Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Klickkemibaserad fluorometrisk analys för apolipoprotein N-acyltransferas från enzymkarakterisering till screening med hög genomströmning

Published: May 13, 2020 doi: 10.3791/61146
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France

Summary

Här presenteras en känslig fluorescensanalys för att övervaka apolipoprotein N-acyltransferasaktivitet med diacylglycerylpeptid och alkyn-fosfolipider som substrat med klickkemi.

Abstract

Lipoproteiner från proteobakterier modifieras posttranslationellt av fettsyror härledda från membranfosfolipider genom verkan av tre integrerade membranenzymer, vilket resulterar i triacylerade proteiner. Det första steget i lipoproteinmodifieringsvägen involverar överföring av en diacylglycerylgrupp från fosfatidylglycerol till prolipoproteinet, vilket resulterar i diacylglycerylprolipoprotein. I det andra steget klyvs signalpeptiden av prolipoprotein och bildar ett apolipoprotein, vilket i sin tur modifieras av en tredje fettsyra härledd från en fosfolipid. Detta sista steg katalyseras av apolipoprotein N-acyltransferas (Lnt). Lipoproteinmodifieringsvägen är avgörande i de flesta γ-proteobakterier, vilket gör den till ett potentiellt mål för utveckling av nya antibakteriella medel. Här beskrivs en känslig analys för Lnt som är kompatibel med screening med hög genomströmning av små hämmande molekyler. Enzymet och substraten är membraninbäddade molekyler; Därför är det inte helt enkelt att utveckla ett in vitro-test. Detta inkluderar rening av det aktiva enzymet i närvaro av tvättmedel, tillgängligheten av alkyn-fosfolipider och diacylglycerylpeptidsubstrat och reaktionsbetingelserna i blandade miceller . För att kunna använda aktivitetstestet i en HTS-inställning (high-throughput screening) föredras dessutom direkt avläsning av reaktionsprodukten framför kopplade enzymatiska reaktioner. I denna fluorometriska enzymanalys görs den alkyn-triacylerade peptidprodukten fluorescerande genom en klickkemireaktion och detekteras i ett multiwell-plattformat. Denna metod är tillämplig på andra acyltransferaser som använder fettsyrainnehållande substrat, inklusive fosfolipider och acyl-CoA.

Introduction

Bakteriella lipoproteiner kännetecknas av kovalent bundna fettsyror vid deras aminoterminer genom vilka de förankras i membran 1,2. Den mogna delen av proteinet är mycket varierande i struktur och funktion, vilket förklarar lipoproteinernas roll i olika biologiska processer i bakteriecellhöljet.

Lipoproteiner modifieras av fosfolipid-härledda fettsyror efter införande i det cytoplasmatiska membranet. Prolipoproteinerna innehåller ett signaturmotiv, lipoboxen, som innehåller en invariant cysteinrest som acyleras och den första aminosyran i det mogna proteinet. Det första steget i denna väg katalyseras av prolipoproteinfosfatidylglycerol::d iacylglyceryltransferas (Lgt), som överför diacylglycerylgruppen från fosfatidylglycerol till prolipoproteinet via en tioeterlänk mellan diacylglyceryl och cystein. Signalpeptidas II (Lsp) klyver signalpeptiden från diacylglycerylprolipoprotein, vilket resulterar i ett apolipoprotein som förankras i membranet genom dess diacylglyceryldel. Det tredje och sista steget katalyseras av apolipoprotein N-acyltransferas (Lnt), som tillför en fettsyra från sn-1-positionen av fosfolipid till apolipoprotein, vilket resulterar i triacylerat moget lipoprotein (figur 1)3. Lnt-reaktionen är en tvåstegs pingisreaktion där en stabil tioesteracylenzym mellanprodukt bildas. Lysofosfolipidbiprodukten frisätts före acylationen av apolipoproteinsubstratet i reaktionens andra steg.

Fosfolipidsubstratspecificiteten bestäms i en Lnt-analys baserat på rörlighetsförskjutningen av N-acyl diacylglycerylpeptid på en hög procentandel Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. Fosfolipider med små polära huvudgrupper, mättade [sn-1] och omättade [sn-2], var föredragna substrat 4. Gelskiftanalysen är inte lämplig för omfattande kinetiska studier av apolipoprotein N-acyltransferas eller för HTS för att identifiera hämmande molekyler. Klickkemi med alkynfettsyror har framgångsrikt använts för att studera lipoproteinmodifiering i bakterier5 och fettsyrametabolism i eukaryoter6. Nyligen rapporterades en in vitro-analys av Ras palmitoylation för att identifiera hämmare7.

I den metod som beskrivs här inkuberas renat aktivt Lnt i tvättmedel med substrat i blandade miceller för att bilda alkyn-triacylerad peptid som därefter detekteras genom fluorescensspektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Enzym- och substratberedning

  1. Rening av enzym
    1. Producera och rena Lnt-enzym från tvättmedelslösliga membran enligt beskrivningen tidigare 4,8. Kortfattat, inducera uttryck av lnt-strep-genen, som kodar för Lnt med en C-terminal Strep-tagg, vid OD 600 av 0,6 med vattenfri tetracyklin (200 ng / ml) vid 37 ° C i 16 timmar.
    2. Skörda celler genom centrifugering vid 4 000 x g i 10 minuter och kassera supernatanten.
    3. Återsuspendera cellpelleten i buffert WA (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) till 100 OD600 enheter per ml.
    4. Bryt cellerna med två passager genom en fransk tryckcellspress vid 10 000 psi.
    5. Ta bort obrutna celler och skräp genom centrifugering vid 13 000 x g i 20 minuter. Behåll supernatanten och kassera pelleten.
    6. Centrifugera supernatanten vid 120 000 x g i 60 min och samla membranblåsorna (genomskinlig brunfärgad pellet). Kassera supernatanten.
    7. Lösgör de integrerade membranproteinerna från membranpelleten med 1% (w / v) n-Dodecyl β-D-maltosid (DDM) i buffert WA i 30 min vid rumstemperatur (RT). Centrifugera och avlägsna osolubiliserat material vid 120 000 x g i 30 minuter. Använd supernatantfraktionen för rening.
    8. Rena Lnt-strep på en affinitetskromatografikolonn (se materialförteckning) och en S400-gelfiltreringskolonn (se materialförteckning) enligt beskrivningen av Nozeret et al.8.
    9. Förvara det renade enzymet i buffert WA innehållande 0,05% DDM och 10% glycerol vid -80 °C.
      OBS: Enzymet är stabilt i över 5 år.
  2. Framställning av alkyn-fosfolipid och biotinylerade fibroblaststimulerande ligandsubstrat (FSL-1-biotin)
    1. Alikvot 100 μL specialsyntetiserad alkyn-POPE (1-hexadec-15-ynoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin, se materialtabell) solubiliserad i kloroform till 1,5 ml rör.
    2. Pierce rören med en spruta och förånga kloroformen i en hastighets-vac vid RT i 2 timmar. Förvara de torra fosfolipidproverna vid -20 °C.
    3. Lös upp alkyn-POPE i 0,1% Triton X-100 vid 500 μM före användning. Lägg till en 3 min ultraljudsbehandling steg i ett ultraljud vatten bad på RT för att solubilize alkyn-POPE om det behövs.
    4. Återsuspendera FSL-1-biotin i vatten vid 445 μM.
      OBS: Båda lösningarna kan förvaras vid -20 °C i minst 2 månader.

2. Röranalys

OBS: Ställ in Lnt-reaktionen i 1,5 ml rör (steg 2.1) dag 1 och belägg 96 brunnsplattor med streptavidin (steg 2.2).

  1. Beredning av reagensblandning och enzymatisk reaktion
    1. För en standard Lnt-analys, blanda alkyn-POPE (slutlig 50 μM från 500 μM stam) och FSL-1-biotin (slutlig koncentration av 50 μM från en 445 μM stam) i Lnt-reaktionsbuffert (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 innehållande 1% BSA) vid en slutlig volym av 18 μL i 1,5 ml rör. Utför alla villkor i tre exemplar.
    2. Ljud ut substratblandningen (beredd i steg 2.1.1) i 3 minuter i ett ultraljudsvattenbad och inkubera vid 37 °C i 5 minuter före tillsats av Lnt-enzym (steg 2.1.3).
      OBS: MTSES (natrium (2-sulfonatoetyl)metanetiosulfonat), ett tiolspecifikt reagens, hämmar Lnt8. Tillsätt 10 mM MTSES (100 mM stamlösning i 100 % DMSO) till reaktionsrören (steg 2.1.1) som ska användas som negativa kontrollprover. Justera volymen på Lnt-reaktionsbufferten så att den totala volymen är 18 μL.
    3. Tillsätt aktivt (1 ng/μl, motsvarande 17,2 nM) eller inaktivt Lnt (C387S) (2 μl 10 ng/μl stam i buffert WA som innehåller 0,05 % DDM) och blanda med substratet (steg 2.1.2) genom att pipettera upp och ner.
    4. Inkubera reaktionen vid 37 °C i 16 timmar i en termomixer med uppvärmt lock.
  2. Streptavidinbeläggning av 96 brunnsplattor
    1. Bered en stamlösning av streptavidin vid 2 mg/ml iH2O.
      OBS: Denna lösning kan förvaras vid -20 °C i upp till 6 månader.
    2. Bered 10 μg/ml streptavidin i vatten från stamlösningen som arbetslösning. Tillsätt 100 μl av lösningen till varje brunn på 96-brunnsplattan. Bind streptavidin till plattan genom att inkubera vid 37 °C över natten utan lock för att lufttorka brunnarna.

OBS: Utför dag 2 klickkemi (steg 2.3), bind Lnt-reaktionsblandningen till streptavidinbelagda plattor (steg 2.4) och detektera fluorescens och analysera resultat (steg 2.5).

  1. Klick-kemi reaktion
    1. Bered stamlösningar av azido-FAM (5 mM i DMSO), TCEP (Tris(2-karboxyetyl)fosfinhydroklorid; 50 mM beredd i vatten), TBTA (Tris[(1-bensyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metyl]amin; 2 mM i tert-butanol:DMSO (4:1)) ochCuSO4∙5H2O(50 mM nyberedd iH2O).
    2. I de 1,5 ml rör som innehåller Lnt-reaktionsblandningen, framställda i steg 2.1.4, utför klickkemi genom att tillsätta reagenserna i följande ordning: 0,2 μL stam Azido-FAM (slutlig koncentration 50 μM), 0,4 μL lager TCEP (slutlig koncentration 1 mM), 0,2 μL stam TBTA (slutlig koncentration 0,02 mM).
    3. Vortex lösningen i 5 s. Tillsätt sedan 0,4 μL lagerCuSO4 (slutlig koncentration 1 mM). Vortex igen i 5 s. Inkubera proverna i mörker vid RT i 1 timme.
  2. Bindning av Lnt-reaktionsblandning till streptavidinbelagda plattor
    1. Tvätta brunnarna på de streptavidinbelagda plattorna efter inkubationen över natten från steg 2.2.2 3x med 200 μL PBS-T1 (PBS innehållande 0,05% Tween-20).
      OBS: Streptavidinplattor kan användas omedelbart eller förvaras torrt vid 4 °C.
    2. Överför 18 μL från klickkemiblandningen från steg 2.3.3 till en brunn i en 96 brunn streptavidinbelagd platta och tillsätt 100 μL PBS-T1 för att binda N-acyl-FSL-1-biotin-FAM-produkt till streptavidinplattor.
    3. Använd biotinfluorescein (0,26 μM från en 3,1 mM stam i DMSO) som positiv kontroll för streptavidinbindning och fluorescensavläsning.
    4. Inkubera plattorna vid RT i 1 h i mörkret i en termomixer och skaka vid 300 rpm.
    5. Utför manuella tvättsteg av de 96 brunnsplattorna med en flerkanalig elektronisk pipett enligt följande: sex tvättar med 200 μL PBS-T2 (PBS innehållande 1% Tween-20), tre spolningar med pipett, tre tvättar med 200 μL PBS, tre spolningar med pipett.
  3. Detektion och analys av fluorescens
    1. Tillsätt 200 μL PBS och registrera fluorescensen vid 520 nm i en fluorescensmikroplattläsare. Spara resultat i kalkylprogram.
      OBS: Biotin-fluorescein används som en positiv kontroll för streptavidinbindning och fluorescensdetektering vid 520 nm. En reproducerbar avläsning på 30 000–40 000 A.U. med 0,26 μM biotin-fluorescein förväntas. Alla prover analyseras i tre exemplar, inklusive kontroller.
    2. Beräkna standardavvikelsen för varje reaktion och beräkna P-värden för negativa kontroller och positiva prover med hjälp av oparad t-test med hjälp av ett statistiskt program.

3. Multiwell-plattanalys

OBS: Ställ in Lnt-reaktionen i 384 brunnsplattor (steg 3.1) dag 1 och täck 384 brunnsplattor med streptavidin (steg 3.2).

  1. Beredning av reagensblandning och enzymatisk reaktion
    OBS: Mängden reagens och enzym reduceras jämfört med röranalysen och Lnt-reaktionen utförs direkt i 384 brunnsplattor. Detta möjliggör användning av mindre material och en minskning av steg som kan automatiseras ytterligare.
    1. Blanda substraten enligt följande: alkyn-POPE (slutlig koncentration 50 μM från 500 μM stam) och FSL-1-biotin (slutlig 50 μM från 500 μM stam) i Lnt-reaktionsbuffert (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 innehållande 1% BSA) vid en volym av 13,5 μL per reaktion per brunn i ett 384 brunnsplattformat. Utför alla villkor i tre exemplar. Beräkna den totala mängden reagens som krävs för antalet reaktioner som ska utföras (dvs. 5,184 μL för en 384-brunnsplatta).
    2. Sonicate substratblandningen i 3 min i ett ultraljudsvattenbad.
    3. Alikvot 13,5 μL av substratblandningen per brunn i en 384 brunnsplatta.
      OBS: Som en negativ kontroll kan 10 mM MTSES (625 mM stamlösning i 100% DMSO) tillsättas per brunn. Justera volymen av Lnt-bufferten (steg 3.1.1) för att nå en slutlig reaktionsvolym på 13,5 μl.
    4. Inkubera vid 37 °C i 5 minuter före tillsats av Lnt-enzym (steg 3.1.5).
    5. Tillsätt 0,5 ng/μL (motsvarande 8,6 nM) aktivt Lnt-enzym eller inaktiv variant (C387S) (1,5 μL från 5 ng/μl-lager i buffert-WA innehållande 0,05 % DDM) i Lnt-reaktionsbuffert (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 % BSA) till varje brunn som innehåller reaktionsblandningen från steg 3.1.3. Blanda reagenser genom att pipettera upp och ner. Den totala reaktionsvolymen är 15 μl.
    6. Försegla plattan med plastfolie för multiwellplattor.
    7. Inkubera vid 37 °C i 16 timmar i en termomixer med uppvärmt lock.
  2. Streptavidin beläggning 384 brunnsplattor
    1. Använd 75 μL streptavidin (10 μg/ml iH2O) från steg 2.2.2 för att belägga brunnar på en 384-brunnsplatta. Låt streptavidin binda till plattan genom att inkubera vid 37 °C över natten utan lock för att lufttorka brunnarna.

OBS: Utför dag 2 klickkemi (steg 3.3), bind Lnt-reaktionsblandningen till streptavidinbelagda plattor (steg 3.4), detektera fluorescens och analysera resultat (steg 3.5).

  1. Klick-kemi reaktion
    1. Bered stamlösningar av azido-FAM (1,2 mM i DMSO), TCEP (tris(2-karboxyetyl)fosfinhydroklorid; 24 mM beredd i H2O), TBTA (Tris[(1-bensyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metyl]amin; 0,48 mM i tert-butanol:DMSO (4:1)) ochCuSO4∙5H2O(24 mM nyberedd iH2O).
    2. Kombinera de tre klickkemireagenserna: en blandning av Azido-FAM (slutlig koncentration 50 μM), TCEP (1 mM final) och TBTA (0,02 mM final), var och en vid 0,75 μL i slutlig volym på 2,25 μL per brunn. Beräkna önskad volym per 384 brunnsplatta (dvs. använd 864 μL när alla brunnar i 384-brunnsplattan används). Blanda kraftigt.
    3. Tillsätt 2,25 μl reagenslösning per brunn direkt till den slutförda Lnt-reaktionen i 384-brunnsplattan från steg 3.1.7.
    4. Blanda genom att pipettera upp och ner med en flerkanalig elektronisk pipett.
    5. TillsättCuSO4 (0,75 μL från 24 mM stam för en slutlig koncentration på 1 mM) och blanda genom pipettering upp och ner med en flerkanalig elektronisk pipett.
    6. Inkubera vid RT i 1 h i mörkret.
  2. Bindning av Lnt-reaktionsblandning till streptavidinbelagda 384-brunnsplattor
    1. Tvätta brunnarna på de streptavidinbelagda plattorna efter inkubationen över natten från steg 3.2.1 1x med 85 μL PBS-T1.
    2. Överför 11 μl av klickkemireaktionen från varje brunn i inkubationsplattan från steg 3.3.6 till den streptavidinbelagda plattan från steg 3.4.1 för att binda N-acyl-FSL-1-biotin-FAM-produkten till streptavidinplattorna.
    3. Tillsätt 64 μl buffert PBS-T1.
    4. Inkludera biotinfluorescein (0,19 μM från ett 3,1 mM-lager i DMSO) som en kontroll för bindning till streptavidinbelagda brunnar.
    5. Inkubera de 384 brunnsplattorna vid RT i 1 h i mörkret i en termomixer och skaka vid 300 rpm.
    6. Tvätta plattorna med en automatisk plattbricka enligt följande: 10 tvättar med 85 μL PBS-T2, plattorna skakas mellan tvättarna; 5 tvättar med 85 μL PBS, plattorna skakas mellan tvättarna.
  3. Detektion och analys av fluorescens
    1. Tillsätt PBS (85 μl) och registrera fluorescens i en fluorescensmikroplattläsare vid 535 nm.
    2. Analysera data enligt beskrivningen (steg 2.5.2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I Lnt-reaktionen överförs sn-1-fettsyran från fosfolipider till en diacylglycerylpeptid, vilket resulterar i mogen triacylerad peptid 8. In vitro Lnt-analysen som beskrivs här är utformad för att använda fosfolipider som innehåller en alkynfettsyra (alkyn-POPE) och FSL-1-biotin som substrat, vilket resulterar i bildandet av alkyn-FSL-1-biotin. Vid en klickkemisk reaktion med azido-FAM bör denna produkt bli fluorescerande märkt och detekterad med fluorescensspektrometri (figur 2).

Reaktionsbetingelserna optimerades för maximal fluorescensavläsning vid 520 nm i en plattläsare. Vid 1 ng/μl-enzym observerades fullständig omvandling av FSL-1-biotin8 (figur 3). Negativa kontroller inkluderade reaktioner utan enzym, med en inaktiv variant av enzymet (aktiv platsmutant C387S) eller med tiolspecifik hämmare MTSES som resulterar i låg fluorescensdetektion. Biotin-fluorescein bundet effektivt till streptavidinbelagda plattor och användes som en intern kontroll för maximal fluorescenssignal. Alla experiment utfördes i tredubbla och standardavvikelseberäkningar och statistisk analys visade att analysen var känslig och reproducerbar.

För att utveckla en HTS-analys för att screena för småmolekylära hämmare av Lnt reducerades mängden reagens och reaktionerna utfördes direkt i 384 brunnsplattor. Dessutom automatiserades tvättstegen med hjälp av en plattbricka (se Materialförteckning). När det gäller röranalysen var reaktionen känslig och reproducerbar, med en signifikant skillnad mellan den negativa kontrollen (C387S) och det aktiva enzymet (Lnt) (figur 4). I HTS avgör Z'-faktorn om ett svar i en analys är tillräckligt stort för screeningändamål9 och beräknas med hjälp av följande ekvation:

Equation 1

Där S är den genomsnittliga signalen, B är bakgrundssignal och σ är standardavvikelse.

Den genomsnittliga Z-faktorn var >0,6 för Lnt-analysen utförd i HTS-format med 384 brunnsplattor, vilket tyder på att analysen för screening av små molekyler för Lnt-hämning var enastående.

Figure 1
Figur 1: Enzymatiska reaktioner vid posttranslationell modifiering av lipoprotein i proteobakterier. De sekventiella stegen katalyserades av Lgt 10, Lsp11 och Lnt12,13,14 i det cytoplasmatiska membranet. PGN: peptidoglykan, SP: signalpeptid, LB: lipobox, konserverat motiv innehållande Cys+1 och modifierat med fettsyror och den första aminosyran i moget lipoprotein, PG: fosfatidylglycerol, G-1-P: glycerol-1-fosfat, PE: fosfatidyletanolamin, lysoPE: lyso- fosfatidyletanolamin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk för den fluorometriska enzymanalysen för apolipoprotein N-acyltransferas (Lnt). Substraten FSL-1-biotin (gul) och alkyn-POPE (blå) blandades med renat Lnt-enzym lösligt i tvättmedel. Reaktionen utfördes i blandade miceller vid 37 °C (steg 1). Alkyn-FSL-1-biotinprodukten märktes med fluorescein (orange) genom klickkemi (steg 2) och detekterades i en fluorescensplattläsare vid bindning till streptavidinbelagda plattor (steg 3). Figuren är en modifierad version av figur 1B publicerad av Nozeret et al.8 enligt Creative Commons-licensen (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Fluorescensdetektion av Lnt-aktivitet i 96 brunnsformat. Lnt-reaktioner utfördes i rör vid 37 °C i 16 timmar. Efter fluorescerande märkning genom klickkemi och bindning till streptavidinbelagda plattor mättes fluorescens med fluorescensspektrometri. Biotin-fluorescein (biotin-fluo 0,26 μM) användes som kontroll för fluorescens. Buffert var endast reaktionsbuffert. Prover som indikerar alkyn-POPE (50 μM), FSL-1-biotin (50 μM) och substrat (blandning av alkyn-POPE och FSL-1-biotin, 50 μM vardera) innehöll inte enzym. Negativa kontroller inkluderade hämning med MTSES (10 mM) och en inaktiv variant av Lnt (C387S). Lnt-enzymet tillsattes vid 1 ng/μl. Standardavvikelser beräknades för n = 3 experiment. ** P-värde < 0,005. Excitation vid 494 nm, bandbredd 5 nm och emission vid 520 nm, bandbredd 5 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Fluorescensavläsning av Lnt-reaktionen i 384-brunnsplattan kompatibel med HTS. Enzymatiska Lnt-reaktioner utfördes i 384 brunnsplattor vid 37 °C. Biotin-fluorescein (biotin-fluo 0,19 μM) användes som kontroll för fluorescens. Buffert var reaktionsbuffert innehållande DMSO. Negativa kontroller inkluderade hämning med MTSES (10 mM) och en inaktiv variant av Lnt (C387S). Lnt-enzym tillsattes vid 0,5 ng/μL. Standardavvikelser beräknades för n = 3 experiment. P-värde < 0,0005. Excitation vid 485 nm, bandbredd 20 nm och emission vid 535 nm, bandbredd 25 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet för Lnt-analysen som beskrivs här, baserat på fluorescensdetektion av den triacylerade produkten, är känsligt och reproducerbart. Den specifika och effektiva bindningen av biotin till streptavidin är ett nyckelelement i analysen. Alkyne-POPE-substrat kvar efter avslutad Lnt-reaktion är också fluorescerande märkt med FAM men avlägsnas effektivt efter bindning på streptavidinplattorna med flera tvättsteg. Dessutom påverkar tillägg av DMSO inte Lnt-aktiviteten och har ingen inverkan på analysen. Både substrat och enzym är mycket lipofila och kräver reaktionsbetingelser i blandade miceller. Tekniker som är beroende av lösliga enzymer och substrat för produktdetektion, inklusive fluorescenspolarisering, är inte tillämpliga8. Den enda begränsningen av analysen är enzymets kompatibilitet med alkynsubstrat, eftersom klickkemireaktionen är beroende av denna kemiska grupp.

Gelskiftesanalyser har rapporterats i tidigare studier för att analysera Lnt-aktivitet och för att bestämma substratspecificitet4. Med det nuvarande protokollet, och parallellt med fluorescensspektrometri, kan fluorescensdetektering i gel användas för att övervaka Lnt-aktivitet8, även om detta format inte är lämpligt för HTS. Röranalysen är särskilt intressant för kinetiska och jämförande studier av Lnt-mutanter. Fosfolipidsubstratspecificitet kan adresseras med användning av alkyn-fosfolipider erhållna genom metabolisk märkning av bakterier med alkynfettsyror som består av olika kedjelängder och mättnadsgrad enligt beskrivningen8.

384-brunnsplattformatet är kompatibelt med HTS-studier eftersom en signifikant skillnad observeras mellan aktivt enzym och en substratkontroll. En genomsnittlig Z-faktor på >0,6 beräknades med de optimerade förhållanden som presenteras här. Analysens höga reproducerbarhet bidrar till den höga Z-faktorn. För framgångsrik HTS rekommenderas en Z-faktor över 0,69. Tvättstegen är effektiva med hjälp av en automatiserad plattbricka. Andra steg kan optimeras ytterligare, inklusive pipettering av reagenser, vilket skulle möjliggöra screening av stora bibliotek med små molekyler.

Protokollet är tillämpligt på andra acyltransferaser som använder fettsyrainnehållande substrat om alkyngrupper är kompatibla med substratigenkänning av enzymet. En nyligen genomförd studie om identifiering av specifika hämmare av eukaryot Palmitoyl Acyl Transferas (PAT) beskriver användning av membranbundet enzym och alkyn-acyl-CoA som substrat7. Palmitoylering av en liten biotinylerad Ras-peptid observerades genom klickkemifluorogen detektion. En pilotskärm i 384-brunnsplattformat av denna analys identifierade specifika hämmare av PAT, vilket tyder på att substrat bestående av alkynfettsyragrupp i kombination med klickkemi och känslig fluorescensdetektering är en lovande metod för målbaserad HTS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Fabrice Agou och Alix Boucharlat från Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) vid Institut Pasteur Paris för användbara förslag på protokollet, alla medlemmar i BGPB-enheten för stöd och vetenskapliga diskussioner och Simon Legood för kritisk läsning av manuskriptet. Arbetet finansierades av globala vårdinitiativ från Institute Carnot Infectious diseases och Institute Carnot Microbes and Health (15 CARN 0017-01 och 16 CARN 0023-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta Purifier FPLC system GE Healthcare NA Purity: NA
Lnt purification
alkyne-POPE Avanti Polar Lipids 900414P Purity: >99%
Lnt substrate
Azido-FAM Lumiprobe A4130 Purity: 100% (pure)
Click reagent
BioPhotometer Plus Eppendorf N/A Purity: NA
OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select plate washer BioTek N° serie 115800, n° materiel 405 Select Purity: NA
Wash steps
biotin-fluorescein Sigma 53608 Purity: ≥90%
Fluorescence control
Copper(II) sulfate pentahydrate Sigma C3036 Purity: ≥98%
Click reagent
DDM Anatrace D310A Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α
Detergent for Lnt purification
Dimethylsulfoxide (DMSO) Invitrogen D12435 Purity: anhydrous
Solbilization Click reagent
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL INTEGRA 4721 Purity: NA
Handling reagents
French Pressure Cell N/A N/A Purity: NA
Cell disruption
FSL-1-biotin EMC microcollections L7030 Purity: NA
Lnt substrate
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate Greiner 781091 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding Greiner 655097 Purity: NA
Black with transparent bottom (up or bottom reading)
Microplate reader Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) Anatrace S110MT Purity: ~100%
Thiol specific inhibitor
Optically Clear Adhesive Seal Sheets Thermo Scientific AB-1170 Purity: NA
Foil to seal multi-well plate
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column GE Healthcare GE28-9356-04 Purity: NA
Lnt purification
StrepTactin Sepharose 50 % IBA Biotechnology 2-1201-010 Purity: NA
Lnt purification
streptavidin Sigma S4762-1MG Purity: ≥13 units/mg protein
Biotin binding
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine Sigma 678937 Purity: 97%
Click reagent
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Sigma 75259 Purity: ≥98%
Click reagent
TECAN Infinite F500 Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
TECAN Infinite M1000 pro Tecan N/A Purity: NA
Fluorescence detection
Thermomixer C Eppendorf 5382000015 Purity: NA
Heated lid
Triton X-100 Sigma 93443 Purity: 10% in H2O
Lnt reaction buffer
Ultra centrifuge Beckman LC N/A Purity: NA
Cell fractionation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
  2. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
  4. Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
  5. Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
  6. Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
  7. Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147 (2017).
  8. Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  10. Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198 (2016).
  11. Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
  12. Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952 (2017).
  13. Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
  14. Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948 (2017).

Tags

Biokemi utgåva 159 integralmembranapolipoprotein N-acyltransferas diacylglycerylpeptid alkyn-fosfolipid blandade miceller klickkemi fluorescens
Klickkemibaserad fluorometrisk analys för apolipoprotein N-acyltransferas från enzymkarakterisering till screening med hög genomströmning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nozeret, K., Pernin, A.,… More

Nozeret, K., Pernin, A., Buddelmeijer, N. Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening. J. Vis. Exp. (159), e61146, doi:10.3791/61146 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter