Summary
Este artigo descreve um protocolo passo a passo para criar um modelo de ceratite porcina ex vivo de ceratite bacteriana. Pseudomonas aeruginosa é usado como organismo prototípico. Este modelo inovador imita a infecção in vivo, pois a proliferação bacteriana depende da capacidade da bactéria de danificar o tecido córnea.
Abstract
Ao desenvolver novos antimicrobianos, o sucesso dos ensaios em animais depende da extrapolação precisa da eficácia antimicrobiana de testes in vitro a infecções em animais in vivo. Os testes in vitro existentes tipicamente superestimam a eficácia antimicrobiana, pois a presença de tecido hospedeiro como barreira de difusão não é contabilizada. Para superar esse gargalo, desenvolvemos um modelo de ceratite bacteriana ex vivo porcina usando Pseudomonas aeruginosa como organismo prototipado. Este artigo descreve a preparação da córnea suína e o protocolo para o estabelecimento da infecção. Moldes de vidro sob medida permitem a configuração direta da córnea para estudos de infecção. O modelo imita a infecção in vivo, pois a proliferação bacteriana depende da capacidade da bactéria de danificar o tecido córnea. O estabelecimento da infecção é verificado como um aumento no número de unidades formadoras de colônias avaliadas por meio de placas viáveis. Os resultados demonstram que a infecção pode ser estabelecida de forma altamente reprodutível nas córneas ex vivo usando o método descrito aqui. O modelo pode ser estendido no futuro para imitar ceratite causada por microrganismos diferentes de P. aeruginosa. O objetivo final do modelo é investigar o efeito da quimioterapia antimicrobiana no progresso da infecção bacteriana em um cenário mais representativo de infecções in vivo. Ao fazê-lo, o modelo descrito aqui reduzirá o uso de animais para testes, melhorará as taxas de sucesso em ensaios clínicos e, finalmente, permitirá a tradução rápida de novos antimicrobianos para a clínica.
Introduction
As infecções corneais são importantes causas de cegueira e ocorrem em proporções epidêmicas em países de baixa e média renda. A etiologia da doença varia de região para região, mas as bactérias são responsáveis pela grande maioria desses casos. Pseudomonas aeruginosa é um patógeno importante que causa uma doença rapidamente progressiva. Em muitos casos, os pacientes ficam com cicatrizes estromais, astigmatismo irregular, necessitam de transplante ou, no pior dos casos, perdem um olho1,2.
A ceratite bacteriana causada pela P. aeruginosa é uma infecção ocular difícil de tratar particularmente devido ao crescente surgimento de cepas resistentes antimicrobianas de P. aeruginosa. Na última década, tornou-se evidente que testar e desenvolver novos tratamentos para infecções córneas, em geral, e aqueles causados por Pseudomonas sp., em particular, são essenciais para combater a tendência atual de resistência a antibióticos3.
Para testar a eficácia de novos tratamentos para infecções córneas, os métodos microbiológicos in vitro convencionais são um substituto ruim devido à diferença na fisiologia bacteriana durante a cultura laboratorial e durante infecções in vivo, bem como devido à falta da interface hospedeira4,5. Os modelos in vivo animal, no entanto, são caros, demorados, só podem entregar um pequeno número de réplicas e levantar preocupações sobre o bem-estar animal.
Neste artigo, demonstramos um modelo simples e reprodutível organotípico ex vivo porcina de ceratite que pode ser usado para testar vários tratamentos para infecções agudas e crônicas. Usamos P. aeruginosa para este experimento, mas o modelo também funciona bem com outras bactérias, e organismos como fungos e leveduras que causam ceratite.
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Protocol
Coelhos do laboratório albino foram sacrificados em laboratório por outros trabalhos experimentais planejados sob protocolos aprovados pelo home office. Os olhos não eram necessários para uso experimental nesses estudos, por isso foram utilizados para este protocolo.
1. Esterilização
- PASSO CRÍTICO: Desinfete todos os fórceps e tesouras de molho por 1h em 5% (v/v) solução de Distel em água destilada, limpe com escova, enxágue com água da torneira e esterilize em forno a 185 °C por um mínimo de 2h.
- Esterilize todos os outros vidros e reagentes autoclavando a 121 °C por 15 minutos ou prepare os reagentes de acordo com as instruções do fabricante. Realizar os seguintes procedimentos em um gabinete de segurança de microbiologia classe II.
2. Coleta de amostras
- Coleção de olhos suínos
- Grandes porcas brancas, uma cruz com um javali hampshire foi usada. Os animais foram atordoados com uma corrente elétrica e os olhos foram enucleados 2h depois no matadouro.
- PASSO CRÍTICO: Uma vez enucleado, transfira os olhos para o laboratório em uma solução salina tamponada de fosfato estéril (PBS) para evitar que eles sequem e processem-nos imediatamente após a chegada.
- Coleção de olhos de coelho
- Extireta as córneas e mande para o laboratório em PBS estéril.
3. Preparação do botão corneoscleral
- Use fórceps estéreis para segurar o tecido ao redor do globo ocular e transferi-lo para uma placa de Petri. Remova o tecido conjuntivo e muscular ao redor do globo ocular em uma placa de Petri usando lâmina de bisturi nº 15 e fórceps.
- Levante suavemente o globo ocular enquanto segura o nervo óptico com fórceps e transfira para um frasco de 0,5 L cheio de PBS estéril.
- Uma vez que todos os olhos estejam limpos do tecido circundante, mova-os usando fórceps estéreis para outro frasco de 0,5 L preenchido com 3% (v/v) iodo de povidona na PBS e deixe por 1 min.
- Transfira os globos oculares para outro frasco de 0,5 L com PBS estéril.
- Use fórceps para segurar o olho ainda em uma placa de Petri e fazer um corte perto da córnea com uma lâmina de bisturi no 10A.
- PASSO CRÍTICO: Segure a borda do corte e use a tesoura para extirar a córnea deixando cerca de 3 mm de esclera ao redor da córnea. Certifique-se de que a extremidade afiada da tesoura não perfura a íris ou o tecido coroidal e está no espaço supra-choroidal.
- Segure o botão córneacleral com fórceps e use outro par de fórceps ponta pontiagudas para separar suavemente o tecido úveal.
- Levante o botão corneoscleral do globo remanescente e enxágue-o brevemente em 1,5% (v/v) solução de iodo povidone em PBS em uma placa de 12 poços.
- Coloque o botão corneoscleral em outra placa de 12 poços cheia de PBS estéril.
- Depois de processar todos os olhos (recomendado máximo de 40 olhos em um lote), coloque cada botão corneoscleral em uma placa de Petri individual (34 mm de diâmetro) lado epitelial para cima e despeje em 3 mL de cultura média pré-aquecida a 37 °C.
NOTA: A composição do meio de cultura é a seguinte: o meio modificado da Águia (DMEM) modificado de Dulbecco: Ham's [1:1] complementado com 5 μg∙mL-1 insulina e 10 ng∙mL-1 fator de crescimento epidérmico (EGF), 10 ng 10% (v/v) soro fetal da panturrilha (FCS), 100 U∙mL-1 penicilina, 100 U∙mL-1 estreptomicina e 2,5 μg∙mL-1 anfotericina B. Como etapa opcional, o meio pode ser complementado com 50 g∙L-1 dextran para evitar o inchaço da córnea excisada durante as etapas de incubação. - Incubar a 37 °C em uma incubadora de cultura tecidificada.
4. Manutenção dos botões corneosclerais
- Após 24 horas, use técnica asséptica para remover a mídia e substituir por 3 mL de mídia de cultura pré-aquecida fresca contendo antibióticos. Mantenha os botões corneosclerais na mídia com antibióticos por 48 horas para desinfetar as córneas. Incubar a 37 °C em uma incubadora de cultura tecidificada.
- PASSO CRÍTICO: Após 48 horas, remova a mídia e enxágue córneas com 2 mL de PBS. Em seguida, mantenha os botões corneosclerais em mídia livre de antibióticos por um mínimo de dois ou idealmente três dias antes da infecção experimental, para remover antibióticos residuais do tecido.
- Incubar a 37 °C em uma incubadora de cultura tecidificada. Mude a mídia pelo menos mais uma vez dentro desses três dias. Descarte córneas se alguma turbidez se desenvolver no meio livre de antibióticos.
5. Preparação de um inóculo
- Despeje 10 mL de caldo LB em um frasco cônico de 50 mL com uma rolha de espuma.
- Transfira uma colônia de P. aeruginosa cepa PAO1 ou coe PA14 de uma placa de ágar fresco e incubar a 37 °C por 3-4 h até que as bactérias estejam em fase de registro médio.
- Transfira a cultura das bactérias para um tubo de 50 mL e centrífuga a 3.000 x g por 5 min. Remova o supernatante e suspenda a pelota da célula na PBS.
- Repita o passo 5.3 mais duas vezes para lavar as células. Suspenda a pelota de célula em PBS e ajuste a densidade óptica em 600 nm para aproximadamente 0,6 usando PBS estéril como um branco.
6. Infectando o botão corneoscleral
- Remova a mídia da placa de Petri e enxágue córneas duas vezes com 1 mL de PBS estéril.
- Aperte suavemente as fórceps enquanto segura a córnea no meio. Use um bisturi de 10A para fazer quatro cortes – dois verticais, dois horizontais – na seção central do botão corneoscleral através da camada epitelial até o estroma subjacente.
- Coloque um molde de vidro estéril em uma placa de 6 poços com a parte larga para cima e coloque a córnea no meio do molde de vidro, lado do epitélio voltado para baixo. Faça o corte bem no centro da parte inferior do molde de vidro.
- PASSO CRÍTICO: Despeje 1 mL de 1% (w/v) ágar de ponto de fusão baixo dissolvido em DMEM para encher completamente o molde de vidro com córnea.
- Deixe o ágar definir e, em seguida, inverter o molde de vidro para que o epitélio córnea esteja voltado para cima.
- Pipeta 15 μL da cultura bacteriana com OD600nm = 0,6 (para P. aeruginosa isso equivale a aproximadamente 1 x 107 unidades de formação de colônias (CFU) em 15 μL) diretamente em uma área cortada e, em seguida, adicionar 85 μL de PBS ao topo para manter o moist epitélio da córnea. Diluir a cultura bacteriana restante e a placa no ágar para contar unidades de formação de colônias para o inóculo.
- Adicione 1 mL de DMEM sem antibióticos no fundo de cada poço com o molde de vidro. Incubar a placa de 6 poços com os botões corneosclera infectados em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2 por até 24 h.
- Configure córnea de controle não infectada ao lado de todos os experimentos. Para configurar o controle não infectado, substitua os 15 μL de cultura bacteriana na etapa 6.6 por PBS estéril.
7. Homogeneização da córnea para colher as bactérias
- Descarte o meio DMEM da parte inferior da placa de 6 poços e adicione 1 mL de PBS estéril para enxaguar a parte inferior do poço.
- Remova o PBS suavemente por pipetação sem tocar na parte central do botão corneoscleral. Remova o anel de vidro usando fórceps estéreis e coloque-o no Distel de 5%.
- Enxágue suavemente a parte superior do botão corneoscleral com 1 mL de PBS duas vezes [opcional].
- Segure a borda do botão corneoscleral com fórceps finos e desprende-o do ágar por baixo.
- Transfira a córnea para um tubo de 50 mL cheio de gelo frio de 1-2 mL de PBS.
- Use um homogeneizador de ponta fina para ver o topo da córnea infectada. O tecido não precisa ser completamente liquidizado. O homogeneizador ajuda a separar bactérias do epitélio córnea e da área de corte.
- Vórtice a córnea em PBS por alguns segundos para misturar o conteúdo.
- Adicione 20 μL do homogeneado a 180 μL de PBS e realize diluições seriais em uma placa de 96 poços.
- Diluir a suspensão em 10-4 e 10-5 diluição e pipeta 10 μL do homogeneato diluído com bactérias em uma placa de ágar de sangue. Incubar a placa por 8 horas e contar o número de UFC. Ao testar o efeito de antimicrobianos, o fator de diluição apropriado deve ser chegado experimentalmente.
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Representative Results
O design dos moldes de vidro é uma ideia inovadora e original, sendo que o uso nos permitiu configurar o modelo de forma consistente com problemas mínimos/sem contaminação. Os moldes foram preparados por um soprador de vidro na Universidade de Sheffield com base em um design (Figura 1A). A configuração experimental mantém a forma convexa da córnea e mantém bactérias no topo do epitélio onde ocorre a infecção(Figura 1B).
Córneas suínas geralmente incham depois de alguns dias em média. Isso é normal e descobrimos que não houve diferença significativa entre córneas com e sem adição do Dextran, que geralmente é adicionado para evitar o inchaço da córnea(Figura 1H). As córneas são tipicamente feridas para ajudar as bactérias a penetrar o epitélio. Embora não tenha havido diferença significativa no progresso da infecção entre córneas feridas (cortadas) e não cortadas (sem cortes), notamos mais variações entre as réplicas em córneas não cortadas(Figura 1C). Lavar as córneas duas vezes com PBS remove o excesso de bactérias que não se ligavam ao epitélio. Houve diferença significativa na UFC entre córneas suínas lavadas e não lavadas infectadas com P. aeruginosa PAO1 por 24 horas(Figura 1D). Não houve diferença significativa nas contagens de UFC entre córneas suínas e de coelho infectadas com PA14 e PAO1 (Figura 1E,1F). Os resultados para ambos os modelos foram reprodutíveis. Após 24 horas, a córnea infectada com qualquer cepa pseudomonas sempre desenvolve opacidade e a área de corte torna-se mais visível e aberta em comparação com a córnea não infectada(Figura 1G).
Figura 1: Ex vivo córnea infectada com Pseudomonas aeruginosa. (A) Imagem esquemática de um molde de vidro usado para manter a forma da córnea e facilitar a introdução de bactérias e tratamentos. A espessura dos moldes de vidro é de 1,5 mm e é a mesma que a espessura dos tubos de ensaio feitos de vidro borossilicato. (B) Imagem esquemática da configuração experimental. (C) Testar o efeito do ferimento na contagem final da UFC após a homogeneização. As córneas não cortadas (n = 16) e cortadas (n = 28) foram infectadas com P. aeruginosa PAO1 e P. aeruginosa PA14 durante 24 horas. As córneas foram lavadas com 1 mL de PBS antes da homogeneização. As barras de erro indicam desvio padrão. (D) Testar o efeito da lavagem de córneas com 2 x 1 mL de PBS (n = 6) e não lavar (n = 6) na contagem final da UFC após infecção com P. aeruginosa PAO1 por 24 horas. As barras de erro indicam desvio padrão. (E) Contagem final de UFC em córneas suínas infectadas com P. aeruginosa PAO1 e P. aeruginosa PA14 por 24 horas (n = 10). Córneas foram lavadas e cortadas. As barras de erro indicam desvio padrão. (F) Contagem final de UFC em córneas de coelho infectadas com P. aeruginosa PAO1 e P. aeruginosa PA14 por 24 horas (n = 6). Córneas foram lavadas e cortadas. As barras de erro indicam desvio padrão. (G) Fotos de córneas ex vivo suínas infectadas com P. aeruginosa PAO1 por 24 horas. O controle foi ferido, mas nenhuma bactéria foi adicionada. As córneas infectadas foram feridas e 107 UFC foram adicionadas ao lado do corte. Nenhuma UFC foi recuperada da córnea de controle. (H) A UI final recuperou-se após 24 horas de infecção com P. aeruginosa PAO1 de córneas tratadas com dextran (n = 2) e aquelas sem dextran (n = 9). Córneas foram lavadas e cortadas. As barras de erro indicam desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O principal motor por trás do desenvolvimento deste modelo de ceratite usando córnea porcina ex vivo é fornecer aos pesquisadores que desenvolvem novos antimicrobianos com um modelo in vitro representativo para determinar com mais precisão a eficácia antimicrobiana nos estágios pré-clínicos. Isso fornecerá aos pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de novos antimicrobianos maior controle sobre o design e formulação de medicamentos nos estágios pré-clínicos, aumentará o sucesso em ensaios clínicos, reduzirá o uso de animais ao permitir estudos direcionados e resultará em uma tradução mais rápida de novos antimicrobianos para clínica.
Vários estudos têm investigado o efeito de infecções em córneas ex vivo de vários animais como: coelho6, cão7, cabra8 e suínos9,10,11. A maioria desses estudos se concentra em formas de estabelecer6 e visualizar uma infecção9, mas até agora houve apenas algumas publicações com foco em testes de drogas e quantificação precisa de bactérias6,7,8,12.
A principal vantagem do nosso modelo é a disponibilidade das córneas suínas como parte da cadeia alimentar. O uso de córneas ex vivo suínas, portanto, alinha-se ao princípio das 3Rs, que é substituir, refinar e reduzir o uso de animais em pesquisa, ao mesmo tempo em que fornece um modelo representativo da interface hospedeira. Não observamos problemas com a contaminação das explanações córneas se o protocolo for rigorosamente seguido. Os moldes de vidro são muito fáceis, rápidos e simples de usar sem qualquer exigência de equipamento especializado. O anel estreito na parte superior torna conveniente a adição de uma pequena quantidade de uma droga testada (100 μL) ou bactérias. O anel do molde de vidro permite que a PBS com bactérias ou uma solução medicamentosa seja retida na parte central da córnea e impede que as bactérias fiquem sob a córnea. O anel é fácil de limpar e esterilizar, e permite a observação das alterações que ocorrem na parte superior da córnea durante a infecção. Cepas de bactérias fluorescentes podem ser usadas para visualizar a infecção ou quantificar a propagação da infecção no tecido usando microscopia confocal fluorescente. As córneas inteiras podem ser processadas para histologia ou imagens de microscopia eletrônica.
Os passos críticos estão marcados no protocolo. Deve-se prestar atenção extra a essas etapas ao realizar o protocolo para garantir o sucesso da infecção. Os passos mais críticos dentro do protocolo são garantir que as córneas sejam tratadas com antibióticos suficientes para prevenir a infecção durante a preparação e, em seguida, que os antibióticos sejam suficientemente eliminados antes da introdução do organismo infeccioso, neste caso P. aeruginosa. Ao configurar os experimentos usando este protocolo, em alguns casos, a turbidez desenvolveu-se durante a incubação no meio livre de antibióticos. Essa turbidez foi indicativa de crescimento de microrganismos no meio livre de antibióticos. Isso pode ser devido ao tratamento incompleto da córnea usando os antibióticos ou devido à contaminação durante o manuseio. Essas córneas não foram levadas adiante para mais experimentos e foram descartadas. O desenvolvimento da turbidez ao incubar córneas em meio livre de antibióticos foi evitado empregando corridas de esterilização frequentes na incubadora, utilizando pontas de pipeta descartáveis com filtro e tomando cuidado adequado ao esterilizar as ferramentas utilizadas para extirção da córnea dos olhos suínos. Outro passo crítico é quando as córneas são colocadas no molde de vidro antes da infecção. O molde de vidro permite manter a forma convexa da córnea. A convexidade da córnea é um desafio para a retenção da dose infecciosa ou do agente terapêutico na superfície da córnea. Por isso, é essencial garantir a presença de vedação adequada entre a córnea e o molde de vidro. Quando há vedação adequada entre a córnea e o molde de vidro, a estrutura do anel acima do molde cria um reservatório para reter a dose infecciosa ou o agente terapêutico. Uma vedação adequada é assegurada preenchendo completamente a seção larga do molde de vidro com ágar DMEM até a borda.
Como é o caso de qualquer modelo, há limitações associadas ao modelo de córnea ex vivo suíno descrito. O modelo aqui descrito não imita a composição, o fluxo e a reposição do filme lacrimal através da córnea. A ação mecânica fornecida pelo piscar também não é incorporada ao modelo. Há concordância na literatura de que a composição e a dinâmica do filme rasgado, e piscando são importantes mecanismos de defesa que removem partículas estranhas e microrganismos do olho13. De fato, o modelo também carece de uma resposta imune que é desencadeada durante a infecção in vivo. É provável que a progressão da infecção in vivo na presença desses mecanismos de defesa seja diferente da observada no modelo ex vivo descrito aqui. Apesar dessas limitações, o modelo de córnea porcina ex vivo é relevante para testar a eficácia dos antimicrobianos existentes e emergentes por duas razões principais: 1) a fisiologia das bactérias no modelo ex vivo imita as condições in vivo, pois a proliferação bacteriana depende de sua capacidade de danificar o tecido córnea, e 2) o modelo incorpora o tecido tridimensional como barreira de difusão para terapêuticas muito parecidas com a da situação in vivo. Portanto, o modelo ex vivo é vantajoso em relação às técnicas convencionais para testes de suscetibilidade antimicrobiana.
O modelo de córnea porcina ex vivo descrito aqui também pode ser usado para estudar diferentes cepas de bactérias, fungos e leveduras que causam ceratite. Este modelo ex vivo córnea é reproduzível e permite que se gere réplicas em um curto espaço de tempo ao contrário dos modelos in vivo. Em vez de PBS, lágrimas artificiais ou células de defesa imunológica hospedeira podem teoricamente ser adicionadas para imitar o cenário ao vivo. Córneas são obtidas da mesma raça de suínos e cerca de 21-23 semanas de idade quando abatidos. Portanto, há menos variabilidade entre as réplicas em comparação com as obtidas de cadáveres humanos. O conceito de usar um modelo de córnea ex vivo porcina para aplicações biomédicas ganhou mais popularidade nos últimos anos por causa de sua semelhança biológica com o olho humano, o que torna esse modelo mais fácil de comparar14. Há aumento do interesse em usar córneas suínas para transplante15,16 ou como modelo para olho seco17 ou cicatrização de feridas18.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Elliot Abattoir em Chesterfield por fornecer olhos suínos. Os anéis de vidro foram feitos com base em nosso projeto pelo soprador de vidro Dan Jackson do Departamento de Química da Universidade de Sheffield. Os autores gostariam de agradecer ao Conselho de Pesquisa Médica (MR/S004688/1) pelo financiamento. Os autores também gostariam de agradecer à senhora deputada Shanali Dikwella pela ajuda técnica na preparação da córnea. Os autores gostariam de agradecer ao senhor deputado Jonathan Emery pela ajuda na formatação de imagens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
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