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Chemistry

लक्षित दवा वितरण के लिए Doxorubicin से भरी हुई इप्टामर-पी-जी-खूंटी संशोधित गोल्ड नैनोकणों का संश्लेषण

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61139
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 3, 3, 3
1College of Life Sciences, Xinyang Normal University, 2Department of Imaging & Pathology, University of Leuven and Oral & Maxillofacial Surgery, University Hospitals Leuven, 3Analysis & Testing Center, Xinyang Normal University

Summary

इस प्रोटोकॉल में, डॉक्सोरुबिक-लोडेड AS1411-जी-पीई-जी-खूंटी संशोधित सोने के नैनोकणों को तीन-चरण अमीस प्रतिक्रियाओं के माध्यम से संश्लेषित किया जाता है। फिर, doxorubicin लोड किया जाता है और कैंसर चिकित्सा के लिए कैंसर की कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए दिया जाता है ।

Abstract

दवा प्रतिरोध और स्वस्थ कोशिकाओं में विषाक्तता के कारण, डॉक्सोरुबिसिन (DOX) का उपयोग नैदानिक कैंसर चिकित्सा में सीमित किया गया है। यह प्रोटोकॉल पॉलीथीन ग्लाइकोल (पी-जी-खूंटी) कोपॉलिमर कार्यात्मक सोने के नैनोकणों (AuNPs) के साथ लोडेड एपटेमर (AS1411) और डोम्स के साथ ग्राफ्ट की गई पॉली (एथिलेनिमाइन) के डिजाइन का वर्णन करता है। AS1411 विशेष रूप से कैंसर कोशिकाओं पर लक्षित न्यूक्लियोलिन रिसेप्टर्स के साथ बंधुआ है ताकि DOX स्वस्थ कोशिकाओं के बजाय कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करता है। सबसे पहले, खूंटी का कार्बोक्सिलेटेड है, फिर पी-जी-खूंटी कोपॉलिमर प्राप्त करने के लिए शाखाओं में बंटी पी को ग्राफ्ट किया जाता है, जिसकी पुष्टि 1एच एनएमआर विश्लेषण द्वारा की जाती है। इसके बाद, पी-जी-खूंटी कोपॉलिमर कोटेड गोल्ड नैनोकणों (पीई-जी-PEG@AuNPs) संश्लेषित किए जाते हैं, और DOX और AS1411 को धीरे-धीरे एयूएनपी के साथ-साथ अमे की प्रतिक्रियाओं के माध्यम से बंधुआ किया जाता है। तैयार AS1411-जी-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs का व्यास ~39.9 एनएम है, जिसमें -29.3 mV की जीटा क्षमता है, जो यह दर्शाता है कि नैनोकण पानी और सेल माध्यम में स्थिर हैं। सेल साइटोटॉक्सिकिटी परख बताती है कि नए डिजाइन किए गए डॉक्स लोडेड AuNPs कैंसर कोशिकाओं (A549) को मारने में सक्षम हैं। यह संश्लेषण AuNPs पर पी-जी-खूंटी कोपॉलिमर्स, एप्टामर्स और डॉक्स की नाजुक व्यवस्था को दर्शाता है जो अनुक्रमिक अमीद प्रतिक्रियाओं द्वारा प्राप्त किए जाते हैं। इस तरह के aptamer-पी-जी-खूंटी कार्यात्मक AuNPs कैंसर चिकित्सा में लक्षित दवा वितरण के लिए एक आशाजनक मंच प्रदान करते हैं ।

Introduction

दुनिया भर में प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या होने के नाते, कैंसर को व्यापक रूप से कम इलाज दर, उच्च पुनरावृत्ति दर, और उच्च मृत्यु दर1, 2होने के रूप में चिह्नित कियाजाताहै। वर्तमान पारंपरिक कैंसर विरोधी तरीकों में सर्जरी, कीमोथेरेपी और रेडियोथेरेपी3शामिल हैं, जिनमें से कीमोथेरेपी क्लिनिक4में कैंसर रोगियों के लिए प्राथमिक उपचार है। क्लीनिकल इस्तेमाल की जाने वाले एंटीकैंसर दवाओं में मुख्य रूप से paclitaxel (PTX)5 और डॉक्सोरुबिकिन (DOX)6,7शामिल हैं । कैंसर साइटोटॉक्सिकिटी के फायदों और कैंसर सेल प्रसार8,9के अवरोध के कारण, एक एंटीनोप्लास्टी दवा, DOX को मोटे तौर पर नैदानिक कीमोथेरेपी में लागू किया गया है। हालांकि, डॉक्स कार्डियोटॉक्सीसिटी10, 11का कारण बनता है, और DOX का छोटा आधा जीवन क्लिनिक12में अपने आवेदन को प्रतिबंधित करता है। इसलिए, एक लक्षित क्षेत्र में नियंत्रित फैशन में DOX लोड करने और उप-आवश्यक रूप से डीडग्रेडेबल दवा वाहकों की आवश्यकता होती है।

नैनोकणों का व्यापक रूप से लक्षित दवा वितरण प्रणालियों में उपयोग किया गया है और कैंसर के इलाज में कई फायदे हैं (यानी, खासी सतह से मात्रा अनुपात, छोटे आकार, विभिन्न दवाओं को समझाने की क्षमता, और ट्यूनेबल सतह रसायन विज्ञान, आदि) 13,14,15. विशेष रूप से, सोने के नैनोकणों (AuNPs) का व्यापक रूप से जैविक और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में उपयोग किया गया है, जैसे फोटोथर्मल कैंसर थेरेपी16,17। 18कैंसर थेरेपी के नैदानिक क्षेत्र में ऑक्सील संश्लेषण और सामान्य सतह कार्यात्मकता जैसे AuNPs के अद्वितीय गुणों में उत्कृष्ट संभावनाएं हैं। इसके अलावा, AuNPs दवा वितरण रणनीतियों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, ट्यूमर का निदान, और कई अध्ययनों में प्रतिरोध पर काबू पानेके लिए 19,20।

इसके बावजूद, AuNPs को उन्नत पारिमेशन और प्रतिधारण (ईपीआर) के माध्यम से ट्यूमर घावों पर उच्च स्थानीय रिहाई के माध्यम से दवा प्रतिरोध को दूर करने के लिए और अधिक सिलवाया जाना चाहिए, जैसे लक्ष्यीकरण और पहुंच गुण। पॉलीमर कार्यात्मक AuNPs ने हाइड्रोफोबिक एंटीकैंसर दवाओं की बेहतर जल घुलनशीलता और21, 22 लंबेसमय तक परिसंचरण समय जैसे अद्वितीयलाभोंका प्रदर्शन किया है। ऑएनपी कोटिंग्स के लिए विभिन्न जैव संगत पॉलिमर का उपयोग किया गया है, जैसे पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी), पॉलीथीलीनमाइन (पीई), हायलूरोनिक एसिड, हेपरिन और ज़ेंथन गम। फिर स्थिरता, साथ ही साथ AuNPs के पेलोड में अच्छी तरह से सुधार हुआ है23। विशेष रूप से, पी एक अत्यधिक शाखाकृत बहुलक है जो प्राथमिक, माध्यमिक और तृतीयक अमीन24की कई दोहराने वाली इकाइयों से बना है। पी में उत्कृष्ट घुलनशीलता, कम चिपचिपाहट और उच्च स्तर की कार्यक्षमता है, जो AuNPs पर कोटिंग के लिए उपयुक्त है।

दूसरी ओर, कैंसर रोधी दवाओं को बेहतर लोडिंग दक्षता के साथ सीधे कैंसर कोशिकाओं को वितरित करने की आवश्यकता है, और प्राथमिक और उन्नत मेटास्टैटिक ट्यूमर25के इलाज के लिए कम विषाक्तता के साथ। लक्षित लिगामेंट्स में कैंसर रोधी दवा लक्षित डिलीवरी सिस्टम26के लिए काफी संभावनाएं हैं । लक्ष्य अणु बाध्यकारी के लिए इसकी चयनशीलता विशिष्टता को लक्षित करने वाली कैंसर रोधी दवा प्रदान करती है और रोगग्रस्त ऊतकों में दवा संवर्धन को बढ़ाती है27। अधिक लिगामेंट्स में एंटीबॉडी, पॉलीपेप्टाइड्स और छोटे अणु शामिल हैं। अन्य लिगामेंट्स की तुलना में, न्यूक्लिक एसिड एप्टैमर्स को विट्रो में संश्लेषित किया जा सकता है और इसे संशोधित करना आसान है। AS1411 एक असंशोधित 26 बीपी फॉस्फोडिस्टर ओलिगोन्यूक्लियोटाइड है जोकैंसर कोशिकाओं28, 29,30पर विशेष रूप से एक अतिउप्रित लक्ष्य परमाणु प्रोटीन रिसेप्टर से बांधने के लिए एक स्थिर डिमरिक जी-टेट्रामर संरचना बनाता है। एएस1411 कई कैंसर कोशिकाओं के प्रसार को रोकता है लेकिन स्वस्थ कोशिकाओं के विकास को प्रभावित नहीं करता है31,32. नतीजतन, AS1411 का उपयोग एक आदर्श लक्षित दवा वितरण प्रणाली बनाने के लिए किया गया है।

इस अध्ययन में, एक पी-जी-खूंटी कोपॉलिमर को एक अमीस प्रतिक्रिया के माध्यम से संश्लेषित किया जाता है, फिर पी-जी-खूंटी कोपॉलिमर कोपित सोने के नैनोकण (पीई-जी-PEG@AuNPs) गढ़े जाते हैं। इसके अतिरिक्त, DOX और AS1411 क्रमिक रूप से तैयार पी-जी-PEG@AuNPs से जुड़े हुए हैं, जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है । इस विस्तृत प्रोटोकॉल का उद्देश्य शोधकर्ताओं को DOX और AS1411 से भरे नए पी-जी-PEG@AuNPs के निर्माण से जुड़े कई आम नुकसान से बचने में मदद करना है।

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Protocol

सावधानी: सभी रसायनों का उपयोग करने से पहले सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (एमएसडीएस) से परामर्श करना सुनिश्चित करें। कोपॉलिमर और नैनोकणों को तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कई रसायन तीव्रता से जहरीले होते हैं। नैनोकणों में भी संभावित खतरे होते हैं । दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, डाकू, पूर्ण लंबाई पैंट, और करीब पैर की हड्डी जूते सहित सभी उपयुक्त सुरक्षा प्रथाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करना सुनिश्चित करें।

1. डबल-कार्बोक्सिल पॉलीथीन ग्लाइकोल (सीटी-खूंटी)33 का संश्लेषण

  1. 100 एमएल राउंड बॉटम फ्लास्क में 1.46 ग्राम (14.6 mmol) succinic anhydride (SA) और 209 मिलीग्राम (1.71 mmol) 4-डाइमेथाइलामिनोपाइरिडीन (डीएमएपी) जोड़ें।
  2. स्टेप 1.1 में इस्तेमाल होने वाले फ्लास्क में 15 एमएल का निर्जल टेट्राहाइड्रोफुरन (टीएचएफ) डालें और एक ग्लास डाट फिट करें। फ्लास्क को 30 मिनट के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. एक नए फ्लास्क में पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) के 4.28 ग्राम (4.28 mmol) और 1.8 एमएल (12.8 mmol) ट्राइथिलमाइन (चाय) जोड़ें।
  4. स्टेप 1.3 में इस्तेमाल होने वाले फ्लास्क में 15 एमएल का निर्जल थफ डालें और ग्लास डाट फिट करें। नाइट्रोजन वातावरण के तहत एक सिरिंज का उपयोग करके, चरण 1.2 में उपयोग किए जाने वाले फ्लास्क में समाधान को धीरे-धीरे स्थानांतरित करें।
  5. 2 घंटे के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर समाधान हिलाओ, तो रात भर कमरे के तापमान (आर टी) पर प्रतिक्रिया जारी रखें ।
  6. रोटरी वाष्पीकरण (40 डिग्री सेल्सियस, 0.1 एमपीए) का उपयोग करके, प्रतिक्रिया समाधान को केंद्रित करें और टीएचएफ सॉल्वेंट को हटा दें।
  7. आरटी में, 1.325 ग्राम/एमएल डाइक्लोरोमेथेन (डीसीएम) के 15 एमएल में चरण 1.6 से प्रतिक्रिया समाधान को भंग करें, फिर वर्षा उत्पाद (पॉलीथीन ग्लाइकोल डायसिड) प्राप्त करने के लिए 15 एमएल कोल्ड डायथिल ईथर (एट2ओ) जोड़ें। फिल्टर पेपर के जरिए सॉल्वेंट निकालें।
    नोट: वर्षा कदम 3x दोहराया जा सकता है ।
  8. 48 घंटे के लिए आरटी में वैक्यूम के तहत उपजी सूखी।

2. पी-जी-खूंटी कोपॉलिमर का संश्लेषण

  1. एक फ्लास्क में डाइमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के चरण 1.8 और 5 एमएल से 305.47 मिलीग्राम सीटी-खूंटी जोड़ें और यह सुनिश्चित करने के लिए आरटी में हलचल करें कि सीटी-खूंटी पूरी तरह से डीएमएसओ में भंग हो गया है।
  2. 1 के 49.46 मिलीग्राम भंग - (3-dimethylaminopropyl) - 3-एथिलकार्बोडिमाइड हाइड्रोक्लोराइड (EDC) DMSO के 5 एमएल में, तो कदम 2.1 में इस्तेमाल फ्लास्क के लिए समाधान जोड़ें और आरटी में 30 मिनट के लिए हलचल।
  3. डीएमएसओ के 5 एमएल में 29.69 मिलीग्राम एन-हाइड्रोक्सीस्यूसिनिमाइड (एनएचएस) को भंग करें और चरण 2.1 में उपयोग किए जाने वाले फ्लास्क का समाधान जोड़ें। 3 घंटे के लिए आरटी में हलचल जारी रखें ।
  4. डीएमएसओ के 10 एमएल में पॉलीथीलीनीमाइन (पीई) के 28.6 माइक्रोन को भंग करें और चरण 2.1 में उपयोग किए जाने वाले फ्लास्क में समाधान ड्रॉपवाइज जोड़ें। कम से कम 3 दिनों के लिए हिलाओ।
  5. एक डायलिसिस बैग (1,000 आणविक वजन कट-ऑफ [MWCO] के लिए कदम 2.4 से प्रतिक्रिया व्यक्त समाधान स्थानांतरित करें। डायलिसिस बैग को 1 एल बीकर में रखें जिसमें 500 एमएल अल्ट्रापुरे पानी के साथ डायलाग के रूप में। 3 दिनों के लिए हर 12 घंटे में अल्ट्रापुरे पानी बदलें।
  6. समाधान को स्टेप 2.5 में एक अन्य डायलिसिस बैग (10,000 MWCO) में स्थानांतरित करें। डायलिसिस बैग को 1 एल बीकर में रखें जिसमें 500 एमएल अल्ट्रापुरे पानी के साथ डायलाग के रूप में। 3 दिनों के लिए हर 12 घंटे में अल्ट्रापुरे पानी बदलें।
  7. रोटरी वाष्पीकरण (40 डिग्री सेल्सियस, 0.1 एमपीए) का उपयोग करके चरण 2.6 से समाधान को केंद्रित करें और पी-जी-खूंटी पाउडर प्राप्त करने के लिए नमूना को फ्रीज-सुखाएं।

3. पी-जी-PEG@AuNPs का संश्लेषण

  1. एक नए फ्लास्क में अल्ट्रापुरे पानी के 5 मिलीग्राम में तैयार पी-जी-खूंटी (चरण 2.7) को भंग करें और ग्लास डाट के साथ फिट करें।
  2. फ्लास्क में 0.3 एमएल एचयूसीएल4 समाधान का 100 मिलियन एलएल जोड़ें और आरटी में 3 घंटे के लिए समाधान को हिलाएं।
    नोट: समाधान का रंग पीले से नारंगी रंग में तुरंत बदलना चाहिए।
  3. फ्लास्क में 1 मिलीग्राम/एमएल एनएबीएच 4 समाधान का1 एमएल जोड़ें और आरटी में 3 घंटे के लिए समाधान को हिलाएं।
    नोट: प्रतिक्रिया समाधान तुरंत बरगंडी बारी चाहिए ।
  4. पी-जी-PEG@AuNPs समाधान प्राप्त करने के लिए चरण 2.5 में वर्णित 3 दिनों के लिए डायलिसिस बैग (1,000 मेगाल्को) का उपयोग करके प्रतिक्रिया उत्पाद को डायलाइज़ करें।

4. डॉक्स-जी-पी-जी-PEG@AuNPs का संश्लेषण

  1. 2.2 मिलीग्राम/एमएल DOX समाधान के 1 एमएल और पी-जी-PEG@AuNPs समाधान के 20 एमएल को एक नए फ्लास्क में जोड़ें और ग्लास डाट के साथ फिट करें।
  2. अल्ट्रापुरे पानी के 1 मिलील में 0.727 मिलीग्राम ईडीसी को भंग करें और चरण 4.1 में उपयोग किए जाने वाले फ्लास्क में ईडीसी समाधान जोड़ें।
  3. अल्ट्रापुरे पानी के 1 एमएल में 0.437 मिलीग्राम एनएचएस घोलें। फ्लास्क के लिए एनएचएस समाधान जोड़ें और 1 घंटे के लिए आरटी पर हलचल ।
  4. डॉक्स-जी-पी-जी-PEG@AuNPs समाधान प्राप्त करने के लिए चरण 2.5 में वर्णित 3 दिनों के लिए डायलिसिस बैग (1,000 MWCO) का उपयोग करके प्रतिक्रिया उत्पाद को डायलाइज़ करें।

5. AS1411-जी-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs का संश्लेषण

  1. एक नए फ्लास्क में DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs समाधान और AS1411 (OD = ऑप्टिकल घनत्व; 1OD ≈ 33 माइक्रोग्राम) के 4OD के 20 एमएल जोड़ें।
  2. अल्ट्रापुरे पानी के 1 मिलील में 28.76 मिलीग्राम ईडीसी को भंग करें और चरण 5.1 में उपयोग किए जाने वाले फ्लास्क में ईडीसी समाधान जोड़ें।
  3. अल्ट्रापुरे पानी के 1 एमएल में 17.27 मिलीग्राम एनएचएस को भंग करें। कदम ५.१ में इस्तेमाल फ्लास्क के लिए एनएचएस समाधान जोड़ें और आरटी में 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया हलचल ।
  4. एएस1411-जी-डीओएक्स-जी-पी-जी-जी-PEG@AuNPs प्राप्त करने के लिए चरण 2.5 में वर्णित के रूप में 3 दिनों के लिए डायलिसिस बैग (1,000 MWCO) का उपयोग करके प्रतिक्रिया उत्पाद को डायलाइज़ करें।

6. नमूना लक्षण वर्णन

  1. सीटी-खूंटी बहुलक (चरण 1.8) और पी-जी-खूंटी कोपॉलिमर (चरण 2.7) को क्रमशः परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) ट्यूबों में क्लोरोफॉर्म-डी में भंग करें। रासायनिक संरचना34की पुष्टि करने के लिए 14.09 टी सुपरकंडक्टिंग चुंबक और 5.0 मिमी 600 मेगाहर्ट्ज ब्रॉडबैंड जेड-रेडिएंट हाई रेजोल्यूशन जांच से लैस 600 मेगाहर्ट्ज एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण करें।
  2. AuNPs, DOX, और AS1411 तितर-बितर, और तैयार पी-जी-PEG@AuNPs (कदम ३.४), DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs (कदम ४.४), और AS1411-जी-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs (कदम ५.४), क्रमशः अल्ट्रापुरे पानी में । फिर, क्यूवेट में स्थानांतरित करें और यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके पराबैंगनी-दृश्यमान (यूवी-विस) स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड करें।
  3. एल्यूमीनियम पन्नी के लिए एक डबल तरफा चिपकने वाला (~ 2 मिमी x 2 मिमी) संलग्न करें, और नमूना समाधान (पी-जी-PEG@AuNPs, DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs, और AS1411-g-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs) पूरे टेप पर समान रूप से डुबकी । एक्स-रे फोटोइलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी एनालाइजर का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण करें।
  4. अल्ट्रापुरे पानी में क्रमशः पी-जी-PEG@AuNPs, डॉक्स-जी-पी-जी-PEG@AuNPs, और AS1411-g-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs समाधान, क्रमशः तितर-बितर करें । फिर, क्यूवेट में स्थानांतरित करें और गतिशील प्रकाश बिखरने का उपयोग करके आकार वितरण का मूल्यांकन करें।
  5. अल्ट्रापुरे पानी में पी-जी-PEG@AuNPs, डॉक्स-जी-पी-जी-PEG@AuNPs, और एएस1411-जी-डीओएक्स-जी-पी-जी-PEG@AuNPs समाधान (प्रत्येक नमूने के लिए अल्ट्रापुरे पानी के प्रति 5 एमएल नमूने की एक बूंद)। 2 घंटे के लिए Sonicate । तांबे ग्रिड को नमूना समाधानों में डुबोएं और एक अवरक्त दीपक के नीचे सूखें। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके आकृति विज्ञान की विशेषता है।
  6. 20 केडीए एमडब्ल्यूसीओ डायलिसिस कैसेट में 1 मिलीग्राम AS1411-जी-डॉक्स-जी-पी-जी-PEG@AuNPs इंजेक्ट करें, फिर 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 80 एमएल में रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाओ।
  7. पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर, 100 माइक्रोन एलिककोट एकत्र करें और ताजा पीबीएस के साथ बदलें। एलिकोट्स की डॉक्स फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने के लिए यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें।

7. CCK-8 AS1411-जी-DOX-जी-पी-जी-PEG@AuNPs नैनोकणों की परख

  1. Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) में A549 कोशिकाओं को विकसित करें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, और १०० μg/ml streptomycin के एक आर्द्र वातावरण के तहत ९५% हवा और 5% सीओ2 ३७ डिग्री सेल्सियस पर के साथ पूरक । हर 2 दिन में कल्चर मीडियम बदलें। कोशिका प्रसार और साइटोटॉक्सिकिटी के लिए मार्ग 5 पर कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए मात्रात्मक रूप से तैयार AS1411-जी-DOX-जी-पी-जी-PEG@AuNPs नैनोकणों के साइटोटॉक्सिकिटी का मूल्यांकन करने के लिए कहते हैं ।
  2. सेल माध्यम के प्रत्येक अच्छी तरह से 1 एमएल में नैनोपार्टिकल समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें। 24 घंटे और 48 घंटे के लिए खेती के बाद, सेल संस्कृति प्लेटों से संस्कृति मीडिया को हटा दें, फिर ताजा संस्कृति मीडिया के 300 माइक्रोन और सेल काउंटिंग किट-8 (सीसीएल-8) किट समाधान के 30 माइक्रोन को प्रत्येक कुएं में तुरंत जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सीओ 2 इनक्यूबेटर में4 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  3. एक 96 अच्छी तरह से थाली में कदम 7.2 से प्रतिक्रिया समाधान के 200 μL हस्तांतरण। एक माइक्रोप्लेट रीडर के साथ 570 एनएम पर प्रत्येक कुएं के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) पढ़ें।
  4. एक माइक्रोस्कोप के तहत 24 घंटे और 48 घंटे में कोशिकाओं की आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें।

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Representative Results

1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग सीटी-खूंटी बहुलक और पी-जी-खूंटी कोपॉलिमर(चित्रा 2)के सफल संश्लेषण की पुष्टि करने के लिए किया गया था। चित्रा 2a से पता चलता है कि δ = 3.61 पीपीएम पर मेथिलीन प्रोटॉन सिग्नल और δ = 2.57 पीपीएम पर कार्बोक्सिल प्रोटॉन सिग्नल सीटी-खूंटी पॉलिमर के सफल संश्लेषण की पुष्टि करते हैं। चित्रा 2b से पता चलता है कि δ = 2.6 पीपीएम पर खूंटी के मेथिलीन प्रोटॉन संकेत और δ = 1.66 पीपीएम पर पी के प्रोटॉन संकेत पी-जी-खूंटी copolymers के संश्लेषण की पुष्टि करते हैं।

यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी का आयोजन किया गया ताकि AuNPs(चित्रा 3)पर तैयार कोपॉलिमर के सफल कार्यात्मकीकरण का निर्धारण किया जा सके । यूवी-विस स्पेक्ट्रा में, ~ 523 एनएम, 507 एनएम और 260 एनएम पर बैंड की उपस्थिति क्रमशः AuNPs, DOX, और AS1411(चित्र 3 ए)की सतह प्लाज्मन अनुनाद (एसपीआर) चोटियों से मेल खाती है। पी-जी-PEG@AuNPs के यूवी-विस स्पेक्ट्रम में ~ 360 एनएम पर बैंड, DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs के यूवी-विस स्पेक्ट्रम में ~ 532 एनएम, और एएस1411-जी-डॉक्स-जी-पी-जी-जी-PEG@AuNPs के यूवी-विस स्पेक्ट्रम में ~ 546 एनएम, AUNPs से जुड़े पी-जी-पेग कोपॉलिमर के सफल संश्लेषण की पुष्टि करते हैं। वे इस बात की भी पुष्टि करते हैं कि DOX और AS1411 को कार्यात्मक AuNPs पर धीरे-धीरे लोड किया गया था(चित्र 3बी)।

एक्स-रे फोटोइलेक्ट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी (एक्सपीएस) का उपयोग AuNPs(चित्रा 4)पर कोपॉलिमर के रासायनिक बंधन की जांच करने के लिए किया गया था। पी-जी-PEG@AuNPs के एक्सपीएस स्पेक्ट्रम ने C1s, O1s, N1s, और Au4f चोटियों को दिखाया AuNPs और पी-जी-खूंटी कोपॉलिमर(चित्रा 4a) केबीच संबंध का संकेत दिया । डॉक्स-जी-पी-जी-PEG@AuNPs के एक्सपीएस स्पेक्ट्रम में मामूली बदलाव हुआ, क्योंकि डीओएक्स को पी-जी-PEG@AuNPs(चित्रा 4b)पर आगे ग्राफ्ट किया गया था । इसके अलावा, AS1411-जी-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs के लिए P2p पीक की उपस्थिति मुख्य रूप से DOX-g-पी-जी-PEG@AuNPs(चित्रा 4c)पर AS1411 के सफल भ्रष्टाचार के कारण था । डीएलएस(चित्रा 5)का उपयोग करके तैयार नैनोकणों के आकार वितरण का विश्लेषण किया गया। पी-जी-PEG@AuNPs की तुलना में, औसत जलयोजन व्यास DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs में थोड़ा बढ़ गया और आगे बढ़ गया एक बार AS1411 पर कलम किया गया था ।

TEM नैनोकणों की आकृति विज्ञान का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और छवियों से पता चला है कि सभी नैनोकणों एकत्रीकरण के बिना एक समान थे(चित्रा 6)। AuNPs की सतह पर copolymers के बीच बातचीत के कारण, AuNPs की दूरी धीरे-धीरे बढ़ गई। तैयार डॉक्स डिलीवरी सिस्टम(चित्रा 7 और चित्रा 8)की लक्षित संपत्ति का निर्धारण करने के लिए एक सेल व्यवहार्यता परीक्षण का उपयोग किया गया था। CCK-8 परिणाम(चित्रा 7)से पता चला है कि 1) A549 सेल संख्या AS1411-जी-DOX-पी-जी-समय के साथ PEG@AuNPs के साथ खेती के बाद कमी आई और 2) नैनोकणों की एकाग्रता में वृद्धि के साथ सेल संख्या में कमी आई । फ्री डॉक्स ग्रुप की तुलना में सेल की संख्या बढ़ी, जो यह दर्शाता है कि विषाक्तता कम हो गई थी ।

ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी छवियों(चित्रा 8)के साथ, परिणाम बताते हैं कि नैनोपार्टिकल्स(चित्रा 8ई, एफ)को जोड़ने के बिना नियंत्रण समूह की तुलना में AS1411-जी-DOX-g-पी-जी-PEG@AuNPs(चित्रा 8ए−डी)के साथ खेती करने के बाद सेल संख्या में कमी आई। इसके अलावा, पीबीएस में तैयार AS1411-g-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs से DOX रिलीज प्रोफाइल की जांच की गई(चित्रा 9)। परिणाम बताते हैं कि कार्यात्मक नैनोकणों से DOX की निरंतर रिहाई A549 कोशिकाओं में कमी का कारण बना, और संचयी DOX रिलीज के बारे में 63.5% ± 3.2% 72 घंटे में था.

Figure 1
चित्रा 1: पी-जी-PEG@AuNP, DOX-g-pei-g-PEG@AuNP, और AS1411-g-DOX-g-pei-g-PEG@AuNP के संश्लेषण का योजनाबद्ध चित्रण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: 1एच एनएमआर स्पेक्ट्रा (क) संश्लेषित सीटी-खूंटी बहुलक और (ख) पी-जी-खूंटी कोपॉलिमर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: यूवी-विस स्पेक्ट्रा (क) AuNPs, DOX, और AS1411, और (ख) पी-जी-PEG@AuNPs, DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs, और AS1411-g-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: (ए) पी-जी-PEG@AuNPs, (ख) डॉक्स-जी-पी-जी-PEG@AuNPs, और (ग) AS1411-g-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: पी-जी-PEG@AuNPs, DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs, और AS1411-g-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs का आकार वितरण ।
d.nm = नैनोपार्टिकल का औसत व्यास। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: (क) पी-जी-PEG@AuNPs, (ख) डॉक्स-जी-पी-जी-PEG@AuNPs, और (ग) AS1411-g-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs की TEM छवियां ।
स्केल बार = 50 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: AS1411-जी-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs (२२० μg/ml और ११० μg/mL) के साथ खेती के बाद A549 कोशिकाओं के ५७० एनएम (OD५७०)पर ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों क्रमशः 24 घंटे और ४८ घंटे के लिए ।
नैनोकणों को जोड़ने के बिना मुफ्त DOX और कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं को नियंत्रण समूहों के रूप में शामिल किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: AS1411-जी-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs के साथ २२० μg/mL (एक) के साथ खेती के बाद A549 कोशिकाओं के ऑप्टिकल सूक्ष्म छवियां (एक ,, ख) और 110 माइक्रोग्राम/एमएल (सी, डी), या 24 घंटे (ऊपर पैनल) और 48 एच (नीचे पैनल) पर नियंत्रण समूह (ई, एफ) के रूप में नैनोकणों को जोड़ने के बिना खेती। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: 72 घंटे के लिए पीबीएस में AS1411-g-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs से DOX की प्रोफाइल जारी करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

1एच एनएमआर स्पेक्ट्रम(चित्रा 2)सीटी-खूंटी कोपॉलिमर और पी-जी-खूंटी कोपॉलिमर के सफल संश्लेषण की पुष्टि करता है। खूंटी और पीई के आणविक वजन क्रमशः १,००० और १,२०० थे । इसके अतिरिक्त, ईडीसी/एनएचएस उत्प्रेरक प्रणाली का उपयोग पी-जी-खूंटी कोपॉलिमर को अमीड प्रतिक्रियाओं के माध्यम से संश्लेषित करने के लिए किया गया था । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यदि पीई-जी-खूंटी कोपॉलिमर के संश्लेषण के लिए खूंटी और पीई के आणविक वजन में परिवर्तन किया जाता है, तो प्रतिक्रिया समय और उत्प्रेरक प्रणाली का पुनर्मूल्यांकन करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, AuNPs पर पी-जी-खूंटी कोपॉलिमर कोटिंग के लिए प्रतिक्रिया स्थिति को और अधिक समायोजित करने की आवश्यकता है, मुख्य रूप से क्योंकि खूंटी-जी-पी कोपॉलिमर का अणु वजन और संरचना AuNPs की कोटिंग दक्षता और व्यास को प्रभावित कर सकती है। बाद में, कोपॉलिमर कार्यात्मक AuNPs की आकृति विज्ञान को भी बदला जा सकता है। पी बहुलक से अमीनो समूहों की संख्या अंतिम पी-जी-खूंटी कोपॉलिमर संश्लेषण की संरचना को प्रभावित कर सकती है, और पी और सीटी-खूंटी के बीच क्रॉसलिंक कार्रवाई अनिवार्य रूप से हो जाएगी। इस प्रकार, चरण 2.4 को सावधानीपूर्वक किए जाने की आवश्यकता है, और पी समाधान को धीरे-धीरे ड्रॉप-बाय-ड्रॉप जोड़ने की आवश्यकता है। संश्लेषण प्रतिक्रिया के बाद, क्रॉसलिंक्ड कोपॉलिमर और अप्रतिबद्ध बहुलक को हटाने के लिए डायलिसिस (चरण 2.5 और 2.6) का संचालन करने की आवश्यकता होती है।

इसके अलावा, DOX और AS1411 क्रमिक रूप से पी-जी-PEG@AuNPs पर अमी प्रतिक्रियाओं के माध्यम से कार्यात्मक हैं, और EDC/एनएचएस उत्प्रेरक प्रणाली का उपयोग किया जाता है । यह प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए 3 दिनों की आवश्यकता है (चरण 4.3 और चरण 5.3) यहां; हालांकि, यदि प्रतिक्रिया समय के लिए 3 दिनों से कम की आवश्यकता होती है, तो कार्यात्मकता दक्षता कम हो जाएगी। जब 3 दिन से अधिक की आवश्यकता होती है, तो एक ही परिणाम प्राप्त किया गया है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रासायनिक ईडीसी, एनएचएस, और असंबद्ध DOX या AS1411 डायलिसिस उपचार (चरण 4.4 और चरण 5.4) के माध्यम से हटाया जा सकता है। यूवी-विस स्पेक्ट्रा और एक्सपीएस नैनोकणों पर कोपॉलिमर के सफल कार्यात्मकीकरण की जांच करने के लिए प्रभावी तरीके हैं, और लगातार परिणाम प्राप्त किए गए हैं(चित्र 3 और चित्रा 4)।

AuNPs, DOX, और AS1411 के विशिष्ट यूवी-विस बैंड से अलग, पी-जी-PEG@AuNPs की अनूठी चोटियों, DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs, और AS1411-g-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs का पालन करना चुनौतीपूर्ण है, प्रत्येक चोटी के अतिव्यापी होने के कारण । इसके अलावा, हमने DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs (संश्लेषण DOX-g-PEI-g-PEG पहले, और AuNPs पर कार्यात्मकता की उपलब्धि) बनाने के लिए एक अलग तरीका प्रदर्शन किया है; हालांकि, इस तरह के एक दृष्टिकोण का उपयोग कर सोने नैनोकणों कम DOX लोडिंग दक्षता35,36के लिए नेतृत्व किया गया है . इस प्रकार, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस काम में DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs के संश्लेषण के लिए विधि पर्याप्त DOX लोडिंग दक्षता के साथ-साथ आगे रिलीज प्रोफाइल सुनिश्चित करेगी। यदि कोई प्रयोग सोने के नैनोकणों की डॉक्स लोडिंग दक्षता को ध्यान में नहीं रखता है, तो AS1411-जी-DOX-g-pei-g-PEG@AuNPs प्राप्त करने के लिए अन्य तरीके हैं। इनमें पहले एक अमीस प्रतिक्रिया के माध्यम से DOX-g-पी-जी-खूंटी या AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG का संश्लेषण, फिर सोने के नैनोकणों पर कार्यात्मकता शामिल है। इस प्रकार, यहां उपयोग की जाने वाली विधि के साथ-साथ प्राप्त कोपॉलिमर को ऊतक इंजीनियरिंग जैसे विविध चिकित्सा अनुप्रयोगों पर लागू किया जा सकता है।

तैयार नैनोकणों के आकार वितरण और आकृति विज्ञान की जांच डीएलएस और टेम द्वारा की जा सकती है। डीएलएस डेटा(चित्रा 5) सेपता चलता है कि हाइड्रेशन व्यास नैनोकण विभिन्न कोटिंग्स से भिन्न होते हैं, और प्रत्येक नमूने के लिए एक से अधिक चोटी दिखाई देती है। पी-जी-खूंटी(चित्रा 1)की संरचना के संबंध में, डीएलएस का सामान्य वितरण वक्र नहीं देखा जाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि नैनोकणों को डीएलएस परीक्षण के दौरान अल्ट्रापुरे पानी में फैलाया जाता है, विभिन्न मात्रा अनुपात का उपयोग किया जाता है, और नैनोकणों की सतह पर कोपॉलिमर के बीच बातचीत के कारण बहु-चोटियों का अभी भी अस्तित्व में है। इस प्रकार, TEM छवियों नैनोकणों की आकृति विज्ञान की पुष्टि करने के लिए उपयोग किया जाता है। पी-जी-PEG@AuNPs, डॉक्स-जी-पी-जी-PEG@AuNPs, और AS1411-g-DOX-पी-जी-PEG@AuNPs की टेम छवियां चित्र 6में दिखाई गई हैं ।

सोने के नैनोकणों की सतहों के विभिन्न घटकों के आधार पर, नैनोकणों के बीच दूरी बदलती है। इसके अलावा, पानी में फैले तैयार नैनोकणों जीटा संभावित परीक्षणों के अनुसार स्थिर हैं (-29 से 50 एमवी समय परीक्षणों के बाद विभिन्न नैनोकणों के लिए)। DOX और AS1411 (प्रोटोकॉल के वर्ग 4 और 5) का आगे कार्यात्मककरण सोने के नैनोकणों के व्यास को प्रभावित नहीं करता है। यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि यूवी-विस सभी परीक्षण विधियों का उपयोग किए बिना नैनोकणों पर लोड किए गए DOX और AS1411 की पुष्टि करने के लिए एक प्रभावी तरीका है।

कैंसर कोशिकाओं पर लक्षित संपत्ति A549 कोशिकाओं का उपयोग कर तैयार AS1411 और DOX भरी हुई AuNPs के विभिंन सांद्रता के साथ सुसंस्कृत और नियंत्रण समूह के रूप में नैनोकणों को जोड़ने के बिना जांच की गई थी । इसके साथ ही A549 सेल फिजिबिलिटी पर फ्री डीओएक्स के इफेक्ट्स(चित्रा 7 और फिगर 8) काभी परीक्षण किया गया । नैनोकणों को जोड़ने के बिना समूह की तुलना में, तैयार AS1411-जी-DOX-पी-जी-PEG@AuNPs A549 कोशिकाओं में कमी का कारण बनती है । हालांकि, जबकि नैनोकणों की एकाग्रता (१०० μg/mL) में कमी आती है, कोशिकाएं मुफ्त DOX समूह की तुलना में 24 घंटे में बेहतर गतिविधि दिखाती हैं । इसका मुख्य कारण यह है कि पी-जी-खूंटी कोपॉलिमर में उत्कृष्ट साइटोकम्पेबिलिटी37 है और शाखाओं में बंटी पी पॉलीमर की गैर-विशिष्ट विषाक्तता को सुधारा जाता है।

अंत में, इप्टामर AS1411 की लक्षित संपत्ति के कारण, प्राप्त नैनोकणों को स्वस्थ कोशिकाओं के बजाय कैंसर कोशिकाओं में जमा किया जाता है। एक बार इप्टामर मान्यता प्राप्त है, DOX कैंसर की कोशिकाओं को मारने के लिए जारी किया जाता है। पीबीएस में AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs से DOX की रिलीज प्रोफाइल(चित्रा 9)दर्ज की गई थी । यह प्रोटोकॉल एक बहु-कदम अमे वाली प्रतिक्रिया के माध्यम से कोपॉलिमर संशोधित AuNPs पर एप्टामर और DOX ग्राफ्ट तैयार करने के लिए एक दृष्टिकोण को दर्शाता है। संश्लेषित नैनोकणों में कैंसर थेरेपी अनुप्रयोगों की क्षमता होती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (31700840) द्वारा वित्त पोषित किया गया था; हेलन प्रांत की प्रमुख वैज्ञानिक अनुसंधान परियोजना (18B430013, 18A150049)। इस शोध को जायनू के युवा विद्वानों के लिए नन्हू स्कॉलर्स प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक अपने सहायक कार्यों के लिए XYNU में लाइफ साइंसेज के कॉलेज से स्नातक छात्र Zebo Qu शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । लेखक अपने उपकरणों के उपयोग के लिए XYNU के विश्लेषण और परीक्षण केंद्र को स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Dimethylaminopyridine Macklin D807273
A549 cell ATCC CCL-185TM
AS1411 BBI Life Sciences Corporation 5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411 (fluorophore-labeled AS1411)
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Cell counting kit-8 (CCK-8) Sigma Aldrich 96992-500TESTS-F
Dichloromethane Traditional Chinese medicine 80047318
Diethyl ether (Et2O) SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd
Dimethyl sulfoxide Macklin D806645
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) Sigma Aldrich
Doxorubicin hydrochloride Rhawn R017518
Ether absolute Traditional Chinese medicine 80059618
Field Emission Transmission Electron Microscope FEI Company Tecnai G2 F 20
Gold(III) chloride trihydrate Rhawn R016035
Laser Particle-size Instrument Malvern Instruments Ltd ZetasizerNanoZS/Masterszer3000E
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride Macklin N808856
N-Hydroxysuccinimide Macklin H6231
NMR software Delta 5.2.1
Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer JEOL JNM-ECZ600R/S3
Origin 8.5 OriginLab
Penicillin Sigma Aldrich V900929-100ML
Phosphate-buffered saline Sigma Aldrich P4417-100TAB
Poly(ethylene glycol) Sigma Aldrich 81188 BioUltra, average Mn ~ 1000
Poly (ethyleneimine) solution Sigma Aldrich 482595 average Mn ~ 1200, 50 wt.% in H2O
Sodium borohydride, powder Acros C18930
Streptomycin Sigma Aldrich 85886-10ML
Succinic anhydride Traditional Chinese medicine 30171826
Tetrahydrofuran Traditional Chinese medicine 40058161
Triethylamine Traditional Chinese medicine 80134318
UV/VIS/NIR Spectrometer Lambda950 Lambda950
X-ray Photoelectron Spectrometer Thermo Fisher Scientific K-ALPHA 0.5EV

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References

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