Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

RT-PCR כמותי בעל תפוקה גבוהה בדגימות סי.

Published: May 28, 2020 doi: 10.3791/61132
Automatic Translation
*1, *2,3,5, 1, 1, 1, 2,3,4, 1, 1
1Babraham Institute, 2Gurdon Institute, University of Cambridge, 3Department of Genetics, University of Cambridge, 4Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute, 5Laboratory of Virology and Infectious Disease, The Rockefeller University
* These authors contributed equally

Summary

במאמר זה פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור קביעה מהירה ואמינה של רמות ביטוי גנים בדגימות C. elegans יחיד או בתפזורת מתואר. פרוטוקול זה אינו דורש בידוד RNA ומייצר cDNA ישירות מדגימות. ניתן להשתמש בו יחד עם פלטפורמות qPCR ננופלואידיות מרובות תפוקה גבוהה בזמן אמת.

Abstract

נייר זה מציג תפוקה גבוהה הפוך שעתוק כמותי PCR (RT-qPCR) בדיקה עבור אלגנים Caenorhabditis כי הוא מהיר, חזק, ורגיש מאוד. פרוטוקול זה מקבל מדידות מדויקות של ביטוי גנים מתולעים בודדות או מדגימות בתפזורת. הפרוטוקול המוצג כאן מספק עיבוד חדשני של שיטות קיימות להכנת DNA משלים (cDNA) יחד עם פלטפורמת RT-qPCR ננופלואידית. החלק הראשון של פרוטוקול זה, בשם 'תולעת ל- CT', מאפשר ייצור cDNA ישירות מנמדודים ללא צורך בבידוד mRNA קודם. זה מגביר את התפוקה הניסיונית על ידי מתן הכנת cDNA מ 96 תולעים ב 3.5 שעות. החלק השני של הפרוטוקול משתמש בטכנולוגיה ננופלואידית קיימת כדי להפעיל RT-qPCR בעל תפוקה גבוהה ב- cDNA. נייר זה מעריך שני שבבים ננו-פלואידיים שונים: הראשון מפעיל 96 דגימות ו -96 מטרות, וכתוצאה מכך 9,216 תגובות בכ 1.5 ימים של עבודת ספסל. סוג השבב השני מורכב משישה מערכי 12 x 12, וכתוצאה מכך 864 תגובות. כאן, שיטת התולעת ל-CT מודגמת על ידי כימות רמות mRNA של גנים המקודדיים חלבוני הלם חום מתולעים בודדות ומדגימות בתפזורת. בתנאי היא רשימה נרחבת של פריימרים שנועדו להגביר RNA מעובד עבור רוב הגנים קידוד בתוך הגנום C. elegans.

Introduction

אופטימיזציה של רצף RNA חד-תאי ו qPCR גילה כי פולסים שעתוק או התפרצויות יכול להוביל וריאציה מסיבית במספר מולקולות RNA לכל תא1. יתר על כן, טכנולוגיות אלה חשפו הטרוגניות תאית משמעותית שהוחמצה בעבר על ידי מדידות תמלוליות סטנדרטיות בתפזורת. בהתאם להקשר, כמה שונות שעתוק תא יחיד נגרמת על ידי הרכב תאי מעורב של רקמות. עם זאת, אפילו באוכלוסיות תאים isogenic גדל תחת אותה סביבה יש הטרוגניות שעתוק נפוצה2,3. "שונות ביולוגית" זו מזוהה יותר ויותר כמאפיין בכל מקום של רשתות סלולריות, מחיידקים לאדם. במקרים מסוימים, זה יכול להיות השלכות פנוטיפיות בפיתוח, התקדמות סרטן, השהיה HIV, ותגובה כימותרפיה4,5.

האלגנים nematode Caenorhabditis הוא אורגניזם מודל ייחודי עם מאפיינים אידיאליים לחקר הסיבות וההשלכות של שונות ביולוגית בין אנשים. nematodes אלה הם אורגניזם מודל פשוט המורכב 959 תאים, ואת קוטיקל שקוף שלהם עושה אותם נוח עבור מחקרי הדמיה vivo6. ג. אלגנס הוא מין הרמפרודיטי המתרבה בעיקר באמצעות הפריה עצמית; זה הביא זנים מעבדה isogenic. למרות איזוגניות ותנאי תרבות מבוקרים, פנוטיפים ותעתיקים רבים משתנים בין אנשים, דבר המצביע על כך שהבדלים סטוכסטיים או מיקרו-ויראליים תורמים להטרוגניות בין אנשים7,8. שונות כזו בביטוי גנים יש השלכות כושר מרובות, כולל שונות בחדירה של מוטציות, הישרדות, תזמון התפתחותי, פוריות7,8,9. בשל תכונות אלה, מחקרים חד-תולעיים מספקים הזדמנות חסרת תקדים לחקור שונות ביולוגית באורגניזם שלם.

יש צורך בסיסי בתחום לפתח ולייעל טכנולוגיות לגילוי מדויק של תעתיקים ברמת תולעת אחת. טכנולוגיות חדשות, כגון רצף RNA תולעת אחת10, רצף RNA מרקמות מבודדות11, רצף תא יחיד12 זמינים כעת עבור C. elegans. עם זאת, האתגר העיקרי נשאר: בעת ניטור interindividuality, גנים מבוטא חלש לעתים קרובות ליפול מתחת לרמות לגילוי13. זה רלוונטי במיוחד עבור תעתיקים נדירים מבודדים מכמויות קטנות של חומר התחלתי, שכן יש קשר מבוסס היטב, הפוך בין ביטוי ממוצע השונות הטכנית, לעתיםקרובות גורםתעתיקים נדירים ליפול מתחת לניתוקים סטטיסטיים 13 . אופטימיזציה של טכנולוגיות qPCR מרובות תפוקה גבוהה הוכיחה שימושית עבור מחקרים חד-תאיים יונקים, במיוחד כאשר לומדים את הביטוי של תעתיקים נדירים14,15. טכנולוגיה זו יכולה לשמש גם למטרות ביצועים ואימות של טכנולוגיות תולעת אחת אחרות.

תולעת ל-CT היא שיטה מהירה וחזקה המותאמת לערכה המשמשת במחקרים לביולוגיה של התא, להכנת cDNA חד-תולעתי. cDNA שהושג בשיטה זו יחד עם טכנולוגיית qPCR ננופלואידית מולטיפלקסים נבחרה מכיוון שהיא מספקת תפוקה ניסיונית גבוהה יותר, טווח דינמי רחב יותר של זיהוי ונומתה למטרות תא יחיד14,15. הכנת cDNA המתוארת ישימה גם לשימוש עם טכנולוגיות PCR סטנדרטיות. התפוקה מוגברת בשתי דרכים: ראשית, הכנת cDNA היא מהירה ואמינה יותר מאשר מיצוי guanidium thiocyanate-phenol-chloroform המסורתי, כי תולעים מתווספות ישירות למאגר התמוגה, תוך דילוג על בידוד ישיר של RNA מתכלה בקלות. שנית, שימוש בטכנולוגיות ננופלואידיות מגדיל באופן משמעותי את מספר הדגימות והיעדים שניתן להפעיל בו זמנית. במאמר זה מושווים שני שבבים: שבב במערך יחיד ושבב רב-מערךי. שבב במערך יחיד יכול להריץ 96 תולעים בודדות ו-96 סטים של פריימרים, מה שמביא ל-9,216 תגובות בכל ניסוי. כדי להשיג תפוקה דומה באמצעות טכנולוגיות qPCR סטנדרטיות ידרוש 96 ניסויים נפרדים qPCR, באמצעות 96 לוחות באר. השבב הרב-מערךי הקטן והגמיש יותר מורכב משישה מערכי 12 x 12 וכתוצאה מכך 864 תגובות. האמינות והרגישות המעולות של השיטה מוגברות על ידי טכנולוגיה ננופלואידית ועל ידי הקדמה של שלב preamplification. השיטה המוצגת במאמר זה נועדה לשמש יחד עם אלגוריתם סטטיסטי עדכני לחילוץ שונות ביולוגית. מאמר זה מציג את הפרוטוקול להכנת cDNA מהירה qPCR תפוקה גבוהה עבור תולעת אחת והן דגימות תולעת אצווה; האלגוריתם יפורסם במקום אחר. עבור פרוטוקול זה, הארגון של כל שבב צריך להיות מוכן לפני הניסוי. טבלה 1 וטבלה 2 מציגות דוגמאות לתוכניות אלה עבור שבב מרובה מערכים ושבב במערך יחיד, בהתאמה. באיור 1 מפורטות גם סקירות של פרוטוקול Worm-to-CT והפעלת השבבים מרובי המערך והמערך הבודד באיור 2.

Protocol

הערה: לאורך פרוטוקול זה Caenorhabditis elegans נקרא "תולעת" או "תולעים". ניתן להזמין מגוון זנים של C. elegans באמצעות מסדי נתונים מקוונים או על ידי יצירת קשר ישיר עם מעבדות המשתמשות באורגניזם המודל. חלק I של פרוטוקול זה (סעיפים 1-3) מתאר הכנת cDNA באמצעות פרוטוקול תולעת ל- CT. חלק II של פרוטוקול זה (סעיפים 4-13) מתאר ריצה בעלת תפוקה גבוהה RT-qPCR באמצעות nanofluidics, מותאם מפרוטוקול שפותח על ידי Fluidigm16. פרוטוקול זה חל על השימוש בשני סוגים של שבבים ננופלואידיים שהוגדרו קודם לכן, שבב מערך יחיד, אשר יכול לפקח על 96 מטרות לתוך 96 דגימות (9,216 תגובות RT-qPCR בסך הכל), או שבב מרובה מערך, אשר מתפקד כיחידות משנה של 12 יעד x 12 דגימות. כל שבב מרובה מערכים מכיל שישה מערכים עצמאיים שניתן להפעיל יחד או בנפרד. לדוגמה, באמצעות שבב רב-מערך שלם יכול לפקח על 72 מטרות x 12 דגימות (או להיפך), או 36 מטרות x 24 דגימות (או להיפך). למידע נוסף על כל אחד מהחומרים המשמשים בפרוטוקול זה, עיין בטבלת החומרים.

1. אימות פריימר RT-qPCR

הערה: פרייומרים בזמן אמת תוכננו על סמך המאפיינים המומלצים שהונפקו במקור על ידי הנחיות MIQUE17. כדי להפוך את הפריימריז לספציפיים עבור RNA מעובד, המוצרים תוכננו כך ששני הפריימריז קשורים לשני צדי צומת ג'וינט אחד לפחות. הדרישות לפריימרים מתאימים כללו 20%-80% תכולת גואנין וציטוסין, טמפרטורת התכה של 58-60 מעלות צלזיוס, הבדל בטמפרטורת ההיתוך בין זוגות פריימר של ≤0°C ואורך מוצר של 70-120 bp. ניתן למצוא את רצף הפריימריז שנוצרו בטבלה משלימה 1. קוד קוד פתוח עבור קבצי ה- Script המשמשים ליצירת פרייומרים ניתן למצוא https://github.com/s-andrews/wormrtpcr. זוגות פריימר עבור תעתיקים עם אתרי splice תוכננו כך שהם שוכבים בשני exons אגף אינטרון אבל לא תוכננו להיות ספציפי גרסה splice, באמצעות תוכנת NCBI Primer Blast18. עבור מחקר זה, ערכות פריימר פוצצו נגד הגנום C. elegans כדי לבדוק כל משלים מחוץ ליעד.

  1. אחזר פריימרים ממסד הנתונים של פריימרים RT-qPCR (טבלה משלימה 1). לחלופין, עיצוב זוגות פריימר qPCR באמצעות כלים מקוונים כגון NCBI פריימר Blast18.
  2. בצע עקומה סטנדרטית qPCR כדי לפקח על ספציפיות ויעילות PCR עבור כל זוג פריימרים באמצעות טכניקות qPCR בצובר סטנדרטי19 והנחיות MIQUEהבאים 17,20.
    הערה: יש להשתמש רק בזוגות פריימר עם R2 > 0.98 ויעילות PCR בין 85% ל- 115%. הרצף, יעילות PCR, ו R2 עבור פריימרים המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלה 3.

2. תמוגה תולעת דרך תולעת ל-CT

  1. בחר את התולעים ממדשאת החיידקים שלהם על צלחת NGM רעננה, unseeded ולאפשר לתולעים לנוע סביב הצלחת במשך 5 דקות כדי להסיר את רוב החיידקים מן התולעת דרך התנועה שלה.
    הערה: המדשאה החיידקית ותנאי הגידול ישתנו בהתאם לתכנון הניסיוני. הניסויים המוצגים כאן דורשים 6 ס"מ לוחות NGM זרעים עם OP50 Escherichia coli עם תולעים של עניין גדל לשלב L4.9 באינקובטור 20 °C (70 °F).
  2. במכסה המנוע ללא RNase, הכינו תערובת ראשית המורכבת מ-12.5 מיקרו-ל' של חיץ RT 2x, 1.25 מיקרו-ל' של מאגר אנזימים RT 20x ו-0.25 μL של מים נטולי גרעין לדגימה. הוסף 14 μL של תערובת הורים ל 11 μL של כל מדגם משלב 2.8.
  3. מניחים את המכסה של רצועת PCR במהופך על הפלטפורמה של היקף ניתוח ולהוסיף 10 μL של תערובת תמוגה כובעי צינור PCR כיפה תחת מיקרוסקופ מורכב.
    הערה: עם דגימה אחת או שתיים בלבד, עדיף להשתמש ברצועת PCR המכילה לפחות ארבעה צינורות, שכן הדבר מפחית את הסיכון שהכובעים ייפתחו בשלבי ההפשרה הבאים. לחלופין, גומיות ניתן להשתמש כדי להחזיק את הכובעים במקום. במקרה זה להבטיח כובעים סגורים כראוי בכל פעם הצינורות מועברים.
  4. בחר את התולעים מהצלחת לתוך כל חריץ של המכסה המכיל את תערובת התמוגה על ידי "גורף" אותם (כלומר, לתפוס את התולעים מתחת עם לבחור) כדי למנוע זיהום חיידקי. סגור את הצינורות ולסובב אותם במשך 5 s באמצעות microcentrifuge שולחן(שולחן החומרים)לפני הצבתם בקבוק דיואר מלא חנקן נוזלי.
    הערה: יש להשתמש בין 15 ל-30 תולעים לניסויים בתפזורת ותולעת אחת למדידות תולעת אחת.
    התראה: בעת טיפול חנקן נוזלי ללבוש Cryo-כפפות, כמו גם משקפי מגן לדבוק תקנות בגדים סטנדרטיים, כי מגע עם העור או העיניים יכול לגרום לפגיעה חמורה כוויות קור.
  5. להקפיא-להפשיר את צינורות PCR 10x על ידי העברת אותם בין חנקן נוזלי ואמבט מים ~ 40 מעלות צלזיוס. השאירו את הצינורות בחנקן הנוזלי למשך 5 שניות לפחות כדי להבטיח שהדגימות קפואות לחלוטין. השאירו את הצינורות באמבט המים עד שהדגימות יפשירו. אין להשאיר לתקופה ארוכה יותר, שכן זה מוביל השפלה RNA.
    הערה: צינורות ניתן להשאיר חנקן נוזלי לתקופה ממושכת של זמן, כמו דגימות קפואים כ -200 מעלות צלזיוס, הפחתת השפלה RNA. זה לא צריך, עם זאת, להיות נקודת עצירה פרוטוקול, כי חנקן נוזלי מתאדה במהירות.
  6. מערבבים את הדגימות על מערבל תרמי(שולחן החומרים)שנקבע על 4 °C (60 °F) עבור 20-30 דקות מסתובב ב ~ 1,800 סל"ד.
  7. בזמן שהדגימות מעורבבות, הפשר את תמיסת העצירה על הקרח.
  8. לסובב את הדגימות למטה באמצעות microcentrifuge שולחן(שולחן החומרים)ולהוסיף 1 μL של פתרון עצירה לכל צינור.
    הערה: ניתן להשאיר את הדגימות ב -80 מעלות צלזיוס עד שבוע לפני תעתיק הפוך של ה- RNA (סעיף 3).

3. תעתיק הפוך

הערה: עבור שעתוק הפוך של תולעים בודדות, התוצאות המוצגות כאן נוצרו באמצעות ריאגנטים המסופקים עם שבבי ננופלואידים (אפשרות 2 באיור 1). ריאגנטים שהודגשו באופציה 2 של איור 1 שימשו גם לתעתיק הפוך של דגימות במאגר. כל אחת מהשיטות פועלת לסירוגין עבור סוגי הדגימות השונים.

  1. שעתוק הפוך של תולעים בודדות
    1. במכסה המנוע נטול RNase, הוסיפו 1.25 μL של תערובת שעתוק הפוכה(שולחן החומרים)לצינור PCR טרי.
      הערה: ניתן להשתמש בלוח PCR של 96 באר ופיפט אוטומטי אם יש דגימות רבות. פרוטוקול היצרן קובע כי μL אחד יכול לשמש לכל מדגם.
    2. קח 5 μL של פתרון התמוגה ולהפסיק לערבב פתרון משלב 2.8 ולהוסיף אותו צינור PCR טרי המכיל את תערובת שעתוק הפוך.
      הערה: פרוטוקול היצרן קובע כי 1 μL של RNA (2.5 pg/μL–250 ng/μL) ניתן להשתמש לכל תגובה. פקד RT שלילי לכל צלחת ניתן להוסיף על ידי החלפת תערובת שעתוק הפוכה עם 5 μL של מדגם lysed ו 1.25 μL של מים ללא RNAse.
    3. הפעל את הדגימות באמצעות תוכנית שעתוק הפוכה הבאה על thermocycler: 25 °C (70 °F) במשך 5 דקות, 42 °C (70 °F) במשך 30 דקות, 85 °C (70 °F) במשך 5 דקות ו 4 °C (70 °F) עבור ∞.
      הערה: ניתן לאחסן את ה- cDNA המיוצר ב- -20 °C (70 °F) לפני שתמשיך להגביר ולאסוף נתונים באמצעות qPCR בעל תפוקה גבוהה.
  2. שעתוק הפוך עבור דגימות בצובר (15-30 תולעים)
    1. במכסה המנוע ללא RNase, הכינו תערובת ראשית המורכבת מ-12.5 מיקרו-ל' של חיץ RT 2x, 1.25 מיקרו-ל' של מאגר אנזימים RT 20x ו-0.25 μL של מים נטולי גרעין לדגימה. הוסף 14 μL של תערובת הורים ל 11 μL של פתרון תמוגה ולהפסיק לערבב פתרון משלב 2.8.
      הערה: כאשר מתמודדים עם מספר גדול של דגימות זה יכול להתבצע ב 96 לוחות באר.
    2. הפעל את הדגימות דרך thermocycler באמצעות תוכנית שעתוק הפוכה הבאה: 37 °C (60 °F) במשך 60 דקות, 95 °C (70 °F) במשך 5 דקות, ו 4 °C (60 °F) עבור ∞.
    3. לדלל את cDNA המיוצר 1:4 במים ללא גרעין.
      הערה: בדרך כלל, המוצרים מגיעים לכרך הסופי של 25 μL, ובמקרה זה 75 μL יש להוסיף. עם זאת, עקב עיבוי אמצעי האחסון הסופי יכול להשתנות. לכן, להתאים בהתאם כדי להפוך את יחס 1:4 בפתרון הסופי. שלב דילול זה אינו חל אם ביצוע qPCR על תולעים בודדות. ניתן לאחסן את ה- cDNA המיוצר ב- -20 °C (70 °F) לפני שתמשיך להגביר ולאסוף נתונים באמצעות qPCR בעל תפוקה גבוהה.

4. הכנת תערובת פריימר מולטיפלקס

  1. הכן מלאי פריימר קדימה/הפוך (F/R) עבור כל זוג פריימרים בריכוז סופי של 50 μM. מערבבים את אותו נפח של פרייומרים קדימה והפוך ב 100 μM כל אחד.
  2. שלב 1 μL של 50 μM F /R פריימר מלאי עבור כל זוג פריימר להיבדק. הוסף את מאגר השעיית ה- DNA עד נפח כולל של 100 μL.
    הערה: ריכוזי פריימר המניה כאן שונים מאלה המתוארים בפרוטוקול היצרן16 אך שומרים על אותו ריכוז סופי של 500 ננומטר.

5. יעד קדם-הידוק ספציפי

  1. הכן תערובת הורים המכילה 1 μL של מאסטרמיקס preamplification(שולחן החומרים),0.5 μL של תערובת פריימר במאגר (שלב 4.2), ו 2.25 μL של מים ללא גרעין לכל תגובה עם נפח עודף כולל של 10%.
  2. בצלחת 96 גם, aliquot 3.75 μL של תערובת הורים לתוך בארות רבות ככל הנדרש עבור מספר הדגימות להיות לרוץ.
  3. הוסף 1.25 μL של פתרונות cDNA של עניין שנוצר בשלב 3.1.3 או 3.2.3 לכל באר.
  4. מכסים את הצלחת עם 96 היטב איטום קלטת, מערבולת בקצרה, צנטריפוגה עם ספינר צלחת שולחן. העבר תרמוציקלר ולהפעיל את התוכנית הבאה: 95 °C (95 °F) במשך 2 דקות, 15 מחזורים של denaturation ב 95 °C (70 °F) עבור 15 s, חישול / הרחבה ב 60 °C (60 °F) במשך 4 דקות, ו 4 °C (60 °F) עבור ∞.
    הערה: היצרן ממליץ מ 10-20 מחזורים עבור תגובת preamplification16. פרוטוקול זה ממליץ על 10 או 15 מחזורים בהתאם לרמות הביטוי של גני היעד.

6. Exonuclease אני טיפול

הערה: זה כדי להסיר פריימרים לא מאוגדים מקדם.

  1. הכן exonuclease אני מערבב המכיל 0.2 μL של exonuclease אני מאגר תגובה(טבלה של חומרים),0.4 μL של exonuclease אני ב 20 U / μL(שולחן החומרים),ו 1.4 μL של מים ללא גרעינים לכל מדגם. שמור את כל ריאגנטים על קרח, במיוחד exonuclease אני.
  2. הסר את צלחת 96 גם (שלב 5.4) מן התרמוציקלר, צנטריפוגה עם ספינר צלחת השולחן, ולהסיר בזהירות את החותם. הוסף 2 μL של exonuclease אני מערבב לכל תגובת preamplification. Reseal, צנטריפוגה, ומניחים את צלחת 96 גם בחזרה לתוך התרמוציקלר באמצעות התוכנית הבאה: 37 °C (60 °F) במשך 30 דקות, 80 °C (60 °F) במשך 15 דקות, ו 4 °C (60 °F) עבור ∞.
  3. קח את הדגימות מתוך התרמוציקלר לדלל אותם 1:5 על ידי הוספת 18 μL של 1x Tris EDTA מאגר(טבלה של חומרים).
    הערה: ניתן לשמור את דגימות cDNA ב -20 °C (70 °F) לשימוש מאוחר יותר. פרוטוקול היצרן מציע דילול פוטנציאלי של 5x, 10x, או 20x בשלב זה16, בהתאם לרמת הביטוי של מטרות הריבית.

7. הכנת תערובות ההסמכה

הערה: תערובות Assay ניתן להכין 384 צלחות גם, כמו בארות יש את אותו מרווח כמו שבבים nanofluidic, מה שהופך את הטעינה קלה יותר.

  1. הכנת תערובות מבחנים לשבב מרובה מערכים
    1. הכן תערובת הורים המורכבת 2 μL של 2x assay טעינת ריאגנט(שולחן החומרים)ו 1.6 μL של מאגר השעיית DNA(שולחן החומרים)עבור כל באר על פי התוכנית המוכנה. Aliquot 3.6 μL של תערובת הורים זו לכל באר לתוך צלחת 384 היטב.
    2. הוסף 0.4 μL של 50 μM F / R פריימר מלאי מוכן בשלב 4.1 לבארות המתאימות על פי התוכנית מוכנה.
      הערה: זה מספק בסך הכל 4 μL של תערובת מבחנים לכל באר, עם עודף של 1 μL.
  2. הכנת תערובות מבחנים לשבב במערך יחיד
    1. הכן תערובת הורים המורכבת 3 μL של 2x assay טעינת ריאגנט ו 2.4 μL של מאגר השעיית DNA עבור כל באר על פי התוכנית מוכנה. Aliquot 5.4 μL של תערובת הורים זו לכל באר לתוך צלחת מסומנת 384 היטב.
    2. הוסף 0.6 μL של 50 μM F / R פריימר מלאי לבארות המתאימות על פי התוכנית מוכנה.
      הערה: זה מספק סך של 6 μL של תערובת מבחני כל טוב, עם עודף של 1 μL.

8. הכנת תערובות המדגם

הערה: ניתן להכין תערובות לדוגמה עד יום אחד מראש ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס.

  1. הכנת דוגמאות לשבב מרובה מערכים
    1. הכן תערובת הורים לדוגמה המורכבת מ- 2 μL של סופרמיקס בדיקה פלואורסצנטי 2x עם ROX נמוך(טבלת חומרים)ו- 0.2 μL של ריאגנט מדגם (טבלת חומרים) לדגימה. לוותר 2.2 μL של תערובת זו לתוך צלחת מסומנת 384 היטב.
      הערה: היצרן ממליץ לא מערבולת ריאגנט מדגם16.
    2. פיפטה 1.8 μL של כל preamplified, exonuclease טיפלתי מדגם משלב 3.2.3 לתוך בארות המתאימות על פי התוכנית מוכנה.
      הערה: זה נותן בסך הכל 4 μL, עם עודף של 1 μL.
  2. הכנת דוגמאות לשבב במערך יחיד
    1. הכן תערובת הורים לדוגמה המורכבת מ- 3 μL של סופרמיקס בדיקה פלואורסצנטי 2x עם ROX נמוך(טבלת חומרים)ו- 0.3 μL של דגימת צבע מחייבת DNA 20x טעינת ריאגנט (לוח החומרים) לדגימה. לוותר 3.3 μL של תערובת זו לתוך צלחת 384 היטב מסומן.
    2. פיפטה 2.7 μL של כל preamplified ו exonuclease טיפלתי מדגם משלב 6.3 לתוך בארות המתאימות על פי התוכנית מוכנה.
      הערה: זה נותן בסך הכל 6 μL, עם עודף של 1 μL. אם יש בארות לרוץ ללא מדגם אלה חייבים להיות טעונים עם תערובת הורים מדגם ו 2.7 μL של מים במקום cDNA. אפשרות זו מומלצת עבור שני סוגי השבבים. המכונה זקוקה ל-ROX נמוך בכל מפרצון כדי לזהות את רשת השבב.

9. פרימיום השבב הננופלואידי

הערה: שבב מרובה מערכים צריך להיות מוכן רק בהפעלה הראשונה. אם קיימות ריצות עוקבות של אותו שבב, ניתן לדלג על שלב זה. שלבים אלה זהים עבור שני סוגי השבבים.

  1. לאט ובזהירות, להזריק את מלוא 150 μL של נוזל קו הבקרה מן המזרקים הכלולים במצטברים של השבב. ודאו ששום נוזל בקרה לא נוגע בשבב על ידי החזקת השבב בזווית של 45° והחזקת קצה המזרק משם כדי למנוע שפיכה.
  2. הסר את סרט המגן הכחול מתחתית השבב.
  3. מניחים את השבב לתוך מכונת הפריימריז PCR nanofluidics(שולחן החומרים),עם ברקוד פונה כלפי חוץ. הפעל את 'פריים (153x)' סקריפט, אשר לוקח ~ 15-20 דקות.
    הערה: הפעל את התרמוציקלר nanofluidics(שולחן החומרים)בשלב זה, כי המצלמה לוקחת בערך 10 דקות כדי להתקרר מתחת 0 °C (60 °F).

10. טעינת השבב הננופלואידי

  1. הסר את התקעים של המחסום ברצף בעת הטעינה. זה מקטין את הסיכוי לטעון בארות.
  2. העבר או 3 μL עבור שבב רב מערך או 5 μL עבור שבב מערך יחיד של כל פריימר assay תערובות ותערובות מדגם לתוך המפרצונים המתאימים של שבב nanofluidic על פי התוכנית מוכנה. הקפד לא להציג בועות, אשר יכול לגרום נפח הכולל שהועבר להיות קטן יותר הרצוי.
    הערה: אם יש בארות שיפעלו ללא פריימר חשוב כי אלה להיות טעון עם תערובת הורים, החלפת נפח פריימר עם מים. הדבר חל על שני סוגי השבבים. בשלב זה, זה יכול להיות קל יותר למקם את השבב על משטח כהה, אשר יאפשר את בארות להיראות בקלות רבה יותר.

11. הפעלת השבב הננופלואידי

הערה: בפעם הראשונה שהפעלת שבב מרובה מערכים, הגדר את קובץ המעקב על-ידי בחירה באפשרות כלים | מעקב אחר שימוש של Flex Six, לחץ על חדש, הזן שם קובץ ובחר מיקום לפני שתלחץ על בוצע.

  1. פתח את תוכנת איסוף הנתונים. לחץ על התחל הפעלה חדשה. מניחים את השבב טעון לתוך התרמוציקלר nanofluidics עם ברקוד פונה כלפי חוץ.
  2. בחר בהגדרת הפרוייקט אם ישים ולאחר מכן לחץ על הבא | טען. אם אתה טוען שבב מרובה מערכים, בחר את המחיצות (מערכים) להפעלה.
  3. בחר את בדיקות ההפניהשל היישום ולאחר מכן שנה את סוג היישום לביטוי גניםושנה את ההפניה הפסיבית ל- ROX. בחר את הבדיקה הבודדת Assay, שנה את סוג הבדיקה לאווה גריןולחץ על הבא.
  4. בחר בפרוטוקול רכיבה תרמית GE FLEX six Fast PCR+Melt v1 כדי להפעיל שבב מרובה מערכים, או בפרוטוקול GE 96.96 Fast PCR+Melt v2 כדי להפעיל שבב במערך יחיד.
  5. ודא שנבחרה חשיפה אוטומטית ולחץ על התחל הפעלה.

12. לאחר הפעלת שבב

הערה: סעיף זה נחוץ רק עבור שבבים מרובי מערכים כאשר אינם משתמשים בשבב כולו.

  1. קח את השבב מתוך התרמוציקלר nanofluidics לטעון לתוך מכונת ננופלואידיקה PCR priming ולהפעיל את פוסט ראן (153x) סקריפט, שנמשך 5 דקות.
  2. סמן את התקעים המשמשים לעיון אישי.
    הערה: כעת ניתן לאחסן את השבב בטמפרטורת החדר ואת המערכים הנותרים על השבב ניתן להפעיל בתוך 2 חודשים.

13. ניקוי וניתוח נתונים

  1. פתח את הנתונים בתוכנה 'ניתוח PCR בזמן אמת' ( טבלה שלחומרים). בדקו את טמפרטורת שיא ההיתוך עבור כל זוג פריימר שנבדק. לחסל תוצאות המציגות יותר משיא טמפרטורת התכה אחד, עבור זוג פריימר נתון.
    הערה: פסגות מרובות מופיעות רק מדי פעם, ככל הנראה כאשר זוגות פריימר יוצרים עמעום, או מאינטראקציות של פריימרים של יעדים עם פריימרים אחרים בתמהיל פריימר במאגר.
  2. יצא את הנתונים כקובץ גיליון אלקטרוני 'מפת חום' והסר דוגמאות או פרייומרים שנכשלו.
  3. נתח נתונים באמצעות שיטת דלתא-Ct21הסטנדרטית . להערכה סטטיסטית בצע ANOVA חד-כיווני ברמות ביטוי יחסיות.

Representative Results

אימות תולעת ל-CT כשיטת הכנה של cDNA

כדי לבדוק אם פרוטוקול תולעת-ל-CT היא שיטת מיצוי cDNA תקפה, היא הושוותה לשיטות מיצוי סטנדרטיות של guanidium thiocyanate-phenol-chloroform. התוצאות מוצגות באיור 3, שם הוכן cDNA מממוצע של כ-1,000 תולעים בשיטת guanidium thiocyanate-phenol-chloroform22 ומ-30 תולעים בשיטת Worm-to-CT. הדגימות היו המומות בחום בו זמנית (30 דקות ב 34 מעלות צלזיוס). באופן גלובלי, רמות ביטוי hsp-70 mRNA לכל 100 ng של RNA הכולל היו דומות בשתי השיטות. עם זאת, במקרה של ביטוי hsp-70 הגבוה ביותר (כלומר, ב- N2 בעקבות הלם חום) רמות הביטוי היו גבוהות יותר בשיטת Worm-to-CT, המציין רגישות משופרת.

כדי לקבוע אם ירידה צפויה בביטוי hsp ב hsf-1(sy441)23, מוטציה בווסת שעתוק הראשי של המלווים מולקולריים23,24, ניתן לשחזר, אינדוקציה המלווה שעתוק בעקבות זעזוע חום קצר הושווה. בשתי השיטות זוהתה ירידה באינדוקציה hsp-70 בבעלי חיים hsf-1(sy441). זה היה צפוי, כי מוטציה hsf-1(sy441) בעלי חיים להפגין יכולת מופחתת לגרום מלווים עקב חיתוך בתחום transactivation של HSF-1. עבור guanidium thiocyanate-פנול-chloroform מיצוי hsp70 ירד ב 82.7% לעומת פקדים ו 92.3% עבור תולעת ל- CT לעומת חיות מסוג בר (איור 3). התוצאות היו דומות בין שתי השיטות ודומות לדוחותקודמים 23. תוצאות אלה מצביעות על כך ששיטת Worm-to-CT היא חלופה חוקית לטכניקות סינתזת cDNA סטנדרטיות.

אימות פלטפורמת PCR ננופלואידיקה המשמשת להגברת מטרות mRNA

כדי לבדוק את העקביות של התוצאות באמצעות qPCR nanofluidic עבור הגברה תעתיק, תוצאות PCR שהתקבלו משיטת התולעת ל- CT בתפזורת הושוו הן על מערכת qPCR סטנדרטית (טבלה של חומרים) ומערכת qPCR ננופלואידית באמצעות שבב רב מערך. שינוי הקיפול בביטוי של שלושה גנים שונים, sma-3 (איור 4A), sma-10 (איור 4B) ו- dnj-26, היה במעקב (איור 4C) בבעלי חיים הנושאים אלל ריק ב- dbl-1 (dbl-1(nk3))25 בהשוואה לעמיתיהם מסוג בר. Dbl-1 מקודד את הליגנד היחיד של חלבון מורפוגנטי עצם (BMP) איתות מסלול. sma-3 ו- sma-10 הם גנים המקודדים אורתולוגים SMAD, מרכיבים מרכזיים של מפל איתות BMP. Dnj-26 מקודד מלווה מולקולרי, יעד של איתות BMP. תוצאות אלה מראות הבדל קטן עד ללא הבדל בשינוי הקיפול המשווה את התוצאות של שתי השיטות, וכתוצאה מכך ערכי P לא משמעותיים ב- 0.3113, 0.2635 ו- 0.3481 עבור sma-3, sma-10 ו- dnj-26, בהתאמה. בסך הכל, תוצאות אלה מראות כי שיטת Worm-to-CT המוחלת על דגימות בתפזורת היא דרך יעילה ומהירה לחלץ RNA מתולעים מעטות ומספקת נתונים אמינים בשילוב עם מערכות PCR סטנדרטיות או פלטפורמות qPCR מבוססות ננו-תפוקה גבוהה.

השוואה בין רמות הביטוי המתקבלות על ידי דגימות בצובר עם ממוצעים המתקבלים מתולעים בודדות

רמות הביטוי היחסיות חושבו באמצעות cDNA שהתקבל מדגימות בצובר (25 תולעים) או מממוצע של 36 דגימות תולעת בודדות (איור 5). שני cDNAs הושגו בשיטת תולעת ל- CT והוגברו באמצעות טכנולוגיית PCR nanofluidics. כפי שנצפה באיור 5A-C, עבור כל המלווים שנבדקו (כלומר, hsp16.1, F44E5.4, hsp-70), השיטות זיהו רמות ביטוי דומות. תוצאות אלה מצביעות על כך שפרמטרים המתקבלים מתולעים בודדות הם אמינים.

יישום של תולעת ל-CT בשילוב עם טכנולוגיית nanofluidics להערכת פרמטרי ביטוי גנים תולעת אחת

מכיוון ששבב המערך הבודד מאפשר ניטור של עד 96 תעתיקי יעד על 96 דגימות בודדות, הוא מתאים אפוא לניטור שונות אישית בביטוי תעתיק בין תולעים בודדות. איור 6A מציג תוצאה מייצגת המציגה את הביטוי הממוצע של תעתיקי hsp מרובים מתולעים בודדות לאחר זעזוע חום קצר. כפי שנצפה באיור, השונות בביטוי התמלילים הייתה שונה באופן דרמטי בין גנים שונים (איור 6A). כדי לקבל תובנות נוספות, מקדם הווריאציה (CV) חושב על-ידי חלוקת סטיית התקן לפי ממוצע רמות הביטוי26 (איור 6B). שלושה גנים שערכי קורות החיים שלהם הוערכו בעבר בשיטות חלופיות היו מנוטרים (נתונים שלא פורסמו). שני תעתיקים יציבים (ife-1 ו- Y45F10D.4) ומשתנה אחד (nlp-2927) הראו את השונות הצפויה שלהם. הגרף מתאר בבירור גם את הקשר ההפוך הידוע בין ערכי שונות לבין רמות ביטוי26 (איור 6B).

לשכפולים טכניים יש חשיבות עליונה כדי להבטיח יכולת לשחזור בעת שימוש בדגימות בצובר. עם זאת, זה לא בהכרח המקרה עבור ניסויים חד תאיים14,15,28. כדי לקבוע אם השימוש בשכפולים טכניים נחוץ להערכת פרמטרים בעת שימוש בדגימות תולעת אחת, נקצרו 28 תולעים בודדות, לאחר הלם חום קצר, ומעובדות באמצעות משולשים טכניים. ערכי קורות החיים שחושבו מנתוני תולעת אחת שהושגו בשלישיות (נקודות כחולות באיור 7, קורות חיים טכניים) לעומת אלה של כל תעתיק המתקבל מתולעים בודדות (נקודות אדומות באיור 7, שונות ביולוגית) הושוו. עבור כל תעתיק שנבדק, קורות הרישוי הטכניים היו נמוכים יותר מה קורות דם ביולוגיים, מה שמצביע על כך שלא נדרשו טריפליקטים טכניים להערכת פרמטרים. העובדה כי משכפלים טכניים אינם נדרשים מגבירה את תפוקת הניסוי מבלי להתפשר על האיכות.

Figure 1
איור 1: מבט כולל על פרוטוקול התולעת ל-CT.
איור זה מציג סקירה קצרה של השלבים השונים הדרושים להפעלת תולעים באמצעות פרוטוקול Worm-to-CT. שתי שיטות אופציונליות מוצגות עבור שלב התמלול ההפוך; אלה הן שיטות להחלפה עבור כל סוג של שבב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מבט כולל על ההכנה וההפעלה של qPCR ננופלואידי.
נתון זה מתאר את ההכנות להפעלת מערכת qPCR ננופלואידית באמצעות שבב מרובה מערכים ושבב במערך יחיד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פרוטוקול תולעת ל-CT בדגימות בצובר סיפק תוצאות מהימנות.
השוואה של פרוטוקול תולעת-ל-CT לעומת תיוקיאנט רגיל guanidium-פנול-כלורופורם החילוץ22 על דגימות בתפזורת. עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים, ב hsf-1(sy441)מוטנטים23, רמות תעתיקי hsp בתגובה להלם חום ירד. ההיסטוגרמות לעיל מתארות את האינדוקציה של hsp-70 בהיעדר (-), או הבא (+) זעזוע חום קצר של 30 דקות ב 34 מעלות צלזיוס. ה- cDNA הושג באמצעות מיצוי guanidium thiocyanate-phenol-chloroform המוחל על 1,000 תולעים (משמאל) או בשיטת Worm-to-CT המוחלת על 30 תולעים במאגר (מימין). רמות הביטוי של hsp-70 לכל 100 ng של RNA הכולל המתקבל על ידי כל שיטה הושוו. כצפוי, ב hsf-1(sy441) אינדוקציה שעתוק של hsp-70 בתגובה להלם חום ירד באופן משמעותי על ידי 82.7% באמצעות guanidium thiocyanate-פנול-כלורופורם ועל ידי 92.3% באמצעות שיטת תולעת-ל-CT. רמות mRNA מגנים היעד היו מנורמל נגד הממוצע של שלושה גנים משק בית CDC-42, pmp-3, ו ire-1. כל נקודה מייצגת שכפול ביולוגי. הנתונים עברו המרה לניתוח סטטיסטי, מכיוון שהם לא עמדו במוסכמות הנדרשות לניתוח פרמטרי. ניתוח סטטיסטי נעשה באמצעות ANOVA חד-כיווני של RM באמצעות מבחן ההשוואות המרובות של Sidak. סוג פראי = N2, hsf-1 = hsf-1(sy441). מייצגי פעילויות מציינים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: תבניות ביטוי היו עקביות בין qPCR סטנדרטי למערכות qPCR ננו-נוזליות.
(A) רמת הביטוי של sma-3 (A), sma-10 (B) או dnj-26 (C) mRNA נקבעה באמצעות qPCR רגיל qPCR ו qPCR ננופלואידי (שבב רב מערך) משלושה משכפלים ביולוגיים של cDNA שנוצר באמצעות תולעת ל- CT מן זן סוג הבר (N2) ואת dbl-1(nk3) זן נוקאאוט25. רמות ביטוי mRNA יחסי נקבעו עבור כל זן באמצעות שיטת דלתא-Ct21. שינוי הקיפול נקבע אז על ידי חלוקת רמות הביטוי המתקבלות בתולעים dbl-1(nk3) על ידי רמות mRNA המתאימות בזן N2. כפי שמוצג בחלונית A, התבניות היו עקביות עבור שתי השיטות בכל משכפל ביולוגי בודד. (B) ו- (C) זהים ל- (A) עבור רמות sma-10 ו- dnj-26 mRNA, בהתאמה. רמות mRNA היעד היו מנורמל נגד הגנים משק הבית CDC-42 ו pmp-3. ניתוח סטטיסטי חושב עבור כל גן באמצעות מבחן t מזווג המשווה את התוצאות של שלושת השכפולים הביולוגיים המיוצרים באמצעות qPCR סטנדרטי ואלה שנוצרו באמצעות qPCR ננופלואידי. ערכי P של השוואות אלה היו 0.3113, 0.2635 ו- 0.3481 עבור sma-3, sma-10 ו- dnj-26, בהתאמה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שימוש בשיטת Worm-to-CT בדגימות בצובר או בתולעים בודדות סיפק רמות ביטוי דומות בעת נרמול לתולעת.
רמות הביטוי של (A) hsp-16.1/11, (B) F44E5.4, ו - (C) hsp-70 (C12C8.1) נותחו בבעלי חיים צעירים בוגרים בהעדר הלם חום או על ידי ביצוע תולעת ל- CT על כמות גדולה של 25 בעלי חיים, או על 36 יחידים. כאשר הנתונים נורמלו לתולעת, לא היה הבדל משמעותי בין רמות שהושגו לתולעת עבור כל תעתיק באמצעות שתי השיטות. רמות mRNA מגנים היעד היו מנורמל נגד הממוצע של שלושת הגנים משק הבית CDC-42, pmp-3, ו ire-1. מייצגי פעילויות מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. סטטיסטיקה = מבחן t מזווג. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: RT-qPCR בעל תפוקה גבוהה על תולעים בודדות בשיטת Worm-to-CT יכול לפקח על השונות הבין-אינדיבידואלית בביטוי גנים.
(A)רמות הביטוי הממוצע עבור 53 תעתיקים שהושגו עם חשיפה להלם חום קצר (30 דקות ב 34 מעלות צלזיוס). Boxplots מייצגים את ההתפלגות של ביטוי mRNA ממוצע מתולעים בודדות (נעשה שימוש ממוצע של שלושה משכפלים טכניים לכל תולעת בודדת). הנקודות מייצגות רמות ביטוי ב- 28 תולעים בודדות. רמות mRNA מגנים היעד היו מנורמל נגד הממוצע של שלושת הגנים משק הבית CDC-42, pmp-3, ו ire-1. (B)מקדם וריאציה26 (CV) כפונקציה של ביטוי mRNA ממוצע עבור 53 תעתיקים בעקבות חשיפה להלם חום קצר חושב מ -28 בעלי חיים בודדים (נתונים גולמיים המוצגים בלוח B). ערכת התמלילים כוללת את התמליל המשתנה nlp-29 27 ושני תעתיקים יציבים (ife-1 ו- Y45F10D.4; נתונים שלא פורסמו). קורות החיים הם היחס בין סטיית התקן לת הממוצע. קורות חיים אלה נוצלו כדי להעריך שונות בין-אינדיבידואלית בביטוי תעתיק בין תולעים בודדות. כצפוי, השונות הבין-אינדיבידואלית משתנה עם רמות ממוצעות מופחתות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: משכפלים טכניים לא היו נחוצים בעת ניתוח שונות בין-אינדיבידואלית בביטוי גנים באמצעות שבב ננופלואידי.
הנתונים שהוצגו בגרף זה התקבלו ב-28 תולעים בודדות בעקבות זעזוע חום קצר (30 דקות ב-34 מעלות צלזיוס). כל נקודה אדומה מייצגת את מקדם הווריאציה (CV) של רמות ביטוי ממוצעות של תעתיק עבור תעתיק אחד הנבחן בין 28 תולעים בודדות (bio CV). כל נקודה כחולה מייצגת את קורות החיים של רמות הביטוי בין שלושה משכפלים טכניים המתקבלים מתולעת אחת, לפי תעתיק המחושב (קורות חיים טכניים). גרף זה מראה כי השונות הטכנית (בין משכפלים טכניים) הייתה נמוכה בהרבה מהשונות הביולוגית (בין תולעים בודדות), דבר המצביע על כך שאין צורך לבצע משכפלים טכניים במערך ביטוי גנים ננו-פלואידי בעת בדיקת ביטוי גנים בתולעים בודדות, בדומה למחקרים חד-תאיים14,15,28. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: תכנון פריסה עבור שבב מרובה מערכים. הטבלה לעיל מציגה פריסה פשוטה שניתן להשתמש בה בעת תכנון הפעלת שבב מרובה מערכים. משמאל נמצאים החללים שיש למלא ביעדי העניין של פריימר ומימין הם חללים שיש למלא בדוגמאות של עניין. כל מבחנים ומערך לדוגמה מזווגים מבחינת מספר דרך השבב. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: תכנון פריסה עבור שבב במערך יחיד. הטבלה לעיל מציגה פריסה פשוטה שניתן להשתמש בה בעת תכנון הפעלת שבב במערך יחיד. בצד שמאל יש חללים שצריכים להתמלא ביעדי עניין ראשוניים ומימין יש חללים שיש למלא בדוגמאות של עניין. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: רשימה של פריימרים RT-qPCR המשמשים במחקר זה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 1: פריימרים ממסד הנתונים של פריימרים RT-qPCR. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

במאמר זה, פרוטוקול Worm-to-CT מוצג כשיטה מהירה ויעילה לחילוץ RNA מתולעים בודדות או ממאגר קטן של תולעים. התפוקה הגבוהה שמציעה המערכת הננופלואידית הופכת אותו לאידיאלי לכימות מדידות שונות בין-אינדיבידואליות. יתר על כן, הרגישות הגבוהה של שיטה זו מאפשרת זיהוי של גנים לידי ביטוי ברמות נמוכות הנופלות מתחת לגילוי בעת שימוש בטכנולוגיות RNA-seq תולעת אחת9.

כאשר בוחנים את הבחירה של שיטה להכין cDNA מתולעים בודדות. Ly et al.29 אופטימיזציה פרוטוקול המסתמך על פרוטאיניאז K לעיכול קוטיקל. הקוטיקל הוא משוכה מרכזית לבידוד מולקולות מתולעים וחלבונים K מספק שיטה יעילה לשבור אותו. עם זאת, proteinase K צריך להיות מומת בחום כדי להיות מסוגל להשתמש באנזימים עבור שעתוק הפוך. בעוד Ly et al. השתמשו בחשיפה של 10 דקות ל-96 מעלות צלזיוס, שלב זה נמנע בפרוטוקול זה מכיוון ש-RNA ניתן להשפלה בקלות. במקום להשתמש בחלבון K, מחזורי הפשרה חוזרים ונשנים שימשו כדי לשבור את הקוטיקל. הפשרת ההקפאה היא שיטה יעילה לשבור את הקוטיקל מכיוון שניתן לבודד יותר RNA לכל תולעת. Ly et al. מדווחים כי RNA הכולל המופק לכל תולעת הוא 35 ng באמצעות פרוטאינאז K, ואילו פרוטוקול זה מקבל 51.75 ng ± 6.74 SEM של RNA הכולל לכל תולעת. הימנעות מחשיפה לחום בשילוב עם צעדי קדם-מדידה ככל הנראה מרחיבה את טווח הזיהוי הדינמי של Worm-to-CT בהשוואה לפרוטוקולים סטנדרטיים. Ly et al. דווח על ערכי Ct מוחלטים של 21.1 ± 0.15 עבור hsp-16.2 ו 22.8 ± 0.17 עבור hsp-70 לאחר הלם חום. באמצעות אותם תנאי הלם חום (1 שעות ב 30 °C (60 °F), פרוטוקול זה מקבל ערכי Ct מוחלטים של 17.93 ± 0.57 עבור hsp-16.2 ו 21.13 ±0.33 עבור hsp-70. הדבר מצביע על כך ששיטת התזה להפשרת הקפאה מספקת תשואות גבוהות יותר של RNA ומתאימה יותר לתעתיקים מבוטאים נמוכים.

מערכות Nanofluidic הן אידיאליות כאשר חוקרים קבוצה נתונה של תעתיקי יעד ושימוש במספר קטן יותר (שבב מרובה מערך) או גדול יותר (שבב במערך יחיד) של דגימות המאפשרות התאמה לקנה המידה של הניסוי. כדי להשיג תמונה לא משוחדת של כל התמלילים המובעים בתולעת אחת, הבחירה הברורה היא להשתמש ברצף RNA. אם, לעומת זאת, המוקד של הניסוי הוא קבוצה קטנה יותר אך עדיין גדולה יחסית של גנים היעד, זה יותר חסכוני לנצל את הפרוטוקול הזה, בתנאי החוקר יש גישה למכונת PCR nanofluidics. העלות של ריאגנטים מערכת nanofluidic ושבב מערך יחיד מוערך כ £ 13 לכל תולעת, ואילו העלויות של ריאגנטים עבור רצף תולעת אחת יהיה כ £ 60 לכל תולעת, לא כולל עלויות רצף.

כאשר בוחנים באיזו פלטפורמת PCR להשתמש, שיטת Worm-to-CT בשילוב עם qPCR ננופלואידי מציעה יתרונות לגבי זמן ותפוקה. ניתן להשיג 9,216 תוצאות RT-qPCR בערך 2 ימים של עבודה, ואילו הגברה של אותו מספר של מטרות באמצעות פלטפורמת qPCR סטנדרטי ייקח בערך 5 שבועות עבודה באמצעות 96 גם לוח בדיקות, פועל ארבע צלחות ביום. עם זאת, אם מספר היעדים להיבדק הוא קטן יותר, אז זה יותר חסכוני להשתמש תולעת ל-CT בשילוב עם מכונת qPCR סטנדרטית. לא ניתן להפעיל מחדש את שבבי המערך הבודד, כך שהפעלת בארות ריקות מקטינה את עלות-היעילות.

מגבלה אחת של השיטה היא היווצרות פוטנציאלית של dimers פריימר-פריימר במהלך שלב multiplexing, אבל זה קורה בפחות מ 1% מהמקרים. למרות שפרוטוקול Worm-to-CT יעיל ומספק תוצאות אמינות כאשר הוא מוחל על תולעים בודדות, יש שיעור כשל של כ -5%, אשר ככל הנראה מתאים למקרים שבהם התולעת נשארת לכודה בכובע או בחלק העליון של הצינור במהלך שלב הקציר.

יחד, שיטה רב-תכליתית ואמינה זו מציעה תפוקה ורגישות מוגברות בהשוואה לטכניקות סטנדרטיות יותר. שיטה זו יכולה להיות שימושית מאוד לאימות מסכי תפוקה גבוהה והיא בחירה מצוינת לנטר או לאמת רמות ביטוי גנים של תולעת אחת. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על טכניקות מאתגרות אחרות, כגון כמות של ביטוי גנים מרקמות מבודדות. לדוגמה, בידוד של רקמות מלאות, כגון המעי, גונדות או תאים המבודדים על ידי FACs, מספק מספיק חומר לביצוע ניסויי רצף RNA. עם זאת, כמויות מוגבלות של חומר מובילות לעתים קרובות לקריאות כפולות, אשר מונעות כמויות של תעתיקים נדירים. בתרחיש זה, באמצעות טכנולוגיה מבוססת nanofluidics צריך לספק רגישות נוספת לניסויים ולהגדיל את עלות היעילות אם החוקרים צריכים לפקח רק על תת קבוצה של כל התמלילים ברקמות או בתאים אלה.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לשרלין מרדוק ולמתקני מכון אייברהם על תמיכתם. JLP נתמך על ידי קרן Wellcome (093970/Z/10/Z) ו- OC נתמך על ידי ERC 638426 ו- BBSRC [BBS/E/B000C0426].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100µM stock primers for genes of interest.
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 for 96.96 chip (Single-Array Chip)
2X Assay Loading Reagent Fluidigm 100-7611
384 well plates
8-strip PCR tubes
96 well ice block
96 well plates
96.96 Dynamic Array IFC Fluidigm BMK-M-96.96 Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip"
96-well sealing tape
BioMark & EP1 Software Fluidigm 101-6793 Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software
BioMark or BioMark HD system Fluidigm 100-2451 K1 Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler"
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs Fluidigm 89000021 Referenced throughout manuscript as "control line fluid"
DNA Suspension buffer TEKnova T0021
domed PCR caps
Exonuclease I New England BioLabs M0293L
Exonuclease I reaction buffer New England BioLabs B0293S
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent Fluidigm 100-7673 referenced throughout manuscript as "sample reagent"
FLEXsix Gene Expression IFC Fluidigm 100-6308 referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip"
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide Fluidigm 68000088 This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.
IFC Controller MX Fluidigm 68000112 I1 Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine"
IFC Controllers SOFTWEAR Fluidigm 100-2297 Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX
liquid nitrogen in dewar
Microcentrifuge StarLab C1301B-230V Used to spin down PCR tube strips in the protocol.
Nuclease Free Water
plate spinner Labnet K4050725 mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner"
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit invitrogen 4402955 This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.
PreAmp Master Mix Fluidigm 100-5580, 100-5581
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions Fluidigm 100-6299 One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)
Rnase Free water
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX Bio-Rad Laboratories 172-5211 referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix"
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA TEKnova T0224 Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer
ThermoMixer C Eppendorf 5382000031 Referenced throughout the text as "thermal mixer"
Trizol Thermo-Fisher 15596026 Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform"
Warm water bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biology. 4 (10), 309 (2006).
  2. Semrau, S., van Oudenaarden, A. Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools. Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).
  3. Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future. Science. 358 (6359), 69-75 (2017).
  4. Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).
  5. Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (2), 107-112 (2007).
  6. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , Edited by The C. elegans Research Community (2015).
  7. Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).
  8. Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).
  9. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  10. Serra, L., et al. Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq. Bio-protocol. 8 (4), 2729 (2018).
  11. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Biology. 14 (8), 1007559 (2018).
  12. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  13. Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).
  14. Ståhlberg, A., Kubista, M. The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).
  15. Livak, K. J., et al. Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells. Methods. 59 (1), 71-79 (2013).
  16. Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide. , https://www.fluidigm.com/binaries/content/documents/fluidigm/resources/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/fluidigm%3Afile (2018).
  17. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
  18. U. S. National Library of Reference. Primer Blast. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ (2020).
  19. Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).
  20. Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).
  21. Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Jr Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinformatics. 22 (7), 85 (2006).
  22. He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).
  23. Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).
  24. Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
  25. Zhang, X., Zhang, Y. Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).
  26. Sørensen, J. B. The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research. Sociological Methods & Research. 30 (4), 475-491 (2002).
  27. Pujol, N. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).
  28. Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
  29. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).

Tags

גנטיקה גיליון 159 RT-qPCR תולעת אחת C. elegans דגימות בתפזורת תולעת ל- CT נמטודות תפוקה גבוהה ננופלואידית מולטיפלקס
RT-PCR כמותי בעל תפוקה גבוהה בדגימות <em>סי.</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chauve, L., Le Pen, J., Hodge, F.,… More

Chauve, L., Le Pen, J., Hodge, F., Todtenhaupt, P., Biggins, L., Miska, E. A., Andrews, S., Casanueva, O. High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology. J. Vis. Exp. (159), e61132, doi:10.3791/61132 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter