Summary
Presentert her er en sensitiv fluorescensanalyse for å overvåke apolipoprotein N-acyltransferaseaktivitet ved bruk av diacylglycerylpeptid og alkyn-fosfolipider som substrater med klikkkjemi.
Abstract
Lipoproteiner fra proteobakterier er posttranslasjonelt modifisert av fettsyrer avledet fra membranfosfolipider ved virkningen av tre integrerte membranenzymer, noe som resulterer i triacylerte proteiner. Det første trinnet i lipoproteinmodifiseringsveien innebærer overføring av en diacylglycerylgruppe fra fosfatidylglyserol til prolipoproteinet, noe som resulterer i diacylglyceryl prolipoprotein. I det andre trinnet spaltes signalpeptidet til prolipoprotein, og danner et apolipoprotein, som igjen modifiseres av en tredje fettsyre avledet fra et fosfolipid. Dette siste trinnet katalyseres av apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Lipoproteinmodifiseringsveien er viktig i de fleste γ-proteobakterier, noe som gjør det til et potensielt mål for utvikling av nye antibakterielle midler. Beskrevet her er en sensitiv analyse for Lnt som er kompatibel med høy gjennomstrømningsscreening av små hemmende molekyler. Enzymet og substratene er membran-innebygde molekyler; Derfor er utviklingen av en in vitro-test ikke enkel. Dette inkluderer rensing av det aktive enzymet i nærvær av vaskemiddel, tilgjengeligheten av alkyn-fosfolipider og diacylglycerylpeptidsubstrater, og reaksjonsbetingelsene i blandede miceller. Videre, for å kunne bruke aktivitetstesten i et oppsett med høy gjennomstrømningsscreening (HTS), foretrekkes direkte avlesning av reaksjonsproduktet fremfor koblede enzymatiske reaksjoner. I denne fluorometriske enzymanalysen blir det alkyntriacylerte peptidproduktet gjort fluorescerende gjennom en klikkkjemireaksjon og detektert i et multiwell plateformat. Denne metoden gjelder for andre acyltransferaser som bruker fettsyreholdige substrater, inkludert fosfolipider og acyl-CoA.
Introduction
Bakterielle lipoproteiner er preget av kovalent bundne fettsyrer ved deres amino-termini gjennom hvilke de er forankret i membraner 1,2. Den modne delen av proteinet er svært variert i struktur og funksjon, og forklarer dermed lipoproteinets rolle i forskjellige biologiske prosesser i bakteriecellehylsteret.
Lipoproteiner modifiseres av fosfolipidavledede fettsyrer etter innføring i cytoplasmisk membran. Prolipoproteinene inneholder et signaturmotiv, lipoboksen, som inneholder en invariant cysteinrest som blir acylert og den første aminosyren i det modne proteinet. Det første trinnet i denne banen katalyseres av prolipoprotein fosfatidylglycerol: :d iacylglyceryltransferase (Lgt), som overfører diacylglycerylgruppen fra fosfatidylglyserol til prolipoproteinet via en tioeterforbindelse mellom diacylglyceryl og cystein. Signalpeptidase II (Lsp) spalter signalpeptidet fra diacylglyceryl prolipoprotein, noe som resulterer i et apolipoprotein som er forankret i membranen gjennom sin diacylglyceryl-del. Det tredje og siste trinnet katalyseres av apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt), som tilfører en fettsyre fra sn-1-posisjonen av fosfolipid til apolipoprotein, noe som resulterer i triacylert modent lipoprotein (figur 1)3. Lnt-reaksjonen er en to-trinns ping-pong-reaksjon hvor et stabilt tioester acylenzym-mellomprodukt dannes. Lysofosfolipidbiproduktet frigjøres før acylering av apolipoproteinsubstratet i det andre trinnet av reaksjonen.
Fosfolipidsubstratets spesifisitet bestemmes i en Llt-analyse basert på mobilitetsskiftet av N-acyl diacylglycerylpeptid på en høy prosentandel Tris-Tricine Urea SDS-SIDE4. Fosfolipider med små polare hodegrupper, mettede [sn-1] og ikke-mettede [sn-2], var foretrukne substrater4. Gelskiftanalysen er ikke egnet for omfattende kinetiske studier av apolipoprotein N-acyltransferase eller for HTS for å identifisere hemmende molekyler. Klikkkjemi ved bruk av alkynfettsyrer har blitt brukt til å studere lipoproteinmodifisering i bakterier5 og fettsyremetabolisme i eukaryoter6. Nylig ble det rapportert en in vitro-analyse av Ras palmitoylation for å identifisere inhibitorer7.
I metoden beskrevet her inkuberes renset aktiv Lnt i vaskemiddel med substrater i blandede miceller for å danne alkyntriacylert peptid som senere detekteres ved fluorescensspektrometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Enzym- og substratpreparasjon
- Rensing av enzym
- Produser og rens Lnt-enzymet fra vaskemiddelløselige membraner som beskrevet tidligere 4,8. Kort sagt, indusere ekspresjon av lnt-strep genet, koding Lnt med en C-terminal Strep tag, ved OD 600 av 0,6 med vannfri tetracyklin (200 ng / ml) ved 37 ° C for 16 timer.
- Høst celler ved sentrifugering ved 4000 x g i 10 minutter og kast supernatanten.
- Resuspend cellepelleten i buffer WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) til 100 OD600 enheter per ml.
- Bryt cellene med to passasjer gjennom en fransk trykkcellepresse ved 10.000 psi.
- Fjern ubrutte celler og rusk ved sentrifugering ved 13 000 x g i 20 minutter. Hold supernatanten og kast pelleten.
- Sentrifuge supernatanten ved 120 000 x g i 60 minutter og samle membranblærene (gjennomsiktig brunfarget pellet). Kast supernatanten.
- Løselig de integrerte membranproteinene fra membranpelleten med 1% (w / v) n-Dodecyl β-D-maltosid (DDM) i buffer WA i 30 minutter ved romtemperatur (RT). Sentrifuge og fjern uoppløselig materiale ved 120 000 x g i 30 minutter. Bruk supernatantfraksjonen til rensing.
- Rens Lnt-strep på en affinitetskromatografikolonne (se materialtabell) og en S400 gelfiltreringskolonne (se materialtabell) som beskrevet av Nozeret et al.8.
- Oppbevar det rensede enzymet i buffer WA inneholdende 0,05 % DDM og 10 % glyserol ved -80 °C.
MERK: Enzymet er stabilt i over 5 år.
- Fremstilling av alkyn-fosfolipid og biotinylerte fibroblaststimulerende ligand (FSL-1-biotin) substrater
- Aliquot 100 μL av spesialsyntetisert alkyn-POPE (1-heksadec-15-ynoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin, se tabell over materialer) oppløselig i kloroform i 1,5 ml rør.
- Pierce rørene med en sprøyte og fordamp kloroformen i en hastighetsventil ved RT i 2 timer. Oppbevar de tørre fosfolipidprøvene ved -20 °C.
- Oppløs alkyn-POPE i 0,1% Triton X-100 ved 500 μM før bruk. Legg til et 3 min sonikeringstrinn i et ultralydvannbad ved RT for å oppløse alkyn-POPE om nødvendig.
- Resuspend FSL-1-biotin i vann ved 445 μM.
MERK: Begge oppløsningene kan oppbevares ved -20 °C i minst 2 måneder.
2. Tube analyse
MERK: På dag 1, sett opp Lnt-reaksjonen i 1,5 ml rør (trinn 2.1) og belegg 96 brønnplater med streptavidin (trinn 2.2).
- Fremstilling av reagensblanding og enzymatisk reaksjon
- For en standard Lnt-analyse blandes alkyn-POPE (final 50 μM fra 500 μM stock) og FSL-1-biotin (endelig konsentrasjon på 50 μM fra en 445 μM bestand) i Lnt reaksjonsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 som inneholder 1% BSA) ved et endelig volum på 18 μL i 1,5 ml rør. Utfør alle forhold i tre eksemplarer.
- Sonikere substratblandingen (fremstilt i trinn 2.1.1) i 3 minutter i et ultralydvannbad og inkubere ved 37 ° C i 5 minutter før tilsetning av Lnt-enzym (trinn 2.1.3).
MERK: MTSES (natrium (2-sulfonatoetyl)methanethiosulfonat), et tiolspesifikt reagens, hemmer Lnt8. Tilsett 10 mM MTSES (100 mM stamløsning i 100 % DMSO) i reaksjonsrørene (trinn 2.1.1) som skal brukes som negative kontrollprøver. Juster volumet på Lnt-reaksjonsbufferen slik at totalvolumet er 18 μL. - Tilsett aktiv (1 ng/μL, tilsvarende 17,2 nM) eller inaktiv Lnt (C387S) (2 μL med 10 ng/μL lager i buffer WA som inneholder 0,05 % DDM) og bland med substratene (trinn 2.1.2) ved å pipettere opp og ned.
- Inkuber reaksjonen ved 37 °C i 16 timer i en termomikser med oppvarmet lokk.
- Streptavidin belegg av 96 brønnplater
- Klargjør en stamløsning av streptavidin ved 2 mg/ml i H2O.
MERK: Denne oppløsningen kan oppbevares ved -20 °C i opptil 6 måneder. - Fra stamløsningen fremstilles 10 μg / ml streptavidin i vann som en arbeidsløsning. Tilsett 100 μL av løsningen til hver brønn på 96-brønnplaten. Bind streptavidin til platen ved å ruge ved 37 °C over natten uten lokk for å lufttørke brønnene.
- Klargjør en stamløsning av streptavidin ved 2 mg/ml i H2O.
MERK: På dag 2 utføre klikk-kjemi (trinn 2.3), binde Lnt reaksjonsblanding til streptavidin-belagte plater (trinn 2.4), og oppdage fluorescens og analysere resultater (trinn 2.5).
- Klikk-kjemi reaksjon
- Forbered stamløsninger av Azido-FAM (5 mM i DMSO), TCEP (Tris (2-karboksyetyl)fosfinhydroklorid; 50 mM tilberedt i vann), TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metyl]amin; 2 mM i tert-butanol:DMSO (4:1)), og CuSO4∙5H 2 O (50 mM tilberedt i H2O).
- I 1,5 ml rørene som inneholder Lnt-reaksjonsblandingen fremstilt i trinn 2.1.4, utfør klikkkjemi ved å tilsette reagensene i følgende rekkefølge: 0,2 μL lager Azido-FAM (sluttkonsentrasjon 50 μM), 0,4 μL av lager TCEP (endelig konsentrasjon 1 mM), 0,2 μL av lager TBTA (endelig konsentrasjon 0,02 mM).
- Vortex løsningen for 5 s. Tilsett deretter 0,4 μL CuSO4 (endelig konsentrasjon 1 mM). Vortex igjen i 5 s. Inkuber prøvene i mørket ved RT i 1 time.
- Binding av Lnt-reaksjonsblanding til streptavidinbelagte plater
- Vask brønnene på de streptavidinbelagte platene etter inkubasjonen over natten fra trinn 2.2.2 3x med 200 μL PBS-T1 (PBS som inneholder 0,05% Tween-20).
MERK: Streptavidinplater kan brukes umiddelbart eller oppbevares tørt ved 4 °C. - Overfør 18 μL fra klikkkjemiblandingen fra trinn 2.3.3 til en brønn i en 96 godt streptavidinbelagt plate og tilsett 100 μL PBS-T1 for å binde N-acyl-FSL-1-biotin-FAM-produkt til streptavidinplater.
- Bruk biotin-fluorescein (0,26 μM fra en 3,1 mM bestand i DMSO) som positiv kontroll for streptavidinbinding og fluorescensavlesning.
- Inkuber platene ved RT i 1 time i mørket i en termomikser, rist ved 300 o / min.
- Utfør manuelle vasketrinn på de 96 brønnplatene med en flerkanals elektronisk pipette som følger: seks vasker med 200 μL PBS-T2 (PBS som inneholder 1% Tween-20), tre spyler med pipette, tre vasker med 200 μL PBS, tre spyler med en pipette.
- Vask brønnene på de streptavidinbelagte platene etter inkubasjonen over natten fra trinn 2.2.2 3x med 200 μL PBS-T1 (PBS som inneholder 0,05% Tween-20).
- Fluorescensdeteksjon og analyse
- Tilsett 200 μL PBS og registrer fluorescensen ved 520 nm i en fluorescensmikroplateleser. Lagre resultater i regnearkprogramvare.
MERK: Biotin-fluorescein brukes som en positiv kontroll for streptavidinbinding og fluorescensdeteksjon ved 520 nm. Det forventes en reproduserbar avlesning på 30 000–40 000 AE med 0,26 μM biotinfluorescein. Alle prøver analyseres i tre eksemplarer, inkludert kontroller. - Beregn standardavviket for hver reaksjon og beregne P-verdier for negative kontroller og positive prøver ved hjelp av uparret t-test ved hjelp av statistisk programvare.
- Tilsett 200 μL PBS og registrer fluorescensen ved 520 nm i en fluorescensmikroplateleser. Lagre resultater i regnearkprogramvare.
3. Multiwell plate analyse
MERK: På dag 1 satte opp Lnt-reaksjonen i 384 brønnplater (trinn 3.1) og belegg 384 brønnplater med streptavidin (trinn 3.2).
- Fremstilling av reagensblanding og enzymatisk reaksjon
MERK: Mengden av reagensene og enzymet reduseres sammenlignet med røranalysen, og Lnt-reaksjonen utføres direkte i 384 brønnplater. Dette tillater bruk av mindre materiale og en reduksjon av trinn som kan automatiseres ytterligere.- Bland substratene som følger: alkyn-POPE (sluttkonsentrasjon 50 μM fra 500 μM lager) og FSL-1-biotin (endelig 50 μM fra 500 μM lager) i Lnt reaksjonsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 som inneholder 1% BSA) ved et volum på 13,5 μL per reaksjon per brønn i et 384 brønnplateformat. Utfør alle forhold i tre eksemplarer. Beregn den totale mengden reagenser som kreves for antall reaksjoner som skal utføres (dvs. 5,184 μL for en 384 brønnplate).
- Sonikere substratblandingen i 3 minutter i et ultralyd vannbad.
- Aliquot 13,5 μL av substratblandingen per brønn i en 384 brønnplate.
MERK: Som en negativ kontroll kan 10 mM MTSES (625 mM lagerløsning i 100% DMSO) legges til per brønn. Juster volumet av Lnt-bufferen (trinn 3.1.1) for å nå et endelig reaksjonsvolum på 13,5 μL. - Inkuber ved 37 °C i 5 minutter før tilsetning av Llt-enzym (trinn 3.1.5).
- Tilsett 0,5 ng/μL (tilsvarende 8,6 nM) aktivt Lnt-enzym, eller inaktiv variant (C387S) (1,5 μL fra 5 ng/μL-lager i buffer-WA som inneholder 0,05 % DDM) i Lnt-reaksjonsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 % BSA) til hver brønn som inneholder reaksjonsblandingen fra trinn 3.1.3. Bland reagenser ved pipettering opp og ned. Det totale reaksjonsvolumet er 15 μL.
- Forsegl platen med plastfolie for flerbrønnsplater.
- Inkuber ved 37 °C i 16 timer i en termomikser med oppvarmet lokk.
- Streptavidin belegg 384 brønnplater
- Bruk 75 μL streptavidin (10 μg/ml i H 2 O) fra trinn 2.2.2 til å belegge brønner på en 384 brønnplate. La streptavidin binde seg til platen ved å ruge ved 37 °C over natten uten lokk for å lufttørke brønnene.
MERK: På dag 2 utføre klikk-kjemi (trinn 3.3), binde Lnt reaksjonsblanding til streptavidin-belagte plater (trinn 3.4), oppdage fluorescens, og analysere resultater (trinn 3.5).
- Klikk-kjemi reaksjon
- Forbered stamløsninger av Azido-FAM (1,2 mM i DMSO), TCEP (tris(2-karboksyetyl)fosfinhydroklorid; 24 mM fremstilt i H 2 O), TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metyl]amin; 0,48 mM i tert-butanol:DMSO (4:1)) og CuSO4∙5H 2 O (24 mM tilberedt i H2O).
- Kombiner de tre klikkkjemireagensene: en blanding av Azido-FAM (sluttkonsentrasjon 50 μM), TCEP (1 mM endelig) og TBTA (0,02 mM endelig), hver ved 0,75 μL i sluttvolum på 2,25 μL per brønn. Beregn ønsket volum per 384 brønnplate (dvs. bruk 864 μL når alle brønnene på 384-brønnplaten brukes). Bland kraftig.
- Tilsett 2,25 μL av reagensløsningen per brønn direkte til den ferdige Lnt-reaksjonen i 384-brønnplaten fra trinn 3.1.7.
- Bland ved pipettering opp og ned med en flerkanals elektronisk pipette.
- Tilsett CuSO4 (0,75 μL fra 24 mM lager for en sluttkonsentrasjon på 1 mM) og bland ved pipettering opp og ned med en flerkanals elektronisk pipette.
- Inkuber ved RT i 1 time i mørket.
- Binding av Lnt-reaksjonsblanding til streptavidinbelagte 384 brønnplater
- Vask brønnene på de streptavidinbelagte platene etter inkubasjonen over natten fra trinn 3.2.1 1x med 85 μL PBS-T1.
- Overfør 11 μL av klikkkjemireaksjonen fra hver brønn i inkubasjonsplaten fra trinn 3.3.6 til streptavidinbelagt plate fra trinn 3.4.1 for å binde N-acyl-FSL-1-biotin-FAM-produktet til streptavidinplatene.
- Tilsett 64 μL buffer PBS-T1.
- Inkluder biotin-fluorescein (0,19 μM fra en 3,1 mM bestand i DMSO) som en kontroll for binding til streptavidinbelagte brønner.
- Inkuber de 384 brønnplatene ved RT i 1 time i mørket i en termomikser, rist ved 300 o / min.
- Vask platene med en automatisert platevaskemaskin som følger: 10 vasker med 85 μL PBS-T2, plater ristes mellom vaskene; 5 vasker med 85 μL PBS, plater ristes mellom vaskene.
- Fluorescensdeteksjon og analyse
- Legg til PBS (85 μL) og registrer fluorescens i en fluorescensmikroplateleser ved 535 nm.
- Analyser data som beskrevet (trinn 2.5.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I Lnt-reaksjonen overføres sn-1-fettsyren fra fosfolipider til et diacylglycerylpeptid, noe som resulterer i modent triacylert peptid8. In vitro Lnt-analysen beskrevet her er designet for å bruke fosfolipider som inneholder en alkynfettsyre (alkyn-POPE) og FSL-1-biotin som substrater, noe som resulterer i dannelsen av alkyn-FSL-1-biotin. Ved en klikkkjemireaksjon med azido-FAM skal dette produktet bli fluorescerende merket og detektert ved fluorescensspektrometri (figur 2).
Reaksjonsforholdene ble optimalisert for maksimal fluorescensavlesning ved 520 nm i en plateleser. Ved 1 ng/μL-enzymble det observert fullstendig omdanning av FSL-1-biotin 8 (figur 3). Negative kontroller inkluderte reaksjoner uten enzym, med en inaktiv variant av enzymet (active site mutant C387S), eller med tiolspesifikk inhibitor MTSES som resulterer i lav fluorescensdeteksjon. Biotin-fluorescein bundet effektivt til streptavidinbelagte plater og ble brukt som en intern kontroll for maksimalt fluorescenssignal. Alle eksperimenter ble utført i tre eksemplarer og standardavviksberegninger og statistisk analyse viste at analysen var sensitiv og reproduserbar.
For å utvikle en HTS-analyse for å skjerme for små molekylhemmere av Lnt, ble mengden reagenser redusert, og reaksjonene ble utført direkte i 384 brønnplater. Videre ble vasketrinnene automatisert ved hjelp av en platevasker (se Materialtabell). Når det gjelder røranalysen, var reaksjonen sensitiv og reproduserbar, med signifikant forskjell mellom negativ kontroll (C387S) og aktivt enzym (Lnt) (figur 4). I HTS avgjør Z-faktoren om en respons i en analyse er stor nok til screeningformål9 og beregnes ved hjelp av følgende ligning:
Der S er gjennomsnittssignalet, B er bakgrunnssignal, og σ er standardavvik.
Den gjennomsnittlige Z-faktoren var >0,6 for Lnt-analysen utført i HTS-format ved bruk av 384 brønnplater, noe som tyder på at analysen for screening av små molekyler for Llt-hemming var enestående.
Figur 1: Enzymatiske reaksjoner ved posttranslasjonell modifisering av lipoprotein i proteobakterier. De sekvensielle trinnene ble katalysert av Lgt 10, Lsp11 og Lnt12,13,14 i cytoplasmisk membran. PGN: peptidoglykan, SP: signalpeptid, LB: lipoboks, konservert motiv som inneholder Cys+1 og modifisert med fettsyrer og den første aminosyren i modent lipoprotein, PG: fosfatidylglycerol, G-1-P: glyserol-1-fosfat, PE: fosfatidyletanolamin, lysoPE: lyso- fosfatidyletanolamin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk av den fluorometriske enzymanalysen for apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Substratene FSL-1-biotin (gul) og alkyn-POPE (blå) ble blandet med renset Llt-enzym oppløselig i vaskemiddel. Reaksjonen ble utført i blandede miceller ved 37 °C (trinn 1). Alkyn-FSL-1-biotinproduktet ble merket med fluorescein (oransje) ved klikkkjemi (trinn 2) og detektert i en fluorescensplateleser ved binding til streptavidinbelagte plater (trinn 3). Figuren er en modifisert versjon av figur 1B publisert av Nozeret et al.8 i henhold til Creative Commons-lisensen (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fluorescensdeteksjon av Llt-aktivitet i 96 brønnformat. Lnt-reaksjoner ble utført i rør ved 37 °C i 16 timer. Etter fluorescerende merking ved klikkkjemi og binding til streptavidinbelagte plater, ble fluorescens målt ved fluorescensspektrometri. Biotin-fluorescein (biotin-fluo 0,26 μM) ble brukt som kontroll for fluorescens. Buffer var kun reaksjonsbuffer. Prøver som indikerer alkyn-POPE (50 μM), FSL-1-biotin (50 μM) og substrater (blanding av alkyn-POPE og FSL-1-biotin, 50 μM hver) inneholdt ikke enzym. Negative kontroller inkluderte hemming med MTSES (10 mM) og en inaktiv variant av Lnt (C387S). Lnt-enzymet ble tilsatt ved 1 ng/μL. Standardavvik ble beregnet for n = 3 eksperimenter. ** P-verdi < 0,005. Eksitasjon ved 494 nm, båndbredde 5 nm og utslipp ved 520 nm, båndbredde 5 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fluorescensavlesning av Lnt-reaksjonen i 384 brønnplate kompatibel med HTS. Enzymatiske Lnt-reaksjoner ble utført i 384 brønnplater ved 37 °C. Biotin-fluorescein (biotin-fluo 0,19 μM) ble brukt som kontroll for fluorescens. Buffer var reaksjonsbuffer som inneholdt DMSO. Negative kontroller inkluderte hemming med MTSES (10 mM) og en inaktiv variant av Lnt (C387S). Lnt-enzym ble tilsatt ved 0,5 ng/μL. Standardavvik ble beregnet for n = 3 forsøk. P-verdi < 0,0005. Eksitasjon ved 485 nm, båndbredde 20 nm og utslipp ved 535 nm, båndbredde 25 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen for Lnt-analysen beskrevet her, basert på fluorescensdeteksjon av det triacylerte produktet, er følsom og reproduserbar. Den spesifikke og effektive bindingen av biotin til streptavidin er et sentralt element i analysen. Alkyne-POPE-substrat igjen etter fullføring av Lnt-reaksjonen er også fluorescerende merket med FAM, men fjernes effektivt etter binding på streptavidinplatene ved flere vasketrinn. Videre påvirker tillegg av DMSO ikke LNT-aktiviteten og har ingen innvirkning på analysen. Både substrat og enzym er svært lipofile og krever reaksjonsbetingelser i blandede miceller. Teknikker som er avhengige av løselige enzymer og substrater for produktdeteksjon, inkludert fluorescenspolarisering, er ikke anvendelige8. Den eneste begrensningen av analysen er enzymets kompatibilitet med alkynsubstrat, fordi klikkkjemireaksjonen er avhengig av denne kjemiske gruppen.
Gelskiftanalyser har blitt rapportert i tidligere studier for å analysere Lnt-aktivitet og for å bestemme substratspesifisitet4. Med den nåværende protokollen, og parallelt med fluorescensspektrometri, kan in-gel fluorescensdeteksjon brukes til å overvåke Lnt-aktivitet8, selv om dette formatet ikke er egnet for HTS. Røranalysen er spesielt interessant for kinetiske og komparative studier av Lnt-mutanter. Fosfolipidsubstratspesifisitet kan behandles ved bruk av alkyn-fosfolipider oppnådd ved metabolsk merking av bakterier med alkynfettsyrer sammensatt av forskjellige kjedelengder og metningsgrad som beskrevet8.
384-brønnplateformatet er kompatibelt med HTS-studier fordi det observeres en signifikant forskjell mellom aktivt enzym og bare en substratkontroll. En gjennomsnittlig Z-faktor på >0,6 ble beregnet med de optimaliserte forholdene som presenteres her. Den høye reproduserbarheten av analysen bidrar til den høye Z 'faktoren. For vellykket HTSanbefales en Z-faktor over 0,6 9. Vasketrinn er effektive ved bruk av en automatisert platevaskemaskin. Andre trinn kan optimaliseres ytterligere, inkludert pipettering av reagenser, noe som vil tillate screening av store biblioteker av små molekyler.
Protokollen gjelder for andre acyltransferaser som bruker fettsyreholdige substrater hvis alkyngrupper er kompatible med substratgjenkjenning av enzymet. En nylig studie om identifisering av spesifikke hemmere av eukaryotisk palmitoylacyltransferase (PAT) beskriver bruk av membranbundet enzym og alkyn-acyl-CoA som substrat7. Palmitoylering av et lite biotinylert Ras-peptid ble observert ved klikkkjemi fluorogen deteksjon. En pilotskjerm i 384 brønnplateformat av denne analysen identifiserte spesifikke hemmere av PAT, noe som tyder på at substrater sammensatt av alkynfettsyregruppe kombinert med klikkkjemi og sensitiv fluorescensdeteksjon er en lovende metode for målbasert HTS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Fabrice Agou og Alix Boucharlat fra Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) ved Institut Pasteur Paris for nyttige forslag til protokollen, alle medlemmer av BGPB Unit for støtte og vitenskapelige diskusjoner, og Simon Legood for kritisk lesing av manuskriptet. Arbeidet ble finansiert av Global Care Initiatives fra Institute Carnot Infectious diseases og Institute Carnot Microbes and Health (15 CARN 0017-01 og 16 CARN 0023-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
| alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
| Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
| BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
| BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
| biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
| DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
| Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
| French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
| FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
| Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
| Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
| Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
| Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
| StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
| streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
| TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
| TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
| TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
| Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |
References
- Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L.
- Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
- Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
- Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
- Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
- Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
- Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
- Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
- Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
- Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
- Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).
