Summary
Dit artikel beschrijft een stapsgewijs protocol om een ex vivo varkensmodel van bacteriële keratitis op te zetten. Pseudomonas aeruginosa wordt gebruikt als een prototypisch organisme. Dit innovatieve model bootst in vivo infectie na omdat bacteriële proliferatie afhankelijk is van het vermogen van de bacterie om hoornvliesweefsel te beschadigen.
Abstract
Bij de ontwikkeling van nieuwe antimicrobiële stoffen is het succes van dierproeven afhankelijk van nauwkeurige extrapolatie van antimicrobiële werkzaamheid van in vitro tests naar dierinfecties in vivo. De bestaande in vitro tests overschatten doorgaans de antimicrobiële werkzaamheid omdat de aanwezigheid van gastheerweefsel als diffusiebarrière niet wordt verantwoord. Om dit knelpunt te overwinnen, hebben we een ex vivo varkens corneamodel van bacteriële keratitis ontwikkeld met Pseudomonas aeruginosa als prototypisch organisme. Dit artikel beschrijft de voorbereiding van het varkensvlies en het protocol voor de vaststelling van de infectie. Op maat gemaakte glasvormen maken een eenvoudige installatie van het hoornvlies mogelijk voor infectiestudies. Het model bootst in vivo infectie na omdat bacteriële proliferatie afhankelijk is van het vermogen van de bacterie om hoornvliesweefsel te beschadigen. De vaststelling van de infectie wordt geverifieerd als een toename van het aantal kolonievormende eenheden dat via levensvatbare plaattellingen wordt beoordeeld. De resultaten tonen aan dat infectie op een zeer reproduceerbare manier kan worden vastgesteld in de ex vivo hoornvliezen met behulp van de hier beschreven methode. Het model kan in de toekomst worden uitgebreid om keratitis na te bootsen die wordt veroorzaakt door andere micro-organismen dan P. aeruginosa. Het uiteindelijke doel van het model is om het effect van antimicrobiële chemotherapie op de voortgang van bacteriële infectie te onderzoeken in een scenario dat meer representatief is voor in vivo infecties. Hierdoor zal het hier beschreven model het gebruik van dieren voor tests verminderen, de slagingspercentages in klinische proeven verbeteren en uiteindelijk een snelle vertaling van nieuwe antimicrobiële stoffen naar de kliniek mogelijk maken.
Introduction
Hoornvliesinfecties zijn belangrijke oorzaken van blindheid en komen voor in epidemische proporties in lage- en middeninkomenslanden. De etiologie van de ziekte varieert van regio tot regio, maar bacteriën zijn verantwoordelijk voor een grote meerderheid van deze gevallen. Pseudomonas aeruginosa is een belangrijke ziekteverwekker die een snel progressieve ziekte veroorzaakt. In veel gevallen blijven patiënten achter met stromale littekens, onregelmatig astigmatisme, moeten ze worden getransplanteerd of verliezen ze in het ergste geval een oog1,2.
Bacteriële keratitis veroorzaakt door P. aeruginosa is een moeilijke ooginfectie om te behandelen, vooral vanwege de toenemende opkomst van antimicrobiële resistente stammen van P. aeruginosa. In het afgelopen decennium is gebleken dat het testen en ontwikkelen van nieuwe behandelingen voor hoornvliesinfecties in het algemeen, en die veroorzaakt door Pseudomonas sp., in het bijzonder, essentieel zijn om de huidige trend in antibioticaresistentie te bestrijden3.
Voor het testen van de werkzaamheid van nieuwe behandelingen voor hoornvliesinfecties zijn conventionele in vitro microbiologische methoden een slecht surrogaat vanwege het verschil in bacteriële fysiologie tijdens laboratoriumkweek en tijdens infecties in vivo en vanwege het ontbreken van de gastheerinterface4,5. In vivo diermodellen zijn echter duur, tijdrovend, kunnen slechts een klein aantal replica's opleveren en zorgen oproepen over dierenwelzijn.
In dit artikel demonstreren we een eenvoudig en reproduceerbaar organotypisch ex vivo varkensmodel van keratitis dat kan worden gebruikt om verschillende behandelingen voor acute en chronische infecties te testen. We hebben P. aeruginosa gebruikt voor dit experiment, maar het model werkt ook goed samen met andere bacteriën en organismen zoals schimmels en gist die keratitis veroorzaken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Albino-laboratoriumkonijnen werden in het laboratorium geofferd voor ander gepland experimenteel werk onder door het thuiskantoor goedgekeurde protocollen. De ogen waren niet nodig voor experimenteel gebruik in die studies, dus werden ze gebruikt voor dit protocol.
1. Sterilisatie
- KRITIEKE STAP: Desinfecteer alle tangen en scharen door 1 uur in 5% (v/v) oplossing van Distel in gedestilleerd water te weken, schoon te maken met een borstel, af te spoelen met kraanwater en te steriliseren in een oven bij 185 °C gedurende minimaal 2 uur.
- Steriliseer al het andere glaswerk en reagentia door gedurende 15 minuten bij 121 °C te autoclaveren of reagentia volgens de instructies van de fabrikant te bereiden. Voer de volgende procedures uit in een veiligheidskast voor microbiologie van klasse II.
2. Monsterverzameling
- Inzameling van varkensogen
- Grote witte landras zeugen, een kruis met een Hampshire zwijn werd gebruikt. De dieren werden verdoofd met een elektrische stroom en de ogen werden 2 uur later in het slachthuis geïnucleeerd.
- KRITIEKE STAP: Zodra ze zijn geënucleeerd, breng je de ogen over naar het lab in een steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om te voorkomen dat ze uitdrogen en deze onmiddellijk bij aankomst te verwerken.
- Inzameling van konijnogen
- Verwijder de hoornvliezen en stuur ze naar het lab in steriele PBS.
3. Voorbereiding van de corneosclerale knop
- Gebruik steriele tang om het weefsel rond de oogbol vast te houden en over te brengen naar een Petrischaal. Verwijder het bindvlies en spierweefsel rond de oogbol op een Petrischaal met scalpelblad nr. 15 en tang.
- Til de oogbol voorzichtig op terwijl u de oogzenuw met een tang vasthoudt en breng over in een pot van 0,5 L gevuld met steriele PBS.
- Zodra alle ogen zijn verwijderd van omliggend weefsel, verplaats ze met steriele tang naar een andere pot van 0,5 L gevuld met 3% (v/v) povidonjodium in PBS en laat 1 minuut staan.
- Breng de oogbollen over in een andere pot van 0,5 L met steriele PBS.
- Gebruik een tang om het oog stil te houden op een Petrischaal en maak een snee in de buurt van het hoornvlies met een scalpelblad nr. 10A.
- KRITIEKE STAP: Houd de rand van de snede vast en gebruik een schaar om het hoornvlies te onttrekken en laat ongeveer 3 mm sclera rond het hoornvlies achter. Zorg ervoor dat het scherpe uiteinde van de schaar de iris of het choroïdale weefsel niet doorboort en zich in de supra-choroïdale ruimte bevindt.
- Houd de corneosclerale knop met een tang vast en gebruik een ander paar puntige eindkrachten om het uveale weefsel voorzichtig te scheiden.
- Til de corneosclerale knop van de resterende wereldbol en spoel deze kort in 1,5% (v/v) povidonjodiumoplossing in PBS in een 12-putplaat.
- Plaats de corneosclerale knop in nog eens 12 putplaat gevuld met steriele PBS.
- Na verwerking van alle ogen(aanbevolen maximaal 40 ogen in één batch),plaats elke corneosclerale knop op een individuele Petri-schotel (34 mm diameter) epitheelzijde naar boven en giet er 3 ml kweekmedium in dat voorverwarmd is tot 37 °C.
OPMERKING: De samenstelling van het kweekmedium is als volgt: Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM): Ham's [1:1] aangevuld met 5 μg∙ml-1 insuline en 10 ng∙ml-1 epidermale groeifactor (EGF), 10% (v/v) foetaal kalfsserum (FCS), 100 U∙ml-1 penicilline, 100 U∙ml-1 streptomycine en 2,5 μg∙ml-1 amfotericine B. Als optionele stap kan het medium worden aangevuld met 50 g∙L-1 dextran om zwelling van het verwijderde hoornvlies tijdens de verdere incubatiestappen te voorkomen. - Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde weefselkweekincubator.
4. Onderhoud van de corneosclerale knoppen
- Gebruik na 24 uur aseptische techniek om media te verwijderen en te vervangen door 3 ml verse voorverwarmde kweekmedia die antibiotica bevatten. Bewaar de corneosclerale knoppen 48 uur in media met antibiotica om de hoornvliezen te desinfecteren. Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde weefselkweekincubator.
- KRITIEKE STAP: Verwijder na 48 uur het medium en spoel de hoornvliezen af met 2 ml PBS. Bewaar vervolgens de corneosclerale knoppen in antibioticavrije media gedurende ten minste twee of idealiter drie dagen vóór de experimentele infectie, om resterende antibiotica uit het weefsel te verwijderen.
- Incubeer bij 37 °C in een bevochtigde weefselkweekincubator. Verander nog minstens één keer van media binnen deze drie dagen. Gooi hoornvliezen weg als er troebelheid ontstaat in het antibioticavrije medium.
5. Bereiding van een entmateriaal
- Giet 10 ml LB bouillon in een conische kolf van 50 ml met een schuimstop.
- Breng een kolonie P. aeruginosa stam PAO1 of stam PA14 over van een verse agarplaat en broed bij 37 °C gedurende 3-4 uur tot de bacteriën zich in de middenstamfase bevinden.
- Breng de bacteriekweek over in een tube van 50 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 3.000 x g. Verwijder het supernatant en hang de celkorrel opnieuw op in PBS.
- Herhaal stap 5.3 nog twee keer om de cellen te wassen. Schort de celpellet opnieuw op in PBS en stel de optische dichtheid bij 600 nm in op ongeveer 0,6 met steriele PBS als blanco.
6. Het infecteren van de corneosclerale knop
- Verwijder de media uit de Petrischaal en spoel de hoornvliezen tweemaal af met 1 ml steriele PBS.
- Knijp voorzichtig in de tang terwijl u het hoornvlies ertussen houdt. Gebruik een 10A scalpel om vier sneden te maken - twee verticaal, twee horizontaal - in het centrale gedeelte van de corneosclerale knop door de epitheellaag naar het onderliggende stroma.
- Plaats een steriele glasvorm in een 6-puts plaat met het brede deel omhoog en plaats het hoornvlies in het midden van de glasvorm, epitheelzijde naar beneden gericht. Maak de snede in het midden van het onderste deel van de glasvorm.
- KRITIEKE STAP: Giet 1 ml van 1% (w/v) laag smeltpunt agar opgelost in DMEM om de glasvorm volledig met hoornvlies te vullen.
- Laat de agar uitzetten en draai vervolgens de glasvorm om zodat het hoornvlieseptheel naar boven gericht is.
- Pipet 15 μL van de bacteriecultuur met OD600nm = 0,6 (voor P. aeruginosa komt dit neer op ongeveer 1 x 107 kolonievormende eenheden (CFU) in 15 μL) direct in een snijgebied en voeg vervolgens 85 μL PBS toe aan de bovenkant om het hoornvliesepepitheel vochtig te houden. Verdun de resterende bacteriecultuur en plaat op agar om kolonievormende eenheden voor het entmateriaal te tellen.
- Voeg 1 ml DMEM zonder antibiotica toe aan de bodem van elke put met de glazen mal. Incubeer de 6-putplaat met de geïnfecteerde corneosclerale knoppen in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende maximaal 24 uur.
- Zet ongeïnfecteerd controle-hoornvlies op naast elk experiment. Om niet-geïnfecteerde controle in te stellen, vervangt u de 15 μL bacteriecultuur in stap 6.6 door steriele PBS.
7. Homogenisatie van het hoornvlies om de bacteriën te oogsten
- Gooi het DMEM medium van de bodem van de 6 putplaat en voeg 1 ml steriele PBS toe om de bodem van de put af te spoelen.
- Verwijder PBS voorzichtig door te pipetten zonder het centrale deel van de corneosclerale knop aan te raken. Verwijder de glazen ring met steriele tang en plaats deze in de 5% Distel.
- Spoel de bovenkant van de corneosclerale knop voorzichtig twee keer af met 1 ml PBS [optioneel].
- Houd de rand van de corneosclerale knop vast met fijne puntpenpen en maak deze los van de agar eronder.
- Breng het hoornvlies over in een buis van 50 ml gevuld met ijskoude 1-2 ml PBS.
- Gebruik een fijne tiphomogenisator om de bovenkant van het geïnfecteerde hoornvlies te verdoezen. Het weefsel hoeft niet volledig geliquideerd te worden. De homogenisator helpt bacteriën los te maken van het hoornvliesepeeel en het snijgebied.
- Draai het hoornvlies enkele seconden in PBS om de inhoud te mengen.
- Voeg 20 μL homogen toe aan 180 μL PBS en voer seriële verdunningen uit in een 96 putplaat.
- Verdun de suspensie serieel tot 10-4 en 10-5 verdunning en pipet 10 μL van de verdunde homogenaat met bacteriën op een bloedagarplaat. Incubeer de plaat gedurende 8 uur en tel het aantal CFU. Bij het testen van het effect van antimicrobiële stoffen moet de juiste verdunningsfactor experimenteel worden bereikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het ontwerp van de glasvormen is een innovatief en origineel idee, waarvan het gebruik ons in staat stelde om het model op een consistente manier op te zetten met minimale / geen problemen met vervuiling. De mallen werden bereid door een glasblazer aan de Universiteit van Sheffield op basis van een ontwerp (Figuur 1A). De experimentele opstelling behoudt de bolle vorm van het hoornvlies en houdt bacteriën op de bovenkant van het epitheel waar infectie plaatsvindt (figuur 1B).
Varkens cornea's zwellen meestal op na enkele dagen in medium. Dit is normaal en we ontdekten dat er geen significant verschil was tussen hoornvliezen met en zonder toevoeging van dextran, die meestal wordt toegevoegd om zwelling van het hoornvlies te voorkomen (figuur 1H). De hoornvliezen zijn meestal gewond om de bacteriën te helpen het epitheel binnen te dringen. Hoewel er geen significant verschil was in de voortgang van infectie tussen gewonde (gesneden) en ongewounde (ongesneden) hoornvliezen, merkten we meer variaties op tussen replica's in ongesneden hoornvliezen (figuur 1C). Door de hoornvliezen twee keer te wassen met PBS worden overtollige bacteriën verwijderd die zich niet aan het epitheel hechtten. Er was een significant verschil in CFU tussen gewassen en ongewassen varkensmaïs die gedurende 24 uur besmet was met P. aeruginosa PAO1 (figuur 1D). Er was geen significant verschil in aantal KVE's tussen varkens- en konijnenmazaïs besmet met PA14 en PAO1 (figuur 1E,1F). De resultaten voor beide modellen waren reproduceerbaar. Na 24 uur ontwikkelt het met pseudomonas-stam geïnfecteerde hoornvlies altijd dekking en wordt het snijgebied zichtbaarder en opener in vergelijking met het niet-geïnfecteerde hoornvlies (figuur 1G).
Figuur 1: Ex vivo hoornvlies besmet met Pseudomonas aeruginosa. (A) Schematisch beeld van een glasvorm die wordt gebruikt voor het behoud van de vorm van het hoornvlies en het vergemakkelijken van de introductie van bacteriën en behandelingen. De dikte van de glasvormen is 1,5 mm en is gelijk aan de dikte van reageerbuizen gemaakt van borosilicaatglas. (B) Schematisch beeld van de experimentele opstelling. (C) Testen van het effect van verwonden op het uiteindelijke aantal CFU's na homogenisatie. Ongesneden (n = 16) en gesneden (n = 28) hoornvliezen werden gedurende 24 uur geïnfecteerd met P. aeruginosa PAO1 en P. aeruginosa PA14. De hoornvliezen werden gewassen met 1 ml PBS vóór homogenisatie. Foutbalken geven standaarddeviatie aan. (D) Het testen van het effect van het wassen van hoornvliezen met 2 x 1 ml PBS (n = 6) en niet wassen (n = 6) op het uiteindelijke aantal CFU's na infectie met P. aeruginosa PAO1 gedurende 24 uur. Foutbalken geven standaarddeviatie aan. (E) Laatste CFU-telling bij varkens cornea's besmet met P. aeruginosa PAO1 en P. aeruginosa PA14 gedurende 24 uur (n = 10). Cornea's werden gewassen en gesneden. Foutbalken geven standaarddeviatie aan. (F) Laatste CFU-telling bij konijnen cornea's besmet met P. aeruginosa PAO1 en P. aeruginosa PA14 gedurende 24 uur (n = 6). Cornea's werden gewassen en gesneden. Foutbalken geven standaarddeviatie aan. (G) Foto's van ex vivo varkens cornea's besmet met P. aeruginosa PAO1 gedurende 24 uur. De controle was gewond, maar er werden geen bacteriën toegevoegd. De geïnfecteerde hoornvliezen raakten gewond en 107 CFU werden aan de snijkant toegevoegd. Er is geen CFU teruggevonden op het controle-hoornvlies. (H) Definitieve CFU herstelde na 24 uur infectie met P. aeruginosa PAO1 van hoornvliezen behandeld met dextran (n = 2) en die zonder dextran (n = 9). Cornea's werden gewassen en gesneden. Foutbalken geven standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste drijfveer achter de ontwikkeling van dit keratitismodel met behulp van ex vivo varkensmaïs is om onderzoekers die nieuwe antimicrobiële stoffen ontwikkelen een representatief in vitro model te bieden om de antimicrobiële werkzaamheid in de preklinische stadia nauwkeuriger te bepalen. Dit zal onderzoekers die betrokken zijn bij de ontwikkeling van nieuwe antimicrobiële stoffen meer controle geven over het ontwerp en de formulering van geneesmiddelen in de preklinische stadia, het succes bij klinische proeven vergroten, het gebruik van dieren verminderen door gerichte studies mogelijk te maken en resulteren in een snellere vertaling van nieuwe antimicrobiële stoffen naar de kliniek.
Een aantal studies hebben het effect van infecties op ex vivo hoornvliezen van verschillende dieren onderzocht, zoals: konijn6, hond7, geit8 en varkens9,10,11. De meeste van deze studies richten zich op manieren om6 vast te stellen en een infectie te visualiseren9 , maar tot nu toe zijn er slechts enkele publicaties gericht op drugstests en nauwkeurige kwantificering van bacteriën6,7,8,12.
Het belangrijkste voordeel van ons model is de beschikbaarheid van de varkens cornea's als onderdeel van de voedselketen. Het gebruik van ex vivo varkensmaa's sluit daarom aan bij het beginsel van 3R's, namelijk het vervangen, verfijnen en verminderen van het gebruik van dieren in onderzoek, terwijl het een representatief model van de gastheerinterface biedt. We hebben geen problemen waargenomen met de besmetting van de hoornvliesexplants als het protocol strikt wordt nageleefd. De glazen mallen zijn zeer eenvoudig, snel en eenvoudig te gebruiken zonder enige vereiste voor gespecialiseerde apparatuur. De smalle ring aan de bovenkant maakt de toevoeging van een kleine hoeveelheid van een getest medicijn (100 μL) of bacteriën handig. De ring van de glazen mal maakt het mogelijk pbs met bacteriën of een medicijnoplossing te behouden in het centrale deel van het hoornvlies en voorkomt dat de bacteriën onder het hoornvlies komen. De ring is gemakkelijk schoon te maken en te steriliseren en maakt het mogelijk om de veranderingen die zich op de bovenkant van het hoornvlies voordoen tijdens infectie waar te nemen. Stammen van fluorescerende bacteriën kunnen worden gebruikt om infectie te visualiseren of de verspreiding van infectie in het weefsel te kwantificeren met behulp van fluorescerende confocale microscopie. De hele hoornvliezen kunnen verder worden verwerkt voor histologie of elektronenmicroscopie beeldvorming.
De kritieke stappen zijn gemarkeerd in het protocol. Extra aandacht moet worden besteed aan deze stappen bij het uitvoeren van het protocol om een succesvolle infectie te garanderen. De meest kritieke stappen binnen het protocol zijn ervoor te zorgen dat de hoornvliezen worden behandeld met voldoende antibiotica om infectie tijdens de voorbereiding te voorkomen en vervolgens dat de antibiotica voldoende worden geëlimineerd vóór de introductie van het infectieuze organisme, in dit geval P. aeruginosa. Bij het opzetten van de experimenten met behulp van dit protocol ontwikkelde troebelheid zich in sommige gevallen tijdens incubatie in het antibioticavrije medium. Deze troebelheid was indicatief voor de groei van micro-organismen in het antibioticavrije medium. Dit kan te wijten zijn aan een onvolledige behandeling van het hoornvlies met behulp van de antibiotica of als gevolg van besmetting tijdens de behandeling. Deze hoornvliezen werden niet naar voren gebracht voor verdere experimenten en werden weggegooid. De ontwikkeling van troebelheid bij het incuberen van hoornvliezen in antibioticavrij medium werd vermeden door frequente sterilisatieruns in de incubator te gebruiken, wegwerppipetpunten met een filter te gebruiken en voldoende voorzichtig te zijn bij het steriliseren van de gereedschappen die worden gebruikt om het hoornvlies uit de varkensogen te verwijderen. Een andere kritieke stap is wanneer de hoornvliezen vóór infectie in de glasvorm worden geplaatst. De glasvorm stelt men in staat om de bolle vorm van het hoornvlies te behouden. De convexiteit van het hoornvlies is een uitdaging voor het vasthouden van de infectieuze dosis of het therapeutische middel op het oppervlak van het hoornvlies. Daarom is het essentieel om de aanwezigheid van een adequate afdichting tussen het hoornvlies en de glasvorm te garanderen. Wanneer er voldoende afdichting is tussen het hoornvlies en de glasvorm, creëert de ringstructuur boven de mal een reservoir om de infectieve dosis of het therapeutische middel vast te houden. Een adequate afdichting wordt gewaarborgd door het brede gedeelte van de glasvorm volledig te vullen met DMEM-agar tot aan de rand.
Zoals het geval is met elk model, zijn er beperkingen verbonden aan het beschreven ex vivo varkensvliesmodel. Het hierin beschreven model bootst de samenstelling, stroming en aanvulling van de traanfilm over het hoornvlies niet na. De mechanische werking van knipperen is ook niet in het model verwerkt. Er is overeenstemming in de literatuur dat traanfilmcompositie en dynamiek, en knipperen zijn belangrijke verdedigingsmechanismen die vreemde deeltjes en micro-organismen uit het oogverwijderen 13. Inderdaad, het model mist ook een immuunrespons die wordt geactiveerd tijdens infectie in vivo. Het is waarschijnlijk dat de progressie van infectie in vivo in aanwezigheid van deze verdedigingsmechanismen verschilt van die waargenomen in het ex vivo model dat hier wordt beschreven. Ondanks deze beperkingen is het ex vivo varkens corneamodel relevant voor het testen van de effectiviteit van bestaande en opkomende antimicrobiële stoffen om twee belangrijke redenen: 1) de fysiologie van de bacteriën in het ex vivo model bootst de in vivo omstandigheden na, omdat bacteriële proliferatie afhankelijk is van hun vermogen om het hoornvliesweefsel te beschadigen, en 2) het model bevat het driedimensionale weefsel als een diffusiebarrière voor therapieën, net als in de in vivo situatie. Daarom is het ex vivo-model voordelig ten opzichte van conventionele technieken voor antimicrobiële gevoeligheidstests.
Het hier beschreven ex vivo varkensmaïsmodel kan ook worden gebruikt voor het bestuderen van verschillende stammen van bacteriën, schimmels en gist die keratitis veroorzaken. Dit ex vivo hoornvliesmodel is reproduceerbaar en stelt men in staat om binnen korte tijd replica's te genereren in tegenstelling tot in vivo modellen. In plaats van PBS kunnen kunstmatige tranen of gastheer immuunafweercellen theoretisch worden toegevoegd om het live scenario na te bootsen. Hoornvliezen worden verkregen van hetzelfde varkensras en ongeveer 21-23 weken oud bij het slachten. Daarom is er minder variabiliteit tussen repliceren in vergelijking met die verkregen uit menselijke kadavers. Het concept van het gebruik van een varkensex vivo hoornvliesmodel voor biomedische toepassingen is de afgelopen jaren populairder geworden vanwege de biologische gelijkenis met het menselijk oog, waardoor dit model gemakkelijker te vergelijkenis 14. Er is meer belangstelling voor het gebruik van varkensmaïs voortransplantatie 15,16 of als model voor droge ogen17 of wondgenezing18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Elliot Abattoir in Chesterfield bedanken voor het verstrekken van varkensogen. De glazen ringen zijn gemaakt op basis van ons ontwerp door de glasblazer Dan Jackson van het Department of Chemistry van de Universiteit van Sheffield. De auteurs willen de Medical Research Council (MR/S004688/1) bedanken voor de financiering. De auteurs willen ook mevrouw Shanali Dikwella bedanken voor de technische hulp bij de bereiding van het hoornvlies. De auteurs willen de heer Jonathan Emery bedanken voor zijn hulp bij het opmaken van foto's.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
- Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
- Sharma, S.
- Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
- Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
- Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
- Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
- Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
- Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
- Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
- Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
- Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C.
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
- Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
- Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
- Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
