Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Syntese av Aptamer-PEI-g-PEG Modifisert Gull Nanopartikler Lastet med Doxorubicin for målrettet legemiddellevering

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61139
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 3, 3, 3
1College of Life Sciences, Xinyang Normal University, 2Department of Imaging & Pathology, University of Leuven and Oral & Maxillofacial Surgery, University Hospitals Leuven, 3Analysis & Testing Center, Xinyang Normal University

Summary

I denne protokollen syntetiseres doksorubicinbelastede AS1411-g-PEI-g-PEG-modifiserte gull nanopartikler via tre-trinns midt i reaksjoner. Deretter lastes doksorubicin og leveres for å målrette kreftceller for kreftbehandling.

Abstract

På grunn av legemiddelresistens og toksisitet i friske celler har bruk av doksorubicin (DOX) vært begrenset i klinisk kreftbehandling. Denne protokollen beskriver utformingen av poly(etylenimine) podet med polyetylenglykol (PEI-g-PEG) kopolymerfunksjonaliserte gull nanopartikler (AuNPer) med lastet aptamer (AS1411) og DOX gjennom midtreaksjoner. AS1411 er spesielt knyttet til målrettede nukleolinreseptorer på kreftceller, slik at DOX retter seg mot kreftceller i stedet for friske celler. Først blir PEG karboksylert, deretter podet til forgrenet PEI for å få en PEI-g-PEG-kopulering, som bekreftes av 1H NMR-analyse. Deretter syntetiseres PEI-g-PEG copolymer-belagte nanopartikler av gull (PEI-g-PEG@AuNPs), og DOX og AS1411 knyttes gradvis til AuNPer via midtreaksjoner. Diameteren på den tilberedte AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs er ~ 39,9 nm, med et zetapotensial på -29,3 mV, noe som indikerer at nanopartiklene er stabile i vann og cellemedium. Cellecytoksisitetsanalyser viser at de nydesignede DOX-lastede AuNP-ene er i stand til å drepe kreftceller (A549). Denne syntesen demonstrerer det delikate arrangementet av PEI-g-PEG-kopolymerer, aptamers og DOX på AuNPer som oppnås ved sekvensielle midtreaksjoner. Slike aptamer-PEI-g-PEG-funksjonaliserte AuNPer gir en lovende plattform for målrettet legemiddellevering i kreftbehandling.

Introduction

Å være det største folkehelseproblemet over hele verden, er kreft allment karakterisert som å ha en lav kurrate, høy tilbakefallsrate og høydødelighet 1,2. Nåværende konvensjonelle anti-kreft metoder inkluderer kirurgi, kjemoterapi ogstrålebehandling 3, blant annet kjemoterapi er den primære behandlingen for kreftpasienter i klinikken4. Kliniske brukte anticancer medisiner inkluderer hovedsakelig paclitaxel (PTX)5 og doxorubicin (DOX)6,7. DOX, et antineoplastisk legemiddel, har blitt bredt brukt i klinisk kjemoterapi, på grunn av fordelene med kreft cytotoksisitet og hemming av kreftcelleproliferasjon8,9. DOX forårsaker imidlertid kardiotoksisitet10,11, og den korte halveringstiden til DOX begrenser anvendelsen i klinikken12. Derfor er nedbrytbare legemiddelbærere nødvendig for å laste DOX og subtilt frigjøre på en kontrollert måte til et målrettet område.

Nanopartikler har blitt mye brukt i målrettede legemiddelleveringssystemer og har flere fordeler ved kreftbehandling (dvs. stort overflate-til-volum-forhold, liten størrelse, evne til å innkapsle ulike stoffer og justerbar overflatekjemi, etc.) 13,14,15. Spesielt har gull nanopartikler (AuNPer) blitt mye brukt i biologiske og biomedisinske applikasjoner, for eksempel fototermisk kreftbehandling16,17. De unike egenskapene til AuNPer, som facile syntese og generell overflatefunksjonalisering, har gode utsikter innen det kliniske feltet kreftbehandling18. Også AuNPer har blitt brukt til å identifisere narkotika levering strategier, diagnostisere svulster, og overvinne motstand i mange studier19,20.

Til tross for dette må AuNPer skreddersys ytterligere for å overvinne legemiddelresistens via høy lokal frigjøring ved tumorlesjoner gjennom forbedret permeasjon og oppbevaring (EPR), for eksempel målretting og tilgjengelighetsegenskaper. Polymerfunksjonaliserte AuNPer har vist unike fordeler, for eksempel forbedret vannløselighet av hydrofobe anticancer medisiner og langvarigsirkulasjonstid 21,22. Ulike biokompatible polymerer har blitt brukt til AuNP-belegg, for eksempel polyetylenglykol (PEG), polyetylenimin (PEI), hyaluronsyre, heparin og xanthan tyggegummi. Da er stabiliteten, så vel som nyttelasten, av AuNPer forbedret godt23. Spesielt er PEI en svært forgrenet polymer som består av mange repeterende enheter av primære, sekundære og tertiære aminer24. PEI har utmerket løselighet, lav viskositet og en høy grad av funksjonalitet, som er egnet for belegg på AuNPer.

På den annen side må antikreftmedisiner leveres til kreftceller direkte med forbedret lasteeffektivitet, og med lavere toksisitet for behandling av primære og avanserte metastatiske svulster25. Målrettede ligander har et stort potensial for anti-kreft narkotika målrettet levering systemer26. Dens selektivitet for målmolekylbinding gir anti-kreftmedisin rettet mot spesifisitet og øker legemiddelberikelse i syke vev27. Flere ligander inkluderer antistoffer, polypeptider og små molekyler. Sammenlignet med andre ligander, kan nukleinsyreaptamerer syntetiseres in vitro og er enkle å modifisere. AS1411 er en umodifisert 26 bp fosfodiester oligonukleotid som danner en stabil dimerisk G-tetramerstruktur for å spesifikt binde seg til en overekspressert mål kjernefysisk proteinreseptor på kreftceller28,29,30. AS1411 hemmer spredningen av mange kreftceller, men påvirker ikke veksten av sunne celler31,32. Som et resultat har AS1411 blitt brukt til å fremstille et ideelt målrettet legemiddelleveringssystem.

I denne studien syntetiseres en PEI-g-PEG-kopolymer via en midtreaksjon, deretter er PEI-g-PEG copolymerbelagte gull nanopartikler (PEI-g-PEG@AuNPs) fremstilt. I tillegg er DOX og AS1411 sekvensielt knyttet til de forberedte PEI-g-PEG@AuNPs, som vist i figur 1. Denne detaljerte protokollen er ment å hjelpe forskere med å unngå mange av de vanlige fallgruvene forbundet med fabrikasjon av nye PEI-g-PEG@AuNPs lastet med DOX og AS1411.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

FORSIKTIG: Sørg for å konsultere alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før du bruker alle kjemikalier. Flere av kjemikaliene som brukes til å forberede kopolymer og nanopartikler er akutt giftige. Nanopartikler har også potensielle farer. Sørg for å bruke alle passende sikkerhetsrutiner og personlig verneutstyr, inkludert hansker, labfrakk, hetter, bukser i full lengde og sko i nærheten.

1. Syntese av dobbelkarboksylpolyetylenglykol (CT-PEG)33

  1. Tilsett 1,46 g (14,6 mmol) kortfattet anhydrid (SA) og 209 mg (1,71 mmol) 4-dimetylaminopyridin (DMAP) til en 100 ml rund bunnflaske.
  2. Tilsett 15 ml vannfri tetrahydrofuran (THF) i kolben som brukes i trinn 1.1 og monter en glasspropp. Oppbevar kolben ved 0 °C i 30 minutter.
  3. Tilsett 4,28 g polyetylenglykol (PEG) og 1,8 ml trietylamin (TEA) i en ny kolbe.
  4. Tilsett 15 ml vannfri THF i kolben som brukes i trinn 1.3 og monter en glasspropp. Overfør oppløsningen sakte til kolben som brukes i trinn 1.2, ved hjelp av en sprøyte under nitrogenatmosfære.
  5. Rør oppløsningen ved 0 °C i 2 timer, og fortsett deretter reaksjonen ved romtemperatur (RT) over natten.
  6. Bruk en roterende fordamper (40 °C, 0,1 MPa), konsentrer reaksjonsløsningen og fjern THF-løsningsmidlet.
  7. Ved RT oppløses reaksjonsløsningen fra trinn 1,6 i 15 ml 1,325 g/ml dichlorometan (DCM), og tilsett deretter 15 ml kaldt kosthylleter (Et2O) for å oppnå nedbørsproduktet (polyetylenglykoldiacid). Fjern oppløsningsvæsken via filterpapir.
    MERK: Nedbørstrinnet kan gjentas 3x.
  8. Tørk utfellingene under vakuum ved RT i 48 timer.

2. Syntese av PEI-g-PEG copolymer

  1. Tilsett 305,47 mg CT-PEG fra trinn 1,8 og 5 ml dimetylsulfoksid (DMSO) i en kolbe og rør ved RT for å sikre at CT-PEG er fullstendig oppløst i DMSO.
  2. Løs opp 49,46 mg 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidhydroklorid (EDC) i 5 ml DMSO, tilsett deretter løsningen i kolben som brukes i trinn 2.1 og rør i 30 min ved RT.
  3. Løs opp 29,69 mg N-hydroksysuccinimid (NHS) i 5 ml DMSO og tilsett oppløsningen i kolben som brukes i trinn 2.1. Fortsett å røre ved RT i 3 timer.
  4. Løs opp 28,6 μL polyetylenimin (PEI) i 10 ml DMSO og tilsett oppløsningen dråpevis i kolben som brukes i trinn 2.1. Rør i 3 dager, i det minste.
  5. Overfør den reagerte løsningen fra trinn 2.4 til en dialysepose (1000 molekylvektkutt [MWCO]). Legg dialyseposen i et 1 L beger med 500 ml ultrarent vann som dialysat. Bytt det ultrarenne vannet hver 12.
  6. Overfør løsningen i trinn 2.5 til en annen dialysepose (10.000 MWCO). Legg dialyseposen i et 1 L beger med 500 ml ultrarent vann som dialysat. Bytt det ultrarenne vannet hver 12.
  7. Konsentrer oppløsningen fra trinn 2.6 ved hjelp av en roterende fordamper (40 °C, 0,1 MPa) og tørk prøven for å få PEI-g-PEG-pulveret.

3. Syntese av PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Løs opp 5 mg tilberedt PEI-g-PEG (trinn 2.7) i 5 ml ultrapure vann i en ny kolbe og passer med en glasspropp.
  2. Tilsett 100 ml 0,3 mM HAuCl4-oppløsning i kolben og rør oppløsningen i 3 timer ved RT.
    MERK: Fargen på oppløsningen skal endres umiddelbart fra gul til oransje.
  3. Tilsett 1 ml 1 mg/ml NaBH4-oppløsning i kolben og rør oppløsningen i 3 timer ved RT.
    MERK: Reaksjonsløsningen skal umiddelbart bli burgunder.
  4. Dialyze reaksjonsproduktet ved hjelp av en dialysepose (1000 MWCO) i 3 dager som beskrevet i trinn 2.5 for å få PEI-g-PEG@AuNPs-løsningen.

4. Syntese av DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Tilsett 1 ml 2,2 mg/ml DOX-oppløsning og 20 ml PEI-g-PEG@AuNPs oppløsning i en ny kolbe og monter med en glasspropp.
  2. Løs opp 0,727 mg EDC i 1 ml ultrarent vann og tilsett EDC-oppløsningen i kolben som brukes i trinn 4.1.
  3. Løs opp 0,437 mg NHS i 1 ml ultrarent vann. Tilsett NHS-løsningen i kolben og rør ved RT i 1 time.
  4. Dialyze reaksjonsproduktet ved hjelp av en dialysepose (1000 MWCO) i 3 dager som beskrevet i trinn 2.5 for å få DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs løsningen.

5. Syntese av AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs

  1. Tilsett 20 ml DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs oppløsning og 4OD AS1411 (OD = optisk tetthet; 1OD ≈ 33 μg) i en ny kolbe.
  2. Løs opp 28,76 mg EDC i 1 ml ultrarent vann og tilsett EDC-oppløsningen i kolben som brukes i trinn 5.1.
  3. Løs opp 17,27 mg NHS i 1 ml ultrarent vann. Tilsett NHS-løsningen i kolben som brukes i trinn 5.1 og rør reaksjonen i 1 time ved RT.
  4. Dialyze reaksjonsproduktet ved hjelp av en dialysepose (1000 MWCO) i 3 dager som beskrevet i trinn 2.5 for å få AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.

6. Eksempel karakterisering

  1. Løs opp CT-PEG-polymeren (trinn 1.8) og PEI-g-PEG-kopolymeren (trinn 2.7) i henholdsvis kloroform-d i kjernemagnetisk resonansrør (NMR). Analyser prøvene ved hjelp av et 600 MHz NMR-spektrometer utstyrt med en 14,09 T superledende magnet og 5,0 mm 600 MHz bredbånd Z-gradient høyoppløselig sonde for å bekrefte den kjemiske strukturen34.
  2. Spre AuNPer, DOX og AS1411, og klargjort PEI-g-PEG@AuNPs (trinn 3.4), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (trinn 4.4) og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (trinn 5.4), henholdsvis i ultrapure vann. Deretter overfører du til cuvettes og registrerer ultrafiolett-synlig (UV-vis) spektra ved hjelp av et UV-vis spektrofotometer.
  3. Fest et dobbeltsidig lim (~2 mm x 2 mm) til aluminiumsfolien, og dypp prøveløsningen (PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs) på hele båndet jevnt. Analyser prøvene ved hjelp av en røntgen fotoelektron spektroskopianalysator.
  4. Disperger PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs løsninger, henholdsvis i ultrarent vann. Deretter overfører du til cuvettes og evaluerer størrelsesfordelingen ved hjelp av dynamisk lysspredning.
  5. Spre PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs løsninger i ultrarent vann (en dråpe prøve per 5 ml ultrarent vann for hver prøve). Soniker i 2 timer. Dypp kobbergitteret i prøveløsninger og tørk under en infrarød lampe. Karakteriser morfologien ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop.
  6. Injiser 1 mg AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs i en 20 kDa MWCO dialysekassett, og plasser deretter i 80 ml fosfatbufret saltvann (PBS) med 5% bovint serumalbumin (BSA). Rør ved 37 °C.
  7. På de forhåndsbestemte tidspunktene samler du 100 μL aliquots og erstatter med fersk PBS. Bruk uv-vis spektrofotometer for å måle DOX fluorescensintensiteten til aliquots.

7. CCK-8 analyse av AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs nanopartikler

  1. Vokse A549 celler i Dulbecco modifisert Eagle medium (DMEM) supplert med 10% foster bovint serum, 100 U / ml penicillin, og 100 μg / ml streptomycin under en fuktet atmosfære på 95% luft og 5% CO2 ved 37 °C. Bytt ut kulturmediet annenhver dag. Bruk celler ved passasje 5 for celleproliferasjon og cytotoksisitetsanalyser for kvantitativt å evaluere cytotoksisiteten til preparerte AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs nanopartikler.
  2. Tilsett 100 μL nanopartikkelløsning i hver brønn som inneholder 1 ml cellemedium. Etter å ha dyrket i 24 timer og 48 timer, fjern kulturmediene fra cellekulturplater, legg deretter til 300 μL ferske kulturmedier og 30 μL celletellingssett-8 (CCK-8) settløsninger umiddelbart til hver brønn. Inkuber i 4 timer i en CO 2-inkubator ved 37 °C.
  3. Overfør 200 μL reaksjonsløsninger fra trinn 7.2 til en 96 brønnplate. Les den optiske tettheten (OD) for hver brønn ved 570 nm med en mikroplateleser.
  4. Vær oppmerksom på morfologien til celler ved 24 timer og 48 timer under et mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1 H NMR-spektroskopi ble brukt til å bekrefte vellykket syntese av CT-PEG-polymer og PEI-g-PEG-kopolymerer (figur 2). Figur 2a viser at metylenprotonsignalet ved δ = 3,61 ppm og karboksylprotonsignal ved δ = 2,57 ppm bekrefter vellykket syntese av CT-PEG polymerer. Figur 2b viser at metylenprotonsignalet til PEG ved δ = 2,6 ppm og protonsignal for PEI ved δ = 1,66 ppm bekrefter syntesen av PEI-g-PEG-kokopolymerer.

UV-vis spektroskopi ble utført for å bestemme vellykket funksjonalisering av forberedt kopulering på AuNPer (Figur 3). I UV-vis spektra tilsvarer tilstedeværelsen av båndene på ~ 523 nm, 507 nm og 260 nm henholdsvis overflateplasmonresonans (SPR) topper av AuNPs, DOX og AS1411 (Figur 3a). Båndene på ~ 360 nm i UV-vis spektrum av PEI-g-PEG@AuNPs, ~532 nm i UV-vis spektrum av DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, og ~546 nm i UV-vis-spekteret av AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs bekrefte vellykket syntese av PEI-g-PEG copolymers festet til AuNPs. De bekrefter også at DOX og AS1411 ble lastet på funksjonaliserte AuNPer gradvis (Figur 3b).

Røntgenfotoelektronspektroskopi (XPS) ble brukt til å undersøke den kjemiske bindingen av kopuler på AuNPer (figur 4). XPS-spekteret av PEI-g-PEG@AuNPs viste C1-, O1-, N1- og Au4f-topper indikerte forbindelsen mellom AuNPer og PEI-g-PEG copolymer (Figur 4a). Det var en liten endring i XPS-spekteret av DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, da DOX ble ytterligere podet på PEI-g-PEG@AuNPs (Figur 4b). Videre skyldtes utseendet på P2p-toppen for AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs hovedsakelig på grunn av vellykket graft av AS1411 på DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (Figur 4c). Størrelsesfordelingen av forberedte nanopartikler ble analysert ved hjelp av DLS (figur 5). Sammenlignet med PEI-g-PEG@AuNPs økte den gjennomsnittlige hydreringsdiameteren litt i DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og økte ytterligere når AS1411 ble podet på.

TEM ble brukt til å bestemme morfologien til nanopartiklene, og bildene viste at alle nanopartikler var ensartede uten aggregering (figur 6). På grunn av samspillet mellom kopulatorer på overflaten av AuNPer, økte avstanden til AuNPer gradvis. En celle levedyktighetstest ble brukt til å bestemme målegenskapen til det klargjorte DOX-leveringssystemet (figur 7 og figur 8). CCK-8-resultater (figur 7) viste at 1) A549-celletallet gikk ned etter dyrking med AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs over tid og 2) cellenummeret gikk ned med økt konsentrasjon av nanopartikler. Sammenlignet med den frie DOX-gruppen økte cellenummeret, noe som indikerer at toksisiteten ble redusert.

Sammen med optiske mikroskopibilder (figur 8) viser resultatene at celletallet ble redusert etter dyrking med AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (Figur 8a−d) sammenlignet med kontrollgruppen uten å legge til nanopartikler (Figur 8e,f). Videre ble DOX-utgivelsesprofilen fra forberedt AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs i PBS undersøkt (figur 9). Resultatene viser at vedvarende frigjøring av DOX fra funksjonaliserte nanopartikler forårsaket nedgangen i A549-celler, og den kumulative DOX-utgivelsen var omtrent 63,5% ± 3,2% ved 72 timer.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av syntese av PEI-g-PEG@AuNP, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: 1 H NMR-spektraav (a) syntetisert CT-PEG-polymer og (b) PEI-g-PEG-kopolymer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: UV-vis spektra av (a) AuNPer, DOX og AS1411, og (b) PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: XPS-spektra av (a) PEI-g-PEG@AuNPs, (b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Størrelsesfordeling av PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
d.nm = gjennomsnittlig diameter på nanopartikkelen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: TEM-bilder av (a) PEI-g-PEG@AuNPs, (b) DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og (c) AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.
Skalastenger = 50 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Optiske tetthetsverdier ved 570 nm (OD570) A549-celler etter dyrking med AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (220 μg/ml og 110 μg/ml) i henholdsvis 24 timer og 48 timer.
Celler med fri DOX og celler uten å legge til nanopartikler er inkludert som kontrollgrupper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Optiske mikroskopiske bilder av A549-celler etter dyrking med AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs ved 220 μg/ml (a b) og 110 μg/ml (c,d) eller culturing uten å tilsette nanopartikler som kontrollgruppe (e,f) ved 24 timer (topppaneler) og 48 timer (bunnpaneler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Utgivelsesprofil for DOX fra AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs i PBS i 72 timer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1H NMR-spekteret (figur 2) bekrefter den vellykkede syntesen av CT-PEG-kopulering og PEI-g-PEG-kokopolymer. Molekylvektene til PEG og PEI var henholdsvis 1000 og 1200. I tillegg ble det EDC/NHS katalytiske systemet brukt til å syntetisere PEI-g-PEG-kopulering via midtreaksjoner. Det skal bemerkes at hvis molekylvektene til PEG og PEI endret seg for å syntetisere PEI-g-PEG-kopulering, må reaksjonstiden og katalytisk system revurderes. Også reaksjonsbetingelsen for PEI-g-PEG-kopulerbelegg på AuNPer må justeres ytterligere, hovedsakelig fordi molekylvekten og strukturen til PEG-g-PEI-kopuler kan påvirke beleggeffektiviteten og diameteren til AuNPer. Etterpå kan morfologien til kopuleringsfunksjonaliserte AuNPer også endres. Antall aminogrupper fra PEI-polymer kan påvirke strukturen til endelig PEI-g-PEG-kopolymersyntese, og krysskoblingsvirkningen mellom PEI og CT-PEG vil uunngåelig forekomme. Dermed må trinn 2.4 utføres nøye, og PEI-løsningen må sakte legges til dråpe for dråpe. Etter syntesereaksjonen må dialyse (trinn 2.5 og 2.6) betjenes for å fjerne krysskoblet kopolymer og ikke-vedtatte polymerer.

Videre er DOX og AS1411 sekvensielt funksjonalisert på PEI-g-PEG@AuNPs via midtreaksjoner, og det katalytiske EDC/NHS-systemet brukes. Det krever 3 dager for hver reaksjon (trinn 4.3 og trinn 5.3) her; Men hvis reaksjonstiden krever mindre enn 3 dager, vil funksjonaliseringseffektiviteten reduseres. Ved behov for mer enn 3 dager er det samme resultatet oppnådd. Det skal bemerkes at kjemisk EDC, NHS og ikke-tilkoblet DOX eller AS1411 kan fjernes gjennom dialysebehandling (trinn 4.4 og trinn 5.4). UV-vis spektra og XPS er effektive metoder for å undersøke vellykket funksjonalisering av kopolymer på nanopartikler, og konsistente resultater er oppnådd (Figur 3 og Figur 4).

Forskjellig fra de karakteristiske UV-vis-båndene til AuNPs, DOX og AS1411, er unike topper av PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs utfordrende å observere, på grunn av overlapping av hver topp. Videre har vi utført en annen metode for å fremstille DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (syntetisere DOX-g-PEI-g-PEG først, og oppnå funksjonalitet på AuNPer); Imidlertid har gull nanopartikler ved hjelp av en slik tilnærming ført til lav DOX-lasteeffektivitet35,36. Dermed bør det bemerkes at metoden for syntese av DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs i dette arbeidet vil sikre tilstrekkelig DOX-lasteeffektivitet samt ytterligere utgivelsesprofil. Hvis et eksperiment ikke tar hensyn til DOX-lasteeffektivitet for gull nanopartikler, er det andre metoder for å oppnå AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs. Disse inkluderer syntese av DOX-g-PEI-g-PEG eller AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG via en midtreaksjon først, deretter funksjonalisering på gull nanopartikler. Dermed kan metoden som brukes her, så vel som de oppnådde kopulerene, brukes på forskjellige medisinske applikasjoner, for eksempel vevsteknikk.

Størrelsesfordelingen og morfologien til forberedte nanopartikler kan undersøkes av DLS og TEM. DLS-data (figur 5) viser at nanopartiklene med hydreringsdiameter varierer fra forskjellige belegg, og mer enn én topp vises for hver prøve. Når det gjelder strukturen til PEI-g-PEG (figur 1), observeres ikke normalfordelingskurve for DLS. Det skal bemerkes at nanopartiklene spres i ultrarent vann under DLS-testen, forskjellige volumforhold brukes, og det finnes fortsatt flere topper på grunn av interaksjoner mellom kopolymerer på overflaten av nanopartikler. Dermed brukes TEM-bilder til å bekrefte morfologien til nanopartikler. TEM-bilder av PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs og AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs er vist i figur 6.

Basert på forskjellige komponenter i overflatene av gull nanopartikler, endres avstandene mellom nanopartikler. Dessuten er de forberedte nanopartiklene spredt i vann stabile i henhold til zeta potensielle tester (-29 til 50 mV for forskjellige nanopartikler etter tidstester). Videre funksjonalisering av DOX og AS1411 (paragraf 4 og 5 i protokollen) påvirker ikke diameteren på gull nanopartikler. Det kan konkluderes med at UV-vis er en effektiv metode for å bekrefte DOX og AS1411 lastet på nanopartikler uten å bruke alle testmetoder.

Den målrettede egenskapen på kreftceller ble undersøkt ved hjelp av A549-celler dyrket med forskjellige konsentrasjoner av tilberedte AS1411 og DOX lastet AuNPs og uten å legge til nanopartikler som kontrollgruppe. Samtidig ble effekten av fri DOX på A549 celle levedyktighet også testet (Figur 7 og Figur 8). Sammenlignet med gruppen uten å legge til nanopartikler, fører den forberedte AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs til en nedgang i A549-celler. Men mens konsentrasjonen av nanopartikler reduseres (100 μg/ml), viser cellene bedre aktivitet ved 24 timer sammenlignet med den frie DOX-gruppen. Dette skyldes hovedsakelig at PEI-g-PEG-kopolymeren har utmerket cytokompatibilitet37 og den ikke-spesifikke toksisiteten til forgrenet PEI-polymer er ameliorated.

Til slutt, på grunn av den målrettede egenskapen til aptamer AS1411, akkumuleres de oppnådde nanopartiklene i kreftceller i stedet for sunne celler. Når aptameren er gjenkjent, frigjøres DOX for å drepe kreftcellene. Utgivelsesprofilen til DOX fra AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs i PBS ble registrert (figur 9). Denne protokollen demonstrerer en tilnærming for å forberede aptamers og DOX podet på copolymer modifiserte AuNPs via et multi-trinns midt i reaksjonen. De syntetiserte nanopartiklene har potensial for kreftbehandlingsapplikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (31700840); Det sentrale vitenskapelige forskningsprosjektet i Henan-provinsen (18B430013, 18A150049). Denne forskningen ble støttet av Nanhu Scholars Program for Young Scholars of XYNU. Forfatterne vil takke bachelorstudenten Zebo Qu fra College of Life Sciences i XYNU for hans nyttige verk. Forfatterne ønsker å anerkjenne Analyse - testsenteret til XYNU for bruk av utstyret deres.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Dimethylaminopyridine Macklin D807273
A549 cell ATCC CCL-185TM
AS1411 BBI Life Sciences Corporation 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411)
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Cell counting kit-8 (CCK-8) Sigma Aldrich 96992-500TESTS-F
Dichloromethane Traditional Chinese medicine 80047318
Diethyl ether (Et2O) SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Dimethyl sulfoxide Macklin D806645
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Sigma Aldrich
Doxorubicin hydrochloride Rhawn R017518
Ether absolute Traditional Chinese medicine 80059618
Field Emission Transmission Electron Microscope FEI Company Tecnai G2 F 20
Gold(III) chloride trihydrate Rhawn R016035
Laser Particle-size Instrument Malvern Instruments Ltd ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Macklin N808856
N-Hydroxysuccinimide Macklin H6231
NMR software Delta 5.2.1
Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer JEOL JNM-ECZ600R/S3
Origin 8.5 OriginLab
Penicillin Sigma Aldrich V900929-100ML
Phosphate-buffered saline Sigma Aldrich P4417-100TAB
Poly(ethylene glycol) Sigma Aldrich 81188 BioUltra, average Mn ~ 1000
Poly (ethyleneimine) solution Sigma Aldrich 482595 average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O
Sodium borohydride, powder Acros C18930
Streptomycin Sigma Aldrich 85886-10ML
Succinic anhydride Traditional Chinese medicine 30171826
Tetrahydrofuran Traditional Chinese medicine 40058161
Triethylamine Traditional Chinese medicine 80134318
UV/VIS/NIR Spectrometer Lambda950 Lambda950
X-ray Photoelectron Spectrometer Thermo Fisher Scientific K-ALPHA 0.5EV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abad, J. M., Bravo, I., Pariente, F., Lorenzo, E. Multi-tasking base ligand: a new concept of AuNPs synthesis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (9), 2329-2338 (2016).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
  3. Jang, B., Kwon, H., Katila, P., Lee, S. J., Lee, H. Dual delivery of biological therapeutics for multimodal and synergistic cancer therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 98, 113-133 (2016).
  4. Gansler, T., et al. Sixty years of CA: a cancer journal for clinicians. CA-A Cancer Journal for Clinicians. 60 (6), 345-350 (2010).
  5. Li, J., et al. Molecular Mechanism for Selective Cytotoxicity towards Cancer Cells of Diselenide-Containing Paclitaxel Nanoparticles. International Journal of Biological Sciences. 15 (8), 1755-1770 (2019).
  6. Zhao, D., et al. Precise ratiometric loading of PTX and DOX based on redox-sensitive mixed micelles for cancer therapy. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 155, 51-60 (2017).
  7. Blum, R. H., Carter, S. K. Adriamycin. A new anticancer drug with significant clinical activity. Annals of Internal Medicine. 80 (2), 249-259 (1974).
  8. de Lima, R. D. N., et al. Low-level laser therapy alleviates the deleterious effect of doxorubicin on rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Photochemistry Photobiology B. 196, 111512 (2019).
  9. Markowska, A., Kaysiewicz, J., Markowska, J., Huczynski, A. Doxycycline, salinomycin, monensin and ivermectin repositioned as cancer drugs. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 29 (13), 1549-1554 (2019).
  10. Songbo, M., et al. Oxidative stress injury in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Toxicology Letters. 307, 41-48 (2019).
  11. Ewer, M. S., Ewer, S. M. Cardiotoxicity of anticancer treatments. Nature Reviews Cardiology. 12 (9), 547-558 (2015).
  12. Gabizon, A., Shmeeda, H., Barenholz, Y. Pharmacokinetics of pegylated liposomal Doxorubicin: review of animal and human studies. Clinical Pharmacokinetics. 42 (5), 419-436 (2003).
  13. Xu, X., Ho, W., Zhang, X., Bertrand, N., Farokhzad, O. Cancer nanomedicine: from targeted delivery to combination therapy. Trends in Molecular Medicine. 21 (4), 223-232 (2015).
  14. Feng, S., Nie, L., Zou, P., Suo, J. Effects of drug and polymer molecular weight on drug release from PLGA-mPEG microspheres. Journal of Applied Polymer Science. 132 (6), 41431 (2015).
  15. Chen, D., et al. Injectable Temperature-sensitive Hydrogel with VEGF Loaded Microspheres for Vascularization and Bone Regeneration of Femoral Head Necrosis. Materials Letters. 229, 138-141 (2018).
  16. Abadeer, N. S., Murphy, C. J. Recent Progress in Cancer Thermal Therapy Using Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 120 (9), 4691-4716 (2016).
  17. Riley, R. S., Day, E. S. Gold nanoparticle-mediated photothermal therapy: applications and opportunities for multimodal cancer treatment. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (4), 1449 (2017).
  18. Fratoddi, I., et al. Highly Hydrophilic Gold Nanoparticles as Carrier for Anticancer Copper(I) Complexes: Loading and Release Studies for Biomedical Applications. Nanomaterials (Basel). 9 (5), 772 (2019).
  19. Lee, S. M., et al. Drug-loaded gold plasmonic nanoparticles for treatment of multidrug resistance in cancer. Biomaterials. 35 (7), 2272-2282 (2014).
  20. Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2740-2779 (2012).
  21. Wei, T., et al. Anticancer drug nanomicelles formed by self-assembling amphiphilic dendrimer to combat cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 2978-2983 (2015).
  22. Galluzzi, L., Buque, A., Kepp, O., Zitvogel, L., Kroemer, G. Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell. 28 (6), 690-714 (2015).
  23. Muddineti, O. S., Ghosh, B., Biswas, S. Current trends in using polymer coated gold nanoparticles for cancer therapy. International Journal of Pharmaceutics. 484 (1-2), 252-267 (2015).
  24. Hu, W., et al. Methyl Orange removal by a novel PEI-AuNPs-hemin nanocomposite. Journal of Environmental Sciences. 53, 278-283 (2017).
  25. Gu, F. X., et al. Targeted nanoparticles for cancer therapy. Nano Today. 2 (3), 14-21 (2007).
  26. Srinivasarao, M., Galliford, C. V., Low, P. S. Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (3), 203-219 (2015).
  27. Liu, Z., Shi, Y., Chen, Z., Duan, L., Wang, X. Current progress towards the use of aptamers in targeted cancer therapy. Chinese Science Bulletin (Chinese Version). 59 (14), 1267 (2014).
  28. Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
  29. Vandghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. Antisense LNA-loaded nanoparticles of star-shaped glucose-core PCL-PEG copolymer for enhanced inhibition of oncomiR-214 and nucleolin-mediated therapy of cisplatin-resistant ovarian cancer cells. International Journal of Pharmaceutics. 573, 118729 (2020).
  30. Andghanooni, S., Eskandani, M., Barar, J., Omidi, Y. AS1411 aptamer-decorated cisplatin-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles for targeted therapy of miR-21-inhibited ovarian cancer cells. Nanomedicine. 13 (21), 2729-2758 (2018).
  31. Palmieri, D., et al. Human anti-nucleolin recombinant immunoagent for cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9418-9423 (2015).
  32. Pichiorri, F., et al. In vivo NCL targeting affects breast cancer aggressiveness through miRNA regulation. Journal of Experimental Medicine. 210 (5), 951-968 (2013).
  33. Hou, S., McCauley, L. K., Ma, P. X. Synthesis and erosion properties of PEG-containing polyanhydrides. Macromolecular Bioscience. 7 (5), 620-628 (2007).
  34. Nie, L., et al. Injectable Vaginal Hydrogels as a Multi-Drug Carrier for Contraception. Applied Sciences. 9 (8), 1638 (2019).
  35. Zou, P., Suo, J., Nie, L., Feng, S. Temperature-responsive biodegradable star-shaped block copolymers for vaginal gels. Journal of Materials Chemistry. 22 (13), 6316-6326 (2012).
  36. Etrych, T., Šubr, V., Laga, R., Říhová, B., Ulbrich, K. Polymer conjugates of doxorubicin bound through an amide and hydrazone bond: Impact of the carrier structure onto synergistic action in the treatment of solid tumours. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 58, 1-12 (2014).
  37. Safari, F., Tamaddon, A. M., Zarghami, N., Abolmali, S., Akbarzadeh, A. Polyelectrolyte complexes of hTERT siRNA and polyethyleneimine: Effect of degree of PEG grafting on biological and cellular activity. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (6), 1561-1568 (2016).

Tags

Kjemi Utgave 160 aptamer gull nanopartikler doxorubicin copolymer legemiddellevering kreftterapi
Syntese av Aptamer-PEI-g-PEG Modifisert Gull Nanopartikler Lastet med Doxorubicin for målrettet legemiddellevering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nie, L., Sun, S., Sun, M., Zhou, Q., … More

Nie, L., Sun, S., Sun, M., Zhou, Q., Zhang, Z., Zheng, L., Wang, L. Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery. J. Vis. Exp. (160), e61139, doi:10.3791/61139 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter