Summary
このプロトコルでは、ドキソルビシンを装填したAS1411-g-PEI-g-PEG変性金ナノ粒子は、3段階のアミド反応を介して合成される。次いで、ドキソルビシンをロードし、癌治療のために標的癌細胞に送達する。
Abstract
健康な細胞における薬剤耐性および毒性のために、ドキソルビシン(DOX)の使用は臨床癌治療において限られている。このプロトコルは、ポリエチレングリコール(PEI-g-PEG)共重合体機能化金ナノ粒子(AuNPs)をアミド反応を介してアプタマー(AS1411)とDOXを移植したポリ(エチレニミン)の設計を記述する。AS1411は、がん細胞上の標的ヌクレオリン受容体と特異的に結合し、DOXが健康な細胞の代わりに癌細胞を標的とするようにする。まず、PEGはカルボキシ化され、次いで分枝状PEIに移植し、PEI-g-PEG共重合体を得、これは 1HNMR分析によって確認される。次に、PEI-g-PEG共重合体被覆金ナノ粒子(PEI-g-PEG@AuNPs)が合成され、DOXとAS1411はアミド反応を介して徐々にAuNPsに共有結合される。調製されたAS1411-g-DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPsの直径は、-29.3mVのゼータ電位を有する、ナノ粒子が水および細胞媒体において安定であることを示す。.細胞細胞毒性アッセイは、新たに設計されたDOX搭載AuNPsが癌細胞を殺すことができることを示している(A549)。この合成は、連続アミド反応によって達成されるAuNPs上のPEI-g-PEGコポリマー、アプタマー、およびDOXの繊細な配置を示しています。このようなアプタマー-PEI-g-PEG機能化されたAuNPsは、がん治療における標的薬物送達のための有望なプラットフォームを提供する。
Introduction
世界的に主要な公衆衛生上の問題である癌は、治癒率が低く、再発率が高く、死亡率が高いとして広く特徴づけられている。現在の従来の抗癌法には、手術、化学療法、および放射線療法3が含まれており、その中で化学療法は、クリニック4における癌患者に対する主要な治療法である。臨床用抗癌剤は主に、パクリタキセル(PTX)5およびドキソルビシン(DOX)6,7を含む。DOXは、抗新生剤である、癌細胞毒性および癌細胞増殖の阻害の利点のために、臨床化学療法に広く適用されている8,9。しかし、DOXは心毒性10、11を引き起こし、DOXの短い半減期は、診療所12での適用を制限する。したがって、DOXをロードし、標的領域に制御された方法で潜伏放出するために分解性薬物キャリアが必要である。
ナノ粒子は標的薬物送達システムで広く使用されており、がん治療にはいくつかの利点があります(すなわち、大きな表面対体積比、小型、様々な薬物をカプセル化する能力、および調整可能な表面化学など)13、14、15。特に、金ナノ粒子(AuNPs)は、光熱癌治療16,17などの生物及び生物医学的用途において広く用いられている。AuNPsのユニークな特性は、ファシリティ合成や一般表面官能化など、がん治療18の臨床分野において優れた見通しを持っている。また、AuNPは、多くの研究で薬物送達戦略を特定し、腫瘍を診断し、抵抗を克服するために使用されてきました19,20.
それにもかかわらず、AuNPは、標的化およびアクセシビリティ特性などの強化された浸透および保持(EPR)を介して腫瘍病変で高い局所放出を介して薬剤耐性を克服するためにさらに調整される必要がある。ポリマー機能性のAUNPsは、疎水性抗癌剤の水溶性の改善や長期の循環時間21,22などの独自の利点を発揮している。ポリエチレングリコール(PEG)、ポリエチレンイミン(PEI)、ヒアルロン酸、ヘパリン、キサンタンガムなどの様々な生体適合性ポリマーがAuNPコーティングに使用されています。その後、AuNPsの安定性とペイロードが23を改善します。具体的には、PEIは、一次、二次、および第三級アミンの多くの繰り返し単位で構成される高度に分岐したポリマーである24。PEIは、優れた溶解性、低粘度、高い機能性を有しており、AUNP上でのコーティングに適しています。
一方、抗癌剤は、癌細胞に直接送達する必要があり、負荷効率を向上させ、原発性および進行転移性腫瘍25を治療するための毒性を低くする必要がある。標的リガンドは、抗癌剤標的送達システム26に大きな可能性を秘めている。標的分子結合に対するその選択性は、特異性を標的とする抗癌薬を付与し、疾患組織における薬物濃縮を増加させる27。よりリガンドには、抗体、ポリペプチド、および小分子が含まれる。他のリガンドと比較して、核酸アプタマーは、インビトロで合成することができ、変更が容易である。AS1411は、癌細胞28、29、30上の過剰発現標的核タンパク受容体に特異的に結合する安定な二量体G-四量体構造を形成する非修飾26bpホスホジエステルオリゴヌクレオチドチドである。AS1411は多くの癌細胞の増殖を阻害するが、健康な細胞31、32の増殖には影響しない。その結果、AS1411は理想的な標的薬物送達システムを作製するために使用されてきた。
本研究では、PEI-g-PEG共重合体をアミド反応を介して合成し、次いでPEI-g-PEG共重合体被覆金ナノ粒子(PEI-g-PEG@AuNPs)を作製した。さらに 、DOXと AS1411 は、図 1 に示すように、準備された PEI-g-PEG@AuNPsに順次リンクされています。この詳細なプロトコルは、研究者がDOXとAS1411を搭載した新しいPEI-g-PEG@AuNPsの製造に関連する多くの一般的な落とし穴を避けるのを助けることを目的としています。
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Protocol
注意: すべての化学物質を使用する前に、関連するすべての材料安全データシート(MSDS)を必ずご確認ください。コポリマーおよびナノ粒子の調製に使用される化学物質のいくつかは、急性毒性である。ナノ粒子には潜在的な危険もあります。手袋、ラボコート、フード、フルレングスパンツ、近い靴など、適切な安全対策と個人用保護具をすべて使用してください。
1. 二重カルボキシルポリエチレングリコール(CT-PEG)33の合成
- コハク酸無水(SA)1.46g(14.6 mmol)と4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)の209mg(1.71ミリモル)を100 mLラウンドボトムフラスコに加えます。
- ステップ1.1で使用したフラスコに無水テトラヒドロフラン(THF)の15mLを加え、ガラスストッパーを装着します。フラスコを0°Cで30分間おいて下します。
- ポリエチレングリコール(PEG)4.28g(4.28 mmol)とトリエチルアミン(TEA)の1.8 mL(12.8 mmol)を新しいフラスコに加えます。
- ステップ1.3で使用したフラスコに無水THFの15 mLを加え、ガラスストッパーを合わせます。ステップ1.2で使用したフラスコに溶液をゆっくりと移し、窒素雰囲気下の注射器を用いた。
- 溶液を0°Cで2時間撹拌し、室温(RT)で一晩反応を続ける。
- ロータリーエバポレーター(40°C、0.1 MPa)を使用して、反応液を濃縮し、THF溶媒を除去します。
- RTでは、ステップ1.6から15mLの1.325g/mLジクロロメタン(DCM)を溶解し、15mLのコールドジエチルエーテル(Et2O)を加えて沈殿物(ポリエチレングリコール二酸)を得る。フィルターペーパーで溶剤を取り除きます。
注:降水ステップは3倍に繰り返すことができます。 - RTで真空下で沈殿物を48時間乾燥させます。
2. PEI-g-PEG共重合体の合成
- ステップ1.8および5 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)から305.47mgのCT-PEGをフラスコに加え、RTで攪拌してCT-PEGがDMSOに完全に溶解していることを確認します。
- DMSOの5mLで1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド(EDC)の49.46mgを5mLに溶解し、ステップ2.1で使用されるフラスコに溶液を加え、RTで30分間かき混ぜます。
- 29.69 mgのN-ヒドロキシスクッチイミド(NHS)をDMSOの5 mLに溶解し、ステップ2.1で使用するフラスコに溶液を加えます。RTで3時間かき混ぜ続けます。
- 28.6 μLのポリエチレンイミン(PEI)をDMSOの10 mLに溶解し、ステップ2.1で使用するフラスコに溶液を滴下して添加します。少なくとも3日間かき混ぜます。
- 反応した溶液をステップ2.4から透析袋(1,000分子量カットオフ[MWCO])に移します。透析袋を1 Lビーカーに入れ、500mLの超純水を透析液として入れます。超純水を12時間ごとに3日間交換します。
- ステップ 2.5 のソリューションを別の透析バッグ (10,000 MWCO) に移します。透析袋を1 Lビーカーに入れ、500mLの超純水を透析液として入れます。超純水を12時間ごとに3日間交換します。
- 回転エバポレーター(40°C、0.1 MPa)を使用してステップ2.6から溶液を濃縮し、サンプルを凍結乾燥してPEI-g-PEG粉末を得る。
3. PEI-g-PEG@AuNPsの合成
- 5 mgの調製した PEI-g-PEG (ステップ 2.7) を 5 mL の超純水に新しいフラスコに溶かし、ガラス栓でフィットさせます。
- フラスコに0.3 mM HAuCl4溶液の100 mLを加え、RTで3時間攪拌します。
注: ソリューションの色は、すぐに黄色からオレンジ色に変更されます。 - フラスコに1mg/mL NaBH4 溶液1 mLを加え、RTで3時間攪拌します。
注:反応溶液は即座にバーガンディを回す必要があります。 - ステップ2.5で説明したように3日間透析バッグ(1,000MWCO)を用いた反応生成物を透析し、PEI-g-PEG@AuNPs溶液を得た。
4. DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPsの合成
- 2.2 mg/mL DOX溶液1 mLと20 mLのPEI-g-PEG@AuNPs溶液を新しいフラスコに加え、ガラス栓に合わせます。
- 0.727 mgのEDCを1mLの超純水に溶解し、ステップ4.1で使用するフラスコにEDC溶液を加えます。
- 1 mLの超純水に0.437mgのNHSを溶かします。フラスコにNHS溶液を加え、RTで1時間かき混ぜます。
- 手順2.5に記載した3日間の透析袋(1,000MWCO)を用いて反応生成物を透析し、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs溶液を得た。
5. AS1411-g-DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPsの合成
- 20 mL の DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs溶液と 4OD AS1411 (OD = 光学密度; 1OD ≈ 33 μg) を新しいフラスコに加えます。
- 28.76 mgのEDCを1mLの超純水に溶解し、ステップ5.1で使用するフラスコにEDC溶液を加えます。
- 1mLの超純水に17.27mgのNHSを溶かします。ステップ5.1で使用したフラスコにNHS溶液を加え、RTで1時間反応をかき混ぜる。
- 透析用バッグ(1,000 MWCO)をステップ2.5に記載した3日間用いて反応生成物を透析し、AS1411-g-g-g-PEI-g-PEG@AuNPsを得た。
6. サンプルの特性評価
- CT-PEGポリマー(ステップ1.8)とPEI-g-PEG共重合体(ステップ2.7)をそれぞれ核磁気共鳴(NMR)チューブでクロロホルムdに溶解する。14.09 T超伝導磁石と5.0mm 600 MHzの広帯域Z勾配高分解能プローブを搭載した600MHz NMR分光計を用いてサンプルを分析し、化学構造34を確認する。
- AuNPs、DOX、およびAS1411を分散し、PEI-g-PEG@AuNPs(ステップ3.4)、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs(ステップ4.4)、AS1411-g-DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPsをそれぞれ超純水中に調製した。次に、UV-vis分光光度計を用いて、キュベットに移し、紫外線可視(UV-vis)スペクトルを記録します。
- 両面接着剤(2mm×2mm)をアルミ箔に取り付け、サンプル溶液(PEI-g-PEG@AuNPs、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs、AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs)をテープ全体に均一に浸します。X線光電子分光分析装置を用いてサンプルを分析します。
- PEI-g-PEG@AuNPs、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs、AS1411-g-doX-g-PEI-g-PEG@AuNPs溶液をそれぞれ超純水に分散させます。次いで、キュベットに移し、動的光散乱を用いてサイズ分布を評価する。
- PEI-g-g-PEG@AuNPs g-PEG@AuNPs、AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs溶液を超純水(各サンプルに対して5mLあたり1滴サンプル)の超純水に分散させます。2時間の超音波処理。銅グリッドをサンプル溶液に浸し、赤外線ランプで乾燥させます。透過型電子顕微鏡を用いて形態を特徴付け
- AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs g-20 kda MWCO透析カセットに1mgを注入し、5%ウシ血清アルブミン(BSA)でリン酸緩衝生理食塩液(PBS)80 mLに入れます。37°Cでかき混ぜる。
- 所定のタイムポイントで、100 μLのアリコートを収集し、新鮮なPBSに交換します。UV-vis分光光度計を使用して、アリコートのDOX蛍光強度を測定します。
7. As1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPsナノ粒子のCCK-8アッセイ
- 10%の胎児ウシ血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシンを37°Cで95%空気、5%CO2の加湿雰囲気下で補ったダルベックコの修飾イーグル培地(DMEM)でA549細胞を増殖させます。 2日ごとに培地を交換してください。細胞増殖および細胞毒性アッセイの継代時の細胞を使用して、調製したAS1411-g-g-g-g-PEI-g-PEG@AuNPsナノ粒子の細胞毒性を定量的に評価する。
- ナノ粒子溶液を100μLずつ、細胞培地1mLを各ウェルに加えます。24時間と48時間培養した後、培養液を細胞培養プレートから取り出し、300μLの新鮮な培養培地と30μLの細胞計数キット-8(CCK-8)キット溶液を各ウェルに直ちに添加します。CO2インキュベーターで4時間インキュベートを37°Cでインキュベートする。
- ステップ7.2から96ウェルプレートに200 μLの反応溶液を移します。マイクロプレートリーダーで570 nmの各井戸の光学密度(OD)を読み取ります。
- 顕微鏡下で24時間と48時間で細胞の形態を観察します。
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Representative Results
1H NMR分光法は、CT-PEGポリマーとPEI-g-PEG共重合体の合成に成功したことを確認するために用いた(図2)。図2aは、δ=3.61ppmでのメチレンプロトン信号とδ=2.57ppmのカルボキシルプロトン信号がCT-PEGポリマーの合成に成功したことを確認することを示す。 図2bは、δ=2.6ppmでのPEGのメチレンプロトンシグナルと、PEIのプロトンシグナルがδ=1.66ppmでPEI-g-PEGコポリマーの合成を確認することを示す。
UV-vis分光法は、AuNPs上で調製されたコポリマーの正常な機能化を決定するために行われた(図3)。UV-visスペクトルにおいて、〜523nm、507nm、および260nmのバンドの存在は、それぞれAuNPs、DOX、およびAS1411の表面プラズモン共鳴(SPR)ピークに対応する(図3a)。PEI-g-PEG@AuNPsのUV-visスペクトルにおける~360nmのバンド、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPsのUV-visスペクトルでは〜532nm、AS1411-g-g-g-PEI-g-PEG@AuNPsのUV-visスペクトルでは、AuNに取り付けられたPEI-g-コポリマーの合成に成功したことを確認した。また、DOX と AS1411 が機能する AuNP に徐々にロードされていることを確認します (図 3b)。
X線光電子分光法(XPS)を用いて、AuNPs上の共重合体の化学結合を調べた(図4)。PEI-g-PEG@AuNPsのXPSスペクトルは、C1、O1、N1、およびAu4fピークを示し、AuNPsとPEI-g-PEGコポリマーの間の関係を示した(図4a)。DOXがPEI-g-g-PEG@AuNPsでさらに移植されたように、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPsのXPSスペクトルにわずかな変化があった(図4b)。さらに、AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPsのP2pピークの出現は、主にDOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs上でのAS1411の移植に成功したためPEG@AuNPsした(図4c)。調製したナノ粒子のサイズ分布をDLSを用いて分析した(図5)。PEI-g-PEG@AuNPsと比較して、平均水和直径はDOX-g-PEI-g-PEG@AuNPsでわずかに増加し、AS1411が移植されるとさらに増加した。
TEMを使用してナノ粒子の形態を決定し、画像は全てのナノ粒子が凝集せずに均一であることを示した(図6)。AuNPsの表面上のコポリマー間の相互作用により、AuNPsの距離は徐々に増加しました。細胞生存率試験を使用して、準備されたDOX送達システムの標的特性を決定した(図7 および 図8)。CCK-8の結果(図7)は、1)A549細胞数が時間の経過とともにAS1411-g-doX-PEI-g-g-PEG@AuNPsで培養した後に減少し、2)ナノ粒子の濃度の増加に伴って細胞数が減少したことを示した。遊離DOX基と比較して、細胞数が増加し、毒性が低下したことを示す。
光学顕微鏡画像(図8)と共に、AS1411-g-DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPs(図8a−d)で培養した細胞数が、ナノ粒子を添加しない対照群と比較して減少したことを示している(図8e,f)。さらに、PBSで調製されたAS1411-g-DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPsからのDOX放出プロファイルを調査した(図9)。結果は、機能的なナノ粒子からのDOXの持続的な放出がA549細胞の減少を引き起こし、累積DOX放出は72時間で約63.5%±3.2%であったことを示した。
図1:PEI-g-PEG@AuNP、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP、AS1411-g-doX-g-PEI-g-PEG@AuNPの合成の概略図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:(a)合成されたCT-PEGポリマーおよび(b)PEI-g-PEG共重合体の1HNMRスペクトル。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:(a)AuNPs、DOX、およびAS1411、および(b)PEI-g-g-PEG@AuNPs g-PEG@AuNPs、およびAS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPsのUV-visスペクトル。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:XPSスペクトル(a)PEI-g-PEG@AuNPs、(b)DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs、および(c)AS1411-g-DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPs。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:PEI-g-PEG@AuNPs、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs、AS1411-g-DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPsのサイズ分布。
d.nm = ナノ粒子の平均直径。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:(a)PEI-g-PEG@AuNPs、(b)DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPs、および(c)AS1411-g-doX-g-PEI-g-PEG@AuNPsのTEM画像。
スケール バー = 50 nm。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs(220μg/mLおよび110μg/mL)をそれぞれ24時間および48時間で培養した後のA549細胞の570nm(OD570)における光学密度値。
遊離DOXを有する細胞およびナノ粒子を添加しない細胞は、対照群として含まれる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPsを220μg/mL(a,b)および110μg/ml(c,d)で培養した後のA549細胞の光学顕微鏡画像、または24時間(上パネル)および48h(パネル)でナノ粒子を加えずに培養する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:PBS中のAS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPsから72時間のDOXの放出プロファイル。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
1HNMRスペクトル(図2)は、CT-PEG共重合体とPEI-g-PEG共重合体の合成に成功したことを確認した。PEGとPEIの分子量はそれぞれ1,000と1,200であった。さらに、EDC/NHS触媒系を用い、アミド反応を介してPEI-g-PEG共重合体を合成した。なお、PEGとPEIの分子量がPEI-g-PEG共重合体を合成するために変化した場合、反応時間と触媒系を再評価する必要がある。また、AUNPs上のPEI-g-PEG共重合体コーティングの反応条件は、主にPEG-g-PEI共重合体の分子重量および構造がAuNPsのコーティング効率および直径に影響を及ぼす可能性があるため、さらに調整する必要があります。その後、共重合体機能化されたAuNPsの形態も同様に変化させることができる。PEIポリマーからのアミノ基の数は、最終的なPEI-g-PEG共重合体合成の構造に影響を与えることができ、PEIとCT-PEGの架橋作用は必然的に起こる。したがって、ステップ 2.4 は慎重に実行する必要があり、PEI ソリューションはゆっくりとドロップバイ ドロップを追加する必要があります。合成反応後、透析(ステップ2.5および2.6)は、架橋コポリマーおよび未反応ポリマーを除去するために操作する必要があります。
さらに、DOXおよびAS1411は、アミド反応を介してPEI-g-PEG@AuNPs上で順次機能化され、EDC/NHS触媒システムが使用されます。各反応に3日を要します(ステップ4.3とステップ5.3)。しかし、反応時間が3日未満で済む場合には、機能化効率が低下します。3日以上必要としたときも同様の結果が得られた。なお、化学的EDC、NHS、および未接続のDOXまたはAS1411は透析処理を通して除去することができる(ステップ4.4およびステップ5.4)。UV-visスペクトルとXPSは、ナノ粒子上のコポリマーの正常な機能化を調べる有効な方法であり、一貫した結果が得られている(図3および図4)。
AuNPs、DOX、AS1411の特徴的なUV-visバンドとは異なり、PEI-g-PEG@AuNPs、DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPs、AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPsのユニークなピークは、各ピークの重複のために観察するのが難しいです。さらに、DOX-g-PEI-g-g-PEG@AuNPsを製造する別の方法を実行しました(DOX-g-PEI-g-PEGを最初に合成し、AuNPsでの機能化の成果)。しかし、このようなアプローチを用いた金ナノ粒子は、DOXのローディング効率35,36につながっている。従って、本研究におけるDOX-g-PEI-g-PEG@AuNPsの合成方法は、さらなる放出プロファイルと同様に十分なDOX負荷効率を確保することを留意すべきである。実験で金ナノ粒子のDOX負荷効率を考慮しない場合、AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPsを得る方法は他にもあります。これらには、まずアミド反応を介したDOX-g-PEI-g-g-g-PEI-g-PEGの合成、次に金ナノ粒子の機能化が含まれます。これにより、ここで用いる方法は、得られたコポリマーと同様に、組織工学などの多様な医療用途に適用することができる。
調製ナノ粒子のサイズ分布と形態は、DLSおよびTEMによって調べることができます。DLSデータ(図5)は、水和直径のナノ粒子が異なるコーティングによって異なり、各サンプルに複数のピークが現れることを示しています。PEI-g-PEGの構造(図1)に関しては、DLSの正規分布曲線は観測されていない。なお、ナノ粒子は、DLS試験中に超純水に分散され、異なる体積比が使用され、ナノ粒子表面上のコポリマー間の相互作用により、マルチピークが存在する。このように、TEM画像はナノ粒子の形態を確認するために使用される。図 6に、PEI-g-PEG@AuNPs、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs、およびAS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPsのTEM画像を示す。
金ナノ粒子の表面の異なる成分に基づいて、ナノ粒子間の距離が変化する。また、調製したナノ粒子は、ゼータ電位試験(時間試験後の異なるナノ粒子に対して-29〜50mV)に従って安定している。DOXおよびAS1411(プロトコルのセクション4および5)のさらなる機能化は、金ナノ粒子の直径に影響を与えない。UV-visは、全ての試験方法を用いずに、ナノ粒子にロードされたDOXおよびAS1411を確認する有効な方法であると結論することができる。
癌細胞の標的化された特性を、異なる濃度の調製されたAS1411およびDOX負荷AuNPsで培養し、ナノ粒子を対照群として添加することなく培養したA549細胞を用いて調べた。同時に、A549細胞生存率に対する遊離DOXの効果もテストされた(図7 および 図8)。ナノ粒子を添加しない基と比較して、調製されたAS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPsはA549細胞の減少をもたらす。しかし、ナノ粒子の濃度が低下する一方で(100μg/mL)、細胞は遊離DOX群と比較して24時間でより良い活性を示す。これは主にPEI-g-PEG共重合体が優れた細胞相溶性37 を有し、分岐したPEIポリマーの非特異的毒性が改善されるためである。
最後に、アプタマーAS1411の標的特性のために、得られたナノ粒子は、健康な細胞の代わりに癌細胞に蓄積される。アプタマーが認識されると、DOXは癌細胞を殺すために放出される。PBS中のAS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPsからのDOXの放出プロファイルを記録した(図9)。このプロトコルは、多段階アミド反応を介して共重合体改変されたAuNPs上で移植されたアプタマーおよびDOXを調製するためのアプローチを示す。合成されたナノ粒子は、がん治療の応用の可能性を秘めています。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、中国の国立自然科学財団(31700840)によって資金提供されました。河南省の主要な科学研究プロジェクト(18B430013、18A150049)。この研究は、XYNUの若い学者のための南湖学者プログラムによって支えられた。著者たちは、XYNUのライフサイエンス大学の学士学生ゼボ・クに、彼の役に立つ作品に感謝したいと思います。著者らは、XYNUの分析・試験センターが機器の使用を認めることを望んでいる。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Dimethylaminopyridine | Macklin | D807273 | |
| A549 cell | ATCC CCL-185TM | ||
| AS1411 | BBI Life Sciences Corporation | 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411) | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Sigma Aldrich | 96992-500TESTS-F | |
| Dichloromethane | Traditional Chinese medicine | 80047318 | |
| Diethyl ether (Et2O) | SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd | ||
| Dimethyl sulfoxide | Macklin | D806645 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Sigma Aldrich | ||
| Doxorubicin hydrochloride | Rhawn | R017518 | |
| Ether absolute | Traditional Chinese medicine | 80059618 | |
| Field Emission Transmission Electron Microscope | FEI Company | Tecnai G2 F 20 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Rhawn | R016035 | |
| Laser Particle-size Instrument | Malvern Instruments Ltd | ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride | Macklin | N808856 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Macklin | H6231 | |
| NMR software | Delta 5.2.1 | ||
| Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer | JEOL | JNM-ECZ600R/S3 | |
| Origin 8.5 | OriginLab | ||
| Penicillin | Sigma Aldrich | V900929-100ML | |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | 81188 | BioUltra, average Mn ~ 1000 |
| Poly (ethyleneimine) solution | Sigma Aldrich | 482595 | average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O |
| Sodium borohydride, powder | Acros | C18930 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | 85886-10ML | |
| Succinic anhydride | Traditional Chinese medicine | 30171826 | |
| Tetrahydrofuran | Traditional Chinese medicine | 40058161 | |
| Triethylamine | Traditional Chinese medicine | 80134318 | |
| UV/VIS/NIR Spectrometer | Lambda950 | Lambda950 | |
| X-ray Photoelectron Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | K-ALPHA 0.5EV |
References
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