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Genetics

नैनोफ्लुइडिक तकनीक का उपयोग करके एकल और बल्क सी एलिगेंस नमूनों में उच्च-थ्रूपुट मात्रात्मक आरटी-पीसीआर

Published: May 28, 2020 doi: 10.3791/61132
Automatic Translation
*1, *2,3,5, 1, 1, 1, 2,3,4, 1, 1
1Babraham Institute, 2Gurdon Institute, University of Cambridge, 3Department of Genetics, University of Cambridge, 4Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute, 5Laboratory of Virology and Infectious Disease, The Rockefeller University
* These authors contributed equally

Summary

इस लेख में एकल या थोक सी elegans नमूनों में जीन अभिव्यक्ति के स्तर के तेजी से और विश्वसनीय निर्धारण के लिए एक उच्च थ्रूपुट प्रोटोकॉल वर्णित है । इस प्रोटोकॉल आरएनए अलगाव की आवश्यकता नहीं है और नमूनों से सीधे सीडीएनए का उत्पादन करता है। इसका उपयोग उच्च-थ्रूपुट मल्टीप्लेक्स्ड नैनोफ्लुइडिक रियल-टाइम क्यूपीसीआर प्लेटफार्मों के साथ किया जा सकता है।

Abstract

यह पेपर कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस के लिए एक उच्च-थ्रूपुट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर) परख प्रस्तुत करता है जो तेज, मजबूत और अत्यधिक संवेदनशील है। यह प्रोटोकॉल एकल कीड़े से या थोक नमूनों से जीन अभिव्यक्ति के सटीक माप प्राप्त करता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल पूरक डीएनए (सीडीएनए) तैयारी के लिए मौजूदा तरीकों का एक उपन्यास अनुकूलन प्रदान करता है जो नैनोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म के साथ मिलकर है। इस प्रोटोकॉल का पहला भाग, जिसका नाम 'वर्म-टू-सीटी' है, सीडीएनए उत्पादन को पूर्व एमएनए अलगाव की आवश्यकता के बिना सीधे सूत्रकृमि से अनुमति देता है। यह 3.5 घंटे में 96 कीड़े से सीडीएनए की तैयारी की अनुमति देकर प्रयोगात्मक थ्रूपुट बढ़ाता है। प्रोटोकॉल का दूसरा हिस्सा सीडीएनए पर हाई-थ्रूपुट आरटी-क्यूपीसीआर चलाने के लिए मौजूदा नैनोफ्लुइडिक तकनीक का इस्तेमाल करता है । यह पेपर दो अलग-अलग नैनोफ्लुइडिक चिप्स का मूल्यांकन करता है: पहला 96 नमूने और 96 लक्ष्य चलाता है, जिसके परिणामस्वरूप बेंचवर्क के लगभग 1.5 दिनों में 9,216 प्रतिक्रियाएं होती हैं। दूसरी चिप प्रकार में छह 12 x 12 सरणी होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप 864 प्रतिक्रियाएं होती हैं। यहां, कीड़ा से सीटी विधि जीन के mRNA स्तर की मात्रा निर्धारित करके प्रदर्शित किया जाता है एक कीड़े से और थोक नमूनों से गर्मी सदमे प्रोटीन encoding । बशर्ते सी एलिगेंस जीनोम के भीतर कोडिंग जीन के बहुमत के लिए प्रसंस्कृत आरएनए को बढ़ाना करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमर की एक व्यापक सूची है।

Introduction

एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण और क्यूपीसीआर के अनुकूलन से पता चला है कि ट्रांसक्रिप्शनल दालें या फटने से प्रति सेल1आरएनए अणुओं की संख्या में भारी भिन्नता हो सकती है । इसके अलावा, इन प्रौद्योगिकियों ने पहले मानक थोक ट्रांसक्रिप्टोर्मिक मापन से चूक गए पर्याप्त सेलुलर विषमता का पर्दाफाश किया। संदर्भ के आधार पर, कुछ एकल-कोशिका प्रतिलेखन परिवर्तनशीलता ऊतकों की मिश्रित सेलुलर संरचना के कारण होती है। हालांकि , एक ही वातावरण के तहत उगाई जाने वाली आइसोजेनिक सेल आबादी में भी व्यापक ट्रांसक्रिप्शनल विषमता2,3है। इस ' जैविक परिवर्तनशीलता ' तेजी से सेलुलर नेटवर्क की एक सर्वव्यापी संपत्ति के रूप में पहचान की है, बैक्टीरिया से आदमी के लिए । कुछ मामलों में, यह विकास, कैंसर की प्रगति, एचआईवी विलंबता, और कीमोथेरेपी4,5के लिए प्रतिक्रिया में फेनोटाइपिक परिणाम हो सकता है ।

नेमाटोड कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस व्यक्तियों के बीच जैविक परिवर्तनशीलता के कारणों और परिणामों का अध्ययन करने के लिए आदर्श विशेषताओं के साथ एक अद्वितीय मॉडल जीव है। ये सूत्रकृमि 959 कोशिकाओं से बना एक सरल मॉडल जीव हैं, और उनका पारदर्शी क्यूटिकल उन्हें वीवो इमेजिंग अध्ययन6में उत्तरदायी बनाता है। सी एलिगेंस एक हर्मैफ्रोडिटिक प्रजाति है जो मुख्य रूप से आत्म-निषेचन के माध्यम से पुन: उत्पन्न होती है; इसके परिणामस्वरूप आइसोजेनिक प्रयोगशाला उपभेदों में हुई। आइसोजेनिकिटी और नियंत्रित संस्कृति की स्थितियों के बावजूद, कई फेनोटाइप और ट्रांसक्रिप्ट व्यक्तियों में परिवर्तनशील होते हैं, जो यह सुझाव देते हैं कि स्टोचस्टिक या माइक्रोएनवायरमेंटल मतभेद व्यक्तियों में विषमता में योगदान देते हैं7,8। जीन अभिव्यक्ति में इस तरह की परिवर्तनशीलता के कई फिटनेस परिणाम होते हैं, जिनमें उत्परिवर्तन, अस्तित्व, विकासात्मक समय औरफेक्यूंटी7,8,9के पेनेट्रेंसी में परिवर्तनशीलता शामिल है। इन विशेषताओं के कारण, एकल-कृमि अध्ययन पूरे जीव में जैविक परिवर्तनशीलता का अध्ययन करने का अभूतपूर्व अवसर प्रदान करते हैं।

एकल-कृमि स्तर पर टेप का सटीक पता लगाने के लिए प्रौद्योगिकियों को विकसित और अनुकूलित करने के लिए क्षेत्र में एक बुनियादी आवश्यकता है । नई प्रौद्योगिकियां, जैसे एकल-कीड़ा आरएनए अनुक्रमण10,अलग ऊतकों से आरएनए अनुक्रमण11,और एकल सेल अनुक्रमण12 अब सी एलिगेंसके लिए उपलब्ध हैं। हालांकि, एक मुख्य चुनौती बनी हुई है: जब अंतरविभावैद्यता की निगरानी, कमजोर व्यक्त जीन अक्सर पता लगाने योग्य स्तर13से नीचे गिर जाते हैं । यह विशेष रूप से दुर्लभ टेप शुरू करने वाली सामग्री की छोटी मात्रा से अलग करने के लिए प्रासंगिक है, क्योंकि मतलब अभिव्यक्ति और तकनीकी विचरण के बीच एक अच्छी तरह से स्थापित, व्युत्क्रम संबंध है, जिससे अक्सर दुर्लभ प्रतिलिपियां सांख्यिकीय कटऑफ13से नीचे गिर जाती हैं। उच्च-थ्रूपुट मल्टीप्लेक्स क्यूपीसीआर प्रौद्योगिकियों का अनुकूलन स्तनधारी एकल-कोशिका अध्ययनों के लिए उपयोगी साबित हुआ है, विशेष रूप से दुर्लभ प्रतिलिपियों14, 15की अभिव्यक्ति का अध्ययन करते समय। इस तकनीक का उपयोग अन्य एकल-कृमि प्रौद्योगिकियों के बेंचमार्किंग और सत्यापन उद्देश्यों के लिए भी किया जा सकता है।

कृमि से सीटी एक तेज, मजबूत विधि है जो सेल बायोलॉजी अध्ययन में उपयोग की जाने वाली किट से अनुकूलित होती है, एकल वर्म सीडीएनए तैयारी के लिए। इस विधि द्वारा प्राप्त सीडीएनए को मल्टीप्लेक्स नैनोफ्लुइडिक क्यूपीसीआर प्रौद्योगिकी के साथ मिलकर चुना गया था क्योंकि यह उच्च प्रयोगात्मक थ्रूपुट प्रदान करता है, जो पता लगाने की एक व्यापक गतिशील रेंज है और इसे एकल-कोशिका प्रयोजनों14, 15के लिए मान्य किया गया है । सीडीएनए की तैयारी मानक पीसीआर प्रौद्योगिकियों के साथ उपयोग के लिए भी लागू है। थ्रूपुट दो तरीकों से बढ़ जाता है: पहला, सीडीएनए तैयारी पारंपरिक ग्वानिडियम थियासाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण की तुलना में तेज और अधिक विश्वसनीय है, क्योंकि कीड़े सीधे लाइसिस बफर में जोड़े जाते हैं, आसानी से डिग्रेडेबल आरएनए के सीधे अलगाव को छोड़ देते हैं। दूसरा, नैनोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकियों का उपयोग करने से नमूनों और लक्ष्यों की संख्या में काफी वृद्धि होती है जिन्हें एक साथ चलाया जा सकता है। इस पेपर में, दो चिप्स की तुलना की जाती है: एक एकल-सरणी चिप और एक बहु-सरणी चिप। एक एकल सरणी चिप 96 एकल कीड़े और 96 प्राइमर सेट चला सकती है, जिसके परिणामस्वरूप प्रति प्रयोग 9,216 प्रतिक्रियाएं होती हैं। मानक क्यूपीसीआर प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके समान थ्रूपुट को पूरा करने के लिए 96 अच्छी प्लेटों का उपयोग करके 96 अलग क्यूपीसीआर प्रयोगों की आवश्यकता होगी। छोटे और अधिक लचीला बहु-सरणी चिप में छह 12 x 12 सरणी होती हैं जिसके परिणामस्वरूप 864 प्रतिक्रियाएं होती हैं। विधि की बेहतर विश्वसनीयता और संवेदनशीलता नैनोफ्लुइडिक प्रौद्योगिकी द्वारा और एक प्रीएम्पिलिफिकेशन चरण की शुरूआत से बढ़ाया जाता है। इस पेपर में प्रस्तुत विधि का उपयोग जैविक विचरण निकालने के लिए अत्याधुनिक सांख्यिकीय एल्गोरिदम के साथ किया जाना है। यह लेख एकल-कीड़े और बैच कृमि नमूनों दोनों के लिए तेजी से सीडीएनए तैयारी और उच्च-थ्रूपुट क्यूपीसीआर के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है; एल्गोरिदम कहीं और प्रकाशित किया जाएगा। इस प्रोटोकॉल के लिए, प्रयोग से पहले प्रत्येक चिप का संगठन तैयार किया जाना चाहिए। तालिका 1 और तालिका 2 क्रमशः एक बहु-सरणी और एकल-सरणी चिप के लिए इन योजनाओं के उदाहरण दिखाते हैं। चित्रा 1 में विस्तृत कीड़ा-टू-सीटी प्रोटोकॉल का अवलोकन भी कर रहे हैं और चित्रा 2में बहु-सरणी और एकल-सरणी चिप्स चला रहे हैं।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल के दौरान कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस को "कीड़ा" या "कीड़े" के रूप में जाना जाता है। सी एलिगेंस उपभेदों की एक किस्म ऑनलाइन डेटाबेस के माध्यम से या सीधे प्रयोगशालाओं कि मॉडल जीव का उपयोग से संपर्क करके आदेश दिया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का भाग I (सेक्शन 1−3) वर्म-टू-सीटी प्रोटोकॉल के माध्यम से सीडीएनए की तैयारी का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल का भाग II (सेक्शन 4−13) में फ्लूइडइगम16द्वारा विकसित प्रोटोकॉल से अनुकूलित नैनोफ्लुइडिक्स का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट आरटी-क्यूपीसीआर चलाने का वर्णन किया गया है। यह प्रोटोकॉल पहले परिभाषित नैनोफ्लुइडिक चिप्स के दो प्रकार के उपयोग पर लागू होता है, एकल-सरणी चिप, जो 96 नमूनों (9,216 आरटी-क्यूपीसीआर प्रतिक्रियाओं कुल) में 96 लक्ष्यों की निगरानी कर सकती है, या बहु-सरणी चिप, जो 12 लक्ष्य x 12 नमूनों के उपइकाओं के रूप में कार्य करती है। हर मल्टी-ऐरे चिप में छह स्वतंत्र सरणी होती हैं जिन्हें एक साथ या अलग से चलाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक पूरी बहु-सरणी चिप का उपयोग करके 72 लक्ष्यों को x 12 नमूनों (या इसके विपरीत), या 36 लक्ष्य x 24 नमूनों (या इसके विपरीत) की निगरानी कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली किसी भी सामग्री के बारे में अधिक जानकारी के लिए, सामग्री की तालिका काउल्लेख करें।

1. आरटी-क्यूपीसीआर प्राइमर सत्यापन

नोट: रियल टाइम प्राइमर मूल रूप से MIQUE दिशानिर्देश17द्वारा जारी की गई अनुशंसित संपत्तियों के आधार पर डिजाइन किए गए थे । प्रसंस्कृत आरएनए के लिए प्राइमर विशिष्ट बनाने के लिए, उत्पादों को इस तरह डिजाइन किया गया था कि दो प्राइमर कम से कम एक स्प्लिस जंक्शन के दोनों तरफ बंधे थे। उपयुक्त प्राइमर के लिए आवश्यकताओं में 20%−80% ग्वानाइन और साइटोसीन सामग्री, 58−60 डिग्री सेल्सियस का पिघलने का तापमान, ≤0.5 डिग्री सेल्सियस के प्राइमर जोड़े और 70-120 बीपी की उत्पाद लंबाई के बीच पिघलने के तापमान में अंतर शामिल था। उत्पन्न प्राइमर का अनुक्रम पूरक तालिका 1में पाया जा सकता है। प्राइमर जेनरेट करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली स्क्रिप्ट के लिए ओपन सोर्स कोड https://github.com/s-andrews/wormrtpcr पर पाया जा सकता है। स्प्लिस साइटों के साथ टेप के लिए प्राइमर जोड़े डिजाइन किए गए थे ताकि वे एक इंट्रॉन को फ्लैंक करने वाले दो एक्सॉन में झूठ बोलें, लेकिन एनसीबीआई प्राइमर ब्लास्ट सॉफ्टवेयर18का उपयोग करके स्प्लिस-वैरिएंट विशिष्ट होने के लिए डिज़ाइन नहीं किए गए थे। इस अध्ययन के लिए, किसी भी ऑफ-टारगेट पूरकता के लिए परीक्षण करने के लिए सी एलिगेंस जीनोम के खिलाफ प्राइमर सेट को नष्ट कर दिया गया था।

  1. आरटी-क्यूपीसीआर प्राइमर(पूरक तालिका 1)के डेटाबेस से प्राइमर को पुनः प्राप्त करें। वैकल्पिक रूप से, एनसीबीआई प्राइमर ब्लास्ट18जैसे ऑनलाइन टूल का उपयोग करके क्यूपीसीआर प्राइमर जोड़े डिजाइन करें।
  2. मानक बल्क क्यूपीसीआरतकनीकों का उपयोग करके प्रत्येक जोड़ी प्राइमर के लिए विशिष्टता और पीसीआर दक्षता की निगरानी करने के लिए एक क्यूपीसीआर मानक वक्र प्रदर्शन करें और एमआईईई दिशानिर्देश17,20का पालन करें ।
    नोट:85% से 115% के बीच आर 2 और जीटी; 0.98 और पीसीआर दक्षता के साथ केवल प्राइमर जोड़े का उपयोग किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर के लिए अनुक्रम, पीसीआर दक्षता और आर2 तालिका 3में विस्तृत हैं।

2. कृमि से सीटी के माध्यम से कीड़ा लाइसिस

  1. एक ताजा, गैर वरीयता प्राप्त एनजीएम प्लेट पर अपने जीवाणु लॉन से कीड़े उठाओ और कीड़े 5 मिनट के लिए थाली के चारों ओर ले जाने के लिए अपने आंदोलन के माध्यम से कीड़ा से बैक्टीरिया के अधिकांश को दूर करने की अनुमति देते हैं ।
    नोट: बैक्टीरियल लॉन और बढ़ती स्थितियों प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर अलग होगा । यहां प्रस्तुत किए गए प्रयोगों के लिए ओपी 50 एस्चेरिचिया कोलाई के साथ वरीयता प्राप्त 6 सेमी एनजीएम प्लेटों की आवश्यकता होती है, जिसमें रुचि के कीड़े 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में L4.9 चरण में उगाए जाते हैं।
  2. एक RNase मुक्त हुड में, एक मास्टर मिश्रण तैयार करें जिसमें 2x आरटी बफर के 12.5 माइक्रोन, 20x आरटी एंजाइम बफर के 1.25 माइक्रोन और प्रति नमूना नाभिक मुक्त पानी का 0.25 माइक्रोन शामिल है। चरण 2.8 से प्रत्येक नमूने के 11 माइक्रोन में मास्टर मिश्रण के 14 माइक्रोन जोड़ें।
  3. एक पीसीआर पट्टी के ढक्कन को विच्छेदन दायरे के मंच पर उल्टा रखें और एक यौगिक माइक्रोस्कोप के नीचे गुंबददार पीसीआर ट्यूब कैप में लाइसिस मिश्रण के 10 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: केवल एक या दो नमूनों के साथ, कम से कम चार ट्यूबों वाली पीसीआर पट्टी का उपयोग करना बेहतर होता है, क्योंकि इससे बाद के फ्रीज-गल चरणों में खुले कैप्स ब्लास्टिंग का खतरा कम हो जाता है। वैकल्पिक रूप से, रबर बैंड जगह में टोपियां पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उस मामले में सुनिश्चित करें कि टोपियां ठीक से हर बार ट्यूबों स्थानांतरित कर रहे है बंद कर रहे हैं ।
  4. प्लेट से कीड़े को लिसिस मिश्रण के प्रत्येक स्लॉट में "स्कूपिंग" द्वारा लें (यानी, पिक के साथ नीचे कीड़े को पकड़ना) बैक्टीरियल संदूषण से बचने के लिए। ट्यूबों को बंद करें और तरल नाइट्रोजन से भरे देवर फ्लास्क में रखने से पहले टेबलटॉप माइक्रोसेंट्रफ्यूज(सामग्री की टेबल) काउपयोग करके उन्हें 5 एस के लिए नीचे स्पिन करें।
    नोट: 15 और 30 कीड़े के बीच थोक प्रयोगों के लिए और एकल कृमि माप के लिए 1 कीड़ा का इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
    सावधानी: तरल नाइट्रोजन से निपटने के दौरान क्रायो-दस्ताने के साथ-साथ सुरक्षात्मक आईवियर पहनते हैं और मानक कपड़ों के नियमों का पालन करते हैं, क्योंकि त्वचा या आंखों के संपर्क में गंभीर ठंढ की चोट हो सकती है।
  5. फ्रीज-गल पीसीआर ट्यूब 10x तरल नाइट्रोजन और एक ~ 40 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान के बीच स्थानांतरित करके। नमूनों को पूरी तरह से जमे हुए हैं सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 5 एस के लिए तरल नाइट्रोजन में ट्यूब छोड़ दें। पानी स्नान में ट्यूबों छोड़ जब तक नमूने गल । लंबी अवधि के लिए न छोड़ें, क्योंकि इससे आरएनए क्षरण होता है।
    नोट: ट्यूबों को तरल नाइट्रोजन में विस्तारित अवधि के लिए छोड़ा जा सकता है, क्योंकि नमूने लगभग -200 डिग्री सेल्सियस तक जमे हुए हैं, जिससे आरएनए क्षरण कम होता है। हालांकि, यह एक प्रोटोकॉल रोक बिंदु नहीं होना चाहिए, क्योंकि तरल नाइट्रोजन तेजी से वाष्पित हो जाता है ।
  6. नमूनों को एक थर्मल मिक्सर(सामग्री की तालिका)पर मिलाएं जो ~ 1,800 आरपीएम पर 20−30 मिनट घूर्णन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया गया है।
  7. जबकि नमूनों को मिलाया जा रहा है, बर्फ पर स्टॉप सॉल्यूशन गल ।
  8. टेबलटॉप माइक्रोसेंट्रफ्यूज(सामग्री की तालिका) काउपयोग करके नमूनों को नीचे स्पिन करें और प्रत्येक ट्यूब में स्टॉप समाधान के 1 माइक्रोल जोड़ें।
    नोट: नमूनों को आरएनए (धारा 3) को रिवर्स ट्रांसक्रिब करने से पहले 1 सप्ताह तक -80 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ा जा सकता है।

3. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन

नोट: एकल कीड़े के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए, यहां दिखाए गए परिणाम नैनोफ्लुइडिक चिप्स (चित्र 1में विकल्प 2) के साथ प्रदान किए गए अभिकर्मकों का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे। चित्रा 1 के विकल्प 2 में हाइलाइट किए गए रिएजेंट्स का उपयोग पूल किए गए नमूनों के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए भी किया गया था। या तो विधि विभिन्न नमूना प्रकारों के लिए एक दूसरे के साथ काम करती है।

  1. एकल कीड़े का रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन
    1. एक RNase मुक्त हुड में, एक ताजा पीसीआर ट्यूब में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मिश्रण(सामग्री की तालिका) के1.25 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: एक ९६ अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट और एक स्वचालित पिपेट का इस्तेमाल किया जा सकता है अगर वहां कई नमूने हैं । निर्माता का प्रोटोकॉल बताता है कि प्रति नमूना 1 माइक्रोन का उपयोग किया जा सकता है।
    2. लाइसिस सॉल्यूशन के 5 माइक्रोन लें और स्टेप 2.8 से सॉल्यूशन मिक्स को रोकें और इसे रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मिक्स युक्त फ्रेश पीसीआर ट्यूब में जोड़ें।
      नोट: निर्माता के प्रोटोकॉल में कहा गया है कि आरएनए के 1 माइक्रोन (2.5 स्नातकोत्तर/μL-250 एनजी/μL) प्रति प्रतिक्रिया का उपयोग किया जा सकता है। प्रति प्लेट एक नकारात्मक आरटी नियंत्रण को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मिश्रण को 5 माइक्रोन के साथ lysed नमूना और आरएनई-मुक्त पानी के 1.25 माइक्रोन के साथ जोड़ा जा सकता है।
    3. थर्मोसाइकिलर पर निम्नलिखित रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रोग्राम का उपयोग करके नमूनों को चलाएं: 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, 30 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस और ∞ के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
      नोट: उत्पादित सीडीएनए को उच्च-थ्रूपुट क्यूपीसीआर का उपयोग करके प्रवर्धन और डेटा संग्रह के लिए आगे बढ़ने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. थोक नमूनों के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (15−30 कीड़े)
    1. एक RNase मुक्त हुड में, एक मास्टर मिश्रण तैयार करें जिसमें 2x आरटी बफर के 12.5 माइक्रोन, 20x आरटी एंजाइम बफर के 1.25 माइक्रोन और प्रति नमूना नाभिक मुक्त पानी का 0.25 माइक्रोन शामिल है। लाइसिस समाधान के 11 माइक्रोन में मास्टर मिक्स के 14 माइक्रोन जोड़ें और चरण 2.8 से समाधान मिश्रण बंद करें।
      नोट: जब नमूनों की एक बड़ी संख्या से निपटने यह ९६ अच्छी तरह से प्लेटों में प्रदर्शन किया जा सकता है ।
    2. निम्नलिखित रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रोग्राम का उपयोग करके थर्मोसाइकिलर के माध्यम से नमूनों को चलाएं: 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और ∞ के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
    3. नाभिक मुक्त पानी में उत्पादित सीडीएनए 1:4 को पतला करें।
      नोट: आम तौर पर, उत्पादों को 25 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में आता है, जिस स्थिति में 75 माइक्रोन जोड़ा जाना चाहिए। हालांकि, संघनन के कारण अंतिम मात्रा भिन्न हो सकती है। इसलिए, अंतिम समाधान में 1:4 अनुपात बनाने के लिए तदनुसार समायोजित करें। यदि एकल कीड़े पर क्यूपीसीआर प्रदर्शन करते हैं तो यह कमजोर पड़ने वाला कदम लागू नहीं होता है। उत्पादित सीडीएनए को उच्च-थ्रूपुट क्यूपीसीआर का उपयोग करके प्रवर्धन और डेटा संग्रह के लिए आगे बढ़ने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. मल्टीप्लेक्स प्राइमर मिक्स की तैयारी

  1. 50 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता पर प्राइमर की प्रत्येक जोड़ी के लिए एक फॉरवर्ड/रिवर्स (एफ/आर) प्राइमर स्टॉक तैयार करें। प्रत्येक 100 माइक्रोन पर फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर की एक ही मात्रा मिलाएं।
  2. प्रत्येक प्राइमर जोड़ी का परीक्षण करने के लिए 50 μM F/R प्राइमर स्टॉक के 1 μL गठबंधन करें। डीएनए निलंबन बफर को 100 माइक्रोन की कुल मात्रा तक जोड़ें।
    नोट: स्टॉक प्राइमर सांद्रता यहां निर्माता के प्रोटोकॉल16 में वर्णित लोगों से अलग है, लेकिन ५०० एनएम की एक ही अंतिम एकाग्रता बनाए रखने ।

5. लक्ष्य विशिष्ट प्रीएम्प्लिकरण

  1. एक मास्टर मिश्रण तैयार करें जिसमें 1 माइक्रोन प्रीमिलिफिकेशन मास्टरमिक्स(सामग्री की तालिका),पूल्ड प्राइमर मिक्स (चरण 4.2) का 0.5 माइक्रोन, और 10% समग्र अधिशेष मात्रा के साथ नाभिक मुक्त पानी प्रति प्रतिक्रिया का 2.25 माइक्रोन शामिल है।
  2. एक 96 अच्छी तरह से प्लेट में, मास्टर मिश्रण के 3.75 μL के रूप में कई कुओं के रूप में नमूनों की संख्या के लिए आवश्यक में चलाने के लिए।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से चरण 3.1.3 या 3.2.3 पर उत्पन्न ब्याज के सीडीएनए समाधानों में से 1.25 माइक्रोन जोड़ें।
  4. 96 अच्छी तरह से सीलिंग टेप, संक्षेप भंवर, और एक टेबलटॉप प्लेट स्पिनर के साथ अपकेंद्रित्र के साथ प्लेट को कवर करें। एक थर्मोसाइकिलर में स्थानांतरित करें और निम्नलिखित कार्यक्रम चलाएं: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 चक्र, 4 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग/एक्सटेंशन, और ∞ के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
    नोट: निर्माता प्रीएम्प्लिफिकेशन रिएक्शन16के लिए 10−20 चक्रों से सिफारिश करता है । यह प्रोटोकॉल लक्ष्य जीन के अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर 10 या 15 चक्रों की सिफारिश करता है।

6. एक्सोक्यूलीज आई ट्रीटमेंट

नोट: यह अनिगमित प्राइमर को प्रीएम्प्लिकरण से हटाने के लिए है।

  1. एक एक्सोक्यूलाइज तैयार करें मैं एक्सोन्यूक्लिज आई रिएक्शन बफर(सामग्री की तालिका),एक्सोन्यूक्लिज I के 0.4 माइक्रोन से युक्त 20 यू/माइक्रोन(सामग्री की तालिका)और प्रति नमूना नाभिक मुक्त पानी के 1.4 माइक्रोन मिश्रण करता हूं। बर्फ पर सभी अभिकर्ण रखें, विशेष रूप से एक्सोकलिज़न I।
  2. थर्मोसाइकिलर से 96 वेल प्लेट (स्टेप 5.4) निकालें, टेबलटॉप प्लेट स्पिनर के साथ अपकेंद्रित्र करें, और ध्यान से सील हटा दें। एक्सोन्यूक्लिज के 2 माइक्रोन जोड़ें मैं प्रत्येक प्रीएम्प्लिडिफिकेशन रिएक्शन में मिलाता हूं। रिसील, सेंट्रलाइज, और निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करके 96 अच्छी तरह से प्लेट को थर्मोसाइकिलर में वापस रखें: 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस, और ∞ के लिए 4 डिग्री सेल्सियस।
  3. नमूनों को थर्मोसाइकिलर से बाहर निकालें और उन्हें 1x ट्रिस ईडीए बफर(सामग्रीकी तालिका) के 18 माइक्रोन जोड़कर 1:5 पतला करें।
    नोट: बाद में उपयोग के लिए सीडीएनए नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर रखना संभव है। निर्माता के प्रोटोकॉल में ब्याज के लक्ष्यों के अभिव्यक्ति स्तर के आधार पर इस चरण16में 5x, 10x या 20x के संभावित कमजोर पड़ने का सुझाव दिया गया है।

7. परख घोला जा सकता है की तैयारी

नोट: परख घोला जा सकता है ३८४ अच्छी तरह से प्लेटों में तैयार किया जा सकता है, के रूप में कुओं नैनोफ्लुइडिक चिप्स के रूप में एक ही अंतर है, लोडिंग आसान बना रही है ।

  1. एक बहु सरणी चिप के लिए परख घोला जा सकता है तैयारी
    1. तैयार योजना के अनुसार प्रत्येक कुएं के लिए 2x परख लोडिंग रिएजेंट(सामग्री की तालिका)और डीएनए निलंबन बफर(सामग्री की तालिका) के1.6 माइक्रोन से मिलकर एक मास्टर मिश्रण तैयार करें। इस मास्टर मिश्रण के 3.6 माइक्रोन को 384 अच्छी तरह से प्लेट में शामिल किया गया है।
    2. तैयार योजना के अनुसार उचित कुओं में कदम 4.1 में तैयार 50 μM F/R प्राइमर स्टॉक के 0.4 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: यह 1 माइक्रोन के अधिशेष के साथ, प्रति अच्छी तरह से परख मिश्रण की कुल 4 माइक्रोन प्रदान करता है।
  2. एक एकल सरणी चिप के लिए परख घोला जा सकता है तैयारी
    1. तैयार योजना के अनुसार प्रत्येक कुएं के लिए 2x परख लोडिंग रिएजेंट के 3 माइक्रोन और डीएनए सस्पेंशन बफर के 2.4 माइक्रोन से मिलकर एक मास्टर मिश्रण तैयार करें। अलीकोट 5.4 इस मास्टर मिश्रण के एक चिह्नित 384 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से मिश्रण।
    2. तैयार योजना के अनुसार उपयुक्त कुओं में 50 माइक्रोनएम एफ/आर प्राइमर स्टॉक का 0.6 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: यह 1 माइक्रोल के अधिशेष के साथ, प्रति अच्छी तरह से परख मिश्रण की कुल 6 माइक्रोन प्रदान करता है।

8. नमूना घोला जा सकता है की तैयारी

नोट: नमूना घोला जा सकता है पहले से 1 दिन तक तैयार किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

  1. एक बहु-सरणी चिप के लिए नमूने तैयार करना
    1. एक नमूना मास्टर मिश्रण तैयार करें जिसमें कम रॉक्स(सामग्रीकी तालिका) के साथ 2x फ्लोरोसेंट प्रोब सुपरमिक्स का 2 माइक्रोन और प्रति नमूना रीएजेंट(सामग्री की तालिका) का0.2 माइक्रोन शामिल है। चिह्नित 384 अच्छी तरह से प्लेट में इस मिश्रण के 2.2 μL बांटना।
      नोट: निर्माता नमूना अभिकर्ण16भंवर नहीं की सिफारिश की ।
    2. प्रत्येक प्रीएम्पुलिफाइड, एक्सोन्यूलेस मैंने तैयार योजना के अनुसार उचित कुओं में कदम 3.2.3 से नमूना का इलाज किया।
      नोट: यह कुल 4 माइक्रोन देता है, जिसमें 1 माइक्रोन का अधिशेष होता है।
  2. एक एकल सरणी चिप के लिए नमूने तैयार करना
    1. एक नमूना मास्टर मिश्रण तैयार करें जिसमें कम रॉक्स(सामग्रीकी तालिका) के साथ 2x फ्लोरोसेंट प्रोब सुपरमिक्स के 3 माइक्रोन और प्रति नमूना 20x डीएनए-बाइंडिंग डाई नमूना लोडिंग रिएजेंट(सामग्री की तालिका) का0.3 माइक्रोन शामिल है। चिह्नित 384 अच्छी तरह से प्लेट में इस मिश्रण के 3.3 μL बांटना।
    2. प्रत्येक प्रीम्प्लिफाइड और एक्सोन्यूलेस के पिपेट 2.7 माइक्रोन मैंने तैयार योजना के अनुसार उचित कुओं में चरण 6.3 से नमूना का इलाज किया।
      नोट: यह कुल 6 माइक्रोन देता है, जिसमें 1 माइक्रोन का अधिशेष होता है। यदि कोई कुआं नमूने के बिना चलाया जाना है तो इन्हें सीडीएनए के बजाय नमूना मास्टर मिक्स और 2.7 माइक्रोन पानी से भरा होना चाहिए। यह दोनों चिप प्रकार के लिए अनुशंसित है। चिप के ग्रिड का पता लगाने के लिए मशीन को हर इनलेट में कम रॉक्स की जरूरत होती है ।

9. नैनोफ्लुइडिक चिप भड़काना

नोट: एक बहु-सरणी चिप को केवल पहले रन पर प्रिड करने की आवश्यकता होती है। यदि एक ही चिप के बाद रन हैं तो इस चरण को छोड़ दिया जा सकता है। ये कदम दोनों चिप प्रकार के लिए एक ही हैं।

  1. धीरे-धीरे और ध्यान से, चिप के संचायकों में शामिल सीरिंज से नियंत्रण रेखा तरल पदार्थ के पूर्ण 150 माइक्रोन इंजेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि कोई नियंत्रण तरल चिप को 45 डिग्री कोण पर पकड़कर और स्पिलेज से बचने के लिए सिरिंज की नोक को दूर पकड़कर नहीं छूता है।
  2. चिप के नीचे से ब्लू प्रोटेक्टिव फिल्म निकालें।
  3. चिप को नैनोफ्लुइडिक्स पीसीआर प्राइमिंग मशीन(सामग्री की तालिका)में रखें, जिसमें बारकोड बाहर की ओर सामना करना पड़ रहा है। 'प्राइम(153x)स्क्रिप्ट चलाते हैं, जिसमें ~15-20 मिनट लगते हैं।
    नोट: इस स्तर पर नैनोफ्लुइडिक्स थर्मोसाइकिलर(सामग्री की तालिका)चालू करें, क्योंकि कैमरा 0 डिग्री सेल्सियस से नीचे ठंडा होने में लगभग 10 मिनट का समय लेता है।

10. नैनोफ्लुइडिक चिप लोड

  1. लोडिंग के रूप में क्रमिक रूप से बाधा प्लग निकालें। इससे कुओं को गलत तरीके से लोड करने की संभावना कम हो गई है ।
  2. तैयार योजना के अनुसार नैनोफ्लुइडिक चिप के इसी इनलेट्स में प्रत्येक प्राइमर परख घोला जा सकता है और नमूना घोला जा सकता है की एक बहु-सरणी चिप के लिए या तो 3 μL या स्थानांतरण। सुनिश्चित करें कि बुलबुले पेश न करें, जो कुल मात्रा को वांछित से छोटा हो सकता है।
    नोट: यदि कोई कुओं है कि एक प्राइमर के बिना चलाया जाएगा यह महत्वपूर्ण है इन मास्टर मिश्रण के साथ लोड किया जाना है, पानी के साथ प्राइमर मात्रा प्रतिस्थापन । यह दोनों चिप प्रकारों पर लागू होता है। इस अवस्था में चिप को अंधेरी सतह पर रखना आसान हो सकता है, जिससे कुओं को ज्यादा आसानी से देखा जा सकेगा।

11. नैनोफ्लुइडिक चिप रनिंग

नोट: पहली बार एक बहु-सरणी चिप चला रहा है, टूल्स | का चयन करके ट्रैकिंग फ़ाइल स्थापित करें फ्लेक्स सिक्स यूसेज ट्रैकिंग, नएपर क्लिक करें, फ़ाइल का नाम दर्ज करें, और किए गए क्लिक करने से पहले एक स्थान का चयन करें।

  1. डाटा कलेक्शन सॉफ्टवेयर खोलें। क्लिक करें शुरू करें नया रन। लोडेड चिप को बाहर की ओर आ रहे बारकोड के साथ नैनोफ्लुइडिक्स थर्मोसाइकिलर में रखें।
  2. अगर लागू हो तो प्रोजेक्ट सेटिंग चुनें, फिर अगले | पर क्लिक करें लोड। यदि एक बहु-सरणी चिप लोड कर रहा है, तो चलाने के लिए विभाजन (सरणी) का चयन करें।
  3. एप्लिकेशन रेफरेंस प्रोब्सका चयन करें, फिर आवेदन प्रकार को जीन अभिव्यक्तिमें बदलें, और रॉक्स के निष्क्रिय संदर्भ को बदलें। सिंगल प्रोब परखका चयन करें, जांच प्रकार को ईवा ग्रीनमें बदलें,और आगे क्लिक करें ।
  4. थर्मल साइक्लिंग प्रोटोकॉल जीई फ्लेक्स छह फास्ट पीसीआर + मेल्ट v1 का चयन करें एक बहु सरणी चिप, या प्रोटोकॉल जीई ९६.९६ फास्ट पीसीआर + पिघल v2 चलाने के लिए एक एकल सरणी चिप चलाने के लिए ।
  5. पुष्टि करें कि ऑटो एक्सपोजर का चयन किया गया है और स्टार्ट रनपर क्लिक करें ।

12. पोस्ट चिप रन

नोट: यह अनुभाग केवल मल्टी-ऐरे चिप्स के लिए आवश्यक है जब पूरी चिप का उपयोग नहीं किया जाता है।

  1. नैनोफ्लुइडिक्स थर्मोसाइकिलर से चिप निकालें और नैनोफ्लुइडिक्स पीसीआर प्राइमिंग मशीन में लोड करें और पोस्ट रन (153x) स्क्रिप्ट चलाएं, जो 5 मिनट तक रहता है।
  2. व्यक्तिगत संदर्भ के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लग को लेबल करें।
    नोट: चिप अब कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है और चिप पर शेष सरणी 2 महीने के भीतर चलाया जा सकता है ।

13. डेटा सफाई और विश्लेषण

  1. 'रियलटाइम पीसीआर एनालिसिस'सॉफ्टवेयर(टेबल ऑफ मैटेरियल्स)में डाटा खोलें। परीक्षण किए गए प्रत्येक प्राइमर जोड़ी के लिए पिघलने वाले अधिकतम तापमान की जांच करें। एक दिए गए प्राइमर जोड़ी के लिए, एक से अधिक पिघलने तापमान पीक का प्रदर्शन परिणामों को खत्म करें।
    नोट: कई चोटियां केवल कभी-कभी दिखाई देती हैं, संभवतः जब प्राइमर जोड़े डिमर्स बनाते हैं, या पूल किए गए प्राइमर मिश्रण में अन्य प्राइमर के साथ लक्षित प्राइमर की बातचीत से।
  2. डेटा को 'हीटमैप' स्प्रेडशीट फ़ाइल के रूप में निर्यात करें और विफल नमूनों या प्राइमर को खत्म करें।
  3. मानक डेल्टा-सीटी विधि21का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण करें । सांख्यिकीय मूल्यांकन के लिए सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर पर एक तरह से ANOVA प्रदर्शन करते हैं ।

Representative Results

सीडीएनए तैयारी विधि के रूप में कृमि-से-सीटी का सत्यापन

यह परीक्षण करने के लिए कि क्या कृमि-से-सीटी प्रोटोकॉल एक वैध सीडीएनए निष्कर्षण विधि है, तो इसकी तुलना मानक ग्वानिडियम थियासाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण विधियों से की गई थी। परिणाम चित्रा 3में दिखाए गए हैं, जहां सीडीएनए को मानक ग्वानिडियम थियोसाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण तकनीक22 और 30 कीड़े से कीड़ा-से-सीटी विधि का उपयोग करके ~ 1,000 कीड़े के औसत से तैयार किया गया था। नमूनों को एक साथ (30 मिनट 34 डिग्री सेल्सियस) झटका लगा। विश्व स्तर पर, कुल आरएनए के प्रति 100 एनजी में एचएसपी-70 एमआरएनए अभिव्यक्ति का स्तर दोनों तरीकों का उपयोग करके तुलनीय था। हालांकि, उच्चतम एचएसपी-70 अभिव्यक्ति (यानी, हीट शॉक के बाद N2 में) अभिव्यक्ति का स्तर कीड़ा-टू-सीटी विधि के साथ अधिक था, जो बेहतर संवेदनशीलता का संकेत देता है।

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एचएसएफ-1 (sy441)23में एचएसपी अभिव्यक्ति में अपेक्षित कमी, आणविक चैपरोन्स23, 24के मुख्य ट्रांसक्रिप्शनल नियामक में उत्परिवर्तन, पुन: पेश किया जा सकता है, एक संक्षिप्त गर्मी सदमे के बाद ट्रांसक्रिप्शनल चैपरवन प्रेरण की तुलना की गई थी। दोनों तरीकों के साथ एचएसपी-70 प्रेरण में कमी एचएसएफ-1 (sy441) जानवरों में पाया गया था। यह उम्मीद की गई थी, क्योंकि उत्परिवर्ती एचएसएफ-1 (sy441) जानवर एचएसएफ-1 के ट्रांसएक्टिवेशन डोमेन में ट्रंकेशन के कारण चैपरोन को प्रेरित करने की कम क्षमता प्रदर्शित करते हैं। ग्वानिडियम थिओसाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण एचएसपी 70 के लिए नियंत्रण की तुलना में 82.7% और जंगली प्रकार के जानवरों (चित्रा 3) की तुलना में कृमि-से-सीटी के लिए92.3%की कमी आई। परिणाम दोनों तरीकों के बीच की तुलना में थे और पिछली रिपोर्टों के बराबरथे 23. इन परिणामों से संकेत मिलता है कि कृमि से सीटी विधि मानक सीडीएनए संश्लेषण तकनीकों के लिए एक वैध विकल्प है ।

एमआरएनए लक्ष्यों को बढ़ाने के लिए उपयोग किए जाने वाले नैनोफ्लुइडिक्स पीसीआर प्लेटफॉर्म का सत्यापन

ट्रांसक्रिप्ट प्रवर्धन के लिए नैनोफ्लुइडिक क्यूपीसीआर का उपयोग करके परिणामों की निरंतरता का परीक्षण करने के लिए, कीड़ा-टू-सीटी बल्क विधि से प्राप्त पीसीआर परिणामों की तुलना एक मानक क्यूपीसीआर प्रणाली(सामग्री की तालिका)और बहु-सरणी चिप का उपयोग करके एक नैनोफ्लुइडिक क्यूपीसीआर प्रणाली दोनों पर की गई थी। जंगली प्रकार के समकक्षों की तुलना में डीबीएल-1(डीबीएल-1 (एनके3)25 में शून्य एलील ले जाने वाले जानवरों में तीन अलग-अलग जीन, SMA-3 (चित्रा 4A), sma-10 (चित्रा 4B)और डीएनजे-26की अभिव्यक्ति में गुना परिवर्तन की निगरानी की गई थी । डीबीएल-1 बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी) सिग्नलिंग पाथवे के एकमात्र लिगामेंट को एन्कोड करता है। Sma-3 और sma-10 जीन एंकोडिंग SMAD ऑर्थोलॉग, बीएमपी सिग्नलिंग झरना के प्रमुख घटक हैं । DNJ-26 एक आणविक chaperone, बीएमपी सिग्नलिंग का एक लक्ष्य encodes । ये परिणाम दो तरीकों के परिणामों की तुलना में गुना परिवर्तन में कोई अंतर नहीं दिखाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप क्रमशः 0.3113, 0.2635, और 0.3481 पर स्मा-3, स्मा-10और डीएनजे-26पर महत्वपूर्ण पी-मान नहीं हैं। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि थोक नमूनों पर लागू कीड़ा-टू-सीटी विधि कुछ कीड़े से आरएनए निकालने का एक कुशल और तेजी से तरीका है और या तो मानक पीसीआर सिस्टम या उच्च-थ्रूपुट नैनोफ्लुइडिक्स-आधारित क्यूपीसीआर प्लेटफार्मों के साथ मिलकर विश्वसनीय डेटा प्रदान करता है।

एकल कीड़े से प्राप्त औसत के साथ थोक नमूनों द्वारा प्राप्त अभिव्यक्ति के स्तर के बीच तुलना

सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर की गणना या तो थोक नमूनों (25 कीड़े) से प्राप्त सीडीएनए या औसतन 36 एकल कृमि नमूनों(चित्रा 5)से प्राप्त सीडीएनए का उपयोग करके की गई थी। दोनों सीडीएनए को वर्म-टू-सीटी विधि का उपयोग करके प्राप्त किया गया था और नैनोफ्लुइडिक्स पीसीआर तकनीक का उपयोग करके परिलक्षित किया गया था। जैसा कि चित्र 5ए-सीमें देखा गया है, सभी चैपरोन्स परीक्षण (यानी, एचएसपी 16.1,एफ44ई5.4, एचएसपी-70)के लिए, तरीकों ने तुलनीय अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाया। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एकल कीड़े से प्राप्त पैरामीटर विश्वसनीय हैं।

एकल वर्म जीन अभिव्यक्ति मापदंडों का अनुमान लगाने के लिए नैनोफ्लुइडिक्स प्रौद्योगिकी के साथ-साथ कीड़ा-टू-सीटी का आवेदन

क्योंकि एकल सरणी चिप ९६ व्यक्तिगत नमूनों पर ९६ लक्ष्य टेप तक की निगरानी की अनुमति देता है, इसलिए यह अच्छी तरह से एक कीड़े के बीच प्रतिलिपि अभिव्यक्ति में व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता की निगरानी के लिए अनुकूल है । चित्रा 6A एक प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करता है जो एक छोटी गर्मी के झटके के बाद एकल कीड़े से कई एचएसपी ट्रांसक्रिप्ट की औसत अभिव्यक्ति दिखाता है। जैसा कि आंकड़ा में देखा गया है, टेप की अभिव्यक्ति में परिवर्तनशीलता विभिन्न जीन(चित्रा 6A)में नाटकीय रूप से भिन्न थी। आगे की जानकारी हासिल करने के लिए, अभिव्यक्ति के स्तर26 (चित्रा 6B)के मतलब से मानक विचलन को विभाजित करके भिन्नता (सीवी) के गुणांक की गणना की गई थी। तीन जीन जिनके सीवी मूल्यों को पहले वैकल्पिक तरीकों से अनुमानित किया गया है (अप्रकाशित डेटा) की निगरानी की गई थी । दो स्थिर टेप(ife-1 और Y45F10D.4)और एक चर(एनएलपी-2927)ने अपनी अपेक्षित परिवर्तनशीलता दिखाई। ग्राफ में परिवर्तनशीलता मूल्यों और अभिव्यक्ति के स्तर26 (चित्रा 6B)के बीच प्रसिद्ध व्युत्क्रम संबंध को भी स्पष्ट रूप से दर्शाया गया है।

थोक नमूनों का उपयोग करते समय प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए तकनीकी प्रतिकृति सर्वोपरि महत्व की है। हालांकि, यह जरूरी नहीं कि एकल सेल प्रयोगों के लिए मामला14,15,28। यह निर्धारित करने के लिए कि एकल-कृमि नमूनों का उपयोग करते समय पैरामीटर अनुमान के लिए तकनीकी प्रतिकृति का उपयोग आवश्यक है, 28 व्यक्तिगत कीड़े काटे गए थे, एक छोटे गर्मी के झटके के बाद, और तकनीकी ट्रिपलिटेंट का उपयोग करके संसाधित किया गया था। ट्रिपलीकेट (चित्रा 7 में नीले डॉट्स, तकनीकी सीवी) बनाम व्यक्तिगत कीड़े (चित्रा 7में लाल डॉट्स, जैविक परिवर्तनशीलता) से प्राप्त हर ट्रांसक्रिप्ट के लिए त्रिपालेट (चित्रा 7में नीले बिंदु) में प्राप्त एकल-कृमि डेटा से गणना किए गए सीवी मूल्यों की तुलना की गई। परीक्षण की गई हर ट्रांसक्रिप्ट के लिए, तकनीकी सीवी जैविक सीवी की तुलना में कम थे, यह दर्शाता है कि पैरामीटर अनुमान के लिए तकनीकी ट्रिपलिट्स की आवश्यकता नहीं थी। तथ्य यह है कि तकनीकी प्रतिकृति की आवश्यकता नहीं है गुणवत्ता से समझौता किए बिना प्रयोग के थ्रूपुट को बढ़ाता है।

Figure 1
चित्रा 1: कीड़ा से सीटी प्रोटोकॉल का अवलोकन।
यह आंकड़ा कीड़ा से सीटी प्रोटोकॉल के माध्यम से कीड़े चलाने के लिए आवश्यक विभिन्न चरणों का एक संक्षिप्त सिंहावलोकन दिखाता है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन चरण के लिए दो वैकल्पिक तरीके दिखाए गए हैं; ये किसी भी प्रकार की चिप के लिए विनिमेय तरीके हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: नैनोफ्लुइडिक क्यूपीसीआर की तैयारी और संचालन का अवलोकन।
यह आंकड़ा एक बहु-सरणी चिप और एक एकल सरणी चिप का उपयोग कर नैनोफ्लुइडिक क्यूपीसीआर सिस्टम चलाने की तैयारी को दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: थोक नमूनों पर कीड़ा से सीटी प्रोटोकॉल विश्वसनीय परिणाम प्रदान की है ।
बल्क नमूनों पर वर्म-टू-सीटी प्रोटोकॉल बनाम नियमित ग्वानिडियम थियोसाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण की तुलना22। पिछले निष्कर्षों के अनुरूप, एचएसएफ-1 (sy441)म्यूटेंट23में, गर्मी के झटके के जवाब में एचएसपी ट्रांसक्रिप्ट का स्तर कम हो गया। उपरोक्त हिस्टोग्राम (-), या निम्नलिखित (+) की अनुपस्थिति में एचएसपी-70 के प्रेरण को 34 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के एक छोटे गर्मी के झटके को दर्शाते हैं। सीडीएनए को 1,000 कीड़े (बाएं) पर लागू ग्वानिडियम थिओसाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण का उपयोग करके या 30 पूल्ड वर्म (दाएं) पर लागू कीड़ा-टू-सीटी विधि का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। प्रत्येक विधि द्वारा प्राप्त कुल आरएनए के प्रति 100 एनजी एचएसपी-70 के अभिव्यक्ति स्तर की तुलना की गई। जैसा कि उम्मीद थी, एचएसएफ-1 (sy441) में हीट शॉक के जवाब में एचएसपी-70 के ट्रांसक्रिप्शनल इंडक्शन में ग्वानिडियम थियोसाइनेट-फिनोल-क्लोरोफॉर्म का उपयोग करके 82.7% और वर्म-टू-सीटी विधि का उपयोग करके 92.3% तक की कमी आई। लक्ष्य जीन से एमआरएनए का स्तर तीन हाउसकीपिंग जीन सीडीसी-42, पीएमपी-3और इर-1के औसत के मुकाबले सामान्य रूप से उत्प्रेरित किया गया था। प्रत्येक डॉट एक जैविक दोहराने का प्रतिनिधित्व करता है। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए डेटा को लॉग रूप दिया गया था, क्योंकि वे पैरामेट्रिक विश्लेषण के लिए आवश्यक सम्मेलनों को पूरा नहीं करते थे। सांख्यिकीय विश्लेषण सिडक के कई तुलना परीक्षण का उपयोग करके आरएम-वन-वे इनोवा का उपयोग करके किया गया था। जंगली प्रकार = N2, hsf-1 = hsf-1 (sy441)। बार मतलब की मानक त्रुटि को निरूपित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: अभिव्यक्ति पैटर्न मानक क्यूपीसीआर और नैनोफ्लुइडिक क्यूपीसीआर सिस्टम के बीच संगत थे।
(A) स्मा-3 (ए), स्मा-10 (बी) या डीएनजे-26 (सी) एमआरएनए का अभिव्यक्ति स्तर नियमित क्यूपीसीआर और नैनोफ्लुइडिक क्यूपीसीआर (मल्टी-सरणी चिप) के माध्यम से वन्य प्रकार के तनाव (एन2) और डीबीएल-1 (nk3) नॉकआउटतनाव 25से कीड़ा-टू सीटी के माध्यम से उत्पन्न सीडीएनए के तीन जैविक प्रतिकृति के माध्यम से निर्धारित किया गया था । सापेक्ष mRNA अभिव्यक्ति का स्तर डेल्टा-सीटी विधि21का उपयोग कर प्रत्येक तनाव के लिए निर्धारित किया गया । गुना परिवर्तन तो N2 तनाव में इसी mRNA स्तर से Dbl-1 (nk3) कीड़े में प्राप्त अभिव्यक्ति के स्तर को विभाजित करके निर्धारित किया गया था । जैसा कि पैनल एमें दिखाया गया है, पैटर्न प्रत्येक व्यक्तिगत जैविक दोहराने में दोनों तरीकों के अनुरूप थे। (B)और(C)क्रमशः SMA-10 और DNJ-26 mrna स्तर के लिए(ए)के रूप में ही हैं । हाउसकीपिंग जीन सीडीसी-42 और पीएमपी-3के खिलाफ टारगेट एमआरएनए का स्तर सामान्य किया गया । सांख्यिकीय विश्लेषण की गणना प्रत्येक जीन के लिए मानक क्यूपीसीआर के माध्यम से उत्पादित तीन जैविक प्रतिकृति के परिणामों की तुलना करते हुए एक युग्मित टी-परीक्षण का उपयोग करके की गई थी और जो नैनोफ्लुइडिक क्यूपीसीआर के माध्यम से उत्पन्न होते हैं । इन तुलनाओं के पी-वैल्यू क्रमशः 0.3113, 0.2635, और 0.3481 SMA-3, sma-10,और DNJ-26के लिए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: थोक नमूनों पर या एकल कीड़े पर कीड़ा से सीटी विधि का उपयोग करते हुए प्रति कीड़े को सामान्यीकृत करने पर अभिव्यक्ति के समान स्तर प्रदान किए जाते हैं।
(A) hsp-16.1/11,(B)F44E5.4, और(C) hsp-70 (C12C8.1) के अभिव्यक्ति के स्तर को गर्मी के झटके के अभाव में युवा वयस्क जानवरों में विश्लेषण किया गया या तो 25 जानवरों के थोक पर कीड़ा-टू-सीटी प्रदर्शन करके, या ३६ एकल व्यक्तियों पर । जब डेटा को प्रति कीड़ा सामान्यीकृत किया गया था, तो दोनों तरीकों का उपयोग करके प्रत्येक ट्रांसक्रिप्ट के लिए प्रति कीड़ा प्राप्त स्तरों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। लक्ष्य जीन से एमआरएनए का स्तर तीन हाउसकीपिंग जीन सीडीसी-42, पीएमपी-3और इर-1के औसत के मुकाबले सामान्यीकृत किया गया था। बार मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकी = जोड़ा टी परीक्षण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: कीड़े से सीटी विधि का उपयोग कर एकल कीड़े पर उच्च थ्रूपुट आरटी-qPCR जीन अभिव्यक्ति में अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता की निगरानी कर सकता है ।
(क)एक छोटी गर्मी के झटके (34 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट) के संपर्क में आने पर प्राप्त 53 प्रतिलिपियों के लिए मतलब अभिव्यक्ति का स्तर। Boxplots व्यक्तिगत कीड़े से मतलब mRNA अभिव्यक्ति के वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं (व्यक्तिगत कीड़े प्रति तीन तकनीकी प्रतिकृति के एक औसत का इस्तेमाल किया गया) । डॉट्स 28 व्यक्तिगत कीड़े में अभिव्यक्ति के स्तर का प्रतिनिधित्व करते हैं। लक्ष्य जीन से एमआरएनए का स्तर तीन हाउसकीपिंग जीन सीडीसी-42, पीएमपी-3और इर-1के औसत के मुकाबले सामान्यीकृत किया गया था। (ख)एक छोटी गर्मी सदमे के संपर्क में आने के बाद ५३ टेप के लिए मतलब mRNA अभिव्यक्ति के एक समारोह के रूप में भिन्नता26 (सीवी) के गुणांक 28 व्यक्तिगत जानवरों (पैनल बीमें दिखाया गया कच्चा डेटा) से गणना की गई थी । ट्रांसक्रिप्ट के सेट में वेरिएबल एनएलपी-29 ट्रांसक्रिप्ट27 और दो स्थिर ट्रांसक्रिप्ट(आईएफई-1 और Y45F10D.4;अप्रकाशित डेटा) शामिल हैं । सीवी मतलब करने के लिए मानक विचलन का अनुपात है। इस सीवी का उपयोग व्यक्तिगत कीड़े के बीच ट्रांसक्रिप्ट अभिव्यक्ति में अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता का अनुमान लगाने के लिए किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता कम मतलब अभिव्यक्ति के स्तर के साथ पहुंचा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: नैनोफ्लुइडिक चिप का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति में अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता का विश्लेषण करते समय तकनीकी प्रतिकृति आवश्यक नहीं थी।
इस ग्राफ में प्रस्तुत किए गए डेटा को एक छोटे गर्मी के झटके (34 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट) के बाद 28 व्यक्तिगत कीड़े में प्राप्त किया गया था। प्रत्येक लाल डॉट 28 व्यक्तिगत कीड़े (जैव सीवी) के बीच एक प्रतिलिपि के लिए मतलब प्रतिलिपि अभिव्यक्ति के स्तर के भिन्नता (सीवी) के गुणांक का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक नीली बिंदी एक ही कीड़े से प्राप्त तीन तकनीकी प्रतिकृति के बीच अभिव्यक्ति के स्तर के सीवी का प्रतिनिधित्व करती है, प्रति ट्रांसक्रिप्ट परख (तकनीकी सीवी)। इस ग्राफ से पता चलता है कि तकनीकी परिवर्तनशीलता (तकनीकी प्रतिकृति के बीच) जैविक परिवर्तनशीलता (व्यक्तिगत कीड़े के बीच) की तुलना में बहुत कम थी, यह सुझाव देते हुए कि एकल कीड़े में जीन अभिव्यक्ति को बताते समय नैनोफ्लुइडिक जीन अभिव्यक्ति सरणी पर तकनीकी प्रतिकृति करना अनावश्यक है, इसी तरह एकल-कोशिका अध्ययन14,15,28। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: मल्टी-सरणी चिप के लिए योजना लेआउट। ऊपर दी गई तालिका एक साधारण लेआउट दिखाती है जिसका उपयोग मल्टी-सरणी चिप चलाने की योजना बनाते समय किया जा सकता है। बाईं ओर वे स्थान हैं जिन्हें ब्याज के प्राइमर लक्ष्यों से भरा जाना चाहिए और दाईं ओर वे स्थान हैं जिन्हें ब्याज के नमूनों से भरा जाना चाहिए। प्रत्येक परख और नमूना सरणी चिप के माध्यम से संख्या वार बनती है । कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: एकल-सरणी चिप के लिए योजना लेआउट। ऊपर दी गई तालिका एक साधारण लेआउट दिखाती है जिसका उपयोग एकल-सरणी चिप चलाने की योजना बनाते समय किया जा सकता है। बाईं ओर रिक्त स्थान है कि ब्याज के प्राइमर लक्ष्यों से भरा जाना चाहिए और सही पर रिक्त स्थान है कि ब्याज के नमूनों से भरा जाना चाहिए रहे हैं । कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 3: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले आरटी-क्यूपीसीआर प्राइमर की सूची। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 1: आरटी-क्यूपीसीआर प्राइमर के डेटाबेस से प्राइमर। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस पेपर में, कीड़ा-से-सीटी प्रोटोकॉल को एकल कीड़े या कीड़े के एक छोटे पूल से आरएनए निकालने के लिए एक तेजी से और कुशल विधि दिखाई गई है। नैनोफ्लुइडिक सिस्टम द्वारा पेश किया गया उच्च-थ्रूपुट इसे अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता मापों के परिमाणीकरण के लिए आदर्श बनाता है। इसके अलावा, इस विधि की उच्च संवेदनशीलता कम स्तर पर व्यक्त जीन का पता लगाने की अनुमति देती है जो एकल-कृमि आरएनए-सेक्यू प्रौद्योगिकियों 9 का उपयोग करते समय पता लगाने से नीचेगिरतेहैं।

एकल कीड़े से सीडीएनए तैयार करने के लिए विधि के विकल्प पर विचार करते समय। Ly एट अल29 ने एक प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जो क्यूटिकल पाचन के लिए प्रोटीनेज के पर निर्भर करता है। क्यूटिकल कीड़े से अणुओं के अलगाव के लिए एक बड़ी बाधा है और प्रोटीन के इसे तोड़ने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है। हालांकि, प्रोटीन के लिए गर्मी निष्क्रिय करने के लिए रिवर्स प्रतिलेखन के लिए एंजाइमों का उपयोग करने में सक्षम होना चाहिए । जबकि Ly et al. 96 डिग्री सेल्सियस के लिए एक 10 मिनट जोखिम का इस्तेमाल किया, इस कदम से बचा गया था क्योंकि आरएनए आसानी से अपमानजनक है। प्रोटीनेज कश्मीर का उपयोग करने के बजाय, क्यूटिकल को तोड़ने के लिए बार-बार फ्रीज-गल चक्रों का उपयोग किया जाता था। फ्रीज-गल क्यूटिकल को तोड़ने के लिए एक प्रभावी तरीका है क्योंकि अधिक आरएनए को प्रति कीड़ा अलग किया जा सकता है। Ly et al. रिपोर्ट है कि प्रति कीड़ा निकाले गए कुल आरएनए प्रोटीन के का उपयोग करके 35 एनजी है, जबकि यह प्रोटोकॉल प्रति कीड़ा कुल आरएनए के 51.75 एनजी ± 6.74 एसईएम प्राप्त करता है। प्रीएम्पलिफिकेशन चरणों के साथ मिलकर हीट एक्सपोजर से बचना जाहिरा तौर पर मानक प्रोटोकॉल की तुलना में कीड़ा-टू-सीटी की गतिशील रेंज का पता लगाने को चौड़ा करता है। Ly et al. हीट शॉक के बाद एचएसपी-16.2 के लिए 0.15 ± 0.15 और एचएसपी-70 के लिए 0.17 ± 22.8 के पूर्ण सीटी मूल्यों की रिपोर्ट करें। इसी हीट शॉक स्थितियों (30 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे) का उपयोग करते हुए, यह प्रोटोकॉल एचएसपी-16.2 के लिए 0.57 ± 17.93 और एचएसपी-70 के लिए 21.13 ±0.33 के पूर्ण सीटी मूल्य प्राप्त करता है। यह इंगित करता है कि फ्रीज-गल लाइसिस विधि आरएनए की अधिक पैदावार प्रदान करती है और नीच व्यक्त किए गए टेप के लिए अधिक उपयुक्त है।

लक्ष्य टेप के दिए गए सेट की जांच करते समय नैनोफ्लुइडिक सिस्टम आदर्श होते हैं और प्रयोग के पैमाने पर अनुकूलन की अनुमति देने वाले नमूनों की छोटी (बहु-सरणी चिप) या बड़ी (एकल-सरणी चिप) संख्या का उपयोग करते हैं। एक ही कीड़े में व्यक्त सभी टेप की एक निष्पक्ष तस्वीर प्राप्त करने के लिए, स्पष्ट विकल्प आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करना है। यदि, हालांकि, प्रयोग का ध्यान एक छोटा लेकिन अभी भी लक्ष्य जीन का अपेक्षाकृत बड़ा सेट है, तो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए अधिक लागत प्रभावी है, बशर्ते शोधकर्ता के पास नैनोफ्लुइडिक्स पीसीआर मशीन तक पहुंच हो। नैनोफ्लुइडिक सिस्टम रिएजेंट्स और सिंगल-ऐरे चिप की लागत लगभग £१३ प्रति कीड़ा के रूप में अनुमानित है, जबकि एकल-कृमि अनुक्रमण के लिए अभिकर्मकों की लागत लगभग £६० प्रति कीड़ा होगी, जिसमें अनुक्रमण लागत शामिल नहीं है ।

पीसीआर प्लेटफॉर्म का उपयोग करने पर विचार करते समय, नैनोफ्लुइडिक क्यूपीसीआर के साथ मिलकर कीड़ा-टू-सीटी विधि समय और थ्रूपुट के संबंध में फायदे प्रदान करती है। लगभग 2 दिनों के काम में 9,216 आरटी-क्यूपीसीआर परिणाम प्राप्त करना संभव है, जबकि एक मानक क्यूपीसीआर प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके समान संख्या के लक्ष्यों का प्रवर्धन लगभग 5 कार्य सप्ताह लेगा, 96 अच्छी प्लेट का उपयोग करके, एक दिन में चार प्लेटें चलाना। हालांकि, यदि परीक्षण किए जाने वाले लक्ष्यों की संख्या छोटी है, तो मानक क्यूपीसीआर मशीन के साथ मिलकर कीड़ा-टू-सीटी का उपयोग करना अधिक लागत प्रभावी है। एकल सरणी चिप्स को फिर से नहीं चलाया जा सकता है, इसलिए खाली कुओं को चलाने से लागत दक्षता कम हो जाती है ।

विधि की एक सीमा मल्टीप्लेक्सिंग चरण के दौरान प्राइमर-प्राइमर डिमर का संभावित गठन है, लेकिन यह 1% से भी कम मामलों में होता है। यद्यपि कीड़ा-टू-सीटी प्रोटोकॉल कुशल है और एकल कीड़े पर लागू होने पर विश्वसनीय परिणाम प्रदान करता है, लगभग 5% की विफलता दर होती है, जो संभवतः उन मामलों से मेल खाती है जहां कीड़ा कटाई चरण के दौरान टोपी या ट्यूब के शीर्ष में फंसा रहता है।

साथ में, यह बहुमुखी और विश्वसनीय विधि अधिक मानक तकनीकों की तुलना में थ्रूपुट और संवेदनशीलता में वृद्धि प्रदान करती है। यह विधि उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन के सत्यापन के लिए बहुत उपयोगी हो सकती है और एकल-कृमि जीन अभिव्यक्ति के स्तर की निगरानी या मान्य करने के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प है। इस विधि को अन्य चुनौतीपूर्ण तकनीकों पर लागू किया जा सकता है, जैसे कि अलग-थलग ऊतकों से जीन अभिव्यक्ति का मात्रा। उदाहरण के लिए, पूर्ण ऊतकों का अलगाव, जैसे आंत, गोनाड, या एफएसी द्वारा अलग की गई कोशिकाएं, आरएनए अनुक्रमण प्रयोगों को करने के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करती हैं। हालांकि, सीमित मात्रा में सामग्री अक्सर डुप्लिकेट पढ़ता है, जो दुर्लभ प्रतिलिपियों के मात्रा को पहले से ही रोकता है। इस परिदृश्य में, नैनोफ्लुइडिक्स आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग करके प्रयोगों के प्रति अतिरिक्त संवेदनशीलता प्रदान करनी चाहिए और लागत दक्षता में वृद्धि करनी चाहिए यदि शोधकर्ताओं को उन ऊतकों या कोशिकाओं में सभी प्रतिलिपियों के केवल सबसेट की निगरानी करने की आवश्यकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम शरलीन मर्डोक और बाबरहाम इंस्टीट्यूट की सुविधाओं को उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं । जेएलपी को वेलकम ट्रस्ट (093970/Z/10/Z) द्वारा समर्थित किया गया था और ओसी ईआरसी ६३८४२६ और BBSRC [BBS/E/B000C0426] द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100µM stock primers for genes of interest.
20X DNA Binding Dye Fluidigm 100-7609 for 96.96 chip (Single-Array Chip)
2X Assay Loading Reagent Fluidigm 100-7611
384 well plates
8-strip PCR tubes
96 well ice block
96 well plates
96.96 Dynamic Array IFC Fluidigm BMK-M-96.96 Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip"
96-well sealing tape
BioMark & EP1 Software Fluidigm 101-6793 Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software
BioMark or BioMark HD system Fluidigm 100-2451 K1 Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler"
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs Fluidigm 89000021 Referenced throughout manuscript as "control line fluid"
DNA Suspension buffer TEKnova T0021
domed PCR caps
Exonuclease I New England BioLabs M0293L
Exonuclease I reaction buffer New England BioLabs B0293S
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent Fluidigm 100-7673 referenced throughout manuscript as "sample reagent"
FLEXsix Gene Expression IFC Fluidigm 100-6308 referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip"
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide Fluidigm 68000088 This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.
IFC Controller MX Fluidigm 68000112 I1 Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine"
IFC Controllers SOFTWEAR Fluidigm 100-2297 Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX
liquid nitrogen in dewar
Microcentrifuge StarLab C1301B-230V Used to spin down PCR tube strips in the protocol.
Nuclease Free Water
plate spinner Labnet K4050725 mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner"
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit invitrogen 4402955 This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.
PreAmp Master Mix Fluidigm 100-5580, 100-5581
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions Fluidigm 100-6299 One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)
Rnase Free water
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX Bio-Rad Laboratories 172-5211 referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix"
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA TEKnova T0224 Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer
ThermoMixer C Eppendorf 5382000031 Referenced throughout the text as "thermal mixer"
Trizol Thermo-Fisher 15596026 Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform"
Warm water bath

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References

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Chauve, L., Le Pen, J., Hodge, F., Todtenhaupt, P., Biggins, L., Miska, E. A., Andrews, S., Casanueva, O. High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology. J. Vis. Exp. (159), e61132, doi:10.3791/61132 (2020).

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