Summary
В этом протоколе модифицированные наночастицы из золота, загруженные доксорубицином AS1411-g-PEI-g-PEG, синтезируются с помощью трехступчатых реакций амиде. Затем доксорубицин загружается и доставляется в целевые раковые клетки для лечения рака.
Abstract
Из-за лекарственной устойчивости и токсичности в здоровых клетках, использование доксорубицина (DOX) было ограничено в клинической терапии рака. Этот протокол описывает проектирование поли (этиленимин) привиты полиэтиленгликоль (PEI-g-PEG) кополимер функциональных наночастиц золота (AuNPs) с загруженным aptamer (AS1411) и DOX через амиде реакций. AS1411 специально связан с целевыми нуклеолиновых рецепторов на раковых клетках, так что DOX цели раковых клеток, а не здоровых клеток. Во-первых, ПЕГ карбоксилируется, а затем привит в разветвленной PEI для получения КОПОлимер PEI-g-PEG, что подтверждается анализом 1H NMR. Далее синтезируются кополимеры PEI-g-PEG с покрытием золотых наночастиц (PEI-g-PEG@AuNPs), а DOX и AS1411 постепенно соотносяты с AuNPs через реакции амиде. Диаметр подготовленного AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs составляет 39,9 нм, с потенциалом zeta -29,3 мВ, что указывает на то, что наночастицы стабильны в воде и клеточной среде. Анализы цитотоксии клеток показывают, что недавно разработанные DOX загруженные AUNPs способны убивать раковые клетки (A549). Этот синтез демонстрирует деликатное расположение кополицей PEI-g-PEG, aptamers и DOX на AuNPs, которые достигаются последовательными реакциями на фоне. Такие aptamer-PEI-g-PEG функционализированные AuNPs обеспечивают перспективную платформу для целевой доставки лекарств в терапии рака.
Introduction
Будучи основной проблемой общественного здравоохранения во всем мире, рак широко характеризуется как имеющие низкий уровень излечения, высокий уровень рецидивов, ивысокий уровень смертности 1,2. Текущие традиционные противоопухоотные методы включают хирургию, химиотерапиюи лучевую терапию 3,среди которых химиотерапия является основным методом лечения онкологических больных вклинике 4. Клинические препараты, используемые противораковые препараты в основном включают паклитаксел (PTX)5 и доксорубицин (DOX)6,7. DOX, антинеопластический препарат, широко применяется в клинической химиотерапии, из-за преимуществ цитотоксичности рака и ингибирования пролиферациираковых клеток 8,9. Тем не менее, DOX вызываеткардиотоксичность 10,11, и короткий период полуиссяка DOX ограничивает его применение в клинике12. Таким образом, разлагаемые носители наркотиков необходимы для загрузки DOX и субекентно выпускать в контролируемой форме в целевую область.
Наночастицы широко используются в целевых системах доставки лекарств и имеют ряд преимуществ в лечении рака (т.е. значительное соотношение поверхности к объему, небольшой размер, способность инкапсулировать различные препараты, и настраиваемая химия поверхности и т.д.) 13,14,15. В частности, золотые наночастицы (AUNPs) широко используются в биологических и биомедицинских приложениях, таких как фототермальнаятерапия рака 16,17. Уникальные свойства AuNPs, такие как поверхностный синтез и общая функционализация поверхности, имеют отличные перспективы в клинической области терапии рака18. Кроме того, AUNPs были использованы для выявления стратегий доставки лекарств, диагностики опухолей, и преодолеть устойчивостьво многих исследованиях 19,20.
Несмотря на это, AuNPs должны быть дополнительно адаптированы для преодоления лекарственной устойчивости через высокий местный релиз при поражениях опухоли за счет повышения пронизывания и удержания (EPR), таких как ориентации и доступности свойства. Полимерные функционализированные АУН обладают уникальными преимуществами, такими как улучшение водонепроницаемости гидрофобных противораковых препаратов и длительноевремя циркуляции 21,22. Различные биосовместимые полимеры были использованы для покрытий AuNP, таких как полиэтиленгликоль (PEG), полиэтилен (PEI), гиалуроновая кислота, гепарин и ксантановая резинка. Тогда стабильность, а также полезная нагрузка, AUNPs улучшается хорошо23. В частности, PEI является высоко разветвленной полимер, который состоит из многих повторяющихся единиц первичных, вторичных и третичных аминов24. PEI имеет отличную завихреемость, низкую вязкость и высокую степень функциональности, которая подходит для покрытия на AUNPs.
С другой стороны, противоопухолевая препараты должны быть доставлены в раковые клетки непосредственно с улучшенной эффективностью загрузки, и с более низкой токсичностью для лечения первичных и передовыхметастатических опухолей 25. Целевые лиганды имеют большой потенциал для противоопухохоных препаратов целевых системдоставки 26. Его избирательность для связывания целевых молекул придает противоопухохоковой препарат ориентации специфики и увеличивает обогащение наркотиков в больныхтканях 27. Больше лигандов включают антитела, полипептиды и небольшие молекулы. По сравнению с другими лигандами, квитамеры нуклеиновой кислоты могут быть синтезированы в пробирке и легко модифицируются. AS1411 является неизмененным 26 bp фосфодитер олигонуклеотид, который образует стабильную димерик G-тетрамер структуры специально связываться с переэкспрессии целевой рецептор ядерного белкана раковых клетках 28,29,30. AS1411 подавляет пролиферацию многих раковых клеток, но не влияет на ростздоровых клеток 31,32. В результате, AS1411 был использован для изготовления идеальной целевой системы доставки наркотиков.
В этом исследовании, PEI-g-PEG кополимер синтезируется через реакцию амиде, то PEI-g-PEG кополимер покрытием золотых наночастиц (PEI-g-PEG@AuNPs) изготовлены. Кроме того, DOX и AS1411 последовательно связаны с подготовленным PEI-g-PEG@AuNPs, как показано на рисунке 1. Этот подробный протокол призван помочь исследователям избежать многих распространенных ловушек, связанных с изготовлением новых PEI-g-PEG@AuNPs загруженных DOX и AS1411.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ВНИМАНИЕ: Перед использованием всех химических веществ обязательно проконсультируйтесь со всеми соответствующими листами данных о безопасности материалов (MSDS). Некоторые химические вещества, используемые для приготовления кополимера и наночастиц, являются остро токсичными. Наночастицы также имеют потенциальную опасность. Убедитесь в том, чтобы использовать все соответствующие методы безопасности и средства индивидуальной защиты, в том числе перчатки, лабораторное пальто, капюшоны, брюки в полный рост, и обувь с близкого к нося.
1. Синтез двойного карбоксилового полиэтиленгликоль (CT-PEG)33
- Добавьте 1,46 г (14,6 ммоль) сучинового ангидрида (SA) и 209 мг (1,71 ммоль) 4-диметиламинопиридин (DMAP) в круглую нижнюю колбу 100 мл.
- Добавьте 15 мл тетрагидрофурана ангидрогидрофурана (THF) в колбу, используемую в шаге 1.1, и потейте стеклянной пробкой. Держите колбу при 0 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
- Добавьте в новую колбу 4,28 г (4,28 ммоль) полиэтиленгликоль (ПЭГ) и 1,8 мл (12,8 ммоль) триэтиламина (ТГЭ).
- Добавьте 15 мл ангидроуса THF в колбу, используемую в шаге 1.3, и повестейте стеклянную пробку. Перенесите раствор медленно в колбу, используемую в шаге 1.2, используя шприц под азотной атмосферой.
- Перемешать раствор при температуре 0 градусов по Цельсию в течение 2 ч, а затем продолжить реакцию при комнатной температуре (RT) на ночь.
- Используя роторный испаритель (40 градусов по Цельсию, 0,1 МПА), сконцентрировать раствор реакции и удалить растворитель THF.
- На RT растворите реакционной раствор от шага 1.6 в 15 мл 1.325 г/мл дихлорметана (DCM), затем добавьте 15 мл холодного диэтил эфира (Et2O) для получения продукта осадков (полиэтиленгликоль диацид). Удалите растворитель с помощью фильтровальной бумаги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг осадков может быть повторен 3x. - Высушите осадки под вакуумом в RT на 48 ч.
2. Синтез кополимера PEI-g-PEG
- Добавьте 305,47 мг CT-PEG из шага 1.8 и 5 мл диметилсульфсида (DMSO) в колбу и перемешайте в RT, чтобы гарантировать, что CT-PEG полностью растворяется в DMSO.
- Растворите 49,46 мг 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодимид гидрохлорид (ЭДК) в 5 мл ДМСО, затем добавьте раствор в колбу, используемую в шаге 2.1 и перемешать в течение 30 минут на RT.
- Растворите 29,69 мг N-гидроксисучинимида (NHS) в 5 мл DMSO и добавьте раствор в колбу, используемую в шаге 2.1. Продолжайте перемешивать на RT в течение 3 ч.
- Растворите 28,6 мл полиэтилена (PEI) в 10 мл DMSO и добавьте раствор по капле в колбу, используемую в шаге 2.1. Перемешать в течение 3 дней, по крайней мере.
- Перенесите прореагированное решение с шага 2.4 на диализный мешок (1000 молекулярных отрезанных весов)... Поместите диализный мешок в стакан 1 л с 500 мл ультрачистой воды в качестве диализа. Изменение ультрачистой воды каждые 12 ч в течение 3 дней.
- Перенесите раствор в шаг 2.5 в другой диализный мешок (10 000 MWCO). Поместите диализный мешок в стакан 1 л с 500 мл ультрачистой воды в качестве диализа. Изменение ультрачистой воды каждые 12 ч в течение 3 дней.
- Сосредоточьте раствор из шага 2.6 с помощью роторного испарителя (40 градусов по Цельсию, 0,1 МП) и заморозьте-высушите образец для получения порошка PEI-g-PEG.
3. Синтез PEI-g-PEG@AuNPs
- Растворите 5 мг подготовленной PEI-g-PEG (шаг 2.7) в 5 мл ультрапурной воды в новой колбе и поправьте стеклянной пробкой.
- Добавьте 100 мл раствора HAuCl4 0,3 мм в колбу и перемешайте раствор в течение 3 ч на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет раствора должен немедленно измениться с желтого на оранжевый. - Добавьте 1 мл раствора NaBH4 в колбу и перемешайте раствор в течение 3 л на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Решение реакции должно мгновенно превратить бордовый. - Диализ реакции продукта с помощью диализа мешок (1000 MWCO) в течение 3 дней, как описано в шаге 2.5 для получения PEI-G-PEG@AuNPs решения.
4. Синтез DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
- Добавьте 1 мл раствора 2,2 мг/мл DOX и 20 мл раствора PEI-g-PEG@AuNPs в новую колбу и повместить стеклянной пробкой.
- Растворите 0,727 мг ЭДК в 1 мл ультрачистой воды и добавьте раствор EDC в колбу, используемую в шаге 4.1.
- Растворите 0,437 мг ГСЗ в 1 мл ультрапурной воды. Добавить решение NHS в колбу и перемешать на RT в течение 1 ч.
- Диализ реакции продукта с помощью диализа мешок (1000 MWCO) в течение 3 дней, как описано в шаге 2.5 для получения DOX-G-PEI-G-PEG@AuNPs решения.
5. Синтез AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
- Добавьте 20 мл раствора DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs и 4OD AS1411 (OD - оптическая плотность; 1OD ≈ 33 мкг) в новую колбу.
- Растворите 28,76 мг EDC в 1 мл ультрачистой воды и добавьте раствор EDC в колбу, используемую в шаге 5.1.
- Растворите 17,27 мг ГСЗ в 1 мл ультрачистой воды. Добавьте раствор NHS в колбу, используемую в шаге 5.1, и размешайте реакцию на 1 ч на RT.
- Диализ реакции продукта с помощью диализа мешок (1000 MWCO) в течение 3 дней, как описано в шаге 2.5 для получения AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
6. Характеристика образца
- Растворите полимер CT-PEG (шаг 1.8) и кополимер PEI-g-PEG (шаг 2.7) в трубах ядерного магнитного резонанса (NMR) соответственно. Проанализируйте образцы с помощью спектрометра 600 МГц NMR, оснащенного сверхпроводящих магнитом 14,09 Т и 5,0 мм 600 МГц широкополосного зонда высокого разрешения, чтобы подтвердить химическуюструктуру 34.
- Разогнать AuNPs, DOX, и AS1411, и подготовленные PEI-g-PEG@AuNPs (шаг 3.4), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (шаг 4.4), и AS1411-g-DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPs (шаг 5.4), соответственно в ультрапурной воде. Затем перенесите на кюветы и замелите ультрафиолетовые видимые (УФ-виз) спектры с помощью УФ-визави спектрофотометра.
- Прикрепите двусторонний клей (2 мм х 2 мм) к алюминиевой фольге и окуните образец раствора (PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs и AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs) на всю ленту равномерно. Проанализируйте образцы с помощью рентгеновского фотоэлектроноспектроскопии анализатора.
- Разогнать PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, и AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, соответственно, в ультрапурной воде. Затем перенесите на кюветы и оцените распределение размера с помощью динамического рассеяния света.
- Разогнать PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, и AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs растворы в ультрапурной воде (одна капля образца на 5 мл ультрапурной воды для каждого образца). Соникат на 2 ч. Опустите медную сетку в образец растворов и высушите под инфракрасной лампой. Характеризовать морфологию с помощью электронного микроскопа передачи.
- Ввините 1 мг AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs в кассету с диализом 20 кДа MWCO, затем поместите в 80 мл фосфатного буферного солевого раствора (PBS) с 5% альбумин сыворотки крупного рогатого скота (BSA). Перемешать при 37 градусов по Цельсию.
- В заданные сроки соберите 100 алицитов йл и замените свежими PBS. Используйте УФ-визави спектрофотометр для измерения интенсивности флуоресценции DOX алицитов.
7. Анализ CCK-8 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs наночастиц
- Выращиваем клетки A549 в модифицированной среде орла Дульбекко (DMEM), дополненной 10% сывороткой крупного рогатого скота плода, 100 U/mL пенициллином и 100 мкг/мл стрептомицина в увлажненной атмосфере 95% воздуха и 5% CO2 при 37 градусах Цельсия. Замените культурную среду каждые 2 дня. Используйте клетки при прохождении 5 для пролиферации клеток и анализа цитотоксичности для количественной оценки цитотоксии подготовленных наночастиц AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
- Добавьте 100 МКЛ раствора наночастиц в каждую хорошо содержать 1 мл клеточной среды. После культивирования в течение 24 ч и 48 ч, удалить культуру средств массовой информации из пластин клеточной культуры, а затем добавить 300 йл свежих средств культуры и 30 йл комплекта подсчета клеток-8 (CCK-8) комплект решений сразу к каждой хорошо. Инкубация в течение 4 ч в инкубаторе CO2 при 37 градусах Цельсия.
- Передача 200 МКЛ реакционной растворов из шага 7.2 в пластину 96 хорошо. Прочитайте оптическую плотность (OD) каждой хорошо на 570 нм с микроплечом читателя.
- Наблюдайте за морфологией клеток на 24 ч и 48 ч под микроскопом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1 год Спектроскопия НМР была использована для подтверждения успешного синтеза полимеров CT-PEG и кополимеров PEI-g-PEG(рисунок 2). Рисунок 2a показывает, что метиленовый протонный сигнал при δ и 3,61 промилле и карбоксил протонный сигнал при δ и 2,57 промилле подтверждают успешный синтез полимеров CT-PEG. Рисунок 2b показывает, что метиленовый протонный сигнал ПЕГ при δ и 2,6 промилле и протонный сигнал PEI при δ и 1,66 промилле подтверждают синтез кополимеров PEI-g-PEG.
УФ-виз спектроскопия была проведена для определения успешной функционализации подготовленного кополимера на AUNPs(рисунок 3). В уф-визави, наличие полос на 523 нм, 507 нм и 260 нм соответствует поверхности плазмонные резонансы (SPR) пики AuNPs, DOX, и AS1411, соответственно (Рисунок 3a). Полосы на 360 нм в спектре UV-vis PEI-g-PEG@AuNPs, 532 нм в спектре УФ-визави DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs и 546 нм в спектре УФ-виз AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs подтверждают успешный синтез ПЭИ-Г-ПЕГ кополиперов, прикрепленных к ЕПВ-Г-Г-PEG@AuNPs. Они также подтверждают, что DOX и AS1411 были загружены на функциональные AUNPs постепенно(рисунок 3b).
Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS) была использована для исследования химической связи кополимера на AUNPs(рисунок 4). Спектр XPS PEI-g-PEG@AuNPs показал C1s, O1s, N1s, и Au4f пики указали на связь между AuNPs и PEI-g-PEG copolymer (Рисунок 4a). Существовал небольшое изменение в спектре XPS DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, как DOX был дополнительно привит на PEI-g-PEG@AuNPs (Рисунок 4b). Кроме того, появление пика P2p для AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs было в основном связано с успешным трансплантатом AS1411 на DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (Рисунок 4c). Распределение размеров подготовленных наночастиц было проанализировано с помощью DLS(рисунок 5). По сравнению с PEI-g-PEG@AuNPs, средний диаметр гидратации немного увеличился в DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs и далее увеличился после того, как AS1411 был привит.
TEM был использован для определения морфологии наночастиц, и изображения показали, что все наночастицы были однородны без агрегации(рисунок 6). Благодаря взаимодействию между кополимерыми на поверхности АУН постепенно увеличивалась дистанция АУН. Тест жизнеспособности ячейки был использован для определения целевого свойства подготовленной системы доставки DOX(рисунок 7 и рисунок 8). Результаты CCK-8(рисунок 7) показали, что 1) число клеток A549 уменьшилось после культивирования с AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs с течением времени и 2) количество клеток уменьшилось с повышенной концентрацией наночастиц. По сравнению со свободной группой DOX, количество клеток увеличилось, что указывает на то, что токсичность была снижена.
Вместе с изображениями оптической микроскопии(рисунок 8),результаты показывают, что число клеток уменьшилось после культивирования с AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (Рисунок 8a'd) по сравнению с контрольной группой без добавления наночастиц (Рисунок 8e,f). Кроме того, был исследован профиль выпуска DOX из подготовленного AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs в PBS(рисунок 9). Результаты показывают, что устойчивый выпуск DOX из функциональных наночастиц вызвал снижение в клетках A549, а совокупный выпуск DOX составил около 63,5% ± 3,2% при 72 ч.
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация синтеза PEI-g-PEG@AuNP, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP и AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: 1H NMR спектры (а) синтезированных CT-PEG полимера и (b) PEI-g-PEG copolymer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: УФ-виз спектры (а) AuNPs, DOX, и AS1411, и (б) PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, и AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: СПЕКТР XPS (a) PEI-g-PEG@AuNPs, b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs и (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Распределение размеров PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs и AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
d.nm - средний диаметр наночастицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: TEM изображения (а) PEI-g-PEG@AuNPs, (b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, и (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
Масштаб баров 50 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Оптические значения плотности на уровне 570 нм (OD570) клеток A549 после культивирования с AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (220 мкг/мл и 110 мкг/мл) для 24 ч и 48 ч, соответственно.
Клетки со свободным DOX и клетки без добавления наночастиц включены в качестве контрольных групп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Оптические микроскопические изображения клеток A549 после культивирования с AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs на уровне 220 мкг/мл (a,b) и 110 мкг/мл (c,d), или культивирование без добавления наночастиц в качестве контрольной группы (e,f) на 24 ч (верхние панели) и 48 h (нижние панели). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9: Выпуск профиля DOX от AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs в PBS для 72 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Спектр 1НМР H(рисунок 2) подтверждает успешный синтез кополимера CT-PEG и кополимера PEI-g-PEG. Молекулярные веса PEG и PEI были 1000 и 1200, соответственно. Кроме того, каталитическая система EDC/NHS использовалась для синтеза кополимера PEI-g-PEG с помощью реакций амида. Следует отметить, что если молекулярные веса ПЕГ и PEI изменились для синтеза кополимера PEI-g-PEG, то время реакции и каталитическая система должны быть переоценены. Кроме того, состояние реакции кополимерного покрытия PEI-g-PEG на AUNPs необходимо дополнительно отрегулировать, главным образом потому, что вес молекулы и структура кополимера PEG-g-PEI могут влиять на эффективность покрытия и диаметр AuNPs. После этого морфология кополимера функционализированных AUNPs также может быть изменена. Количество аминокислотных групп из полимера PEI может влиять на структуру окончательного синтеза кополимеров PEI-g-PEG, и неизбежно произойдет перекрестное действие между PEI и CT-PEG. Таким образом, шаг 2.4 должен быть выполнен тщательно, и решение PEI должно быть медленно добавлено капля за каплей. После реакции синтеза необходимо проработать диализ (шаги 2.5 и 2.6), чтобы удалить перекрестный кополимер и неотредактированные полимеры.
Кроме того, DOX и AS1411 последовательно функционируют на PEI-g-PEG@AuNPs с помощью амидом реакций, и каталитическая система EDC/NHS используется. Это требует 3 дней для каждой реакции (шаг 4.3 и шаг 5.3) здесь; однако, если время реакции требует менее 3 дней, эффективность функционализации будет снижаться. При необходимости более 3 дней, тот же результат был получен. Следует отметить, что химические EDC, NHS, и неподключеные DOX или AS1411 могут быть удалены с помощью диализа (шаг 4.4 и шаг 5.4). УФ-виз спектра и XPS являются эффективными методами для исследования успешной функционализации кополимера на наночастицах, и последовательные результаты былиполучены (рисунок 3 и рисунок 4).
В отличие от характерных УФ-визави полос AuNPs, DOX и AS1411, уникальные пики PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, и AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs являются сложными для наблюдения, из-за перекрытия каждого пика. Кроме того, мы провели другой метод изготовления DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (синтез DOX-g-PEI-g-PEG в первую очередь и выполнение функционализации на AUNPs); однако, золотые наночастицы, использующие такой подход, привели к низкой эффективности загрузки DOX35,36. Таким образом, следует отметить, что метод синтеза DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs в этой работе обеспечит достаточную эффективность загрузки DOX, а также дальнейший профиль выпуска. Если эксперимент не учитывает эффективность загрузки DOX золотых наночастиц, существуют и другие методы получения AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. К ним относятся синтез DOX-g-PEI-g-PEG или AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG с помощью реакции сначала, а затем функционализации на наночастиц золота. Таким образом, метод, используемый здесь, а также полученные кополимеры могут быть применены к различным медицинским приложениям, таким как тканевая инженерия.
Распределение размеров и морфология подготовленных наночастиц могут быть исследованы DLS и TEM. Данные DLS(рисунок 5) показывают, что наночастицы диаметра гидратации варьируются от различных покрытий, и для каждого образца появляется более одного пика. Что касается структуры PEI-g-PEG(рисунок 1),то нормальной кривой распределения DLS не наблюдается. Следует отметить, что наночастицы рассредоточены в ультрапурной воде во время испытания DLS, используются различные соотношения объема, и многокоторые все еще существуют, из-за взаимодействия между монополимерами на поверхности наночастиц. Таким образом, изображения TEM используются для подтверждения морфологии наночастиц. Изображения TEM PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs и AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs показаны на рисунке 6.
На основе различных компонентов поверхностей золотых наночастиц меняются расстояния между наночастицами. Кроме того, подготовленные наночастицы, рассеянные в воде, стабильны в соответствии с потенциальными испытаниями zeta (-29-50 мВ для различных наночастиц после времени испытаний). Дальнейшая функционализация DOX и AS1411 (разделы 4 и 5 протокола) не влияет на диаметр золотых наночастиц. Можно сделать вывод, что UV-vis является эффективным методом подтверждения DOX и AS1411, загруженных на наночастицы без использования всех методов тестирования.
Целевое свойство раковых клеток было исследовано с использованием A549 клетки, культурные с различными концентрациями подготовленных AS1411 и DOX загружены AuNPs и без добавления наночастиц в качестве контрольной группы. В то же время, влияние свободного DOX на жизнеспособность ячейки A549 также было протестировано(рисунок 7 и рисунок 8). По сравнению с группой без добавления наночастиц, подготовленный AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs приводит к снижению количества клеток A549. Однако, в то время как концентрация наночастиц уменьшается (100 мкг/мл), клетки показывают лучшую активность на 24 ч по сравнению со свободной группой DOX. Это главным образом потому, что PEI-g-PEG copolymer имеет отличную цитосовместимость37 и неспецифической токсичности разветвленного полимера PEI улучшена.
Наконец, из-за целевого свойства aptamer AS1411, полученные наночастицы накапливаются в раковых клетках вместо здоровых клеток. После того, как aptamer признается, DOX выпущен, чтобы убить раковые клетки. Профиль выпуска DOX от AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs в PBS был записан(рисунок 9). Этот протокол демонстрирует подход к подготовке aptamers и DOX привиты на кополимер модифицированных AuNPs через многоступенчатую реакцию фонета. Синтезированные наночастицы имеют потенциал для применения терапии рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Национальным фондом естественных наук Китая (31700840); Ключевой научно-исследовательский проект провинции Хэнань (18B430013, 18A150049). Это исследование было поддержано программой ученых Нанху для молодых ученых XYNU. Авторы хотели бы поблагодарить студента бакалавриата Зебо Цу из Колледжа наук о жизни в XYNU за его полезные работы. Авторы хотели бы отметить Аналитический и испытательный центр XYNU за использование их оборудования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Dimethylaminopyridine | Macklin | D807273 | |
| A549 cell | ATCC CCL-185TM | ||
| AS1411 | BBI Life Sciences Corporation | 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411) | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Sigma Aldrich | 96992-500TESTS-F | |
| Dichloromethane | Traditional Chinese medicine | 80047318 | |
| Diethyl ether (Et2O) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Dimethyl sulfoxide | Macklin | D806645 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Sigma Aldrich | ||
| Doxorubicin hydrochloride | Rhawn | R017518 | |
| Ether absolute | Traditional Chinese medicine | 80059618 | |
| Field Emission Transmission Electron Microscope | FEI Company | Tecnai G2 F 20 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Rhawn | R016035 | |
| Laser Particle-size Instrument | Malvern Instruments Ltd | ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Macklin | N808856 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Macklin | H6231 | |
| NMR software | Delta 5.2.1 | ||
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | JEOL | JNM-ECZ600R/S3 | |
| Origin 8.5 | OriginLab | ||
| Penicillin | Sigma Aldrich | V900929-100ML | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 81188 | BioUltra, average Mn ~ 1000 |
| Poly (ethyleneimine) solution | Sigma Aldrich | 482595 | average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O |
| Sodium borohydride, powder | Acros | C18930 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | 85886-10ML | |
| Succinic anhydride | Traditional Chinese medicine | 30171826 | |
| Tetrahydrofuran | Traditional Chinese medicine | 40058161 | |
| Triethylamine | Traditional Chinese medicine | 80134318 | |
| UV/VIS/NIR Spectrometer | Lambda950 | Lambda950 | |
| X-ray Photoelectron Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | K-ALPHA 0.5EV |
References
- Abad, J. M., Bravo, I., Pariente, F., Lorenzo, E. Multi-tasking base ligand: a new concept of AuNPs synthesis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (9), 2329-2338 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Jang, B., Kwon, H., Katila, P., Lee, S. J., Lee, H. Dual delivery of biological therapeutics for multimodal and synergistic cancer therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 98, 113-133 (2016).
- Gansler, T., et al. Sixty years of CA: a cancer journal for clinicians. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 60 (6), 345-350 (2010).
- Li, J., et al. Molecular Mechanism for Selective Cytotoxicity towards Cancer Cells of Diselenide-Containing Paclitaxel Nanoparticles. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1755-1770 (2019).
- Zhao, D., et al. Precise ratiometric loading of PTX and DOX based on redox-sensitive mixed micelles for cancer therapy. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 155, 51-60 (2017).
- Blum, R. H., Carter, S. K. Adriamycin. A new anticancer drug with significant clinical activity. Annals of Internal Medicine. 80 (2), 249-259 (1974).
- de Lima, R. D. N., et al. Low-level laser therapy alleviates the deleterious effect of doxorubicin on rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Photochemistry Photobiology B. 196, 111512 (2019).
- Markowska, A., Kaysiewicz, J., Markowska, J., Huczynski, A. Doxycycline, salinomycin, monensin and ivermectin repositioned as cancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 29 (13), 1549-1554 (2019).
- Songbo, M., et al. Oxidative stress injury in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Toxicology Letters. 307, 41-48 (2019).
- Ewer, M. S., Ewer, S. M.
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Barenholz, Y. Pharmacokinetics of pegylated liposomal Doxorubicin: review of animal and human studies. Clinical Pharmacokinetics. 42 (5), 419-436 (2003).
- Xu, X., Ho, W., Zhang, X., Bertrand, N., Farokhzad, O. Cancer nanomedicine: from targeted delivery to combination therapy. Trends in Molecular Medicine. 21 (4), 223-232 (2015).
- Feng, S., Nie, L., Zou, P., Suo, J. Effects of drug and polymer molecular weight on drug release from PLGA-mPEG microspheres. Journal of Applied Polymer Science. 132 (6), 41431 (2015).
- Chen, D., et al. Injectable Temperature-sensitive Hydrogel with VEGF Loaded Microspheres for Vascularization and Bone Regeneration of Femoral Head Necrosis. Materials Letters. 229, 138-141 (2018).
- Abadeer, N. S., Murphy, C. J. Recent Progress in Cancer Thermal Therapy Using Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 120 (9), 4691-4716 (2016).
- Riley, R. S., Day, E. S. Gold nanoparticle-mediated photothermal therapy: applications and opportunities for multimodal cancer treatment. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (4), 1449 (2017).
- Fratoddi, I., et al. Highly Hydrophilic Gold Nanoparticles as Carrier for Anticancer Copper(I) Complexes: Loading and Release Studies for Biomedical Applications. Nanomaterials (Basel). 9 (5), 772 (2019).
- Lee, S. M., et al. Drug-loaded gold plasmonic nanoparticles for treatment of multidrug resistance in cancer. Biomaterials. 35 (7), 2272-2282 (2014).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2740-2779 (2012).
- Wei, T., et al. Anticancer drug nanomicelles formed by self-assembling amphiphilic dendrimer to combat cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 2978-2983 (2015).
- Galluzzi, L., Buque, A., Kepp, O., Zitvogel, L., Kroemer, G. Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell. 28 (6), 690-714 (2015).
- Muddineti, O. S., Ghosh, B., Biswas, S. Current trends in using polymer coated gold nanoparticles for cancer therapy. International Journal of Pharmaceutics. 484 (1-2), 252-267 (2015).
- Hu, W., et al. Methyl Orange removal by a novel PEI-AuNPs-hemin nanocomposite. Journal of Environmental Sciences. 53, 278-283 (2017).
- Gu, F. X., et al. Targeted nanoparticles for cancer therapy. Nano Today. 2 (3), 14-21 (2007).
- Srinivasarao, M., Galliford, C. V., Low, P. S. Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (3), 203-219 (2015).
- Liu, Z., Shi, Y., Chen, Z., Duan, L., Wang, X. Current progress towards the use of aptamers in targeted cancer therapy. Chinese Science Bulletin (Chinese Version). 59 (14), 1267 (2014).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M.
- Vandghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. Antisense LNA-loaded nanoparticles of star-shaped glucose-core PCL-PEG copolymer for enhanced inhibition of oncomiR-214 and nucleolin-mediated therapy of cisplatin-resistant ovarian cancer cells. International Journal of Pharmaceutics. 573, 118729 (2020).
- Andghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. AS1411 aptamer-decorated cisplatin-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles for targeted therapy of miR-21-inhibited ovarian cancer cells. Nanomedicine. 13 (21), 2729-2758 (2018).
- Palmieri, D., et al. Human anti-nucleolin recombinant immunoagent for cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9418-9423 (2015).
- Pichiorri, F., et al. In vivo NCL targeting affects breast cancer aggressiveness through miRNA regulation. Journal of Experimental Medicine. 210 (5), 951-968 (2013).
- Hou, S., McCauley, L. K., Ma, P. X. Synthesis and erosion properties of PEG-containing polyanhydrides. Macromolecular Bioscience. 7 (5), 620-628 (2007).
- Nie, L., et al. Injectable Vaginal Hydrogels as a Multi-Drug Carrier for Contraception. Applied Sciences. 9 (8), 1638 (2019).
- Zou, P., Suo, J., Nie, L., Feng, S. Temperature-responsive biodegradable star-shaped block copolymers for vaginal gels. Journal of Materials Chemistry. 22 (13), 6316-6326 (2012).
- Etrych, T., Šubr, V., Laga, R., Říhová, B., Ulbrich, K. Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 58, 1-12 (2014).
- Safari, F., Tamaddon, A. M., Zarghami, N., Abolmali, S., Akbarzadeh, A. Polyelectrolyte complexes of hTERT siRNA and polyethyleneimine: Effect of degree of PEG grafting on biological and cellular activity. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (6), 1561-1568 (2016).
