Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הקמת דגם חזיר אקס ויוו קרנית לחקר טיפולים תרופתיים נגד קרטיטיס בקטריאלי

Published: May 12, 2020 doi: 10.3791/61156
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,5, 3, 1,6, 1,7, 1,2
1Sheffield Collaboratorium for Antimicrobial Resistance and Biofilms (SCARAB), University of Sheffield, 2Department of Chemical and Biological Engineering, University of Sheffield, 3Hyderabad Eye Research Foundation, L V Prasad Eye Institute, 4Health Economics and Decision Science, School of Health and Related Research, University of Sheffield, 5Department of Molecular Biology and Biotechnology, University of Sheffield, 6Department of Materials Science and Engineering, University of Sheffield, 7Department of Infection, Immunity and Cardiovascular Disease, University of Sheffield

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב כדי להגדיר מודל אקס ויוו חזירי של קרטיטיס חיידקי. פסאודומונס ארוגינוזה משמש כאורגניזם אב-טיפוס. מודל חדשני זה מחקה זיהום vivo כמו התפשטות חיידקים תלויה ביכולתו של החיידק לפגוע ברקמת הקרנית.

Abstract

בעת פיתוח מיקרוביאלית חדשנית, ההצלחה של ניסויים בבעלי חיים תלויה אקסטרפולציה מדויקת של יעילות מיקרוביאלית מבדיקות במבחנה לזיהומים בבעלי חיים vivo. בדיקות במבחנה הקיימות בדרך כלל מעריכות יתר על המידה את היעילות האנטי-מיקרוביאלית מכיוון שנוכחות רקמה מארחת כמחסום דיפוזיה אינה נחשבת. כדי להתגבר על צוואר בקבוק זה, פיתחנו מודל הקרנית אקס ויוו חזירי של קרטיטיס חיידקי באמצעות Pseudomonas aeruginosa כאורגניזם אב טיפוס. מאמר זה מתאר את הכנת הקרנית חזירית ופרוטוקול להקמת הזיהום. תבניות זכוכית העידו לאפשר התקנה פשוטה של הקרנית למחקרי זיהום. המודל מחקה זיהום vivo כמו התפשטות חיידקים תלויה ביכולתו של החיידק לפגוע ברקמת הקרנית. הקמת זיהום מאומתת כגידול במספר יחידות יוצרות המושבה המוערכות באמצעות ספירת לוחיות רישוי בנות קיימא. התוצאות מראות כי זיהום ניתן להקים בצורה לשחזור מאוד בקרניות ex vivo באמצעות השיטה המתוארת כאן. המודל יכול להיות מורחב בעתיד לחקות קרטיטיס הנגרמת על ידי מיקרואורגניזמים שאינם P. aeruginosa. המטרה הסופית של המודל היא לחקור את ההשפעה של כימותרפיה מיקרוביאלית על ההתקדמות של זיהום חיידקי בתרחיש מייצג יותר של זיהומים in vivo. בכך, המודל המתואר כאן יפחית את השימוש בבעלי חיים לבדיקות, ישפר את שיעורי ההצלחה בניסויים קליניים ובסופו של דבר יאפשר תרגום מהיר של מיקרוביאליות חדשניות למרפאה.

Introduction

זיהומים בקרנית הם גורמים חשובים לעיוורון ומתרחשים בממדי מגיפה במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית. האטיולוגיה של המחלה משתנה מאזור לאזור אבל חיידקים מהווים רוב גדול של מקרים אלה. Pseudomonas aeruginosa הוא פתוגן חשוב שגורם למחלה מתקדמת במהירות. במקרים רבים, חולים נשארים עם צלקות סטרומה, אסטיגמציה לא סדירה, דורשים השתלה או בתרחיש הגרוע ביותר, לאבדעין 1,2.

קרטיטיס בקטריאלי הנגרם על ידי P. aeruginosa הוא זיהום עיניים קשה לטיפול במיוחד בשל הופעתה הגוברת של זנים עמידים מיקרוביאלית של P. aeruginosa. בעשור האחרון, התברר כי בדיקות ופיתוח טיפולים חדשים עבור זיהומים הקרנית, בכלל, ואלה הנגרמים על ידי Pseudomonas sp., בפרט, חיוניים כדי להילחם במגמה הנוכחית עמידות לאנטיביוטיקה3.

לבדיקת היעילות של טיפולים חדשים לזיהומים בקרנית, שיטות מיקרוביולוגיות במבחנה קונבנציונליות הן פונדקאית גרועה בשל ההבדל בפיזיולוגיה החיידקית במהלך תרבות המעבדה ובמהלך זיהומים ב vivo, כמו גם בשל היעדר ממשק המארח4,5. מודלים של בעלי חיים Vivo, לעומת זאת, הם יקרים, זמן רב, יכול רק לספק מספר קטן של משכפלים ולהעלות חששות לגבי רווחת בעלי החיים.

במאמר זה, אנו מדגימים פשוט לשחזור organotypic ex vivo דגם חזירי של קרטיטיס שניתן להשתמש בהם כדי לבדוק טיפולים שונים עבור זיהומים חריפים וכרוניים. השתמשנו P. aeruginosa עבור ניסוי זה, אבל המודל עובד גם היטב עם חיידקים אחרים, ואורגניזמים כגון פטריות ושמרים הגורמים קרטיטיס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ארנבי מעבדה לבקנים הוקרבו במעבדה לעבודות ניסיוניות מתוכננות אחרות תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי משרד הפנים. העיניים לא נדרשו לשימוש ניסיוני במחקרים אלה ולכן הם שימשו לפרוטוקול זה.

1. עיקור

  1. שלב קריטי: לחטא את כל המלקחיים והמספריים על ידי השרייה של 1 שעות בתמיסת 5% (v/v) של דיסטל במים מזוקקים, לנקות עם מברשת, לשטוף במי ברז לעקר בתנור ב 185 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפחות.
  2. לעקר את כל כלי זכוכית אחרים ריאגנטים על ידי autoclaving ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות או להכין ריאגנטים על פי הוראות היצרן. בצע את ההליכים הבאים בארון בטיחות מיקרוביולוגיה מדרגה 2.

2. אוסף לדוגמה

  1. אוסף עיניים חזיריות
    1. חזירי יבשה לבנים גדולים, צלב עם חזיר בר המפשייר שימש. בעלי החיים היו המומים עם זרם חשמלי והעיניים היו חנוקות 2 שעות מאוחר יותר בבית המטבחיים.
    2. שלב קריטי: לאחר ההסתבכות, העבירו את העיניים למעבדה בתמיסת מלח סטרילית עם אגירת פוספט (PBS) כדי למנוע מהן להתייבש ולעבד אותן מיד עם ההגעה.
  2. אוסף עיני ארנב
    1. בלו את הקרניות ולשלוח למעבדה ב PBS סטרילי.

3. הכנת כפתור הקרנית

  1. השתמש מלקחיים סטריליים להחזיק את הרקמה המקיפה את גלגל העין ולהעביר אותו לצלחת פטרי. הסר את הלחמית ורקמת השריר סביב גלגל העין על צלחת פטרי באמצעות להב אזמל מס '15 ומלקחיים.
  2. בעדינות להרים את גלגל העין תוך החזקת עצב הראייה עם מלקחיים ולהעביר לצנצנת 0.5 L מלא PBS סטרילי.
  3. לאחר שכל העיניים מנוקות מהרקמה שמסביב, להעביר אותם באמצעות מלקחיים סטריליים עוד 0.5 L צנצנת מלא 3% (v / v) יוד povidone ב PBS ולהשאיר במשך 1 דקות.
  4. העבר גלגלי עיניים לצנצנת 0.5 L נוספת עם PBS סטרילי.
  5. השתמש מלקחיים להחזיק את העין עדיין על צלחת פטרי ולעשות חתך ליד הקרנית עם להב אזמל לא 10A.
  6. צעד קריטי: החזיקו את קצה החתך והשתמשו במספריים כדי לבלום את הקרנית ולהשאיר כ -3 מ"מ של סקלרה המקיפה את הקרנית. ודא את הקצה החד של מספריים לא לנקב את הקשתית או רקמת choroidal והוא בחלל סופרה-choroidal.
  7. החזק את כפתור corneoscleral עם מלקחיים ולהשתמש זוג אחר של מלקחיים קצה מחודד להפריד בעדינות את רקמת uveal.
  8. הרם את כפתור corneoscleral מן הגלובוס הנותרים ולשטוף אותו בקצרה 1.5% (v / v) פתרון יוד povidone ב PBS בצלחת 12 גם.
  9. מניחים את כפתור corneoscleral לתוך צלחת נוספת 12 היטב מלא PBS סטרילי.
  10. לאחר עיבוד כל העיניים(מומלץ מקסימום 40 עיניים באצווה אחת),מניחים כל כפתור corneoscleral לצלחת פטרי בודדים (קוטר 34 מ"מ) צד אפיתל למעלה ויוצקים 3 מ"ל של תרבות בינונית מראש מחומם ל 37 °C (69 °F).
    הערה: ההרכב של מדיום התרבות הוא כדלקמן: המדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM): של בשר חזיר [1:1] בתוספת 5 מיקרוגרם ∙ mL-1 אינסולין ו 10 ng∙mL-1 גורם גדילה אפידרמיס (EGF), 10% (v/v) סרום עגל עוברי (FCS), 100 U∙mL-1 פניצילין, 100 U∙mL-1 סטרפטומיצין ו-2.5 מיקרוגרם∙mL-1 אמפוטריצין B. כצעד אופציונלי, ניתן להשלים את המדיום עם 50g∙L-1 dextran כדי למנוע נפיחות של הקרנית שנכרתה במהלך שלבי הדגירה הנוספים.
  11. דגירה ב 37 °C (69 °F) באינקובטור תרבית רקמות לחה.

4. תחזוקה של כפתורי corneoscleral

  1. לאחר 24 שעות, השתמש בטכניקה אספטית כדי להסיר מדיה ולהחליף עם 3 מ"ל של מדיה תרבות רעננה מראש מחומם המכיל אנטיביוטיקה. שמור את הכפתורים corneoscleral במדיה עם אנטיביוטיקה במשך 48 שעות כדי לחטא את הקרניות. דגירה ב 37 °C (69 °F) באינקובטור תרבית רקמות לחה.
  2. שלב קריטי: לאחר 48 שעות, להסיר את התקשורת ולשטוף קרניות עם 2 מ"ל של PBS. לאחר מכן לשמור את הכפתורים corneoscleral במדיה ללא אנטיביוטיקה במשך מינימום של יומיים או אידיאלי שלושה ימים לפני זיהום ניסיוני, כדי להסיר אנטיביוטיקה שיורית מן הרקמה.
  3. דגירה ב 37 °C (69 °F) באינקובטור תרבית רקמות לחה. שנה מדיה לפחות פעם אחת נוספת בשלושת הימים הבאים. השלך קרניות אם כל עכירות מתפתחת במדיום ללא אנטיביוטיקה.

5. הכנת אינקולום

  1. יוצקים 10 מ"ל של מרק LB לתוך בקבוק חרוט 50 מ"ל עם פקק קצף.
  2. להעביר מושבה של P. aeruginosa זן PAO1 או זן PA14 מצלחת אגר טרי דגירה ב 37 °C (69 °F) עבור 3-4 שעות עד החיידקים נמצאים בשלב באמצע יומן.
  3. להעביר את התרבות של חיידקים צינור 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 5 דקות. הסר את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא ב- PBS.
  4. חזור על שלב 5.3 פעמיים נוספות כדי לשטוף את התאים. להשעות מחדש את גלולת התא ב PBS ולהתאים את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר לכ 0.6 באמצעות PBS סטרילי כמו ריק.

6. הדבקת כפתור corneoscleral

  1. הסר את המדיה מצלחת פטרי ולשטוף קרניות פעמיים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי.
  2. בעדינות לסחוט מלקחיים תוך החזקת הקרנית באמצע. השתמש אזמל 10A לעשות ארבעה חתכים - שני אנכי, שני אופקי - בחלק המרכזי של כפתור corneoscleral דרך שכבת האפיתל אל סטרומה הבסיסית.
  3. מניחים תבנית זכוכית סטרילית בצלחת של 6 בארות עם החלק הרחב למעלה ומניחים את הקרנית באמצע תבנית הזכוכית, צד אפיתל הפונה כלפי מטה. הפוך את החתך ממש במרכז החלק התחתון של תבנית הזכוכית.
  4. שלב קריטי: יוצקים 1 מ"ל של 1% (w / v) נקודת התכה נמוכה אגר מומס DMEM כדי למלא את תבנית הזכוכית עם קרנית לחלוטין.
  5. אפשר אגר להגדיר ולאחר מכן להפוך את עובש הזכוכית, כך אפיתל הקרנית פונה כלפי מעלה.
  6. פיפטה 15 μL של תרבות החיידקים עם OD600nm = 0.6 (עבור P. aeruginosa זה משווה כ 1 x 107 יחידות יוצרות מושבה (CFU) ב 15 μL) ישירות לתוך אזור לחתוך ולאחר מכן להוסיף 85 μL של PBS לפסגה כדי לשמור על קרנית אפיתל לחות. לדלל את התרבות החיידקית הנותרת ואת הצלחת על אגר לספור יחידות להרכיב מושבה עבור inoculum.
  7. מוסיפים 1 מ"ל של DMEM ללא אנטיביוטיקה לתחתית כל באר עם תבנית הזכוכית. דגירה צלחת 6-well עם כפתורי corneoscleral נגועים באינקובטור לח ב 37 °C (67 °F) עם 5% CO2 עבור עד 24 שעות.
  8. הקם קרנית בקרה לא מודבקת לצד כל ניסוי. כדי להגדיר שליטה לא מודבקת, החלף את 15 μL של תרבות החיידקים בשלב 6.6 עם PBS סטרילי.

7. הומוגניזציה של הקרנית כדי לקצור את החיידקים

  1. השלך את מדיום DMEM מתחתית צלחת 6 באר ולהוסיף 1 מ"ל של PBS סטרילי לשטוף את החלק התחתון של הבאר.
  2. הסר PBS בעדינות על ידי pipetting מבלי לגעת בחלק המרכזי של כפתור corneoscleral. הסר את טבעת הזכוכית באמצעות מלקחיים סטריליים ומניחים אותה ב- 5% Distel.
  3. שטפו בעדינות את החלק העליון של כפתור הקרנית עם 1 מ"ל של PBS פעמיים [אופציונלי].
  4. החזיקו את קצה כפתור הקרניאוסקלרל עם מלקחיים עדינים וניתק אותו מהאגר שמתחת.
  5. מעבירים את הקרנית לצינור 50 מ"ל מלא בקרח קר 1-2 מ"ל של PBS.
  6. השתמש homogenizer קצה עדין כדי להטות את החלק העליון של הקרנית נגוע. הרקמה לא צריכה להיות מחוסלת לחלוטין. homogenizer מסייע לנתק חיידקים מן האפיתל הקרנית ואת האזור לחתוך.
  7. וורטקס הקרנית ב PBS במשך כמה שניות כדי לערבב את התוכן.
  8. הוסף 20 μL של הומוגנט ל 180 μL של PBS ולבצע דילול סדרתי בצלחת 96 היטב.
  9. לדלל באופן סדרתי את ההשעיה ל 10-4 ו 10-5 דילול פיפטה 10 μL של הומוגנט מדולל עם חיידקים על צלחת אגר דם. דגירה את הצלחת במשך 8 שעות ולספור את מספר CFU. כאשר בודקים את ההשפעה של מיקרוביאלים, גורם הדילול המתאים חייב להגיע באופן ניסיוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

העיצוב של תבניות הזכוכית הוא רעיון חדשני ומקורי, שהשימוש בו איפשר לנו להקים את המודל בצורה עקבית עם בעיות מינימליות / ללא זיהום. התבניות הוכנו על ידי מפוח זכוכית באוניברסיטת שפילד על בסיס עיצוב (איור 1A). המערך הניסיוני שומר על צורת הקמור של הקרנית ומחזיק חיידקים בחלק העליון של האפיתל שבו מתרחש זיהום (איור 1B).

קרניות חזיר בדרך כלל להתנפח לאחר כמה ימים בינוני. זה נורמלי ומצאנו שאין הבדל משמעותי בין קרניות עם ובלי תוספת של דקסטרן, שבדרך כלל מתווספת כדי למנוע נפיחות בקרנית(איור 1H). הקרניות פצועות בדרך כלל כדי לעזור לחיידקים לחדור את האפיתל. למרות שלא היה הבדל משמעותי בהתקדמות ההדבקה בין קרניות פצועות (חתוכות) וקרניות לא מבוססות (לא חתוכות), שמנו לב לשינויים נוספים בין העתקים בקרניות לא חתוכות(איור 1C). שטיפת הקרניות פעמיים עם PBS מסירה חיידקים עודפים שלא נקשרו לאפיתל. היה הבדל משמעותי ב- CFU בין קרניות חזיר שטף ורחוצים נגוע P. aeruginosa PAO1 במשך 24 שעות(איור 1D). לא היה הבדל משמעותי בספירת ה-CFU בין חזירים לקרניות ארנבות שנדבקו ב-PA14 וב-PAO1(איור 1E,1F). התוצאות עבור שני הדגמים היו לשחזור. לאחר 24 שעות, הקרנית הנגועה בזן פסאודומונס תמיד מפתחת אטימות והאזור החתוך הופך גלוי ופתוח יותר בהשוואה לקרנית הלא נגועה (איור 1G).

Figure 1
איור 1: הקרנית אקס ויוו נגועה בפסאודומונס ארוגינוזה. (A)תמונה סכמטית של תבנית זכוכית המשמשת לשמירה על צורת הקרנית והקלה על הכנסת חיידקים וטיפולים. עובי תבניות הזכוכית הוא 1.5 מ"מ והוא זהה לעובי של מבחנות העשויות מזכוכית בורוסיליקט. (B) תמונה סכמטית של ההגדרה הניסיונית. (C) בדיקת ההשפעה של פציעה על ספירת CFU הסופי לאחר הומוגניזציה. קרניות לא חתוכות (n = 16) וחתוכות (n = 28) נדבקו ב- P. aeruginosa PAO1 וב- P. aeruginosa PA14 למשך 24 שעות. הקרניות נשטפו עם 1 מ"ל של PBS לפני הומוגניזציה. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. (ד)בדיקת ההשפעה של שטיפת קרניות עם 2 x 1 מ"ל של PBS (n = 6) ולא כביסה (n = 6) על ספירת CFU הסופי לאחר זיהום עם P. aeruginosa PAO1 במשך 24 שעות. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. (ה)ספירת CFU סופית בקרניות חזיר נגוע P. aeruginosa PAO1 ו P. aeruginosa PA14 במשך 24 שעות (n = 10). קרניות נשטפו ונחתכו. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. (ו)ספירת CFU סופית בקרניות ארנב נגוע P. aeruginosa PAO1 ו P. aeruginosa PA14 במשך 24 שעות (n = 6). קרניות נשטפו ונחתכו. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. (G)תמונות של קרניות חזיר אקס ויוו נגוע P. aeruginosa PAO1 במשך 24 שעות. השליטה נפצעה אך לא נוספו חיידקים. הקרניות הנגועות נפצעו ו-107 CFU נוספו לצד החתך. לא נמצאו CFU מהקרנית הבקרה. (H) CFU הסופי התאושש לאחר 24 שעות של זיהום עם P. aeruginosa PAO1 מ קרניות שטופלו דקסטרן (n = 2) ואלה ללא דקסטרן (n = 9). קרניות נשטפו ונחתכו. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המניע העיקרי מאחורי הפיתוח של מודל זה קרטיטיס באמצעות הקרנית אקס ויוו חזירי היא לספק לחוקרים פיתוח antimicrobials הרומן עם מודל במבחנה נציג כדי לקבוע בצורה מדויקת יותר יעילות מיקרוביאלית בשלבים הפרה-קוליניים. זה יספק לחוקרים המעורבים בפיתוח מיקרוביאלים חדשים שליטה רבה יותר על תכנון וניסוח תרופות בשלבים הפרה-קליניים, להגדיל את ההצלחה בניסויים קליניים, להפחית את השימוש בבעלי חיים על ידי הפעלת מחקרים ממוקדים ולהוביל לתרגום מהיר יותר של מיקרוביאלית חדשה למרפאה.

מספר מחקרים חקרו את השפעת הזיהומים על קרניות אקס ויוו מבעלי חיים שונים כגון: ארנב6, כלב7, עז8 וחזירים9,10,11. רוב המחקרים הללו מתמקדים בדרכים להקים6 ולהמחיש זיהום9 אבל עד כה היו רק כמה פרסומים המתמקדים בבדיקות סמים וכימות מדויק שלחיידקים 6,7,8,12.

היתרון העיקרי של המודל שלנו הוא הזמינות של קרניות חזיריות כחלק משרשרת המזון. השימוש בקרניות חזיר אקס ויוו ולכן עולה בקנה אחד עם העיקרון של 3Rs, שהוא להחליף, לחדד ולהפחית את השימוש בבעלי חיים במחקר, תוך מתן מודל מייצג של ממשק המארח. לא ראינו בעיות עם זיהום של explants הקרנית אם הפרוטוקול הוא אחריו בקפדנות. תבניות הזכוכית קלות מאוד, מהירות וישירות לשימוש ללא כל דרישה לציוד מיוחד. הטבעת הצרה בחלק העליון הופכת את התוספת של כמות קטנה של תרופה שנבדקה (100 μL) או חיידקים לנוחים. הטבעת של עובש הזכוכית מאפשר PBS עם חיידקים או פתרון סמים להישמר בחלק המרכזי של הקרנית ומונע את החיידקים מלהיכנס מתחת לקרנית. הטבעת קלה לניקוי וחיטוי, ומאפשרת תצפית על השינויים המתרחשים בחלק העליון של הקרנית במהלך ההדבקה. זנים של חיידקים מתויגים פלואורסצנטיים יכולים לשמש כדי לדמיין זיהום או לכמת את התפשטות הזיהום ברקמה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית. כל הקרניות יכולות להיות מעובדות עוד יותר להיסטולוגיה או הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים.

השלבים הקריטיים מסומנים בפרוטוקול. יש להקדיש תשומת לב נוספת לשלבים אלה בעת ביצוע הפרוטוקול כדי להבטיח זיהום מוצלח. הצעדים הקריטיים ביותר בתוך הפרוטוקול הם להבטיח כי קרניות מטופלים עם אנטיביוטיקה מספיק כדי למנוע זיהום במהלך ההכנה ולאחר מכן כי האנטיביוטיקה מסולקים מספיק לפני כניסתה של האורגניזם זיהומיות, במקרה זה P. aeruginosa. בעת הגדרת הניסויים באמצעות פרוטוקול זה, במקרים מסוימים, עכירות התפתחה במהלך הדגירה במדיום ללא אנטיביוטיקה. עכירות זו הצביעה על צמיחה של מיקרואורגניזמים במדיום ללא אנטיביוטיקה. זה יכול להיות בגלל טיפול לא שלם של הקרנית באמצעות אנטיביוטיקה או עקב זיהום במהלך הטיפול. קרניות אלה לא נלקחו קדימה לניסויים נוספים והושלכו. התפתחות של עכירות בעת דגירה קרניות במדיום ללא אנטיביוטיקה נמנעה על ידי שימוש ריצות עיקור תכופות באינקובטור, באמצעות טיפים פיפטה חד פעמית עם מסנן ולטפל כראוי בעת עיקור הכלים המשמשים לכריתת הקרנית מעיני חזיר. צעד קריטי נוסף הוא כאשר הקרניות ממוקמות בתבנית הזכוכית לפני ההדבקה. תבנית הזכוכית מאפשרת לשמור על צורת הקמור של הקרנית. הקמור של הקרנית הוא אתגר לשמירה על המינון המדביק או הסוכן הטיפולי על פני הקרנית. לכן, חיוני כדי להבטיח את נוכחותו של חותם הולם בין הקרנית לבין עובש הזכוכית. כאשר יש חותם הולם בין הקרנית לתבנית הזכוכית, מבנה הטבעת מעל התבנית יוצר מאגר כדי לשמור על המינון המדביק או על הסוכן הטיפולי. חותם הולם מובטח על ידי מילוי מלא של החלק הרחב של תבנית הזכוכית עם אגר DMEM עד השוליים.

כמו בכל דגם, ישנן מגבלות הקשורות לדגם הקרנית האקס ויוו חזירי המתואר. המודל המתואר בזאת אינו מחקה את הקומפוזיציה, הזרימה והחידוש של סרט הדמעה על פני הקרנית. הפעולה המכנית המסופקת על ידי מצמוץ גם אינה משולבת במודל. יש הסכמה בספרות שקורעת את הקומפוזיציה והדינמיקה של הסרט, ומהבהבים הם מנגנוני הגנה חשובים המסירים חלקיקים ומיקרואורגניזמים זרים מהעין13. ואכן, המודל גם חסר תגובה חיסונית המופעלת במהלך זיהום vivo. סביר להניח כי ההתקדמות של זיהום vivo בנוכחות מנגנוני הגנה אלה שונה מזו שנצפתה במודל ex vivo המתואר כאן. למרות מגבלות אלה, מודל הקרנית אקס ויוו חזירי רלוונטי לבדיקת האפקטיביות של מיקרוביאלים קיימים ומתפתחים משתי סיבות עיקריות: 1) הפיזיולוגיה של החיידקים במודל אקס ויוו מחקה את תנאי ה- in vivo שכן התפשטות חיידקים תלויה ביכולתם לפגוע ברקמת הקרנית, ו -2) המודל משלב את הרקמה התלת מימדית כמחסום דיפוזיה לטיפולים. לכן, מודל ex vivo הוא יתרון על פני טכניקות קונבנציונליות עבור בדיקות רגישות מיקרוביאלית.

מודל הקרנית אקס ויוו חזירי המתואר כאן יכול לשמש גם לחקר זנים שונים של חיידקים, פטריות ושמרים הגורמים קרטיטיס. דגם זה של הקרנית אקס ויוו ניתן לשחזור ומאפשר ליצור שכפולים תוך זמן קצר שלא כמו בדגמי vivo. במקום PBS, ניתן להוסיף באופן תיאורטי קרעים מלאכותיים או תאי הגנה חיסוניים מארחים כדי לחקות את התרחיש החי. קרניות מתקבלות מאותו גזע של חזירים וכ 21-23 שבועות כאשר נשחט. לכן, יש פחות שונות בין משכפלים בהשוואה לאלה המתקבלים מגוויות אנושיות. הרעיון של שימוש במודל קרנית אקס ויוו חזירי ליישומים ביו-רפואיים צבר פופולריות רבה יותר בשנים האחרונות בגלל הדמיון הביולוגי שלו לעין האנושית מה שהופך מודל זה לקל יותר להשוואה14. יש עניין מוגבר בשימוש קרניות חזיר להשתלה15,16 או כמודל לעין יבשה17 או ריפויפצעים 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לאליוט אבטואר בצ'סטרפילד על שסיפק עיניים חזיריות. טבעות הזכוכית נעשו על סמך העיצוב שלנו על ידי מפוח הזכוכית דן ג'קסון מהמחלקה לכימיה באוניברסיטת שפילד. המחברים מבקשים להודות למועצה למחקר רפואי (MR/S004688/1) על המימון. המחברים רוצים גם להודות לגברת שאנלי דיקוולה על העזרה הטכנית בהכנת הקרנית. המחברים רוצים להודות למר ג'ונתן אמרי על העזרה בעיצוב תמונות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL Falcon tube SLS 352070
Amphotericin B Sigma A2942
Cellstar 12 well plate Greiner Bio-One 665180
Dextran Sigma 31425-100mg-F
Distel Fisher Scientific 12899357
DMEM + glutamax SLS D0819
Dual Oven Incubator SLS OVe1020 Sterilising oven
Epidermal growth factor SLS E5036-200UG
F12 HAM Sigma N4888
Foetal calf serum Labtech International CA-115/500
Forceps Fisher Scientific 15307805
Handheld homogeniser 220 Fisher Scientific 15575809 Homogeniser
Heracell VIOS 160i Thermo Scientific 15373212 Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R VWR 521-2242 Centrifuge
Insulin, recombinant Human SLS 91077C-1G
LB agar Sigma L2897
Multitron Infors Not appplicable Bacterial incubator
PBS SLS P4417
Penicillin-Streptomycin SLS P0781
Petri dish Fisher Scientific 12664785
Petri dish 35x10mm CytoOne Starlab CC7672-3340
Povidone iodine Weldricks pharmacy 2122828
Safe 2020 Fisher Scientific 1284804 Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15 Fisher Scientific O305
Scalpel Swann Morton Fisher Scientific 11849002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
  2. Sharma, S. Keratitis. Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).
  3. Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
  4. Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
  5. Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
  6. Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
  7. Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
  8. Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
  9. Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
  10. Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
  11. Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
  12. Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  13. Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces. Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).
  14. Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
  15. Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
  16. Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
  17. Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
  18. Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 159 פסאודומונס aeruginosa קרטיטיס קרנית אקס ויוו עין חזירון
הקמת דגם חזיר אקס ויוו קרנית לחקר טיפולים תרופתיים נגד קרטיטיס בקטריאלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Okurowska, K., Roy, S., Thokala, P., … More

Okurowska, K., Roy, S., Thokala, P., Partridge, L., Garg, P., MacNeil, S., Monk, P. N., Karunakaran, E. Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis. J. Vis. Exp. (159), e61156, doi:10.3791/61156 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter