH = 7.2, 0.2 μm 크기의 멸균 필터에 적응하십시오. 시술 내내 4°C로 유지하십시오.
- 세포 배양 배지 준비(CCM): RPMI 1640 와 10% [v/v] 태아 소 혈청 (FBS), 1% [v/v] L-글루타민 (여기, 2 mM L-글루타민, 1% [v/v] 페니실린-연쇄 절제술신(여기, 100단위/mL 페니실린 및 100 μg/mL 연쇄절제술).
참고: 각 시약의 필요한 양은 다음 단계에서 시드할 셀 수에 따라 달라집니다.
- PBM 격리
참고: 모든 유리와 플라스틱 제품은 사용하기 전에 소독해야 합니다. 안전상의 이유로, 유리 제품으로 부상의 위험을 줄이기 위해 인간의 혈액 샘플을 처리 할 때 플라스틱 제품의 사용을 권장합니다.- 가위를 사용하여 버피 코트가 들어있는 가방의 호스 끝을 잘라냅니다.
- 가방의 덕트를 통해 가방의 내용기를 직접 50mL 튜브 2개(~25mL)에 부어 버피 코트를 배포합니다.
- 부드럽게 붓거나 파이프 PBS를 튜브에 붓고 50 mL 볼륨에 도달합니다. 튜브를 3배 거꾸로 부드럽게 돌려 내용들을 섞는다.
- 버피 코트-PBS 혼합물을 4개의 새로운 50mL 원심분리기 튜브에 나누어 각 신선한 튜브에 혼합물의 25mL를 피펫팅하여 나눕니다.
- 10mL 세로지컬 파이펫을 사용하여 버피 코트-PBS 혼합물 아래에 밀도 그라데이션 배지 13mL을 천천히 놓습니다. 파이펫 홀더에서 채워진 파이펫을 분리하고 즉시 피펫의 상부 개구부를 엄지 손가락으로 연결하여 밀도 그라데이션 매체의 추가 누출을 방지하여 버피 코트-PBS 혼합물로 섞어줍니다.
참고: 엄지 손가락으로 상부 개구부를 잡고, 채워진 파이펫을 원물 원심분리기 튜브의 바닥에 놓고 밀도 그라데이션 매체가 버피 코트-PBS 혼합물 아래에 서서히 흐르게 하여 파이펫 내부에 밀도 그라데이션 배지의 약 1mL를 남깁니다. - 버피 코트-PBS 혼합물을 포함하는 다른 3개의 튜브와 함께 1.2.5단계를 반복한다.
- 원심분리기는 1,000xg에서 20분, 25°C의 혼합물을 포함하는 4개의 튜브를 슬로우 제동 모드에서 모두 분리한다. 원심 분리를 위해 보호 뚜껑이 있는 홀더를 사용하십시오.
- 각 튜브의 뚜껑을 열고 혈장 과혈피를 사용하여 플라즈마와 혈소판을 포함하는 상부 층을 제거하고 생물학적 위험 액체 폐기물 용기에 폐기하십시오.
- 혈장과 밀도 그라데이션 중간 층 사이의 희끄무레한 탁탁작은 분수(두께~2~3mm)로 나타나는 말초 혈액 단핵 세포 층을 수집하기 위한 세로지학적 파이펫을 사용합니다. 펠릿에는 바닥에 적혈구가 포함되어 있습니다. 가장 하위 계층을 형성하는 적혈구를 옮기지 마십시오. 네 개의 튜브 모두에 대해 이 것을 반복합니다.
참고: 말초 혈액 단핵 세포는 PBM 및 림프구로 구성됩니다. PBM은 자기 CD14+ 분리 중에 나중에 림프구에서 분리됩니다. - 4개의 튜브에서 2개의 50 mL 관으로 말초 혈액 단핵 세포를 풀.
- PBS로 두 개의 튜브를 50mL로 채우고 뚜껑으로 덮습니다.
- 생물학적 위험 액체 폐기물 용기에 원래 4개의 튜브에서 남은 적혈구와 플라즈마를 폐기하십시오.
- 원심 분리기는 일반 원심분리기 속도로 500 x g및 18-20 °C에서 8 분 동안 두 튜브를 원심 분리합니다.
- 원심 분리 후, 세로지학적 파이펫으로 상체를 제거하고 생물학적 위험 액체 폐기물 용기에 버려십시오.
- 혈청 피펫을 사용하여 PBS의 5mL로 세포를 다시 중단합니다.
- 셀 서스펜션을 50mL 원심분리기 튜브로 풀을 풀고 PBS로 50mL로 채웁니다.
- 셀 서스펜션의 5 μL을 사용하여 트라이판 블루(45 μL) 배제 방법을 사용하여 셀 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 피펫 10 μL 의 트라이판 블루-PBM 용액을 셀 카운터 챔버로 입력하고 표준 계수 프로토콜당 셀 수를 계산합니다. 방정식 1을 사용하여 총 셀 번호 CT를 계산합니다.
- 세포를 계산한 후, 1.2.13 단계에서 수행된 것처럼 50mL 튜브원심분리.
- CD14 양수 선택
- 각 튜브의 뚜껑을 부드럽게 열고 펠릿을 방해하지 않고 혈청 피펫을 사용하여 상체 파이펫을 제거하고 버립니다.
- 자기 분리 버퍼의 계산된 양(방정식 2)을 추가하고(여기서 1 x 107 총 셀당 완충액의 80 μL)을 추가하고 용액을 위아래로 배관하여 셀 펠릿을 다시 놓습니다.
- 방정식 3(여기, 1 x 107 총 셀당 10 μL)을 사용하여 CD14+ 자기 구슬 및 파이펫의 해당 부피를 사용하여 계산합니다.
- 위아래로 피펫팅하여 잘 섞고 뚜껑을 닫고 용액을 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 인큐베이션 시, 자기 분리 버퍼로 튜브를 최대 50mL까지 채웁니다.
- 1.2.13 단계에서 수행된 원심분리기.
- 세포 펠릿을 방해하지 않고 혈청 피펫을 사용하여 상체를 흡입하고 폐기하십시오.
- 파이펫은 자기 분리 버퍼의 해당 양 (방정식 4; 여기, 1 x 108 셀 당 버퍼의 500 μL) 및 3 배 위아래로 파이펫을 하여 부드럽게 혼합합니다.
- 살균제로 분무하고 닦아 자기 분리 스테이션을 소독합니다. 자기 분리를 위한 기둥과 함께 라미나르 플로우 후드에 놓습니다.
- 자기장에 자기 분리 컬럼을 놓고 세척 및 라벨이 없는 세포(즉, 폐기물)를 수집하기 위해 기둥 아래에 빈 50mL 원심분리기 튜브를 배치합니다.
- 자기 분리 버퍼 3mL을 컬럼으로 파이프하여 자기 분리 열을 헹구는 다. 절차 전반에 걸쳐 컬럼이 건조하지 마십시오.
- 자기 분리 버퍼의 15 mL 원심 분리 튜브 및 파이펫 1 mL을 준비합니다.
- 자기 분리 컬럼에 셀 서스펜션(1.3.8 단계에서 제조)을 적용합니다. 필터 아래 50mL 원심분리기 튜브에서, 통과 된 라벨이없는 세포를 수집합니다.
참고: 열의 차단을 피하기 위해 열당 2 x 109 셀을 초과하지 마십시오. - 컬럼 저장소가 비어 있는 즉시(즉, 셀이 컬럼을 통과한 경우)을 복사 파이펫을 사용하여 자기 분리 버퍼 3mL을 적용하고 컬럼을 통과하게 합니다. 이 3x를 반복합니다.
- 손으로 부드럽게 당기면 자기 분리기에서 자기 분리 열을 제거한 다음, 자기 분리 버퍼의 사전 파이프 1 mL을 포함하는 15 mL 튜브에 놓습니다 (1.3.12 단계에서 준비됨).
- 5mL의 자기 분리 버퍼를 컬럼에 추가하고 플런저를 컬럼으로 단단히 밀어 마그네틱 으로 표시된 셀을 플러시합니다.
- MDM 및 MDDC 차별화에 대한 시약 준비
- 1.2.17 단계에서 수행된 것처럼 trypan 파란색 제외 방법을 사용하여 셀 카운터를 사용하여 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다.
- 다음과 같은 추가 단계에 대한 CCM 또는 FBS의 필요한 부피를 계산합니다: 1 x 106 셀/mL(단계 1.5.1)의 세포 밀도에 대응하는 CCM의 부피 또는 FBS의 0.9mL 당 6 x 106 세포의 세포 밀도에 대응하는 FBS의 부피(단계 1.6.3).
- 뚜껑을 닫고 튜브를 원심분리기에 놓고 원심분리기를 1.2.13 단계에서 수행한 대로 배치합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거하고 버립니다. 세포 파종 또는 세포 동결을 위한 1.6단계로 진행한다.
- MDM 및 MDDC로의 PBM 파종 및 차별화
- 3배 위아래로 피펫팅하여 1.4.2단계(여기서, 1 x 106 셀/mL의 최종 농도)에서 계산된 CCM의 계산된 부피에서 셀 펠릿을 재연한다.
- 피펫은 혈청 피펫을 사용하여 별도의 원심분리기 튜브에서 MDM 및 MDDC로 분화하기 위한 세포 수를 피펫한다.
- 파이펫 차별화 요소는 PbM을 사용하여 CCM에 차별화하고 위아래로 파이펫을 하여 잘 섞습니다. 차별화 요소는 다음과 같이 적용됩니다.
- MDDC의 경우: 최종 농도 10 ng/mL 인터류신-4 (IL-4) 및 10 ng/mL 과립-대식세포 콜로니-자극 계수(GM-CSF).
- MDM의 경우: 10 ng/mL 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)의 최종 농도.
- 3mL의 현탁액을 웰당 분배하여 6웰 플레이트에 첨가된 분화 인자를 가진 CCM의 세포 현탁액을 피펫한다(3 x 106 셀/웰, 즉 1 x 106 셀/mL에 해당).
- 6웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에배치하고 CCM을 새로 고치지 않고 6일 동안 분화하게 한다.
참고: 차별화 범위는 버피 코트및 실험용 설정의 현지 가용성에 따라 5~8일 범위이며, 적절한 기술을 사용하여 차별화 효율이 결정되는 경우(토론 섹션을 참조).
- PBM 동결
- 냉동 보호 매체에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단 (여기, FBS 및 디메틸 황산화물 [DMSO; cytotoxic]) 의 비율로 9:1 (v/v) 예비 FBS의 부피를 파이프로. 이는 6 x 106 셀/mL의 최종 세포 농도에 해당하며, 10% DMSO(v/v)의 추가 첨가를 고려한다.
- 라미나르 플로우 후드에서 원하는 극저온 수를 표시합니다(예: 날짜, 격리 코드 및 셀 수를 기록).
- 파이펫 0.9 mL의 순수 FBS에서 의 세포 현탁액 (여기, FBS의 0.9 mL에서 6 x 106 세포) 각 극저온에. 그 후, DMSO의 0.1 mL을 천천히 피펫하고 극저온을 3배 위아래로 돌려 서스펜션을 잘 섞는다.
- 극저온을 세포 동결 용기로 옮기고 즉시 24시간 동안 -80°C로 설정한다.
- 24시간 후, -80°C 냉동고 및 용기로부터 극저온을 제거하고 세포 저장에 적합한 액체 질소 탱크에 넣습니다.
- MDM 및 MDDC로의 PBM 해빙 및 차별화
- 필요한 모든 시약을 수조에서 37°C로 데우세요(~20~30분).
- 해동 된 세포의 수에 해당하는 6 개의 웰 플레이트의 적절한 수를 준비하십시오 (여기서, 1.8 x 107 세포 당 1 플레이트, 즉 3 극저온). 무균 조건하에서 각 웰에 CCM의 파이펫 2 mL. 플레이트를 인큐베이터(5% CO2,37°C)에 15분 동안 배치하여 pH가 평형을 할 수 있도록 합니다.
- 액체 질소 탱크에서 냉동 된 세포와 극저온의 필요한 양을 가지고 부드럽게 세포 현탁액의 균일 한 해동을 보장하기 위해 37 °C 수조 (1-2 분)에 그들을 소용돌이.
- 수조에서 극저온을 제거하고 살균제로 오염제거하여 에이전트가 뚜껑 및 O 링과 상호 작용하지 않도록 합니다.
참고: 본인의 모든 단계는 무균 조건하에서 완료되어야 합니다. - 해동할 극저온 수에 해당하는 15mL 원심분리기 튜브의 적절한 수를 준비한다(여기, 6 x 106 세포/튜브). 각 튜브에 미리 워진 CCM의 파이펫 9 mL.
- 파이펫은 극저온의 내용내용이 CCM을 포함하는 튜브로 천천히(드롭바이드롭)한다. 뚜껑을 닫고 각 튜브에 대해 반복하며 원심분리기는 일반 원심분리기 속도로 5분 동안 200 x g로 반복됩니다.
- 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오.
- 혈청 피펫(3 x 106 세포/mL에 대응하는 세포 밀도)를 사용하여 위아래로 피펫을 사용하여 전동된 CCM의 2mL에서 각 튜브(1극 극저온으로부터 세포를 포함)에서 펠릿을 재연한다.
- 각 튜브에서, 파이펫은 이전에 준비된 CCM의 2mL를 포함하는 6개의 웰 플레이트의 2개의 우물(웰당 1mL)으로 재중단된 세포를 3 x 106 세포/웰의 세포 밀도에 도달하였다(최종 농도 1 x 106 셀/mL에 해당). 다른 모든 튜브에 대해 이 것을 반복합니다.
- 섹션 1.5.3에 설명된 대로 차별화를 진행합니다.
- 6웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에배치하고 CCM을 새로 고치지 않고 6일 동안 분화하게 한다.
2. 인간 폐포 상피 조직의 삼중 세포 공동 배양 모델
참고: 이 섹션에서는 12개의 웰 플레이트 인서츠에 해당하는 볼륨 및 셀 번호에 대한 지침을제공합니다. 그림 1은 모델 어셈블리에 대해 제안된 타임라인을 요약합니다.
- 상피 세포 (A549 세포주) 파종
- 공급 업체 (ATTC)에 의해 제공 된 권고에 따라 상피 세포를 배양. 간략하게, CCM에서 세포를 80% 세포 수렴성(주당 약 2x-3배)으로 하위 배양한다.
참고: 서브컬쳐 A549는 5-25의 통로 범위에서 A549 세포를 사용하여 공동배양 모델 조성 전에 적어도 4개의 구절을 위한. - 12 개의 웰 플레이트로 미리 따뜻힌 CCM의 파이펫 1.5 mL (우물의 수는 원하는 모델 수에 해당).
- 멸균 핀셋을 사용하여 12웰 플레이트의 우물에 개별 12 웰 세포 배양 삽입을 배치합니다.
- 하위 배분 프로토콜에 따라 플라스크에서 세포를 분리한다(즉, 분리제를 사용하여, 1.2.13 단계에서 수행된 것과 마찬가지로 원심분리에 의한 에이전트를 제거). A549의 최종 세포 농도에 해당하는 CCM의 적절한 부피에서 재중단(여기, 50 x 104 셀/mL; 삽입당 세포 현탁액의 0.5 mL, 즉 27.8 x 104 셀/cm22의 종자 밀도에 해당되는 25 x 104 세포/인서트).
- 1mL 파이펫을 사용하여 삽입물의 정파 측에 셀 서스펜션(즉, 25 x 104 셀/인서트)의 파이펫 0.5 mL.
- 뚜껑으로 플레이트를 덮고 4일 동안 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에넣습니다.
참고: 상대비 현미경으로 A549 세포의 합류를 정기적으로 확인합니다.
- 공급 업체 (ATTC)에 의해 제공 된 권고에 따라 상피 세포를 배양. 간략하게, CCM에서 세포를 80% 세포 수렴성(주당 약 2x-3배)으로 하위 배양한다.
- MDDC 시드
- MDDC를 포함하는 6개의 웰 플레이트에 부착되지 않은 세포로 CCM을 흡인.
- 각 웰에 신선한 예열 된 CCM 1 mL을 추가합니다.
- 셀 스크레이퍼를 사용하여 각 웰에서 분리(긁힘) 부착된 MDDC를 사용하여 기존 CCM 3mL로 우물을 부드럽게 세척하고 원뿔원 원심분리튜브에 결합합니다.
- 셀 서스펜션 10μL 및 트라이판 블루 용액 10μL을 사용하여 셀 카운터로 셀 카운터를 사용하여 셀 카운터를 사용하여 셀 카운터를 사용하여 셀 카운터를 사용하여 셀 카운터를 사용하여 셀 카운터를 사용하여 셀 을 계산합니다.
- 1.2.13 단계에서 수행된 바와 같이 세포 현탁액을 원심분리합니다.
- 재서스펜션에 필요한 CCM 볼륨을 계산합니다(방정식 5):
필요한 MDDC 밀도 = 42 x 104 셀/mL; 각 인서트에는 6.3 x 104 세포가 필요하며, 이는 7 x 104 셀/cm2의 종자 세포 밀도에 해당합니다(여기서, 150 μL은 2.2.10 단계에서 0.9cm2에 추가).
세포 재서스펜션에 대한 CCM 부피(Vm; 방정식 5):
- 인서츠에 A549가 자라면서 12개의 웰 플레이트의 상부 챔버에서 CCM을 부드럽게 흡인하고 폐기하십시오.
- 멸균 핀셋을 사용하여 멸균 페트리 접시에 A549 셀로 인서트를 거꾸로 놓습니다. PBS를 장착한 원심분리기 튜브(50mL)를 준비하고 세포 스크레이퍼를 미리 적시한다.
- 인서트기의 기저 표면(즉, 위쪽 부분의 위쪽 부분)에서 A549 세포를 긁어 내어 인서츠의 모공을 통해 자랍니다.
참고: 개별 샘플을 긁는 사이에 PBS(튜브로 제조)로 스크레이퍼를 헹구고 시술 기간 내내 젖어 두십시오. - 원심분리(2.2.5단계)에 따라, 흡인 및 상복부를 폐기한 다음, 계산된 CCM(2.2.6단계) 및 파이펫을 3배 위아래로 재분산시다.
- 각 인서트 위에 있는 셀 서스펜션의 파이펫 150 μL은 인서트의 전체 기저 표면이 액체로 동일하게 덮여 있고 기포를 포함하지 않도록 합니다.
- 뚜껑으로 접시를 덮고 세포 배양 인큐베이터에 70 분 동안 배치하십시오. 세포 배양 판(인서트가 처음 배치된 곳)에서 CCM을 흡인하고, 생물학적 위험 액체 폐기물로 폐기하고, 각 우물에 신선한 CCM1.5mL의 파이펫을 버린다. 뚜껑으로 플레이트를 덮고 셀 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에놓습니다.
참고: 세포를 건조하지 않도록 위에서 언급한 기간을 초과하지 마십시오. - 인큐베이션 후, 각 인서트를 멸균 핀셋으로 조심스럽게 잡고 CCM을 포함하는 접시에 일반 위치에 놓습니다. 뚜껑으로 접시를 덮고 셀 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO2)로돌려놓습니다.
- 대식세포(MDM) 파종
- 미리 분화된 MDM이 들어 있는 6개의 웰 플레이트를 사용하여 셀 인큐베이터에서 라미나르 플로우 후드로 배치합니다.
- 6개의 웰 플레이트에서 자라는 미부착 MDM과 각각 의 상쾌한 프리워드 CCM1mL로 CCM을 흡입하고 폐기하십시오.
- 셀 스크레이퍼를 사용하여 개별 우물에서 부착 된 MDM을 부드럽게 제거하십시오 (MDDC의 경우 2.2.3 단계에서 수행됨).
- 피펫 10 μL의 트라이판 블루는 우물 또는 튜브에 넣고 MDM 서스펜션의 10 μL을 추가하여 1:1 (v/v)의 최종 희석을 달성합니다. 적절한 계수 프로토콜을 사용하여 MDM 수를 계산합니다.
- 1.2.13 단계에서 수행된 바와 같이 세포 현탁액을 원심분리합니다.
- 필요한 볼륨을 계산합니다(방정식 6):
필요한 MDM 밀도 = CCM에서 2.5 x 104 셀/mL(여기서 각 삽입은 0.5mL CCM에서 1.25 x 104 셀이 필요하며, 이는 1.4 x 104 셀/cm2의종자 세포 밀도에 해당한다).
(6) - 원심분리시, 흡인 및 상체를 폐기하면, 계산된 CCM(2.3.6단계) 및 파이펫을 3배 위아래로 재분산시한다.
- 1mL 파이펫을 사용하여 A549 및 MDDC(상피 세포에 직접 가하지 않음)를 이용한 세포 배양 인서트의 벽에 MDM 서스펜션(2.3.7단계에서 제조)의 조심스럽게 파이펫 0.5 mL. 24h용 세포배양배양배기(37°C, 5%CO2)에뚜껑을 덮고 놓는 플레이트를 덮는다.
- 공액 인터페이스(ALI)로 의 공동 문화 모델 이전
- 세포 배양 인큐베이터에서 조립된 모델의 24h(±2h) 배양 기간이 끝나면 세포 배양 삽입물의 정모 및 기저 부위모두에서 CCM을 흡인 및 폐기한다.
- 멸균 핀셋을 사용하여, 1mL 파이펫을 사용하여 각각 의 우물과 파이펫 0.6 mL의 개별 인서트를 들어 올립니다. 인서드의 정점에 CCM을 추가하지 마십시오.
- 뚜껑이 있는 덮개 플레이트와 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에배치하여 24시간 전에 추가 사용한다.
(6)3. 선택된 양수 컨트롤에 노출 (염증 반응을 유도하기위한 알려진 자극)
참고: 알려진 프로염증 자극 내독소 리포시아당카라이드(LPS)7 및 프로염증성 사이토카인 종양 괴사 인자 α(TNF-α)7에 대한 균양 모델의 노출은 모델의 반응성을 예시하는 데 사용된다. 더욱이, 세제(Triton X-100)에 노출되면 락테이트 탈수소효소(LDH) 분석의 민감도를 확인하는 데 사용된다.
- 양수 제어 솔루션 준비: LPS 스톡(증류수 1 mg/mL), TNF-α 스톡(증류수100 μg/mL) 및 트리톤-X 100(PBS의 2% [v/v]).
- ALI 조건에서 공동 문화 모델의 24 시간 인큐베이션에 따라, 흡인 및 기저 구획에서 상퍼를 폐기. 멸균 핀셋을 사용하여 우물과 파이펫 0.6 mL의 개별 인서트를 각 우물에 들어올립니다.
- 1 μg/mL LPS, 1 μg/mL TNF-α, 0.2% 트리톤-X 100 : 다음과 같이 원적 원심 분리튜브에서 CCM의 주식을 희석하여 개별 긍정적 인 제어 작업 솔루션을 준비합니다. 볼륨은 테스트된 인서츠 수(여기 100 μL/삽입)에 해당합니다. 3배 위아래로 파이프를 사용하여 솔루션을 잘 섞습니다.
- 셀 배양 삽입의 벽에 천천히 피펫팅하여 각 양수 제어 용액의 100 μL을 적용하십시오. 24h용 세포배양배양(37°C, 5%CO2)에뚜껑을 덮고 배치한다. 인큐베이션 시 핀셋을 사용하여 개별 인서트를 보유하여 삽입물의 정물 측에 액체를 흡인하고 폐기하십시오.
- 기저 구획에서 CCM을 수집하고 추가 LDH 분석을 위해 1) 4°C에 저장하고, 세포막 파열 매개 세포 독성을 나타내는 및/또는 2) 효소 연계 면역소벤터벤트 분석(ELISA)을 통한 단백질 방출의 추가 분석을 위해 -80°C에 저장한다. 키트 공급 업체 의 권고에 따라 assays를 실행합니다.
- CCM을 제거하면, PBS 3x로 인서트를 세척하고 두 삽입면 PFA 용액으로 잘 덮여 있는지 확인하여 세포 배양 인서트에 세포를 4 % [w /v] 파라 포름알데히드 (PBS, 실온에서 15 분)로 고정하십시오. 이후 PBS로 3배 세척하여 PFA를 제거합니다. 추가 면역 스테인닝을 위해 PBS에 침수된 샘플을 4°C에서 저장합니다(이 방법의 예는 이전에17에설명되었다).
Representative Results
폐포 상피 세포및 면역 세포로 구성된 인간 폐 공동 배양 모델은 신선하거나 냉동 된 MDDC 및 MDM 선조자 (여기, 인간 말초 혈액 유래 단핵구)에서 조립되었다. 도 1에제시된 바와 같이, A549 세포는 단핵 분리/해동을 포함하는 첫 번째 단면도 후에 3일 후에 시드하였다. 6일간의 차별화 된 MdM은 둥근 모양으로 나타났고 MDDC는 관찰 가능한 돌출부로 더 긴 모양을 형성했습니다. 그들은 또한 특히 신선한 단세포(그림 2, 그림 3)와차별화 될 때 응집체로 나타났습니다. 상피 세포는 3일간의 성장 후 세포의 조밀한 세포층을 형성하여 막 인서트가 조립되었을때(도 4). 24h의 조립과 ALI 조건을 추가로 24시간 동안 거친 후, 공존은 노출을 위해 준비되었다.
3D세포 배양 모델의 반응성은 이전에 설명된 바와 같이 의사-ALI 접근법을 사용하여 알려진 프로염증 자극에 노출될 때 조사되었다. 염증 자극, LPS 및 TNF-α는, 공기 노출 세포 모델의 정표면에 낮은 부피(100 μL)에 첨가되었다. 동시에, 세포 독성의 척도로서 막 파열의 부재는 LDH 분석기를 통해 평가되었다. 기저구의 CCM에서 의 LDH 방출이 현저한 증가를 관찰하였고, 막 파열에 대한 양성 제어에 노출되면, 세제 트리톤-X 100(그림5). 이러한 결과는 세포독성 물질에 대한 모델의 반응성을 입증한 반면, LDH 방출의 증가는 TNF-α 또는 LPS를 가진 정량적 자극시 관찰되지 않았다.
신선하거나 이전에 냉동된 PBM로 조립된 샘플에서 LDH의 서로 다른 측정값에 대한 가능한 이유는 샘플 저장소에 기인할 수 있다. -80°C에서 신선한 PBM의 샘플은 더 오랜 시간 동안 저장되었다; 따라서, LDH 효소의 활성은 떨어질 수 있다. 특히, LDH는 CCM에서 최대 4일 동안만 안정적입니다. 따라서, 수퍼네이트 수집 후 최신 2일 의 분석 작업을 수행하는 것이 좋습니다. 또는 수집 후 직접 슈퍼네티츠를 동결할 수 있습니다. 그러나 동결은 LDH의 효소 활동을 감소시킬 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다.
프로염증 중제기의 분비(여기, TNF-α 및 인터류킨 6 [IL-6] 및 8 [IL-8])을 기저 CCM로 의 분비하여 ELISA를 통해 정량화하였다. 통계적으로 유의한(p&0.05, 단방향 ANOVA)의 방출에서 IL-6 및 IL-8의 증가는 LPS-및 TNF-α-처리된 샘플 모두에서 각각의 처리되지 않은 세포에 비해, 뿐만 아니라 PBM 소스로부터 조립된 세포 배양모델(도 6)에서관찰되었다. 기저 CCM에서 모든 테스트된 사이토카인의 농도(pg/mL)가 신선한 PBM으로 구성된 공동배양에서 높았지만, 두 개의 동문화와 단일배양 간의 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(p> 0.05)(그림 6). 2D 상피 세포 배양에 대하여 공동배양 모델의 부가가치를 확인하기 위해, A549 단배양은 LPS 또는 TNF-α에도 노출되었다. 예상대로, A549 단문화에서 조사된 모든 중개자의 출시는 두 공동 재배 모델에 비해 낮았다. 비록, 그들 사이의 차이는 통계적으로 유의하지 않았다 (p > 0.05, 단방향 ANOVA).
3D 인간 폐포 상피 조직 장벽의 세포 형태는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(LSM)를 통해 평가되었다. 각 모델의 조성을 시각화하기 위해, MCULTURE 모델(MDM) 내의 대식세포는 성숙한 대식세포 마커 25F9로 염색하였다. MDDC는 활성화된 수지상세포(30)에중요한 마커인 CD83로 염색되었다. 세포 형태에 관해서는, 해동 된 PBM을 사용하는 것과 비교하여 신선한 PBM에서 MDM과 MDDC를 사용하는 공동 문화 모델 사이에 차이가 관찰되지 않았습니다. LPS-및 TNF-α-노출된 코배기에서는 신선하고 냉동된 면역 세포로 구성되며, LSM 이미지에서 중단된 상피층을 관찰하였으며, 이는 치료되지 않은 세포의 경우는아니었다(도 7, 도 8).
그림 1: 프로토콜의 회로도 타임라인입니다. 3D 공동문화 모델 제제, 조립 및 응용 분야(시험된 물질에 대한 노출)의 프레젠테이션. ALI = 공기 액체 인터페이스, MDDC = 단핵구 유래 수지상 세포, MDM = 단세포 유래 대식세포, PBM = 말초 혈액 단핵구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MDM 및 MDDC는 신선한 PBM과 차별화되었습니다. 상아항미세현미경이미지(A)MDM 및(B)MDDC의 신선한 PBM로부터(세포 격리 후 6일). MDM은 둥근 모양이며 MDDC는 종종 응집로 관찰됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 냉동 PBM과 차별화된 MDM 및 MDDC. 상아항미세현미경이미지(A)MDM 및(B)MDDC의 해동 된 PBM로부터 (해동 후 6 일). MDM은 둥근 모양이지만 일부 길쭉한 세포를 관찰 할 수 있습니다. MDDC는 돌출부가 있는 둥근 모양의 모양도 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 막 인서트가 성장하는 상피 세포. 파종 후 4일 만에 막 인서트가 자라는 동류 A549의 위상-조영 현미경 이미지는 조밀한 세포 층을 형성한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 세포 독성 결과 막 파열 기지를 통해 조사 (LDH) 분석. 데이터는 처리되지 않은 세포에 비해 접힌 증가로 제시된다 (평균 ± SD, n = 3, 별표는 처리되지 않은 세포에 비해 통계적으로 유의한 증가를 나타냅니다, **p < 0.01, ****p & 0.0001). 녹색 모델에서 신선한 PBM에서 MDM및 MDDC가 표현되고, 해동 된 PBM에서 조립 된 보라색 모델이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 동문화 및 단일 배양에 있는 선동적인 반응. 선동적인 중재자(TNF-α, IL-6 및 IL-8)는 LPS 또는 TNF-α를 사용하여 24h 챌린지에 따라 공동배양에서 방출된다. 데이터는 처리되지 않은 세포(평균 ± SD, n = 3, **p & 0.01, ***p & 0.001, ****p & 0.0001)에 상대적인 것으로 제시됩니다. 녹색 모델에서 신선한 PBM에서 MDM및 MDDC가 표현되고, 해동 된 PBM에서 조립 된 보라색 모델이 표시됩니다. 회색은 A549 단일 컬쳐를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 신선한 면역 세포로 구성된 동배의 형태. 새로운 PBM의 MDM 및 MDDC를 사용하여 모델의 압정 측면의 정색 및 기저 면의 LSM 이미지는 핵(DAPI), 마젠타는 세포골격(로다민-팔로이드), 화이트는 MDM(25F9), 녹색을 나타내는 MDDCs(CD83)를 나타낸다. 흰색 화살표는 MDM을 나타내고 녹색 화살표는 MDDC를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 냉동 면역 세포로 구성된 동배의 형태. 상응하는 Xz 프로젝션을 이용한 공동배양 모델의 액면및 해동 된 PBM으로부터 MDM 및 MDDC를 사용하는 모델의 기저측의 LSM 이미지. 시안은 핵(DAPI),자젠타가 세포골격(rhodamine-phalloidin), 백색은 MDM(25F9)을 나타내고, 녹색은 MDDC(CD3)를 나타낸다. 흰색 화살표는 MDM을 나타내고 녹색 화살표는 MDDC를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
화학 물질과 약물을 포함한 새로운 물질의 새로운 생산은 점차 시험관 내 모델의 예측 필요성을 증가시킵니다. 동물 실험32의교체, 감소 및 정제의 세 가지 원칙을 준수하기 위해, 체외 세포 모델은 약물 또는 물질의 작용8,9,,10,,11의회피 메커니즘에 대한 교체 및 감소 측면에 관한 강력한 도구가 되었다., 여기에 제시된 것은 이전에 냉동 된 단핵구에서 갓 분리되거나 해동된 면역 세포를 사용하여 다세포 모델을 조립하는 상세한 프로토콜입니다. 또한 ALI에서 모델의 재배를 설명합니다. 마지막으로, 프로토콜은 선동자극에 노출되는 예를 설명하고 신선하거나 냉동된 단핵구를 포함하는 두 모델의 반응을 비교한다.
기존의 침수 노출7,,22,,31에비해 ALI 조건하에서 성장하고 노출된 모델의 향상된 복잡성의 부가가치를 확인하고 정당화하기 위해 다양한 연구가 수행되었다. 상피 세포의 단일 배양에 비해 공동 배양에서 더 높은 염증 반응의 관찰은 이전 연구를 확인합니다. 이 연구는 제시된 공동배양 모델(LPS로 자극)을 사용하고 A549 단일배양 등가 모델7에비해 TNF 및 IL1B의 유전자 발현 수준에서 더 높은 반응을 보였다. 한편, 두 모델 모두 A549 단배양에 비해 측정된 염증 성 중재자 방출 값 내에서 더 높은 변이를 보였다. 이는 이전에도시된바와 같이 생물학적 반복(즉, 반복 1회, 기증자 1개)에서 면역 세포를 사용하여 설명할 수 있다. 원하는 경우, 복제 사이의 변이는 1) 동일한 기증자로부터 해동 된 PBM을 사용하여 또는 2) 세포를 동결하기 전에 다른 기증자로부터 PBM을 풀링한 다음 각 반복에서 동일한 풀을 후속으로 사용할 수 있습니다. 더 많은 생물학적 반복을 포함 하는 것도 좋습니다.
세포 동결 기술은 중요한 단계로 간주될 수 있습니다. 그러나, 그것은 현상 및 기능 분석을 위한 세포를 보존하기 위한 일반적인 실험실 절차입니다. 다양한 연구는 냉동 PBM의 품질이 생존에 필수적임을 입증하고, 적절한 동결 기술은 동일한 세포(28,,32)와후속 연구 결과의 성공에 열쇠이다. 프로토콜의 수정은 일반적으로 버피 코트의 가용성이 제한되어 있기 때문에 실험 설정에서 유연성을 제공하는 PBM을 동결하여 수행 할 수 있습니다. 새로 고립된 것 보다 냉동 PBM(여러 바이알)을 사용하는 또 다른 장점은 1년 후에도 후속 실험에서 사용할 수 있다는 것입니다. 이것은 실험에서 원하는 또는 필요한 매개 변수인 경우 기증자 - 기증자 가변성의 잠재적 인 문제를 감소시다.
최대 13개월 후에 수행된 실험실 간 비교의 결과는 PBM이 액체 질소 탱크에 적절하게 저장될 때 세포 생존가능성 또는 세포회수(33)에아무런 영향 없이 장기간 사용할 수 있음을 보여준다. 실험을 수행하기 전에 세포 생존가능성 및 세포 반응성을 신중하게 검증하면 저장 시간(1년 이상)이 길어질 수 있다. 또한 액체 질소 탱크의 온도는 항상 안정적으로 유지되어야합니다. 냉동 보존 된 PBM의 생존가능성에 영향을 미치는 주요 요인은 10%-20 %(v/ v)28의최적의 농도로 DMSO 농도로 나타났습니다. 동결의 잠재적으로 유해한 효과를 최소화하기 위해, 단백질의 다른 소스, FBS 또는 BSA (40% 최대 100 %34까지농도의 넓은 범위)는 종종 세포 생존을 증가시킬 수있는 천연 보호 성분으로 동결 배지에 추가됩니다.
DMSO의 높은 세포 독성 잠재력으로 인해 먼저 FBS에서 PBM을 분산한 다음 이미 FBS에 분산된 PBM에 DMSO를 추가하는 것이 좋습니다. 특히, FBS 농도가 높지만 (>40%) 세포 생존능력이 개선되지 않았고, 동시에세포(28)에해를 끼치지 않았다. 그럼에도 불구하고, 모노사이클을 동결하는 것은 제한된 버피 코트 가용성의 문제를 극복하는 가능한 방법입니다. 그러나, 신선한 PBM로부터 MDDC 및 MDM을 사용하는 것이 바람직한 경우, 면역 세포는 분리7,,16,,17,35,,,36, 37,37후에 5-8일 후에 분화되고 사용될 수 있다. 실험 계획이 허용하는 경우 MDDC와 MDM 모두에서 최소 6일간의 차별화를 권장합니다. 그러나 동일한 실험에서 서로 다른 반복 간의 일관성과 특정 표면 마커 표현식의 일상적인 검사는 매우 중요합니다. 분화 시간 후에 LPS와 같은 선동적인 자극에 대한 반응성은 또한 정기적으로 확인되어야 합니다.
A549 세포주사용으로 많은 조사가 ALI에서 수행되었거나, 단일배양으로 또는 다른 세포 유형(대식세포, 수지상 세포 또는 섬유아세포)과 결합하여 3D 공동배양모델(22,,24,,29,38)로수행되었다., 본 3D 공문화 모델을 이용하여, 세포독성, 산화스트레스, 또는 (나노-) 물질의 염증효과를 최대 72h1,,17,,21,,24,,29까지조사하였다. 모델의 생체 내 조직과 유사성은 이전에 모델16의공초점 레이저 스캐닝 이미징을 기반으로 조사되었다. 모델을 조립할 때, 세포 증식(여기에 제시된 모델에서 A549에 영향을 미칠 수 있음)과 1차(증식 하지 않음) 면역 세포의 성능(여기, MDDC 및 MDM)을 모두 고려하는 것이 중요합니다. 또한 모든 CD14 양성 단핵구가 MDDC 및 MDM으로 분화되는 것은 아니며, 세포가 부착된 형태와 일시 중단된 형태로 모두 존재할 수 있다는 점도 고려해야 합니다. 공동배양 어셈블리의 특성에 기초하여(여기서, 두 세포 유형 모두 기존 상피 층에 부착해야 함), 두 면역 세포 유형의 부착 된 하위 집단만 사용하는 것이 좋습니다. 또한 LPS에 대한 단핵구, MDDC 및 MDM 단일배양 반응성 및 특정 표면 마커(CD14, CD163, CD86, CD93 또는 CD206, CD206, 데이터 표시 되지 않음)의 일상적인 분석은 6일 및 7일간의 차별화가 최적의 타임포인트임을 시사하였다.
인간 폐에서 의 실적인 수의 폐포 상피 세포가 ~160,000 세포/cm2에해당하지만, 모델에서 계산된 A549 세포의 수는삽입체 16,,18에서배양된 9일 후 ~1,000,000세포/cm2이다. 따라서, 이러한 시험관 내 모델의 한계를 고려해야 합니다. 첫째, 상피 세포의 밀도는 성장하는 막에 컨물층을 형성하는 능력에 기초하여 확립되었다. 또한 A549가 평평하고 확산되는 상피 형 I 세포와는 반대로, 입체 형 II 세포를 나타내는 것이 중요합니다. 한편, 필요한 수의 면역세포는 문헌에 기초하여 확립되었고, 이 프로토콜에서 세포수/표면적(39,39,40,41)으로41제시되었다. 400세포/mm2(4세포/cm2) 16의 범위에서 MDDC의 세포 밀도는 500-750세포/mm2(5-7 세포/cm2)의 정상 상태 세포 밀도와 비교된다(5- 7 세포/cm22)에서생체 내연구39에서보고된다. 이 모델에서 MDM의 밀도는 인간 폐포영역(40)에서생체 내 의 생체 내 상황과 동일한 범위 내에 있다.
성숙한 대식세포 마커 염색(25F9)은 기저측뿐만 아니라 기저측(즉, 수지상 세포의 부위)에서 모두 관찰되었다. 막 삽입 모공을 통해 면역 세포의 전좌가 가능하고 또한 염색 강도에 관찰 된 차이를 설명 할 수있는이 모델(16)을사용하여 관찰되었습니다. 그러나, 또 다른 가능한 설명은 성숙한 대식세포 마커도 수지상 세포에 표현될 수 있지만, 발현은 매우 공여자 특이적42이다. 또한, 25F9 발현의 강도는 MDM에서 훨씬높다(도 7, 도 8). 두 염증 자극 (LPS 및 TNF-α) 두 공동 문화에서 폐 상피 장벽의 무결성에 영향을(그림 7, 도 8). 이는 이전간행물(43,44)에,44 기초하여 선동적인 사이토카인 및 세균성 제품이 상피 장벽의 무결성을 방해한다는 것을 보여주었습니다.
인간 폐포 상피의 3D 다세포 모델은 이전에17년에확립되고 특징지어지며,,생체 외21,,24,25,,45에서생물학적 반응(즉, 급성 염증 반응, 산화 스트레스 반응, 입자 분포 및 세포 통신)을 평가하기 위한 강력하고 유용한 도구로 작용하였다. 결과는 프로염증 자극(여기, LPS 및 TNF-α)에 대한 공동배양 모델의 재조함을 확인한다. 반응은 신선한 PBM에서 면역 세포를 사용할 때 약간 증가했다; 그러나, 신선한 대 해동 된 PBM을 사용 하 여 공동 문화 사이 통계적으로 유의 한 차이가 없었다. 더욱이, 두 동배 모델의 선동반응은 동일한(ALI) 조건하에서 재배된 상피 세포 단배배의 반응보다 높았다. 요약하자면, 프로토콜은 MDM 및 MDDC로의 분화를 위해 신선하거나 해동된 PBM을 사용하여 3D 인간 폐포 상피 조직 공동 배양 모델의 조립을 설명합니다. 두 모델 모두 염증 자극에 매우 반응하는 것으로 나타났습니다. 따라서 잠재적 위험 및 독성 평가를 위한 강력한 도구역할을 할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 그림 3의 공동 문화 계획에 대한 박사 미겔 Spuch-Calvar과 중요한 독서에 대한 박사 베디아 베검 카라코카크에게 감사드립니다. 이 연구는 보조금 협정에 따라 유럽 연합 (EU)의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에 의해 지원되었다, 아돌프 머클 재단에 의해. B.D. 재정적 지원을 위한 피터 und 트라우들 엥겔혼 재단에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchmark microplate reader | does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland | ||
| Cell culture Incubator | does not have to be specific | ||
| Cell freezing container (for example Mr. Frosty) | does not have to be specific | ||
| Centrifuge | does not have to be specific | ||
| Confocal laser scanning microscope | does not have to be specific, for example | Zeiss LSM 710 meta | |
| Heamatocytometer, or automatic cell counter | does not have to be specific | ||
| Laminar bio-safety hood class II | does not have to be specific | ||
| MultiStand Macs (Macs Cell Separator) | Miltenyi, Germany | 130-042-303 | |
| pH meter | does not have to be specific | ||
| Phase contrast inverted light microscope | does not have to be specific | ||
| Pipette boy, pipettors (different volumes) | do not have to be specific | ||
| Scissors | do not have to be specific | ||
| Vacuum pump | does not have to be specific | ||
| Water bath | does not have to be specific | ||
| Disposable small equipment/glassware | Catalogue Number | ||
| 15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes | does not have to be specific | ||
| 6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile | Falcon, Switzerland | 353046 and 353043 | |
| Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 μm pore size | Falcon, Switzerland | 353181 | |
| Cell scrapper | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 353085 | |
| Cryovials | do not have to be specific | ||
| Glass autoclaved Petri Dishes | do not have to be specific | ||
| LS Columns | Miltenyi, Germany | 130-042-401 | |
| Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 μm pore size | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 10040-446 | |
| Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL) | does not have to be specific | ||
| Sterile pipettes | do not have to be specific | ||
| Chemicals | |||
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | A7030-100g | |
| CD14+ MicroBeads human - magnetic beads | Miltenyi, Germany | 130-097-052 | |
| Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red | Gibco, Switzerland | 25300054 | |
| Density gradient medium Lymphoprep | Alere Technologies AS, Norway | 1114547 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich, Switzerland | D2438 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | E6758-100g | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco, Switzerland | 10270-106 | |
| Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-093-864 | |
| Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-095-373 | |
| Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-096-485 | |
| L-glutamine | Gibco, Switzerland | 25030-024 | |
| Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli | Sigma-Aldrich, Switzerland | 4524-5mg | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | 158127 | |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco, Switzerland | 15140-122 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco, Switzerland | 10010-015 | |
| Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI) | Gibco, Switzerland | 42401-018 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Switzerland | T8787 | |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma Aldrich, Switzerland | ||
| Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | Immunotools | 11343015 | |
| Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response | |||
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche, Switzerland | 11644793001 | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY206 | |
| Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY208 | |
| Immunostaining | |||
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 μg/mL | Sigma-Aldrich, Switzerland | 10236276001 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 μg/mL | Abcam, UK | ab150115 | |
| Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 μg/mL | Agrisera, Sweden | AS09 633 | |
| Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 μg/mL | eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland | 14-0115-82 | |
| Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 µM | Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland | R415 | |
| Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution | Abcam, UK | ab244204 |
References
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