Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tehlike Değerlendirmesi İçin Epitel Hücreleri ve Primer İmmün Hücrelerden Oluşan Çok Hücreli İnsan Alveoler Modeli

Published: May 6, 2020 doi: 10.3791/61090
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Adolphe Merkle Institute, University of Fribourg
* These authors contributed equally

Summary

Burada sunulan birincil insan kanı monosit izolasyon yanı sıra makrofajlar ve dendritik hücreler ve çok hücreli insan akciğer modeli içine epitel hücreleri ile montaj içine farklılaşma için bir protokoldür. Proinflamatuar uyaranlara maruz kalındığında, taze izole edilmiş veya çözülmüş monositlerden farklı bağışıklık hücrelerinden oluşan kokültürlerin biyolojik yanıtları karşılaştırılır.

Abstract

Alveoler hücre kokültür modeli burada alveoler epitel tip II hücreleri ve iki tip bağışıklık hücrelerinden oluşan alveoler epitel doku bariyerinin simülasyonu için tanımlanmıştır (yani, insan monosit kaynaklı makrofajlar [MDM] ve dendritik hücreler [MDCs]). Çok hücreli modeli birleştirmek için bir protokol sağlanır. Alveolar epitel hücreleri (A549 hücre hattı) iki odalı kuyularda geçirilebilir ekler üzerinde batık koşullar altında yetiştirilen ve farklılaştırılmış koşullar altında, daha sonra farklılaşmış MdM ve MdDCs ile birlikte. Son olarak, hücreler birkaç gün boyunca bir hava-sıvı arayüzüne maruz kalırlar. İnsan birincil bağışıklık hücrelerinin insan buffy kat izole edilmesi gerektiğinden, bağışıklık hücreleri ya taze ya da çözülmüş monositler farklılaştırılan deneysel ihtiyaçlarına dayalı yöntemi uyarlamak için karşılaştırılır. Taze izole edilmiş veya çözülmüş monosit türevi bağışıklık hücreleri ile alveolar hücrelerden oluşan üç boyutlu modeller, tedavi edilmeyen hücrelere göre proinflamatuar uyaranlara (lipopoplysaccharide ve tümör nekroz faktörü α) maruz kalındığında sitokin (interlökinler 6 ve 8) salınımında istatistiksel olarak anlamlı bir artış göstermektedir. Diğer taraftan, kokültürlerde gözlenen sitokin salınımı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktur. Bu, sunulan modelin taze veya çözülmüş periferik kan monositlerinden (PBM) farklılaşan MdM ve MdDC'lerin varlığında proinflamatuar uyaranlara yanıt verdiğini göstermektedir. Bu nedenle, aerosolize ilaçlar veya nanomalzemeler de dahil olmak üzere farklı maddelere akut biyolojik tepki araştırmaları için güçlü bir araçtır.

Introduction

In vitro akciğer hücresi kültürleri aerosollerin tehlikelerini değerlendirmek için uygun maliyetli, sağlam ve iyi kontrollü platformlar sunuyoruz1. İnsan alveoler pnömofitler için model hücre sistemi olarak, pulmoner adenokarsinomdan izole edilen epitel A549 hücre hattı genellikle2kullanılır. Bu hücreler alveolar bölgeden skuamöz tip II epitel hücreleri temsil3 ve tehlike ve toksisite değerlendirmesi için yaygın olarak kullanılan akciğer hücresi hattı1,4,5,6,7,8,9,10. A549 hücre hattı alveoler epitel tip II hücrelerinin ilgili özelliklere sahiptir, yoğun paketlenmiş fosfolipidler içeren karakteristik lamellar organların varlığı gibi3.

Bu hücreler bir hava-sıvı arayüzü (ALI) kültürlü olduğunda, yüzey e-posta hücrelerinin apikal tarafında serbest bırakılır gösterilmiştir, yüzey gerilimi azaltarak11,12,13. Bu özellik özellikle nanomalzeme solunum tehlikesi ve toksisite araştırmalarında önemlidir. Bir kez solunan nanomalzemeler / toksikmaddeler alveoler bölgede birikir, ilk pulmoner sürfaktan ile etkileşim ve sulu hipofaze kuvvetleri ıslatma tarafından yerinden edilir, pulmoner hücreler ile etkileşim gerçekleşirnerede 14,15. A549 hücreleri bir monolayer oluşturmak rağmen (ALI ekili daha sonraki zaman çok katmanlı içine aşırı büyüyebilir) ve sürfaktan üretmek, bir dezavantajı düşük transepitel elektrik direnci değerleri ile sonuçlanan, ancak yine de hücreler arası (nano) parçacıklar translokasyon16karşıfonksiyonel bir bariyer sunan, 17,18.18

Akciğerlerde, fagositik ve profesyonel antijen sunan hücreler (yani makrofajlar ve dendritik hücreler) dahil olmak üzere, doğrudan hücre-hücre teması veya hücreler arası sinyal yoluyla iletişim kuranarak homeostaz'ı kontrol etmek ve sürdürmek için çeşitli bağışıklık hücresi popülasyonları vardır. Makrofajlar ve dendritik hücreler adaptif immün yanıtın kritik doğuştan gelen etkileri ve başlatıcıları19. Epiteliçinde veya altında bulunan dendritik hücreler antijenleri yakalamak için lümen epitel boyunca çıkıntılar oluşturabilir. Alveoler makrofajlar epitelin apikal yüzeyinde yer alır ve yabancı maddeye karşı ilk hücresel savunmayı temsil eden sentinel hücreler olarak hareket eder, bakteriyel, viral ve mantar enfeksiyonlarına karşı ilk hücresel savunmayı temsil eder. Onların henotypik plastisite hızla bu tür uyaranlara yanıt olarak proinflamatuar reaksiyonların indüksiyon sağlar yanı sıra anti-inflamatuar tetikleme içine kayması (yani, inhibitör) reaksiyonlar20.

İnsan alveoler epitel doku bariyerini simüle etmek için, apikal ve bazal tarafta insan kanı monosit kaynaklı makrofajlar (MdM) ve dendritik hücreler (MDDC) ile desteklenen A549 hücreleri ile üçlü bir kokültür modeli oluşturduk, sırasıyla17. ALI bu modelin Ekimi daha önce bildirilmiştir16, hatta kadar 72 h post-pozlama21. Karbon nanotüpler maruz kalma akut bağışıklık yanıtları önemli ölçüde hücre kültüründe ALI maruz olarak batık koşullara göre geliştirilmiş22. Coculture modeli, kültürlü ve ALI farklı malzemelere maruz, daha önce çinko oksit maruz kalma üzerine sitotoksisite, oksidatif stres ve inflamatuar yanıtları araştırmak için kullanılmıştır,23 grafen ile ilgili malzemeler24, altın nano tanecikleri25,26, karbon nanotüpler21, ve volkanik kül ve dizel egzoz parçacıkları27.

Ayrıca, bir in vitro insan akciğer modelinde bağışıklık efektörü hücreleri olarak makrofajlar ve dendritik hücrelerin önemli rolü teyit edilmiştir. Özellikle, modelde artmış proinflamatuar yanıt monokültür sistemlerine göre sadece bağışıklık hücrelerinin varlığında gözlenmiştir7. Birincil monosit tentüretilen bağışıklık hücrelerinin kullanımının olası sakıncaları, PBM'lerin sınırlı erişilebilirliğinin yanı sıra donör-donör varyasyonudur. Bu potansiyel dezavantajları bir çözüm olarak, burada sunulan hücre kültürü modeli derleme için taze izole PBMs28 kriyopreservation tanıtan bir protokoldür. Bu çalışmanın amacı, PBM'lerin insan buffy coats'tan izolasyonu da dahil olmak üzere 3Boyutlu insan alveolar epitel doku modeli montajını göstermektir. Proinflamatuar uyaranlara duyarlılık, yeni PBM'lerden farklı olan veya dondurulmuş/çözülmüş PBM'lerden farklı olan MDM ve MDDC'lerden oluşan modelle karşılaştırılır.

Test edilmemiş insan kanı örnekleri ile çalışmak, HIV (insan immün yetmezlik virüsü), hepatit B ve hepatit C gibi bulaşıcı hastalıkların potansiyel bulaşmasını önlemek için özel bakım gerektirir. Bu nedenle, eldiven, önlük, maske ve göz koruması gibi kişisel koruyucu önlemlerin kullanımı çok önemlidir ve iyi laboratuvar uygulama ilkelerine uygun olmalıdır. Bu korumalar, cilt veya mukoza zarlarının potansiyel olarak enfeksiyöz sıvılara maruz kalma riskini azaltır. Buna ek olarak, buffy coats ve PBM'lerin kullanımında çalışanlar için hepatit B virüsüne karşı aşılama zorunludur ve anti-hepatit B antikorlarının kan titrek düzeyleri 100 IU/L'nin üzerinde olmalıdır (ülkeye özgü yasal gerekliliklerin ele alınması gerekmektedir). Buna ek olarak, tüm çalışmalar biyogüvenlik seviyesi 2 laboratuvarlarında yapılmalıdır (ülkeye özel yasal gerekliliklerin ele alınması gerekmektedir). Tüm protokolü yürütürken, laboratuvar ortamında çalışmak ve atıkların işlenmesi de dahil olmak üzere memeli hücre kültürünün işlenmesiile ilgili standart sağlık ve güvenlik önlemleri benimsenmelidir.

Protocol

İnsan kanından izole edilen birincil monositleri içeren çalışma, Adolphe Merkle Enstitüsü için Federal Halk Sağlığı Ofisi İsviçre komitesi tarafından onaylanmıştır (referans numarası: 611-1, Meldung A110635/2).

1. Periferik kan monositlerinin (PBM) insan buffy paltolarından izolasyonu

NOT: Aşağıdaki bölümde, İsviçre'nin Bern kentindeki İsviçre Transfüzyon Merkezi'nden satın alınan 50 mL'lik bir buffy ceket çantasından bağışıklık hücrelerinin izolasyonu açıklanmaktadır.

  1. Reaktiflerin hazırlanması
    1. Tampon kat başına 100 mL manyetik ayırma tamponu hazırlayın: %0,5 [w/v] büyükbaş serum albumini (BSA; fosfat tamponlu salinde [PBS]) 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ile hazırlayın ve pH = 7,2, 0,22 μm'lik pore size'a göre steril filtreye ayarlayın. İşlem boyunca 4 °C'de tutun.
    2. Hücre kültürü ortamını (CCM) hazırlayın: RPMI 1640 %10 [v/v] fetal büyükbaş serum (FBS), %1 [v/v] L-glutamin (burada 2 mM L-glutamin) ve %1 [v/v] penisilin-streptomisin (burada, 100 adet/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin).
      NOT: Her reaktifin gerekli miktarı aşağıdaki adımlarda tohumlanacak hücre sayısına bağlıdır.
  2. PBM'lerin Yalıtımı
    NOT: Tüm cam ve plastik eşyalar kullanılmadan önce sterilize edilmelidir. Güvenlik nedenleriyle, plastik eşya kullanımı cam ile yaralanma riskini azaltmak için insan kanı örnekleri işleme önerilir.
    1. Buffy coat içeren çanta hortum ucunu açmak kesmek için makas kullanın.
    2. Çantanın içindekileri doğrudan iki konik santrifüj 50 mL tüpe (her biri ~25 mL) geçirerek, çantanın içindekileri torbanın kanalına dökerek buffy katını dağıtın.
    3. 50 mL hacimlere ulaşmak için tüplere PBS'yi yavaşça dökün veya pipetlayın. Tüpü yavaşça ters 3x çevirerek içeriğini karıştırın.
    4. Buffy coat-PBS karışımını her taze tüpte karışımın 25 mL'ini boruhaline getirerek dört yeni 50 mL konik santrifüj tüpüne bölün.
    5. 10 mL serolojik pipet kullanarak buffy coat-PBS karışımının altına 13 mL yoğunluk gradyan ortamı nı yavaşça yerleştirin. Dolu pipeti pipet tutucudan ayırın ve yoğunluk degrade ortamının buffy coat-PBS karışımına ek olarak sızmasını önlemek için pipetin üst açıklığı nızı hemen başparmakla takın.
      NOT: Üst açıklığı başparmakla tutarak, dolgulu pipeti konik santrifüj tüpünün altına yerleştirin, böylece yoğunluk gradyan ortamı yavaşça buffy coat-PBS karışımının altından akar ve pipetin içinde yoğunluk gradyan ortamının yaklaşık 1 mL'sini bırakır.
    6. Buffy coat-PBS karışımını içeren diğer üç tüple adım 1.2.5'i tekrarlayın.
    7. 1.000 x g ve 25 °C'de 20 dakika boyunca karışımları içeren dört tüpü de yavaş bir frenleme modunda santrifüj edin. Santrifüj için koruyucu kapaklı tutucular kullanın.
    8. Her tüpün kapağını açın, plazma ve trombosit içeren üst katmanı serolojik pipet kullanarak çıkarın ve biyolojik tehlike yaratan sıvı atık kabına atın.
    9. Plazma ve yoğunluk gradyan orta tabakalar arasında beyazımsı bulanık küçük bir fraksiyon (~2-3 mm kalınlığında) olarak görünen periferik kan mononükleer hücre tabakasını toplamak için serolojik bir pipet kullanın. Pelet in altında kırmızı kan hücreleri var. En alt tabakayı oluşturan eritrositleri aktarmaktan kaçının. Bunu dört tüp için de tekrarlayın.
      NOT: Periferik kan mononükleer hücreleri PBM ve lenfositlerden oluşur. PBM'ler daha sonra manyetik CD14+ ayrımı sırasında lenfositlerden ayrılacaktır.
    10. Dört tüpten iki 50 mL tüpe havuz periferik kan mononükleer hücreleri.
    11. PBS ile iki tüpü 50 mL'ye doldurun ve kapağını bir kapakla kapatın.
    12. Biyolojik tehlike arz eden sıvı atık kabına orijinal dört tüpten arta kalan eritrositleri ve plazmayı atın.
    13. 500 x g ve 18-20 °C'de 8 dk ve normal santrifüj hızında 18-20 °C'lik iki tüpü santrifüj edin.
    14. Santrifüjden sonra, bir serolojik pipet ile supernatant çıkarın ve biyolojik olarak tehlike sıvı atık kabına atın.
    15. Serolojik pipet kullanarak 5 mL PBS ile hücreleri yeniden askıya alın.
    16. Hücre süspansiyonlarını bir 50 mL konik santrifüj tüpe havuzlayın ve PBS ile 50 mL'ye doldurun.
    17. Trypan mavisi (45 μL) dışlama yöntemini kullanarak hücre sayacı olan hücreleri saymak için hücre süspansiyonunun 5 μL'sini kullanın.
    18. Pipet 10 μL trypan mavi-PBMs çözeltisi bir hücre sayacı odasına ve standart sayma protokolü ne göre hücre sayısını saymak. Toplam hücre numarasını hesaplamak için Denklem 1'i kullanın, CT.
      Equation 1
    19. Hücreleri sayarak, adım 1.2.13'te yapıldığı gibi 50 mL'lik tüpü santrifüj edin.
  3. CD14 pozitif seçimi
    1. Yavaşça her tüpün kapağını açın, sonra kaldırmak ve pelet rahatsız etmeden bir serolojik pipet kullanarak supernatant atın.
    2. Manyetik ayırma arabelleği hesaplanan miktarı (Denklem 2) ekleyin (burada, 1 x 107 toplam hücre başına tampon 80 μL) ve solüsyon yukarı ve aşağı borulama hücre pelet yeniden askıya.
      Equation 2
    3. Cd14+ manyetik boncukların karşılık gelen hacmini ve pipeti uygun hacimde Denklem 3 (burada, 1 x 107 toplam hücre başına 10 μL) kullanarak hesaplayın.
      Equation 3
    4. Yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın, kapağı kapatın ve çözeltiyi 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
    5. Kuluçka dan sonra, manyetik ayırma tamponu ile 50 mL'ye kadar tüpü doldurun.
    6. Merkez gibi adım 1.2.13 yapılır.
    7. Aspire ve hücre pelet rahatsız etmeden bir serolojik pipet kullanarak supernatant atın.
    8. Pipet manyetik ayırma tampon karşılık gelen miktarı (Denklem 4; burada, tampon 1 x 108 hücreleri başına 500 μL) ve yavaşça yukarı ve aşağı 3x pipetleme tarafından karıştırın.
      Equation 4
    9. Manyetik ayırma istasyonunu bir sterilizasyon maddesi ile püskürterek ve silerek dezenfekte edin. Manyetik ayırma için sütun ile birlikte laminar akış kaputuna yerleştirin.
    10. Manyetik ayırma sütununu manyetik alana yerleştirin ve yıkama ve etiketsiz hücreleri (yani atık) toplamak için doğrudan sütunun altına boş bir 50 mL konik santrifüj tüp yerleştirin.
    11. 3 mL manyetik ayırma tamponu boruyu koloniçine sokarak manyetik ayırma sütununu durulayın. Yordam boyunca sütunun kurumasına izin vermeyin.
    12. 15 mL konik santrifüj tüp ve pipet 1 mL manyetik ayırma tamponu hazırlayın.
    13. Hücre süspansiyonu (adım 1.3.8 olarak hazırlanmış) manyetik ayırma sütununa uygulayın. Filtrenin altındaki 50 mL konik santrifüj tüpte, içinden geçen etiketsiz hücreleri toplayın.
      NOT: Sütunun tıkanmasını önlemek için sütun başına 2 x 109 hücreyi geçmeyin.
    14. Sütun haznesi boşalır boşalır atmaz (yani hücreler sütundan geçtiğinde), serolojik pipet kullanarak 3 mL manyetik ayırma tamponu uygulayın ve sütundan geçmesine izin verin. Bu 3x tekrarlayın.
    15. Manyetik ayırma sütununu elle yavaşça çekerek manyetik ayırıcıdan çıkarın ve önceden borulanmış 1 mL manyetik ayırma tamponu içeren 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin (adım 1.3.12'de hazırlanır).
    16. Sütuna 5 mL manyetik ayırma tamponu ekleyin ve manyetik etiketli hücreleri, pistiyi kolona sıkıca iterek dışarı atın.
  4. MDM ve MDDC farklılaşması için reaktif hazırlığı
    1. Adım 1.2.17'de yapılan trypan mavi dışlama yöntemini kullanarak hücre sayacı olan hücreleri sayın.
    2. CcM veya FBS'nin gerekli hacimlerini aşağıdaki gibi hesaplayın: 1 x 106 hücre/mL (adım 1.5.1) hücre yoğunluğuna karşılık gelen CCM hacmi veya 0,9 mL'lik FBS başına 6 x 106 hücrelik bir hücre yoğunluğuna karşılık gelen FBS hacmi (adım 1.6.3).
      Equation 5
    3. Kapağı kapatın, tüpü santrifüje yerleştirin ve 1.2.13 adımda yapıldığı gibi santrifüj edin. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatant'ı çıkarın ve atın. Hücre tohumlama için adım 1.5'e veya hücre dondurma için adım 1.6'ya geçin.
  5. PBM tohumlama ve MDMs ve MDDC içine farklılaşma
    1. 1.4.2 (burada, 1 x 106 hücre/mL nihai konsantrasyon) olarak hesaplanan CCM hesaplanan hacminde hücre pelet ivezne ve 3x aşağı boru ile.
    2. Pipet serolojik pipet kullanarak ayrı konik santrifüj tüplerde MDM ve MDDC'ler ayırt etmek için amaçlanan hücre sayısı.
    3. Pipet, PBM'lerle CCM'ye ayırıcı faktörleri ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın. Ayırt edici faktörler aşağıdaki gibi uygulanır:
      1. MdDC'ler için: 10 ng/mL interlukin-4 (IL-4) ve 10 ng/mL granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) nihai konsantrasyonu.
      2. MDM'ler için: 10 ng/mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) nihai konsantrasyonu.
    4. Pipet ccm hücre süspansiyonları ek diferansiyel faktörler ile 6 kuyu plakaları içine iyi başına süspansiyon 3 mL dağıtarak (karşılık gelir 3 x 106 hücreleri / iyi, yani, 1 x 106 hücreleri /mL).
    5. 6 kuyu plakasını bir hücre kültürü kuluçka makinesine (37 °C, %5 CO2)yerleştirin ve CCM'yi yenilemeden 6 gün boyunca farklılaşmalarını sağlar.
      NOT: Farklılaşma, uygun teknikler kullanılarak belirlenmesi koşuluyla, buffy coats'un yerel kullanılabilirliğine ve deneysel kuruluma bağlı olarak 5-8 gün arasında değişmektedir (tartışma bölümüne bakın).
  6. PBM dondurma
    1. Bir kriyoprotektif ortamda hücre pelet resuspend (burada, FBS ve dimetil sülfoksit [DMSO; sitotoksik]) bir oranda 9:1 (v / v) önceden ısıtılmış FBS bir hacim pipetting tarafından. Bu, %10 DMSO (v/v) ilavesi göz önünde bulundurularak 6 x 106 hücre/mL'lik son hücre konsantrasyonuna karşılık gelmektedir.
    2. Laminar akış başlığında istenilen cryovial sayısını işaretleyin (örneğin, tarih, izolasyon kodu ve hücre sayısını kaydedin).
    3. Pipet 0.9 saf FBS hücre süspansiyon mL (burada, 6 x 106 hücreleri 0.9 mL FBS) her cryovial için. Daha sonra, yavaş yavaş pipet 0.1 mL DMSO ve cryovials yukarı ve aşağı 3x çevirerek süspansiyon iyi karıştırın.
    4. Cryovials bir hücre dondurma kabına aktarın ve hemen 24 saat için -80 °C ayarlayın.
    5. 24 saat sonra cryovialleri -80 °C'lik dondurucu ve kaptaki lerden çıkarın ve hücre depolaması için uygun sıvı nitrojen tankına yerleştirin.
  7. PBM çözülme ve MDM ve MDDC içine farklılaşma
    1. Bir su banyosunda (~20-30 dk) gerekli tüm reaktifleri 37 °C'ye ısıtın.
    2. Çözülmüş hücre sayısına karşılık gelen 6 kuyu plakasının uygun sayısını hazırlayın (burada, 1.8 x 107 hücre başına bir plaka, yani 3 kriyovial). Pipet 2 mL CCM her kuyuya aseptik koşullarda. PH'ın dengede durmasını sağlamak için plakaları 15 dakika boyunca kuvöze (% 5 CO2, 37 °C) yerleştirin.
    3. Sıvı nitrojen tankından dondurulmuş hücrelerle gerekli miktarda cryovial alın ve hücre süspansiyonunun düzgün bir şekilde çözülmesini sağlamak için 37 °C'lik su banyosunda (1-2 dk) yavaşça döndürün.
    4. Cryovial'ı su banyosundan çıkarın ve bir sterilizasyon maddesi ile dezenfekte edin, böylece ajan kapak ve O-halkası ile etkileşime girmez.

      NOT: Burada, tüm adımlar aseptik koşullar altında tamamlanmalıdır.
    5. Çözülecek cryovial sayısına karşılık gelen uygun sayıda 15 mL konik santrifüj tüp hazırlayın (burada, 6 x 106 hücre/tüp). Her tüpiçine önceden ısıtılmış CCM pipet 9 mL.
    6. Pipet yavaş yavaş (drop-by-drop) CCM içeren bir tüp içine cryovial içeriğini. Kapağı kapatın, her tüp için tekrarlayın ve düzenli bir santrifüj hızında 5 dk için 200 x g santrifüj.
    7. Pelet rahatsız etmeden supernatant atın.
    8. Serolojik pipet (hücre yoğunluğu 3 x 106 hücre/mL'ye karşılık gelen hücre yoğunluğu) kullanarak yukarı ve aşağı boru lar kullanarak önceden ısıtılmış CCM'nin 2 mL'sinde her tüpten (bir kriyonial den hücre içeren) peleti yeniden askıya alın.
    9. Her tüpten, pipet, daha önce hazırlanmış CCM'nin 2 mL'sini içeren 6 kuyudan iki kuyuya (kuyu başına 1 mL) yerleştirin ve 3 x 106 hücre/kuyu (1 x 106 hücre/mL'lik son konsantrasyona karşılık gelen) bir hücre yoğunluğuna ulaşın. Bunu diğer tüm tüpler için tekrarlayın.
    10. Bölüm 1.5.3'te açıklandığı gibi farklılaşmaya devam edin.
    11. 6 kuyu plakasını bir hücre kültürü kuluçka makinesine (37 °C, %5 CO2)yerleştirin ve CCM'yi yenilemeden 6 gün boyunca farklılaşmalarını sağlar.

2. İnsan alveolar epitel dokusunun üçlü hücre likültür modeli

NOT: Bu bölümde 12 kuyu plaka eklerkarşılık gelen hacimleri ve hücre numaraları talimatlarısağlar. Şekil 1, model derlemesi için önerilen bir zaman çizelgesini özetler.

  1. Epitel hücre (A549 hücre hattı) tohumlama
    1. Kültür tedarikçi (ATTC) tarafından sağlanan tavsiyelere göre epitel hücreleri. Kısaca, CCM'deki hücreleri %80 hücre birleşimiile alt kültüre edin (yaklaşık olarak, haftada 2x-3x).
      NOT: Alt kültür A549, 5-25 geçiş aralığında A549 hücrelerini kullanarak, coculture model kompozisyonundan önce en az dört pasaj için.
    2. Önceden ısıtılmış CCM'nin 1,5 mL'lik pipeti 12 kuyu plakasına (kuyu sayısı istenilen sayıda modele karşılık gelir).
    3. Sterilize cımbız kullanarak 12 kuyu plaka kuyuları içine ayrı 12 kuyu hücre kültürü ekler yerleştirin.
    4. Hücreleri alt ekim protokolüne göre bir şişeden ayırın (örneğin, bir ayırma maddesi kullanarak, 1.2.13 adımda yapıldığı gibi ajanın santrifüjünü çıkartın). A549'un son hücre konsantrasyonuna karşılık gelen CCM'nin uygun hacminde yeniden askıya alın (burada, 50 x 104 hücre/mL; kesici uç başına 0,5 mL hücre süspansiyonu, yani 25 x 104 hücre/insert, 27,8 x 104 hücre/cm2tohumlama yoğunluğuna karşılık gelir).
    5. Pipet 0,5 mL hücre süspansiyonu (yani, 25 x 104 hücre/insert) 1 mL pipet kullanarak kesici uç apikal tarafına.
    6. Plakaları kapaklarla kaplayın ve 4 gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine (37 °C, %5 CO2)yerleştirin.
      NOT: A549 hücrelerinin faz kontrastlı mikroskop altında birleştiği yerdüzenli olarak kontrol edin.
  2. MDDC tohumlama
    1. MdDC içeren 6 kuyu plakaları bekar hücreleri ile CCM aspire.
    2. Her kuyuya 1 mL taze önceden ısıtılmış CCM ekleyin.
    3. Bir hücre kazıyıcı kullanın, her kuyudan bağlı MdDC'leri ayırın (kazıyın), kuyuları mevcut 1 mL CCM 3x ile nazikçe yıkayın ve bunları tek bir konik santrifüj tüpünde birleştirin.
    4. 10 μL hücre süspansiyonu ve 10 μL trypan mavi çözeltisi kullanarak trypan mavi dışlama yöntemini kullanarak hücre sayacı olan hücreleri sayın.
    5. Adım 1.2.13'te yapıldığı gibi hücre süspansiyonuna santrifüj edin.
    6. Yeniden askıya alma için gereken CCM hacmini hesaplayın (Denklem 5):
      Gerekli MDDC yoğunluğu = 42 x 104 hücre/mL; her kesici uç 6,3 x 104 hücre gerektirir, bu da 7 x 104 hücre/cm2'lik bir çekirdek hücre yoğunluğuna karşılık gelir (burada, 2.2.10 adımda 0.9 cm2'ye 150°L eklenir.).
      Hücre geri süspansiyonu için CCM hacmi (Vm; Denklem 5):
      Equation 8
    7. CcM'yi 12 kuyu plakasının üst haznesinden, kesici uçlarda büyüyen A549 ile hafifçe aspire edin ve atın.
    8. Sterilize cımbız kullanarak steril petri kabında Baş aşağı pozisyonda A549 hücreleri ile ekler yerleştirin. PBS ile konik bir santrifüj tüpü (50 mL) hazırlayın ve bir hücre kazıyıcıönceden nemlendirin.
    9. Kesici uçların gözenekleri ile büyümesi gereken kesici uçların bazal yüzeyinden (yani baş aşağı pozisyondaki üst kısmı) A549 hücrelerini kazıyın.
      NOT: Kazıyıcıyı pbs (bir tüpiçinde hazırlanmış) ile tek tek numuneleri kazımak arasında durulayın ve işlem boyunca ıslak tutun.
    10. Santrifüj üzerine (adım 2.2.5), aspire ve supernatant atın, sonra CCM hesaplanan miktarda (adım 2.2.6) ve pipet yukarı ve aşağı 3x MDDC pelet yeniden dağıtmak.
    11. Pipet 150 μL her kesici uç üstüne hücre süspansiyon böylece kesici uç tüm bazal yüzey eşit sıvı ile kaplı dır ve kabarcıklar içermeyen.
    12. 70 dakika boyunca bir hücre kültürü kuluçka bir kapak ve yer ile çanak kapağı. Hücre kültür plakalarından CCM aspire (kesici uçlar başlangıçta yerleştirilmiş olan), biyolojik bir sıvı atık atmak ve pipet 1.5 mL taze CCM her kuyuiçine. Kapağı nı bir kapakla kapatın ve hücre kuluçka makinesine yerleştirin (37 °C, %5 CO2).
      NOT: Hücrelerin kurumasını önlemek için yukarıda belirtilen süreyi aşmayın.
    13. Kuluçkadan sonra, her kesici ucu sterilize edilmiş cımbızla dikkatlice tutun ve sıradan bir pozisyonda CCM içeren plakalara yerleştirin. Plakayı bir kapakla kapatın ve hücre kuluçka makinesine geri döndürün (37°C, %5 CO2).
  3. Makrofaj (MDM) tohumlama
    1. Önceden farklılaştırılmış MDM içeren 6 iyi plaka alın.
    2. 6 kuyu plakası halinde yetiştirilen bekar MDM'lerle CCM'yi aspire edin ve atın ve her kuyuda 1 mL taze ısıtılmış CCM pipet.
    3. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, yapışkan MDM'leri tek tek kuyulardan nazikçe çıkarın (MDDC'ler için adım 2.2.3'te yapıldığı gibi).
    4. Pipet 10 μL trypan mavisi bir kuyuya veya tüpe ve 1:1 (v/v) son seyreltme elde etmek için MDM süspansiyon 10 μL ekleyin. Uygun sayma protokolünü kullanarak MD Sayısını sayın.
    5. Adım 1.2.13'te yapıldığı gibi hücre süspansiyonuna santrifüj edin.
    6. Gerekli hacmi hesaplayın (Denklem 6):
      Gerekli MDM yoğunluğu = CCM'de 2,5 x 104 hücre/mL (burada, her kesici uç 0,5 mL CCM'de 1,25 x 104 hücre gerektirir ve bu hücreler 1,4 x 104 hücre/cm2'likbir çekirdek hücre yoğunluğuna karşılık gelir).
      Equation 10(6)
    7. Santrifüj üzerine, aspire ve supernatant atın, CCM hesaplanan miktarda (adım 2.3.6) VE pipet yukarı ve aşağı 3x olarak MDM pelet yeniden dağıtmak.
    8. Hücre kültürünün duvarına MDM süspansiyonunun 0,5 mL'lik (adım 2.3.7'de hazırlanmış) inceltme pipetleri, 1 mL'lik pipet kullanarak A549 ve MDDC'ler (doğrudan epitel hücrelerinde değil) ile yerleştirilir. Kapak plakaları kapak ve bir hücre kültürü kuluçka yeri (37 °C, 5% CO2) için 24 saat.
  4. Coculture modelinin hava-sıvı arabirimine transferi (ALI)
    1. Bir hücre kültürü kuluçka makinesinde biraraya getirilen modelin 24 h (±2 h) kuluçka süresinin bitiminde, hücre kültürünün hem apikal hem de bazal kısımlarından ve kuyulardan CCM aspire edin ve atın.
    2. Sterilize cımbız kullanarak, kuyulardan ve pipetten 0,6 mL taze önceden ısıtılmış CCM'den ayrı kesici uçlar 1 mL pipet kullanarak her kuyuya kaldırın. Ekleme ucunun apikal tarafına CCM eklemeyin.
    3. Kapak plakaları kapak ve bir hücre kültürü kuluçka yer (37 °C, 5 % CO2) 24 saat daha fazla kullanım için.

3. Seçilen pozitif kontrollere maruz kalma (proinflamatuar yanıtı indükleyen uyarıcılar)

NOT: Kokültür modellerinin bilinen proinflamatuar stimülatoksin endotoksin lipolysakkarit (LPS)7 ve proinflamatuar sitokin tümör nekroz faktörü α (TNF-α)7'ye maruz kalma modelinin duyarlılığını göstermek için kullanılır. Ayrıca, bir deterjanmaruz kalma (Triton X-100) laktat dehidrogenaz duyarlılığını doğrulamak için kullanılır (LDH) titreşme.

  1. Pozitif kontrol çözümlerini hazırlayın: LPS stoku (distile suda 1 mg/mL), TNF-α stoku (distile suda 100 μg/mL) ve PBS'de Triton-X 100 (%2 [v/v]).
  2. ALI koşullarında coculture modelinin 24 saat kuluçka üzerine, aspire ve bazal bölmesinden supernatant atın. Sterilize cımbız kullanarak, kuyulardan tek tek kesici uçları ve 0,6 mL taze önceden ısıtılmış CCM'yi her kuyuya kaldırın.
  3. KOnik santrifüj tüplerinde CCM'deki stokları seyrelterek bireysel pozitif kontroller çalışma çözümleri hazırlayın: 1 μg/mL LPS, 1 μg/mL TNF-α ve %0,2 Triton-X 100. Hacimler test edilen kesici uç sayısına karşılık gelir (burada, 100 μL/insert). 3x yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak çözümleri iyice karıştırın.
  4. Hücre kültürü kesici uçduvarı üzerine yavaşça boru takarak her pozitif kontrol çözeltisinin 100 μL'sini uygulayın. 24 saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesinde (37 °C, %5 CO2)bir kapak ve yer ile kuyu plakasını kapatın. Kuluçka üzerine, cımbız kullanarak tek tek ekler tutarak kesici ve kesici uç apical tarafında sıvı atın.
  5. CcM'yi bazal bölmelerde toplayın ve daha fazla LDH analizi için 4 °C'de saklayın, hücre zarı yırtılma aracılı sitotoksisiteyi belirterek ve/veya 2) enzime bağlı immünosorbent tahlil (ELISA) yoluyla protein salınımının daha fazla analizi için -80 °C'de saklayın. Kit tedarikçisi önerilerine göre tahlilleri çalıştırın.
  6. CCM'nin çıkarılması üzerine, uçları PBS 3x ile yıkayın ve hücre kültürü ndeki hücreleri %4 [w/v] paraformaldehit (PBS'de, oda sıcaklığında 15 dk) her iki kesici uç tarafının PFA çözeltisi ile iyi bir şekilde kaplanmasını sağlayarak düzeltin. Daha sonra PFA kaldırmak için PBS ile 3x yıkayın. Daha fazla immünboyama için PBS'ye batık numuneleri 4 °C'de saklayın (bu yöntemin bir örneği daha önce17kez açıklanmıştır).

Representative Results

Alveoler epitel hücreleri ve bağışıklık hücrelerinden oluşan insan akciğer kokültür modelleri, taze veya dondurulmuş MKH'lerden ve MdM progenitorlarından (burada, insan periferik kan kaynaklı monositler) bir araya getirildi. Şekil 1'desunulduğu gibi, A549 hücreleri monosit izolasyonu/erimeiçeren ilk bölümden 3 gün sonra tohumlandı. 6 günlük farklılaşmadan sonra, farklılaştırılmış MKH'ler yuvarlak şekilli olarak ortaya çıkmış, MdC'ler ise gözlemlenebilir çıkıntılarla daha uzun bir şekil oluşturmuştur. Ayrıca özellikle taze monositlerden ayırt edildiğinde aglomera olarak ortaya çıktılar (Şekil 2, Şekil 3). Epitel hücreleri, kokültürler bir araya getirildiğinde membran uçlarında 3 günlük büyümeden sonra yoğun bir hücre hücresi oluşturmuştur(Şekil 4). 24 saat montaj ve 24 saat ali koşullarına maruz kaldıktan sonra, kokültürler pozlama için hazırlandı.

3D hücre kültürü modellerinin duyarlılığı, daha önce29olarak açıklandığı gibi, sözde ALI yaklaşımı kullanılarak bilinen proinflamatuar uyaranlara maruz kalındığında araştırılmıştır. Proinflamatuar uyaranlar, LPS ve TNF-α, düşük hacimlerde (100 μL) hava maruz hücre modelinin apikal yüzeyine eklendi. Buna paralel olarak, sitotoksisitenin bir ölçüsü olarak membran rüptürü yokluğu LDH tsay ile değerlendirildi. Bazal kompartmanın CCM'sinde LDH salınımında önemli bir artış membran rüptürü için pozitif kontrole maruz kalındığında gözlendi, triton-x 100 deterjanı(Şekil 5). Bu sonuçlar modelin sitotoksik bir maddeye duyarlılığını kanıtlarken, TNF-α veya LPS ile apikal stimülasyon da LDH salınımında bir artış gözlenmedi.

Taze veya önceden dondurulmuş PBM'lerle birleştirilmiş numunelerde LDH'nin farklı ölçülen değerlerinin olası bir nedeni numune depolamasına atfedilebilir. Taze PBM'lerden alınan numuneler -80 °C'de daha uzun süre saklandı; bu nedenle LDH enziminin aktivitesi düşebilir. Özellikle, LDH CCM sadece 4 gün için istikrarlı; bu nedenle, supernatants topladıktan sonra en son 2 gün tayini gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Alternatif olarak, toplama dan sonra doğrudan supernatants dondurmak mümkündür. Ancak, donma LDH enzimatik aktivitesini azaltabilir dikkate almak önemlidir.

Proinflamatuar mediatörlerin (burada TNF-α ve interlökin6 [IL-6] ve 8 [IL-8]) bazal CCM'ye salgıları ELISA ile ölçüldü. Il-6 ve IL-8 salınımında istatistiksel olarak anlamlı (p < 0.05, tek yönlü ANOVA) artışlar, hem LPS hem de TNF-α- tedavi edilen örneklerde, tedavi edilmeyen hücrelere göre ve her iki PBM kaynağından toplanan hücre kültürü modellerinde gözlendi (Şekil 6). Bazal CCM'de test edilen tüm sitokinlerin konsantrasyonları (pg/mL) taze PBM'lerden oluşan kokültürlerde daha yüksek olmasına rağmen, iki kokültür ve monokültür arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildi (p > 0.05)(Şekil 6). 2D epitel hücre kültürüne göre kokültür modellerinin katma değerini doğrulamak için, A549 monokültürleri de LPS veya TNF-α'ya maruz kalmıştır. Beklendiği gibi, A549 monokültürlerinden araştırılan tüm arabulucuların serbest bırakılması her iki ortak kültür modeline göre daha düşüktü; ancak aralarındaki fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (p > 0.05, tek yönlü ANOVA).

3Boyutlu insan alveoler epitel doku bariyerinin hücresel morfolojisi konfokal lazer tarama mikroskopisi (LSM) ile değerlendirildi. Her modelin bileşimini görselleştirmek için, coculture modelleri (MDM) içindeki makrofajlar olgun makrofaj belirteci 25F9 ile boyanmıştır. MDDC'ler CD83 ile boyandı, hangi aktif dendritik hücreler için önemli bir belirteçtir30. Hücresel morfoloji ile ilgili olarak, çözülmüş PBM kullananlara göre taze PBM'lerden MDM ve MdDC kullanan kokültür modelleri arasında fark gözlenmemiştir. LpS- ve TNF-α-maruz kokültürlerde, her ikisi de taze ve dondurulmuş bağışıklık hücrelerinden oluşan, LSM görüntülerinde bozulmuş epitel tabakası gözlendi, ki bu tedavi edilmeyen hücrelerde durum böyle değildi(Şekil 7, Şekil 8).

Figure 1
Şekil 1: Protokolün şematik zaman çizelgesi. 3D coculture modeli hazırlama, montaj ve uygulama sunumu (test edilmiş bir maddeye maruz kalma). ALI = hava-sıvı arabirimi, MDDCs = monosit kaynaklı dendritik hücreler, MDM = monosit kaynaklı makrofajlar, PBM = periferik kan monositleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: MDM'ler ve MDDC'ler taze PBM'lerden ayırt edilir. Farklılaştırılmış (A) MDM'lerin faz-kontrast mikroskobu görüntüsü ve (B) MDDK'lar taze PBM'lerden (hücre izolasyonundan 6 gün sonra). MKH'ler yuvarlak şekilliyken, MKH'ler genellikle aglomera olarak gözlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: MDM'ler ve MDDC'ler dondurulmuş PBM'lerden ayırt edilir. Çözülmüş PBM'lerden(A)MDM'lerin ve (B)MDDC'lerinin faz-kontrast mikroskobu görüntüsü (çözülmeden 6 gün sonra). MDM'ler yuvarlak şekillidir, ancak bazı uzamış hücreler gözlemlenebilir. MDC'ler de çıkıntılarla yuvarlak şekilli görünür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Membran uçlarında epitel hücreleri büyüme. Faz kontrastlı mikroskopi görüntüsü confluent A549 bir membran eklemek üzerinde büyüyen 4 gün tohumlama dan sonra, hücrelerin yoğun bir tabaka oluşturan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Membran rüptürü esaslı (LDH) tahkikat ile incelenen sitotoksisite sonuçları. Veriler işlenmemiş hücrelere göre kat artış olarak sunulur (ortalama ± SD, n = 3, yıldız işareti işlenmemiş hücrelere göre istatistiksel olarak anlamlı bir artışı gösterir, **p < 0.01, ****p < 0.0001). Yeşil modellerde yeni PBM'lerden MdM'ler ve MdDC'ler temsil edilir ve çözülmüş PBM'lerden monte edilen mor modellerde temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Kokültürlerde ve monokültürlerde proinflamatuar reaksiyonlar. Proinflamatuar mediatörler (TNF-α, IL-6 ve IL-8) LPS veya TNF-α ile 24 saat meydan okuma üzerine konik lerde serbest. Veriler işlenmemiş hücrelere göre sunulur (ortalama ± SD, n = 3, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001). Yeşil modellerde yeni PBM'lerden MdM'ler ve MdDC'ler temsil edilir ve çözülmüş PBM'lerden monte edilen mor modellerde temsil edilir. Gri, A549 monokültürlerini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Taze bağışıklık hücrelerinden oluşan kokültürlerin morfolojisi. Yeni PBM'lerden MDM ve MDD'ler kullanarak modelin apikal kenarlarının xz projeksiyonları ile kokültür modelinin apikal ve bazal yanlarının LSM görüntüleri. Beyaz ok MDM'yi, yeşil ok ise MDDC'yi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Donmuş bağışıklık hücrelerinden oluşan kokültürlerin morfolojisi. Kokültür modelinin apikal tarafının lsm görüntüleri karşılık gelen xz projeksiyonları ile ve çözülmüş PBM'lerden MDM ve MDD'ler kullanarak modelin bazal tarafı. Beyaz ok MDM'yi, yeşil ok ise MDDC'yi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Kimyasallar ve ilaçlar da dahil olmak üzere yeni malzemelerin ortaya çıkan üretimi, giderek prediktif in vitro modeller için ihtiyacı artırır. Hayvan testi nin üç prensibine uymak için32, in vitro hücre modelleri, bir ilacın veya malzemenin eyleminin mekanizmalarını açıklamak için değiştirme ve azaltma yönü ile ilgili güçlü araçlar haline gelmiştir8,9,10,11. Burada sunulan ya taze izole veya daha önce dondurulmuş monositler çözülmüş bağışıklık hücreleri kullanarak çok hücreli modeli montaj ayrıntılı bir protokoldür. Ayrıca ali modelinin ekimi açıklanan. Son olarak, protokol proinflamatuar uyaranlara maruz kalma bir örnek göstermektedir ve taze veya dondurulmuş monositler içeren iki modelin yanıtını karşılaştırır.

Geleneksel su altı maruziyeti7,22,31ile karşılaştırıldığında ALI koşullarında yetiştirilen ve maruz kalan modellerin gelişmiş karmaşıklığının katma değerini doğrulamak ve haklı çıkarmak için çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Kokültürlerde epitel hücrelerinin monokültürlerine göre daha yüksek proinflamatuar yanıtın gözlemi bir önceki çalışmayı doğrulamaktadır. Çalışma sunulan coculture modeli kullanılan (LPS ile uyarılmış) ve A549 monokültür eşdeğermodeli7 ile karşılaştırıldığında TNF ve IL1B gen ekspresyon düzeylerinde daha yüksek bir yanıt gösterdi. Diğer taraftan, her iki modelde de ölçülen proinflamatuar mediatör salınım değerleri içinde A549 monokültürlerine göre daha yüksek varyasyonlar saptamıştır. Bu biyolojik tekrarlar içinde farklı donörlerin bağışıklık hücrelerinin kullanımı ile açıklanabilir (buffy kat) biyolojik tekrarlar içinde (yani, bir tekrarı, bir donör), daha önce gösterildiği gibi7. İstenirse, çoğaltmalar arasındaki varyasyonlar 1) aynı donörveya 2) farklı donörlerden pbms havuz hücreleri dondurma, daha sonra her tekrarı aynı havuzun sonraki kullanımı çözülmüş PBMs kullanılarak aşılabilir. Daha fazla biyolojik tekrarlar da dahil olmak üzere tavsiye edilir.

Hücre dondurma tekniği kritik bir adım olarak kabul edilebilir; ancak, fenotipik ve fonksiyonel analiz için hücreleri korumak için ortak bir laboratuvar prosedürüdür. Çeşitli çalışmalar dondurulmuş PBM'lerin kalitesinin hayatta kalmaları için hayati önem taşıdığını ve uygun bir dondurma tekniğinin aynı hücrelerle sonraki tahlillerin başarısının anahtarı olduğunu göstermiştir28,32. Protokolün modifikasyonu, genellikle buffy coats'un kullanılabilirliği genellikle sınırlı olduğundan, deneysel kurulumda esneklik sağlayan PBM'lerin dondurulması yla gerçekleştirilebilir. Dondurulmuş PBM'leri (birkaç şişede) taze izole olanlar üzerinde kullanmanın bir diğer avantajı da, 1 yıl sonra bile sonraki deneylerde kullanılabilmeleridir. Bu, bir deneyde istenilen veya gerekli bir parametre ise donörden donöre değişkenlik konusunu azaltır.

13 aya kadar yapılan laboratuvarlar arası karşılaştırmanın sonuçları, pbm'lerin sıvı nitrojen tankında düzgün bir şekilde depolandığında hücre canlılığı veya hücre geri kazanımı üzerinde herhangi bir etkisi olmaksızın uzun bir süre boyunca kullanılabileceğini göstermektedir33. Daha uzun depolama süreleri (1 yıldan fazla) bir deneme gerçekleştirmeden önce hücre canlılığı ve hücre duyarlılığının dikkatli bir şekilde doğrulanması yla mümkün olabilir. Ayrıca, sıvı nitrojen tankındaki sıcaklık her zaman sabit kalmalıdır. Kriyopayrılmış PBM'lerin canlılığını etkileyen ana faktör DMSO konsantrasyonu olarak bulundu, optimal konsantrasyon %10-20 (v/v)28idi. Donma potansiyel zararlı etkilerini en aza indirmek için, farklı protein kaynakları, FBS veya BSA (% 40'tan %100%34'ekadar geniş bir konsantrasyon aralığı ile) genellikle hücre sağkalımını artırabilir doğal koruyucu bileşenler olarak dondurma ortamına eklenir.

DMSO'nun yüksek sitotoksik potansiyeli nedeniyle, önce FBS'de PBM'lerin dağılması, daha sonra FBS'de dağılmış olan PBM'lere DMSO eklenmesi önerilir. Özellikle, yüksek FBS konsantrasyonları (>40%) hücre canlılığında herhangi bir iyileşme göstermedi, aynı zamanda, onlar hücrelere zarar vermedi28. Bununla birlikte, donma monositler sınırlı buffy kat kullanılabilirliği sorunları nın üstesinden gelmek için olası bir yaklaşımdır. Ancak, taze PBM'lerden MdDC ve MdM kullanımı isteniyorsa, bağışıklık hücreleri ayırt edilebilir ve izolasyondansonra 5-8 gün kullanılabilir 7,16,17,35,36,37. Deneysel planlama izin veriyorsa, hem MDDC'lerde hem de MdM'lerde en az 6 günlük farklılaşma önerilir. Ancak, aynı deneydeki farklı tekrarlar arasındaki tutarlılık ve belirli yüzey işaretleyici ifadelerinin rutin denetimleri çok önemlidir. Farklılaşma süresinden sonra LPS gibi proinflamatuar bir uyarıcıya yanıt da düzenli olarak kontrol edilmelidir.

A549 hücre hattı kullanarak birçok araştırma ALI ya bir monokültür olarak ya da diğer hücre tipleri ile birlikte yapılmıştır (makrofajlar, dendritik hücreler, veya fibroblastlar) içine 3D coculture modeli22,24,29,38. Bu 3D coculture modeli kullanılarak, sitotoksisite, oksidatif stres, ya da proinflamatuar etkileri (nano-)malzemelerin kadar araştırılmıştır 72 h1,17,21,24,29. Modelin in vivo dokuya olan benzerliği daha önce model16'nınkonfokal lazer tarama görüntülemesine dayanarak araştırılmıştır. Modeli oluştururken, hem hücre çoğalması (burada sunulan modelde A549 etkileyebilir) hem de birincil (çoğalmayan) bağışıklık hücrelerinin performansı (burada, MdDcs ve MKH) dikkate almak önemlidir. Tüm CD14 pozitif monositlerin MKH'ler ve MKH'ler arasında ayrım yapmamaları ve hücrelerin hem bağlı hem de askıda formlarda bulunabildiği göz önünde bulundurulmalıdır. Coculture assembly (burada, her iki hücre türleri mevcut epitel tabakası eklemek gerekir) doğasına göre, her iki bağışıklık hücresi türünün sadece yapışkan alt popülasyonları kullanılması tavsiye edilir. Buna ek olarak, monositler, MDDC ve MDM monokültür duyarlılığının LPS'ye karşı rutin analizleri ve belirli yüzey belirteçlerinin (CD14, CD163, CD86, CD93 veya CD206, veri gösterilmez) ifadesi, 6 ve 7 günlük farklılaşmanın optimum zaman noktaları olduğunu ileri sürmüştür.

İnsan akciğerlerinde alveoler epitel hücreleringerçekçi bir sayı ~ 160.000 hücreleri / cm2karşılık olsa da, modelde sayılan A549 hücrelerinin sayısı ~ 1.000.000 hücre / cm2 9 gün sonra eklemek16,18kültürlü . Bu nedenle, bu in vitro modelsınırlamaları dikkate alınması gerekir. İlk olarak, epitel hücrelerinin yoğunluğu büyüyen membran üzerinde bir konfluent tabaka oluşturmak için yeteneğine dayalı kurulmuştur. A549'un, epitel tip I hücrelerinin aksine, kütip formunda epitel tip II hücreyi temsil ettiğini belirtmek de önemlidir. Diğer taraftan, gerekli sayıda bağışıklık hücresi literatüre göre kurulmuş ve bu protokolde hücre numarası/yüzey alanı39,40,41olarak sunulmuştur. 400 hücre/mm2 (4 hücre/cm2)aralığındaki MdDC'lerin hücreyoğunluğu, in vivo çalışmalardan bildirilen 500-750 hücre/mm2 (5- 7 hücre/cm2)sabit durum hücre yoğunluğu ile karşılaştırılabilir39. Bu modeldeki MdM yoğunluğu insan alveolar bölgede in vivo durum40aynı aralık içindedir.

Olgun makrofaj belirteç boyama (25F9) hem apikal tarafta (MdM'lerin bulunduğu yerde) hem de bazal tarafta (yani dendritik hücrelerin yerinde) gözlendi. Membran ekler gözenekleri ile bağışıklık hücrelerinin translokasyonu mümkündür ve aynı zamanda bu model kullanılarak gözlenmiştir16, boyama yoğunlukları gözlenen farklılıkları açıklayabilir. Ancak, başka bir olası açıklama olgun makrofaj belirteci de dendritik hücrelerde ifade edilebilir, ancak ifade son derece donör özgü42. Ayrıca, 25F9 ifadesinin yoğunluğu MDM'lerde çok daha yüksektir(Şekil 7, Şekil 8). Her iki proinflamatuar uyaran (LPS ve TNF-α) her iki kokültürde pulmoner epitel bariyerin bütünlüğünü etkilemiştir(Şekil 7, Şekil 8). Bu proinflamatuar sitokinler ve bakteriyel ürünler epitel bariyerlerin bütünlüğünü bozan gösteren önceki yayınlar43,,44 dayalı bekleniyordu.

İnsan alveolar epitel 3D çok hücreli modeli, kurulan ve daha önce karakterize17, biyolojik yanıtları değerlendirmek için güçlü ve yararlı bir araç olarak hizmet vermiştir (yani, akut proinflamatuar reaksiyonlar, oksidatif stres yanıtı, parçacık dağılımı, ve hücresel iletişim) in vitro21,24,25,45. Sonuçlar, kokültür modellerinin proinflamatuar uyaranlara (burada, LPS ve TNF-α) karşılığını doğrulamaktadır. Yanıt biraz taze PBMs bağışıklık hücreleri kullanılarak artmıştır; ancak, taze vs çözülmüş PBM'ler kullanarak cocultures arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu. Ayrıca, her iki kokültür modelinin proinflamatuar reaksiyonları aynı (ALI) koşullar altında yetiştirilen epitel hücre monokültürlerinden daha yüksekti. Özetle, protokol, MDM ve MDD'lere farklılaşmak için taze veya çözülmüş PBM'ler kullanarak 3Boyutlu bir insan alveoler epitel kokültür modelinin bir araya getirin. Her iki modelin de proinflamatuar uyaranlara karşı son derece duyarlı olduğu gösterilmiştir; bu nedenle, potansiyel tehlike ve toksisite değerlendirmeleri için güçlü araçlar olarak hizmet verebilir.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar, Şekil 3'teki coculture programı için Dr. Miguel Spuch-Calvar'a ve eleştirel okuma için Dr. Bedia Begüm Karaocak'a teşekkür eder. Bu çalışma, 760813 sayılı hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı ve Adolphe Merkle Vakfı tarafından PATROLS projesi tarafından desteklenmiştir. B.D. mali destek için Peter und Traudl Engelhorn vakfı sayesinde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benchmark microplate reader does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland
Cell culture Incubator does not have to be specific
Cell freezing container (for example Mr. Frosty) does not have to be specific
Centrifuge does not have to be specific
Confocal laser scanning microscope does not have to be specific, for example Zeiss LSM 710 meta
Heamatocytometer, or automatic cell counter does not have to be specific
Laminar bio-safety hood class II does not have to be specific
MultiStand Macs (Macs Cell Separator) Miltenyi, Germany 130-042-303
pH meter does not have to be specific
Phase contrast inverted light microscope does not have to be specific
Pipette boy, pipettors (different volumes) do not have to be specific
Scissors do not have to be specific
Vacuum pump does not have to be specific
Water bath does not have to be specific
Disposable small equipment/glassware Catalogue Number
15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes does not have to be specific
6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile Falcon, Switzerland 353046 and 353043
Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 μm pore size Falcon, Switzerland 353181
Cell scrapper does not have to be specific, for example VWR, Switzerland 353085
Cryovials do not have to be specific
Glass autoclaved Petri Dishes do not have to be specific
LS Columns Miltenyi, Germany 130-042-401
Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 μm pore size does not have to be specific, for example VWR, Switzerland 10040-446
Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL) does not have to be specific
Sterile pipettes do not have to be specific
Chemicals
Bovine serum albumine (BSA) Sigma-Aldrich, Switzerland A7030-100g
CD14+ MicroBeads human - magnetic beads Miltenyi, Germany 130-097-052
Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red Gibco, Switzerland 25300054
Density gradient medium Lymphoprep Alere Technologies AS, Norway 1114547
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich, Switzerland D2438
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich, Switzerland E6758-100g
Fetal bovine serum (heat inactivated) Gibco, Switzerland 10270-106
Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade Miltenyi, Germany 130-093-864
Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade Miltenyi, Germany 130-095-373
Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade Miltenyi, Germany 130-096-485
L-glutamine Gibco, Switzerland 25030-024
Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli Sigma-Aldrich, Switzerland 4524-5mg
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich, Switzerland 158127
Penicilin-Streptomycin Gibco, Switzerland 15140-122
Phosphate Buffer Saline (PBS) Gibco, Switzerland 10010-015
Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI) Gibco, Switzerland 42401-018
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Switzerland T8787
Trypan blue solution (0.4%) Sigma Aldrich, Switzerland
Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) Immunotools 11343015
Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche, Switzerland 11644793001
Human IL-6 DuoSet ELISA R&D, Biotechne, Switzerland DY206
Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA R&D, Biotechne, Switzerland DY208
Immunostaining
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 μg/mL Sigma-Aldrich, Switzerland 10236276001
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 μg/mL Abcam, UK ab150115
Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 μg/mL Agrisera, Sweden AS09 633
Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 μg/mL eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland 14-0115-82
Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 µM Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland R415
Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution Abcam, UK ab244204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rothen-Rutishauser, B., Blank, F., Mühlfeld, C., Gehr, P. In vitro models of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of particulate matter. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (8), 1075-1089 (2008).
  2. Giard, D., et al. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. Journal of National Cancer Institute. 51 (5), 1417-1423 (1973).
  3. Ochs, M., Weibel, E. R., et al. Ch. 2: Functional Design of the Human Lung for Gas Exchange . Fishman's Pulmonary Diseases and Disorders, 5e. Grippi, M. A., et al. , McGraw-Hill Education. (2008).
  4. Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 Cell Line as a Type II Pulmonary Epithelial Cell Model for Drug Metabolism. Experimental Cell Research. 243 (2), 359-366 (1998).
  5. Guo, X. Y., Lu, M., Chen, X. Q., He, F. D., Li, A. Correlation study of biological characteristics of non-small cell lung cancer A549 cells after transfecting plasmid by microbubble ultrasound contrast agent. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 9 (6), 582-586 (2016).
  6. Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS ONE. 11 (10), 0164438 (2016).
  7. Bisig, C., Voss, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. The crux of positive controls - Proinflammatory responses in lung cell models. Toxicology In Vitro. 54, 189-193 (2019).
  8. Rothen-Rutishauser, B., et al. A newly developed in vitro model of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of nanoparticles. ALTEX. 25, (2008).
  9. Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
  10. Thai, P., Chen, Y., Dolganov, G., Wu, R. Differential regulation of MUC5AC/Muc5ac and hCLCA-1/mGob-5 expression in airway epithelium. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 33 (6), 523-530 (2005).
  11. Wu, J., et al. Characterization of air-liquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 51 (2), 6950 (2017).
  12. Shapiro, D. I., Nardone, L. L., Rooney, S. A., Motoyama, E. K., Munoz, J. L. Phospholipid biosynthesis and secretion by a cell line (A549) which resembles type II aleveolar epithelial cells. Biochimica and Biophysica Acta. 530 (2), 197-207 (1978).
  13. Balis, J., Bumgarner, S. D., Paciga, J. E., Paterson, J. F., Shelley, S. A. Synthesis of lung surfactant-associated glycoproteins by A549 cells: description of an in vitro model for human type II cell dysfunction. Experimental Lung Research. 6 (3-4), 197-213 (1984).
  14. Schurch, S., Gehr, P., Im Hof, V., Geiser, M., Green, F. Surfactant displaces particles toward the epithelium in airways and alveoli. Respiration Physiology. 80 (1), 17-32 (1990).
  15. Gehr, P., Schurch, S., Berthiaume, Y., Hof, V. I., Geiser, M. Particle Retention in Airways by Surfactant. Journal of Aerosol Medicine. 3 (1), 27-43 (2009).
  16. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B., Gehr, P. Dendritic Cells and Macrophages Form a Transepithelial Network against Foreign Particulate Antigens. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (6), (2007).
  17. Rothen-Rutishauser, B. M., Kiama, S. G., Gehr, P. A three-dimensional cellular model of the human respiratory tract to study the interaction with particles. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 32, (2005).
  18. Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An optimized in vitro model of the respiratory tract wall to study particle cell interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (2006).
  19. Jardine, L., et al. Lipopolysaccharide inhalation recruits monocytes and dendritic cell subsets to the alveolar airspace. Nature Communications. 10 (1), 1999 (2019).
  20. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
  21. Chortarea, S., et al. Repeated exposure to carbon nanotube-based aerosols does not affect the functional properties of a 3D human epithelial airway model. Nanotoxicology. 9 (8), 983-993 (2015).
  22. Hilton, G., Barosova, H., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B., Bereman, M. Leveraging proteomics to compare submerged versus air-liquid interface carbon nanotube exposure to a 3D lung cell model. Toxicology In Vitro. 54, 58-66 (2019).
  23. Brandenberger, C., et al. Effects and uptake of gold nanoparticles deposited at the air-liquid interface of a human epithelial airway model. Toxicology and Applied Pharmacology. 242, (2010).
  24. Drasler, B., et al. Single exposure to aerosolized graphene oxide and graphene nanoplatelets did not initiate an acute biological response in a 3D human lung model. Carbon. 137, 125-135 (2018).
  25. Durantie, E., et al. Carbon nanodots: Opportunities and limitations to study their biodistribution at the human lung epithelial tissue barrier. Biointerphases. 13, (2018).
  26. Brandenberger, C., et al. Quantitative evaluation of cellular uptake and trafficking of plain and polyethylene glycol-coated gold nanoparticles. Small. 6 (15), 1669-1678 (2010).
  27. Tomašek, I., et al. Combined exposure of diesel exhaust particles and respirable Soufrière Hills volcanic ash causes a (pro-)inflammatory response in an in vitro multicellular epithelial tissue barrier model. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 67 (2016).
  28. Nazarpour, R., et al. Optimization of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Cryopreservation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 1 (2), 88-93 (2012).
  29. Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), (2014).
  30. Ju, X., et al. The Analysis of CD83 Expression on Human Immune Cells Identifies a Unique CD83+-Activated T Cell Population. Journal of Immunology. 197 (12), 4613-4625 (2016).
  31. Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface: A Comparison with Conventional, Submerged Cell-Culture Conditions. BioMed Research International. , 12 (2013).
  32. Germann, A., Schulz, J. C., Kemp-Kamke, B., Zimmermann, H., von Briesen, H. Standardized serum-free cryomedia maintain peripheral blood mononuclear cell viability, recovery, and antigen-specific T-cell response compared to fetal calf serum-based medium. Biopreservation and Biobanking. 9 (3), 229-236 (2011).
  33. Weinberg, A., et al. Optimization and Limitations of Use of Cryopreserved Peripheral Blood Mononuclear Cells for Functional and Phenotypic T-Cell Characterization. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (8), 1176 (2009).
  34. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. Freshney, R. I. , Wiley-Liss Inc. 321-334 (2005).
  35. Lehmann, A. B. C., Blank, F., Gehr, P., Rothen-Rutishauser, B. Alternatives to animal testing. Yarmush, M. L., Langer, R. S. , Artech House. 239-260 (2010).
  36. Steiner, S., et al. Reduction in (pro-)inflammatory responses of lung cells exposed in to diesel exhaust treated with a non-catalyzed diesel particle filter. Atmospheric Environment. 81, 117-124 (2013).
  37. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional Profiling of the Human Monocyte-to-Macrophage Differentiation and Polarization: New Molecules and Patterns of Gene Expression. The Journal of Immunology. 177 (10), 7303 (2006).
  38. Chortarea, S., et al. Profibrotic activity of multi-walled carbon nanotubes upon prolonged exposures in different human lung cell types. Applied In Vitro Toxicology. 5 (1), (2019).
  39. Holt, P. G. Pulmonary Dendritic Cells in Local Immunity to Inert and Pathogenic Antigens in the Respiratory Tract. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (2), 116-120 (2005).
  40. Pinkerton, K. E., Gehr, P., Castañeda, A., Crapo, J. D. Comparative Biology of the Normal Lung (Second Edition). Parent, R. A. , Academic Press. 105-117 (2015).
  41. Crapo, J., Barry, B., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
  42. Maniecki, M. B., Møller, H. J., Moestrup, S. K., Møller, B. K. CD163 positive subsets of blood dendritic cells: The scavenging macrophage receptors CD163 and CD91 are coexpressed on human dendritic cells and monocytes. Immunobiology. 211 (6), 407-417 (2006).
  43. Chignard, M., Balloy, V. Neutrophil recruitment and increased permeability during acute lung injury induced by lipopolysaccharide. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (6), 1083-1090 (2000).
  44. Coyne, C. B., et al. Regulation of Airway Tight Junctions by Proinflammatory Cytokines. Molecular Biology of the Cell. 13 (9), 3218-3234 (2002).
  45. Durantie, E., et al. Biodistribution of single and aggregated gold nanoparticles exposed to the human lung epithelial tissue barrier at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 14 (49), (2017).

Tags

Biyoloji Sayı 159 insan akciğer kokültürleri 3D insan kokültürleri hava-sıvı arabirimi insan periferik kan monositlerinin izolasyonu primer makrofajlar ve dendritik hücreler kriyop ayrılmış primer bağışıklık hücreleri
Tehlike Değerlendirmesi İçin Epitel Hücreleri ve Primer İmmün Hücrelerden Oluşan Çok Hücreli İnsan Alveoler Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barosova, H., Drasler, B.,… More

Barosova, H., Drasler, B., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment. J. Vis. Exp. (159), e61090, doi:10.3791/61090 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter